Integration der Yangjing Zhongyu Abkochung in IVF/ICSI-ET-Zyklen bei Patientinnen mit verminderter ovarieller Reserve

Zusammenfassung

Diese Studie zeigt, dass die Abkochung von Yangjing Zhongyu die Ergebnisse der assistierten Reproduktion bei Frauen mit verminderter Eierstockreserve verbessert, indem sie die Qualität der Eizellen und Embryonen verbessert. In einem Rattenmodell für vorzeitiges Ovarialversagen stellte die Abkochung das Hormongleichgewicht wieder her, förderte die Follikelentwicklung und modulierte die Autophagie und den Fettstoffwechsel.

Zusammenfassung

Yangjing Zhongyu Decoction (YZD), eine traditionelle chinesische Kräuterformel, wird vorgeschlagen, die Eierstockfunktion und die Fruchtbarkeitsergebnisse zu verbessern, aber standardisierte klinische Beweise bleiben begrenzt. In dieser Studie wurden die Auswirkungen von YZD bei Frauen mit verminderter ovarieller Reserve (DOR), die sich einer IVF/ICSI-ET unterziehen, zusammen mit der mechanistischen Validierung in einem Rattenmodell für vorzeitiges Ovarialversagen (POF) untersucht. In der klinischen Studie erhielten DOR-Patienten entweder das Standard-GnRH-Antagonistenprotokoll allein oder in Kombination mit YZD. Die Ausgangsmerkmale zwischen den Gruppen waren vergleichbar, und die YZD-Gruppe zeigte eine höhere Anzahl von entnommenen Eizellen und qualitativ hochwertigen Embryonen sowie verbesserte Werte für das Syndrom der traditionellen chinesischen Medizin. Parallel dazu wurde POF bei Ratten induziert, und Tiere, die mit YZD behandelt wurden, zeigten eine verbesserte Brunstzyklizität, eine Wiederherstellung der Serumöstradiolspiegel, eine Verringerung des follikelstimulierenden Hormons und eine gesündere Ovarialhistologie. Die Elektronenmikroskopie zeigte, dass YZD die übermäßige Bildung von Autophagosomen und die Lipidakkumulation in den Eierstockzellen reduzierte, was auf eine Regulierung der Autophagie-Lipid-Stoffwechsel-Achse hindeutet. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass YZD die Funktion der ovariellen Reserven verbessert, die Embryonalentwicklung verbessert und das Schwangerschaftspotenzial bei Frauen mit DOR erhöhen kann. Dieses standardisierte Protokoll bietet einen reproduzierbaren Rahmen für die Integration von YZD in die Zyklen der assistierten Reproduktionstechnologie und unterstützt sein translationales Potenzial in der klinischen Reproduktionsmedizin.

Einleitung

Eine verminderte ovarielle Reserve (DOR) ist eine klinische Erkrankung, die die reproduktive Gesundheit von Frauen beeinträchtigt und durch eine Verringerung der Anzahl oder Qualität der Eierstockfollikel gekennzeichnet^{ist 1}. Klinisch spiegelt sich dies in einer verringerten Anzahl von Antralfollikeln, einem verringerten Spiegel des Anti-Müller-Hormons (AMH) oder erhöhten Konzentrationen des follikelstimulierenden Hormons (FSH) wider². DOR macht etwa 10 % der Unfruchtbarkeitsfälle aus und stellt ein Haupthindernis für eine erfolgreiche Empfängnis^{dar 3}. Im Zusammenhang mit der assistierten Reproduktionstechnologie (ART) wird die Prävalenz von DOR in den Vereinigten Staaten auf 19 % bis 26 % geschätzt⁴ und ist mit reduzierten Schwangerschaftsraten, einer höheren Inzidenz von Präeklampsie und einem erhöhten Risiko für wiederkehrende Fehlgeburten verbunden⁵. Trotz der Verfügbarkeit mehrerer therapeutischer Ansätze bleibt die Verbesserung der ART-Ergebnisse bei DOR-Patienten eine erhebliche Herausforderung, was den Bedarf an neuartigen und wirksamen Interventionen unterstreicht⁶.

