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Methodenartikel

RNA-Isolierung aus dem Epithel der Augenlinse der Maus und den Massenmassen von Faserzellen

909 Aufrufe

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DOI:

10.3791/69079

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10. Oktober 2025

 ,  , 
1School of Optometry and Vision Science Program, Indiana University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Trennung des Epithels der Maus-Augenlinse und der Volumenmasse der Faserzelle, gefolgt von der RNA-Isolierung und der qPCR-Analyse. Diese Methode ermöglicht die Trennung von Linsenzellkompartimenten für eine detailliertere Analyse des Transkriptoms und der biologischen Prozesse in Epithelzellen im Vergleich zu differenzierten Faserzellen.

Zusammenfassung

Die Linse ist ein spezialisiertes, transparentes Gewebe in der vorderen Augenkammer, das aus zwei Hauptzelltypen besteht, Epithelzellen und Faserzellen. Eine Monoschicht aus Linsenepithelzellen bedeckt die vordere Hemisphäre der Linse, während der größte Teil der Linse aus einer Masse von Linsenfaserzellen besteht. Eine kollagene Basalmembran, die sogenannte Kapsel, umgibt und umhüllt das gesamte Gewebe. Linsenepithelzellen haften stark an der Linsenkapsel und können leicht von der Fasermasse getrennt werden, indem die Kapsel vom Gewebe abgezogen wird. Schwierigkeiten, eine ausreichende RNA-Konzentration aus der geringen Anzahl von Epithelzellen in der Linsenmonoschicht zu erhalten, haben bisher die Untersuchung von Epithelzell-Transkriptomen im Vergleich zu Faserzell-Transkriptomen behindert. Dieses Protokoll stellt eine Methode zur sauberen Trennung und Isolierung der Epithel- und Faserzellkompartimente sowie RNA-Konzentrationsschritte vor, um nachfolgende transkriptomische Experimente an Epithelzellproben aus einem einzigen Paar Mauslinsen zu ermöglichen. Die Möglichkeit, die wichtigsten Zelltypen der Linse einzeln zu untersuchen, hilft bei der Untersuchung biologischer Mechanismen der Linsenerhaltung und -dysregulation und ermöglicht die Charakterisierung zelltypspezifischer Störungen, die für altersbedingte Linsenpathologien verantwortlich sind.

Einleitung

Die Okularlinse ist ein transparentes Organ, das das Licht fein auf die Netzhaut fokussiert, um ein klares Bild zu erzeugen. Die Linse besteht aus zwei Hauptzelltypen: einer Monoschicht aus Epithelzellen, die die vordere Hemisphäre bedeckt, und Faserzellen, die die Masse des Gewebes ausmachen (Abbildung 1). Die Linse ist von einer kollagenen Basalmembran umgeben, die als Linsenkapsel bekannt ist und an die Epithelzellen fest anhaften. Wenn die Linse wächst, vermehren sich Epithelzellen am Äquator und differenzieren sich zu entstehenden Schalen von Faserzellen, die konzentrisch auf die Linse geschichtet werden 1,2,3. Das lebenslange Wachstum der Linsen hängt von der kontinuierlichen Vermehrung dieser kleinen Population äquatorialer Epithelzellen ab, die die Keimzonebilden 4. Wenn Faserzellen reifen, werden alle zellulären Organellen abgebaut, um lichtstreuende Objektezu eliminieren 5,6,7,8,9,10,11 und die Gewebetransparenz zu erhalten, und die innersten Faserzellen werden schließlich verdichtet, was zu einem starren Linsenzentrum führt 9,12. Aufgrund der umgebenden Linsenkapsel findet kein Zellumsatz in der Linse statt, und die Samenfasern bleiben während des gesamten Lebens im Zentrum der Linse, da neue Fasern an der Gewebeperipherie oder im Kortex hinzugefügt werden. Die Faserzellen der Linse haben je nach Alter unterschiedliche optische Eigenschaften und können eine zeitliche Momentaufnahme der unterschiedlichen biologischen Eigenschaften in jedem gegebenen Stadiumliefern 13.