Yangjing Zhongyu Sudtion (YZD), eine klassische Formulierung aus mehreren Kräutern der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCM), wird seit langem in der Fortpflanzungspraxis angewendet⁷. Es wird angenommen, dass es das endokrine Gleichgewicht verbessert und die Eierstockfunktion unterstützt, wodurch die Ergebnisse bei der In-vitro-Fertilisation und den intrazytoplasmatischen Spermieninjektions-Embryotransfer-Zyklen (IVF/ICSI-ET) verbessert^{werden 8}. Vorläufige klinische Daten deuten darauf hin, dass YZD die Reaktion der Eierstöcke verbessern kann, aber strenge mechanistische und translationale Studien sind noch begrenzt. Die genauen biologischen Signalwege, über die YZD bei DOR-Patienten wirkt, bleiben unklar ^9,10. Die aktuelle Literatur deutet darauf hin, dass chinesische pflanzliche Wirkstoffe die Mikroumgebung der Eierstöcke durch mehrere Mechanismen beeinflussen können, wie z. B. die Modulation der AMH-Expression, die Hemmung follikulärer Atresie-bezogener Signalwege einschließlich PI3K/AKT/mTOR und die Verringerung oxidativer Stressverletzungen. Diese mechanistischen Hypothesen sind jedoch weitgehend indirekt und es fehlt an experimenteller Validierung.

Diese Studie schließt diese Lücken, indem sie die klinische Bewertung mit der experimentellen Verifizierung verbindet. Insbesondere untersuchten wir die Auswirkungen von YZD bei Frauen mit DOR, die sich einer ART unterziehen, und untersuchten ihre mechanistischen Grundlagen unter Verwendung eines Tripterygiumglykosid-induzierten DOR-Rattenmodells. In den Tierversuchen überwachten wir endokrine Marker (Östradiol und FSH), die Anzahl der Antralfollikel, die Bildung von Autophagosomen und die Lipidakkumulation im Eierstockgewebe. Durch die Kombination klinischer Ergebnisse mit experimentellen mechanistischen Daten bietet diese Arbeit ein standardisiertes Protokoll für die Integration von YZD in IVF/ICSI-ET-Zyklen und bietet neue Evidenz, die sein Potenzial als Zusatztherapie zur Verbesserung der ovariellen Reserve und der reproduktiven Ergebnisse bei DOR-Patientinnen unterstützt. Die Neuheit dieser Studie liegt in ihrem dualen Ansatz - der Verknüpfung standardisierter klinischer Anwendung mit mechanistischen Erkenntnissen - der sowohl die klinische Translation als auch das theoretische Verständnis von YZD in der Reproduktionsmedizin voranbringt.

Protokoll

Alle klinischen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt und von der Ethikkommission des Shanghai Changhai Krankenhauses genehmigt (Zulassungs-Nr. CHEC2022-156). Von allen Teilnehmern wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt. Tierversuche wurden von der Ethikkommission des Changhai Medical College genehmigt (Approval No. CHEC2022-156) und entsprach den nationalen Standards für die Pflege von Versuchstieren.

Klinische Merkmale

Patientenrekrutierung und -gruppierung
Von August 2022 bis März 2023 wurden 78 Unfruchtbarkeitspatientinnen, bei denen das Nieren-Yin-Mangel-10-Syndrom diagnostiziert wurde und die eine ART suchten, aus dem Zentrum für Reproduktionsmedizin des First Affiliated Hospital der Naval Medical University und der Ambulanz des Yueyang Hospital der Shanghai University of Traditional Chinese Medicine rekrutiert. Die Teilnehmer wurden nach dem Zufallsprinzip entweder einer Kontrollgruppe oder einer Behandlungsgruppe (jeweils 39 Fälle) unter Verwendung der SPSS 23.0-Zufallszahlengenerierung zugeteilt.