Trotz verfügbarer chirurgischer Optionen ist der Graue Star, definiert als jede Trübung in der normalerweise transparenten Linse, nach wie vor die häufigste Ursache für Erblindung in der Welt14. Katarakte können sich im Linsenepithel, in der Hirnrinde oder im Zellkern mit unterschiedlichen Pathophysiologien manifestieren15. Die zellulären und molekularen Mechanismen der Kataraktbildung sind jedoch unklar 16,17. Um besser zu verstehen, wie man diese verschiedenen Arten von Katarakten verhindern und Alternativen zur Operation entwickeln kann, müssen wir besser verstehen, wie diese verschiedenen Zelltypen ihre Homöostase in der Linse aufrechterhalten.

Die Epithel- und Faserzellen spielen in der Linse unterschiedliche physiologische Rollen. Die Zellproliferation ist beispielsweise auf das Linsenepithelbeschränkt 18. Währenddessen bilden die Linsenfasern die Volumenmasse der Linse und verleihen der Linse Struktur und Brechungseigenschaften9. Um eine differenziertere Sicht auf die biologischen Prozesse zu erhalten, die an den verschiedenen Kompartimenten der Linse beteiligt sind, müssen Epithel- und Faserzellen getrennt untersucht werden. Hier stellen wir eine Methode vor, um das Epithel aus der Volumenmasse der Faserzelle zu isolieren, mRNA aus jeder Fraktion zu extrahieren und diese Transkripte mit Hilfe der quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) der reversen Transkription zu analysieren.

figure-introduction-1
Abbildung 1: Diagramm der Linsenanatomie. Die Linse besteht aus zwei Zelltypen, einer Monoschicht-Epithelzelle (blau und orange), die die vordere Hemisphäre bedeckt, und einer Masse von Linsenfasern (weiß). Das Gewebe ist von einer dünnen kollagenen Membran umgeben, die als Linsenkapsel (Tan) bekannt ist. Vordere Epithelzellen (blau) ruhen, während äquatoriale Epithelzellen (orange) sich vermehren, differenzieren und sich zu neuen Schichten von Faserzellen (weiß) an der Linsenperipherie verlängern. Neue Generationen von Faserzellen werden auf früheren Generationen von Fasern in konzentrischen Schalen überlagert. Die ältesten Linsenfaserzellen werden in der Mitte des Gewebes verdichtet. Diese Zahl wurde gegenüber Cheng (2024)38 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Protokoll

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem "Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren" der National Institutes of Health und einem vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Indiana University genehmigten Protokoll durchgeführt.

1. Arbeitsbereich, Ausrüstung und Reagenzienvorbereitung

  1. Autoklavieren Sie die Pipettenspitzen vor dem Gebrauch und legen Sie Kartons mit autoklavierten Spitzen für RNA-Experimente fest, um eine RNase-Kontamination zu vermeiden.
  2. Behandeln Sie die Arbeitsfläche in der Abzugshaube und dem Stößel zur Homogenisierung des Gewebes mit RNase-Dekontaminationslösung, spülen Sie sie gründlich mit entionisiertem Wasser ab und trocknen Sie sie ab.
  3. Weichen Sie Präparierwerkzeuge (gebogene Pinzetten, gerade Pinzetten und Mikrodissektionsscheren) 5 Minuten lang in 70%igem Ethanol ein und trocknen Sie sie vor Gebrauch mit einem sanften Tuch.
  4. Verwenden Sie brandneue Präparierlöffel und Petrischalen für die Dissektion und Gewebeisolierung.
  5. Aliquotieren Sie 400 μl kaltes TRIzol-Säure-Guanidinium-Phenol-Reagenz in DNAse- und RNAse-freie 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen in der Abzugshaube.

2. Sezieren von Mauslinsen

  1. Euthanasieren Sie erwachsene Mäuse mit einer CO2 -Überdosierung, gefolgt von einer Gebärmutterhalsluxation als sekundäre Maßnahme.
  2. Entkernen Sie die Augen mit einer gebogenen Pinzette.
    1. Drücke das Gewebe, das das Auge umgibt, mit der Pinzette sanft zusammen, so dass das Auge aus der Augenhöhle herausragt. Schließen Sie die Pinzette unter dem Auge und entfernen Sie sie, indem Sie sie gleichmäßig nach oben ziehen.
    2. Übertragen Sie die Augen in ein 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit 750-1000 μl 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
  3. Zum Sezieren die Augen in Vertiefungen in einer Präparierschale mit frischem 1x PBS übertragen.
  4. Halten Sie unter einem Dissektionsmikroskop mit einer geraden Pinzette die Basis des Sehnervs fest und schneiden Sie den Nerv mit einer scharfen Mikrodissektionsschere so nah wie möglich am Auge durch.
  5. Führen Sie vorsichtig eine feine gerade Pinzette in die Öffnung ein, an der der Sehnerv verbunden war, und kneifen Sie, um das Gewebe an Ort und Stelle zu halten.
  6. Führen Sie die Spitze der Mikrodissektionsschere in die gleiche Öffnung ein und schneiden Sie vorsichtig vom hinteren Augenpol in Richtung des Hornhaut-Sklera-Übergangs. Führen Sie die Instrumente nicht zu tief ein, um eine Beschädigung des Objektivs zu vermeiden.
    HINWEIS: Die Nagetierlinse nimmt ein großes Volumen im Auge ein, daher werden flache Schnitte empfohlen, um ein Durchstechen der Linse zu verhindern.
  7. Schneiden Sie mit der Mikrodissektionschere entlang des Hornhaut-Sklera-Übergangs und trennen Sie mindestens die Hälfte des Augenumfangs.
  8. Verwenden Sie die gerade Pinzette, um das Augengewebe sanft umzukehren, während Sie auf die Hornhaut drücken und die Linse durch den Hornhaut-Sklera-Schnitt extrudieren.
  9. Entfernen Sie vorsichtig alle großen, anhaftenden Gewebe mit einer feinen geraden Pinzette von der Linse.
  10. Rollen Sie die Linse bei Bedarf vorsichtig mit einer gebogenen Pinzette auf ein sauberes, zartes Arbeitstuch, um anhaftendes extralentikuläres Gewebe zu entfernen.
    HINWEIS: Rollen Sie das Taschentuch schnell über das Arbeitstuch und lassen Sie es nicht übermäßig austrocknen. Es kann zu kleinen Trübungen auf der Linsenoberfläche kommen, die auf trockene Stellen auf der Linsenkapsel zurückzuführen sind. Diese Trübungen sind in der Regel reversibel, wenn das Objektiv wieder in 1x PBS eingesetzt wird, und haben keinen Einfluss auf nachfolgende Schritte.
  11. Übertragen Sie die gereinigte Linse mit 1x PBS in eine 6 cm Petrischale.
  12. Durchstechen Sie die Linsenkapsel mit einer feinen geraden Pinzette flach in der Nähe des Äquators und ziehen Sie die Linsenkapsel vorsichtig von der Fasermasse ab. Die Linsenepithelzellen bleiben an der Kapsel haften. Entfernen Sie vorsichtig alle großen Faserstücke aus der Kapsel, die sich bei der Entkapselung gelöst haben könnten.
  13. Fassen Sie die Kapsel vorsichtig mit einer feinen geraden Pinzette und schwenken Sie die 1x PBS ein, um alle verbleibenden Fasern zu entfernen. Alle lose anhaftenden Faserzellen dissoziieren von den Kapsel- und Epithelzellen.

3. RNA-Isolierung

HINWEIS: Ein zusammengefasster Arbeitsablauf für die RNA-Isolierung ist in Abbildung 2 dargestellt.