Diagnostische Kriterien
Die westliche medizinische Diagnose folgte der Stellungnahme des Ausschusses der American Society for Reproductive Medicine (ASRM) 2020 zu Indikatoren für die Eierstockreserve¹¹. Zu den Kriterien gehörten FSH ≥ 10 IE/l, Östradiol ≥ 80 pg/ml, Antralfollikelzahl (AFC) < 7 und AMH < 0,5-1,1 ng/ml. Das Nieren-Yin-Mangel-Syndrom wurde nach der Gynäkologie der Traditionellen Chinesischen Medizin¹² und den Diagnostischen Wirksamkeitskriterien der TCM-Syndrome¹³ diagnostiziert.

Ein- und Ausschlusskriterien
Einschlusskriterien waren geplant: IVF/ICSI-ET unter Verwendung eines Antagonistenprotokolls; schlechte Reaktion der Eierstöcke in der Vorgeschichte (< 5 entnommene Eizellen); Alter 20-40 Jahre; Erfüllung der Kriterien des DOR- und des TCM-Syndroms; und unterschriebene Einverständniserklärung. Zu den Ausschlusskriterien gehörten eine Endometriumpathologie (Polypen, Tuberkulose, Dysplasie, Krebs), Gebärmutterfehlbildungen, Komorbiditäten (Diabetes, Lupus), eine kürzliche Hormontherapie (< 3 Monaten), eine Vorgeschichte von Beckenoperationen, Chromosomenanomalien oder Arzneimittelallergien. Die Eliminierungskriterien wurden für Protokollabweichungen, unerwünschte Ereignisse, Entzug oder spontane Empfängnis innerhalb von 2 Wochen nach der Aufnahme angewendet.

Methode der Medikation
Beide Gruppen wurden am 2. bis 3. Menstruationstag durch transvaginalen Ultraschall und Hormontests untersucht. Die Kontrollgruppe erhielt das Antagonisten-Regime: rekombinantes FSH oder humanes menopausales Gonadotropin, Anfangsdosis 225 IE/Tag intramuskulär für 5 Tage, gefolgt von einer Dosisanpassung basierend auf dem Follikelwachstum. Wenn der führende Follikeldurchmesser 12 mm überstieg, wurde mit dem GnRH-Antagonisten (0,125 mg/Tag subkutan) begonnen und bis zum Auslöser fortgesetzt. Wenn ≥ 1 Follikel 18 mm, ≥ 2 17 mm oder ≥ 3 16 mm erreichte, wurde der Eisprung mit 250 μg rekombinantem hCG ausgelöst, gefolgt von der Eizellentnahme nach 34-36 h.

Die Behandlungsgruppe folgte dem gleichen Protokoll mit der Zugabe von Yangjing Zhongyu Decoction (YZD), das 2x täglich (morgens und abends) oral verabreicht wurde, eine Abkochung pro Tag, beginnend mit den Menstruationszyklustagen 2-3 bis zum Triggertag. Die klinische Formel enthielt Rehmannia 12 g, Paeonia lactiflora 12 g, Cornus officinalis 10 g und Angelica sinensis 12 g.

Beobachtungsindikatoren
Zu den klinischen Endpunkten gehörten Ausgangsparameter Alter, BMI (berechnet als Gewicht (kg)/Größe² (m²)), Dauer der Unfruchtbarkeit, FSH, Gonadotropin-Dosis/-Dauer, Nieren-Yin-Mangel-Syndrom-Scores, Anzahl der Antralfollikel (beurteilt durch transvaginalen Ultraschall, 2-9 mm Durchmesser), entnommene Eizellen, Metaphase II (MII)-Eizellen (identifiziert bei der Eizellentnahme), befruchtete Embryonen, Spaltungen, hochwertige Embryonen (definiert nach den Standardkriterien des embryologischen Labors), und klinische Schwangerschaftsrate, die als das Vorhandensein eines Schwangerschaftssacks im Ultraschall in der 6-7. Schwangerschaftswoche definiert wurde.