  1. 2 Linsenkapseln oder 2 Fasermassen in entsprechende 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit 400 μl kaltem TRIzol-Reagenz geben.
    HINWEIS: Die Fasermassen sollten mit einer gebogenen Pinzette von der Schale in die Röhre bewegt werden, um das Gewebe aufzufangen.
  2. Verschließen Sie die Rohre fest und bringen Sie sie für die nachfolgenden Schritte in einen chemischen Abzug.
  3. Homogenisieren Sie die Massenmassen der Linsenfaser vorsichtig mit einem sauberen Pelletstößel.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, die Fasermasse vollständig aufzubrechen.
  4. Inkubieren Sie Proben (Linsenkapseln oder homogenisierte Fasermassen) in TRIzol für 30 min bei Raumtemperatur im Abzug.
  5. Geben Sie in den Abzug 200 μl Chloroform pro 400 μl TRIzol-Reagenz in jedes Röhrchen. Verschließen Sie die Röhrchen fest und schütteln Sie sie 15 s lang kräftig mit der Hand, wobei Sie den Daumen auf der Unterseite der Tube und den Zeigefinger auf der Kappe halten.
    HINWEIS: Die in der Materialliste angegebenen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen werden aufgrund der dichten Versiegelung verwendet. Wenn Sie Mikrozentrifugenröhrchen anderer Marken verwenden, testen Sie vor dem Schütteln den Röhrchenverschluss und die Dichtung, da TRIzol und Chloroformlösung unter der Kappe von Röhrchen austreten können, die nicht dicht verschlossen sind.
  6. Inkubieren Sie die Proben 10-15 Minuten lang bei Raumtemperatur, um eine Phasentrennung zu ermöglichen.
    HINWEIS: Am Boden des Röhrchens sollte sich eine rosa TRIzol-Reagenzschicht befinden, die Lipide und Proteine enthält, eine weiße Schicht zwischen den Phasen, die DNA enthalten, und oben eine klare wässrige Phase, die RNA enthält. Die weiße DNA-Schicht ist in den Epithelzellproben möglicherweise schwieriger zu erkennen.
  7. Proben bei 14.000 x g für 15 min bei 4 °C zentrifugieren.
    HINWEIS: Bewegen Sie die Röhrchen vorsichtig in die Zentrifuge hinein und wieder heraus, wobei Sie darauf achten müssen, die Transferphasen nicht zu stören.
  8. Montieren Sie Röhrchen und Reagenzien aus einem RNA-Reinigungs- und Konzentrator-Kit. Spin-Säulenrohre werden in ein Sammelrohr aus dem Kit eingebaut.
  9. Übertragen Sie die klare wässrige Phase (die oberste Schicht) vorsichtig in ein sauberes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und achten Sie dabei auf das Volumen.
    HINWEIS: Vermeiden Sie es, die weiße DNA-Schicht unter der wässrigen Phase zu stören, zu berühren oder aufzuzeichnen. Kippen Sie das Rohr beim Übertragen der wässrigen Phase, um eine Störung der weißen Schicht zu vermeiden. Es ist vorzuziehen, eine kleine Menge der wässrigen Phase im Röhrchen zu belassen, anstatt die Probe zu verunreinigen. In der Regel können für 200 μl zugesetztes Chloroform 180-190 μl wässrige Phase zurückgewonnen werden.
  10. Geben Sie der wässrigen Phase 200-prozentiges Ethanol im Volumenverhältnis 1:1 zu.
    HINWEIS: RNA-Bindungspuffer aus dem Konzentrator-Kit kann vor der Zugabe von Ethanol in einem volumetrischen Verhältnis von 2:1 zur wässrigen Phase hinzugefügt werden. Dieser Schritt wird übersprungen, um die RNA-Ausbeute zu erhöhen und weil die RNA nach der Isolierung eine ausreichende Reinheit aufweist.
  11. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie das Röhrchen mehrmals umdrehen oder die Lösung auf und ab pipettieren. Übertragen Sie die gemischte Lösung mit einer Pipettore in eine RNA-Spin-Säule.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, den Filter nicht mit der Pipettenspitze zu berühren.
  12. Schleudersäulen bei 16.000 x g für 30 s bei 4 °C zentrifugieren.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, den Deckel der Säule und die Seite des Sammelröhrchens zu beschriften, um die Röhrchensätze organisiert zu halten und für den Fall, dass die Kappe im nachfolgenden Zentrifugationsschritt abbricht.
  13. Verwerfen Sie den Durchfluss und geben Sie 400 μl RNA-Prep-Puffer in die Spin-Säule.
  14. Schleudersäulen bei 16.000 x g für 30 s bei 4 °C zentrifugieren.
  15. Verwerfen Sie den Durchfluss und geben Sie 700 μl RNA Wash Buffer in die Spin-Säule.
  16. Schleudersäulen bei 16.000 x g für 30 s bei 4 °C zentrifugieren.
  17. Verwerfen Sie den Durchfluss und geben Sie 400 μl RNA Wash Buffer in die Spin-Säule.
  18. Schleudersäulen bei 16.000 x g für 1 min bei 4 °C zentrifugieren.
  19. Entsorgen Sie den Durchfluss und zentrifugieren Sie erneut bei 16.000 x g für 30 s bei 4 °C, um sicherzustellen, dass die Schleudersäule trocken ist.
  20. Setzen Sie die Spin-Säule in ein neues, beschriftetes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen ein.
  21. Geben Sie 15 μl RNase-freies Wasser auf den Membranfilter. 2 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, den Filter nicht mit der Pipettenspitze zu berühren.
  22. Die Spin-Säule wird bei 16.000 x g für 30 s bei 4 °C zentrifugiert, um die gereinigte RNA zu eluieren.
    HINWEIS: Die Kappe des 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchens bleibt während der Zentrifugation geöffnet. Platzieren Sie die Spin-Säulen und Mikrozentrifugenröhrchen vorsichtig so, dass die offenen Kappen am Rotordeckel anliegen, damit er während der Zentrifugation nicht schwingt und bricht. Die Deckel sollten der Drehrichtung des Rotors folgen.
  23. Entfernen und entsorgen Sie die Spin-Säulen. Die RNA befindet sich in der Flüssigkeit, die in den 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen gesammelt wird.
  24. Verschließen Sie die 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen fest und inkubieren Sie die RNA-Proben 10 Minuten lang bei 55-65 °C, um die Resolubilisierung zu fördern.
  25. Legen Sie die Proben sofort nach dem Erhitzungsschritt auf Eis.
  26. Lagern Sie die Proben bei -80 °C oder transkribieren Sie sie für die Langzeitlagerung in cDNA.
    HINWEIS: RNA-Proben wurden bis zu 3 Monate ohne nennenswerten Konzentrationsverlust gelagert. Aliquotieren Sie RNA-Proben für die Lagerung in kleinere Volumina, um Gefrier-Tau-Zyklen zu minimieren und eine Degradation zu verhindern.

4. Messung der RNA-Konzentration mit einem UV-Vis-Spektrophotometer

  1. Bewahren Sie die RNA-Proben auf Eis auf, schalten Sie den NanoDrop (UV-Vis-Spektralphotometer) ein und lassen Sie das Instrument initialisieren.
  2. Wählen Sie im Menü Nukleinsäuren das Modul RNA-Quantifizierung aus.
  3. Leeren Sie das UV-Vis-Spektralphotometer, indem Sie 2,0 μl Eluent aus dem RNA-Konzentrationsschritt auf den Sockel pipettieren, in diesem Fall molekulares Wasser. Senken Sie den Instrumentenarm ab und lesen Sie die leere Probe ab.
  4. Heben Sie den Instrumentenarm an, reinigen Sie den Sensorsockel mit einem sauberen, trockenen, schonenden Tuch und anschließend einem weiteren, mit deionisiertem Wasser benetzten Tuch, gefolgt von einem erneuten trockenen Tuch.
  5. Geben Sie bei Bedarf Probendetails in die UV-Vis-Spektralphotometer-Schnittstelle ein.
  6. Laden Sie 2,0 μl der RNA-Probe auf den Sockel, senken Sie den Arm ab und quantifizieren Sie.
  7. Wiederholen Sie die Schritte 4.4 bis 4.6, um den Sockel zwischen den Proben zu reinigen.
  8. Wenn Sie fertig sind, speichern und exportieren Sie das Experiment zur weiteren Quantifizierung, falls erforderlich.