Versuchstiere
Hier wurden 30 weibliche Sprague-Dawley-Ratten mit Lichtschutzfaktor (8 Wochen alt, 160-200 g) unter kontrollierten Bedingungen (23 ± 2 °C, 40%-45% Luftfeuchtigkeit, 12 h Hell-Dunkel-Zyklus) mit ad libitum Futter und Wasser akklimatisiert.

Zubereitung von Medikamenten
YZD wurde mit Rehmannia 30 g, Angelica 15 g, Paeonia lactiflora 15 g und Cornus officinalis 15 g zubereitet. Die Kräuter wurden in Wasser abgekocht, durch einen 200-Mesh-Filter filtriert und unter reduziertem Druck bei 70 °C konzentriert. Die endgültigen Lösungen für niedrige, mittlere und hohe Dosen betrugen 0,34 g/ml, 0,68 g/ml und 1,35 g/ml, was dem 0,5-fachen, 1,0-fachen und 1,2-fachen der klinischen Dosis von YZD entsprach. Abkochungen wurden bei 4 °C gelagert.

Modellierung und Gruppierung
Ein DOR-Modell wurde durch intraperitoneale Injektion von Tripterygiumglykosiden (40 mg/kg täglich über 15 Tage) induziert. Die Ratten wurden nach dem Zufallsprinzip den Blind- (n = 6), Modell- (n = 6) und YZD-Behandlungsgruppen (niedrige, mittlere und hohe Dosen; jeweils n = 6) zugeteilt. Die Verabreichung einer Sonde (10 ml/kg Körpergewicht) erfolgte 1x täglich, beginnend mit dem ersten Tag der Injektion von Tripterygiumglycosiden, die 15 Tage lang fortgesetzt wurde.

Vaginale Zytologie
Die Stadien des Östruszyklus wurden durch vaginale exfoliative Zytologie untersucht. Vaginalabstriche wurden einmal täglich (08:00-10:00 Uhr) mit sterilen Wattestäbchen entnommen, in 30 μl Kochsalzlösung verdünnt und unter einem Lichtmikroskop bei 100-facher Vergrößerung untersucht. Der Beobachtungszeitraum dauerte 15 aufeinanderfolgende Tage. Der normale Östruszyklusindex wurde definiert als der Anteil der Ratten, die in diesem Zeitraum regelmäßige 4-5-tägige Östruszyklen zeigten.

Hormon-Assays
Am Ende des 15-tägigen Behandlungszeitraums wurde unter Narkose Vollblut durch Herzpunktion entnommen, 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerinnen gelassen und 15 Minuten lang bei 4 °C bei 1000 x g zentrifugiert, um Serum zu erhalten. Die E2- und FSH-Werte wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers mittels ELISA gemessen.

Histologie der Eierstöcke
Das Ovarialgewebe wurde unmittelbar nach der Euthanasie durch chirurgische Entfernung beider Eierstöcke entnommen, in kalter Kochsalzlösung gespült, um Blut zu entfernen, und dann 24-48 h lang in 4% Paraformaldehyd bei 4 °C fixiert. Das Gewebe wurde in gradiertem Ethanol dehydriert, in Xylol gereinigt, in Paraffin eingebettet und bei 4-5 μm geschnitten. Die Schnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt, dehydriert, gereinigt und montiert.

Statistische Analyse
Die Daten wurden mit SPSS 26.0 analysiert. Normalvariablen wurden als Mittelwert ± SD ausgedrückt und mittels t-Test verglichen; nicht-normaler Variablen als Median (IQR) und verglichen mit dem Mann-Whitney U-Test. Kategoriale Variablen wurden in % ausgedrückt und mit dem Chi-Quadrat-Test verglichen. p < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Aus Gründen der Konsistenz wurden die gleichen statistischen Methoden auf die Zahlenanalysen angewendet (keine separate Beschreibung des Student's t-Tests).