5. Reverse Transkription

  1. Unter Verwendung einer hochgradig prozessiven und thermostabilen reversen Transkriptase wird die reverse Transkription von 2,0 μg Linsenfaser-RNA und der gesamten extrahierten Epithel-RNA unter Verwendung des vom Hersteller empfohlenen Protokolls durchgeführt. Mischen Sie Reagenzien und RNA für jede Probe in einem sauberen PCR-Röhrchen. Bewahren Sie alle Lösungen und RNA-Proben auf Eis auf.
    HINWEIS: Diese Transkriptase kann bis zu 2,5 μg RNA pro Reaktion rückwärts transkribieren. Es wird von einer vollständigen Umwandlung von RNA in cDNA ausgegangen, daher wird die RNA-Ausgangskonzentration als mutmaßliche cDNA-Konzentration verwendet.
  2. Führen Sie die Reaktion im Thermocycler unter den in Tabelle 1 aufgeführten Bedingungen durch.
  3. Lagern Sie reverse transkribierte cDNA bei -80 °C oder fahren Sie mit dem qPCR-Schritt fort.
    HINWEIS: cDNA-Proben wurden bis zu 4 Monate ohne merklichen Abbau gelagert, da cDNA stabiler ist als RNA. Die Proben können wahrscheinlich länger gelagert werden, vorausgesetzt, die Gefrier-Tau-Zyklen werden minimiert.
SchrittTemperatur (°C)Zeit (min)Zyklen
Glühen25101
Reverse Transkription50101
Inaktivierung von Enzymen8551
Halten4∞1

Tabelle 1: Thermocycler-Bedingungen für die reverse Transkription. Diese Bedingungen sind auf eine spezifische, hochprozessive und thermostabile reverse Transkriptase abgestimmt. Die Laufbedingungen können je nach verwendetem Enzym und Kit variieren.