Sicherheit und Abfallentsorgung
Paraformaldehyd, Xylol und Tripterygiumglykoside wurden in zertifizierten Abzügen mit Handschuhen, Schutzbrillen und Laborkitteln gehandhabt; Verschüttete Flüssigkeiten und kontaminierte Einwegartikel wurden in gekennzeichneten Behältern für gefährliche Abfälle gesammelt und gemäß der institutionellen Biosicherheits-SOP entsorgt. Alle Eingriffe mit Paraformaldehyd, Xylol und Tripterygiumglycosiden wurden in Abzügen mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Handschuhe, Laborkittel, Schutzbrille) durchgeführt. Chemische Abfälle und Tierkadaver wurden gemäß den Richtlinien der institutionellen Biosicherheit entsorgt.

Ergebnisse

Klinische Merkmale

Während der Studie zogen sich 3 Patienten in der Kontrollgruppe aufgrund einer COVID-19-Infektion zurück, und 1 wurde wegen abnormaler Leberfunktion ausgeschlossen, so dass 35 Patienten übrig blieben. In der Behandlungsgruppe brachen 4 Patienten aufgrund von COVID-19 ab, und 35 Patienten beendeten die Studie. So wurden insgesamt 70 Probanden in die abschließen...

Diskussion

In dieser Studie untersuchten wir die potenzielle Rolle von Yangjing Zhongyu Decoction (YZD) als Zusatztherapie für verminderte ovarielle Reserve (DOR) in der assistierten Reproduktionstechnologie (ART). Klinische Befunde zeigten, dass Patientinnen, die zusätzlich zum Standard-Antagonistenprotokoll YZD erhielten, eine signifikant höhere Anzahl an entnommenen Eizellen und qualitativ hochwertige Embryonen erreichten. Obwohl sich die Schwangerschaftsraten zwischen den Gruppen nicht signifik...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Zentrifuge	Serumtrennung (1000 x g, 15 min, 4 & degree; C)	Eppendorf 5810R	5811 000.012
Wattestäbchen (steril)	Sammlung von Proben der vaginalen Zytologie	Jiangsu Kangjian Medizinische Vorräte	KJ-MW-01
ELISA-Kit für E2	Serumestradiolquantifizierung (RAT)	Elabscience Biotechnology Inc.	E-EL-0152
ELISA-Kit für FSH	Serum-FSH-Quantifizierung (Ratte)	Elabscience Biotechnology Inc.	E-EL-R0391
Ethanol (70 & Dash; 100%)	Graduierte Dehydrierung für die Histologie	Sinopharm Chemical Reagent Co., China	100092683
Glasrutschen & Deckfolien	Beispielmontage	Citotest Scientific, China	7101/1812
Hämatoxylin & Eosin	Färbungslösung für die Histologie	Beyotime Biotechnologie, China	C0105S
Lichtmikroskop	Histologie und zytologische Beobachtung	Olympus (generisch, keine Marke)	CX23
Paraffin	Einbettungsmedium	Leica Biosystems	39601095
Paraformaldehyd (4 %)	Fixativ zur Gewebevorbereitung	Sigma-Aldrich	P6148
Kochsalzlösung (0,9 %)	Vorbereitung des vaginalen Abstrichs	Sinopharm Chemical Reagent Co., China	10019318
Sprague & Dash; Dawley-Ratten	Versuchstiere (weiblich, 8 Wochen, 160 Sekunden; 200 g)	Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Tech Co., Ltd.	SCXK(Peking)2024-0011
SPSS-Software	Statistische Analyse (Ver. 26.0)	IBM Corp.	RRID:SCR_002865
Transmissionselektronenmikroskop	Ultrastrukturelle Beobachtung	JEOL Ltd.	JEM-1400Plus
Tripterygiumglykoside	Induktion des DOR-Rattenmodells	Generischer Lieferant (keine Marke)	TG-001
Xylol	Räumungsreagenz für die Histologie	Sinopharm Chemical Reagent Co., China	10023418