6. Quantitative real-time PCR

  1. Bereiten Sie vor Beginn der Reaktionen cDNA-Stammlösungen auf die gewünschte Konzentration vor, indem Sie sie mit Wasser in Molekularqualität verdünnen. In diesen Experimenten wird 1 μl cDNA bei 5 ng/μl für 5 ng/Well-Reaktionen verwendet. Bewahren Sie alle Lösungen und cDNA-Proben auf Eis auf.
    HINWEIS: TaqMan Array-Platten (0,1 ml-Format) werden empfohlen, um Reaktionen von 5-50 ng cDNA pro Vertiefung aufzunehmen. Die Herstellung von Aliquoten von cDNA ist nützlich, um Frost-Tau-Zyklen zu begrenzen. In dieser Studie wurden die Proben auf maximal 5 Gefrier-Auftau-Zyklen begrenzt.
  2. Bereiten Sie einen funktionierenden Mastermix vor, der aus Advanced Master Mix und Sonden nach kommerziellen Empfehlungen besteht. Siehe Abschnitt 7 für eine beispielhafte Vorbereitung. Bewahren Sie alle Lösungen und cDNA-Proben auf Eis auf.
    HINWEIS: Pro Vertiefung wird üblicherweise ein Sondenpaar mit zwei verschiedenen Farbstoffen verwendet. Zum Beispiel wurde in dieser Studie Crygs-FAM-MGB als Gen-of-Interest-Sonde und Ppia-VIC-MGB als interne Kontrolle verwendet. Kommerzielle Empfehlungen für die Endkonzentration von Sonde und Primer liegen bei 250 nM bzw. 900 nM. Wenn ein Ziel sehr stark exprimiert wird, kann eine Primer-begrenzte Sonde erforderlich sein, um eine Erschöpfung der Reaktionsreagenzien zu verhindern.
  3. Laden Sie den cDNA-Stamm (1 μl) in geeignete Vertiefungen auf der qPCR-Platte, gefolgt von dem Arbeits-Mastermix (9 μl). Mischen Sie Lösungen, indem Sie langsam auf und ab pipettieren, während Sie den Mastermix hinzufügen. Stellen Sie sicher, dass der Tropfen cDNA in die Lösung gemischt wird, und vermeiden Sie Blasen.
    HINWEIS: Abhängig von der Empfindlichkeit des Ziels muss die Platte möglicherweise auf Eis geladen werden.
  4. Versiegeln Sie die qPCR-Platte, indem Sie vorsichtig eine optische Klebeabdeckung aufbringen. Verwenden Sie einen Klebefolienapplikator, um die Abdeckung zu glätten und eine dichte Abdichtung um jede Vertiefung herum zu gewährleisten.
  5. Vortex-Platten bei 1000 U/min für 10 s zum Mischen.
  6. Zentrifugieren Sie die Platten bei 1000 x g für 2 min bei Raumtemperatur, um sicherzustellen, dass sich keine Luftblasen am Boden der Vertiefungen befinden.
  7. Legen Sie die Platte in einen quantitativen PCR-Thermocycler und führen Sie sie mit den in Tabelle 2 aufgeführten Zyklen durch.
    HINWEIS: Herkömmliche qPCR-Protokolle sind in der Regel auf 40 Zyklen begrenzt. Es ist unwahrscheinlich, dass eine Erhöhung der Zykluszahl zu aussagekräftigen Ergebnissen führt, da eine einzelne Zielkopie bei 40 Zyklen theoretisch etwa 1 Billion Amplikons liefern kann19.
SchrittTemperatur (°C)Zeit(en)Zyklen
Inaktivierung der Uracil-N-Glykosylase (UNG)501201
Denaturierung951201
Denaturierung95145
Glühen6020
Halten4∞1

Tabelle 2: Thermocyclerbedingungen für die quantitative Polymerase-Kettenreaktion. Diese Bedingungen sind auf eine bestimmte Reihe kommerzieller Genexpressionsassays abgestimmt. Es werden Standardparameter verwendet, mit Ausnahme der Erhöhung der Verstärkungszyklen von 40 auf 45.

7. Beispielhafte Volumenberechnung für qPCR

HINWEIS: Ein R-Quellcode für einen Volumenrechner für die unten beschriebenen Gleichungen ist in der Zusatzdatei 1 verfügbar. Dieser Rechner ist für die Taqman-Sonden und den Mastermix, die in der Materialtabelle aufgeführt sind.

  1. Bestimmen Sie die Anzahl der zu pipettierenden Wells und berechnen Sie einen Mindestüberschuss von 12,5 %. Diese Überschusskonstante (kÜberschuss) kompensiert Pipettierfehler und stellt sicher, dass genügend Lösung vorhanden ist. In diesem Beispiel werden 96 Wells als Ziel für die Probenvorbereitung verwendet.
    Gleichung:
    figure-protocol-1
    Beispiel:
    figure-protocol-2
    HINWEIS: Wenn 12,5 % Überschuss keine ganze Zahl ist, besteht eine einfache Möglichkeit, in den nachfolgenden Schritten "schöne" Zahlen zu gewährleisten, darin, auf die nächste Vertiefung aufzurunden und kÜberschuss entsprechend anzupassen.
  2. Berechnen Sie die Arbeits-Master-Mix-Lautstärke. In diesen Experimenten werden 1 μl cDNA und 9 μl Arbeits-Mastermix pro Vertiefung verwendet. cDNA- und Mastermix-Volumina können nach Bedarf angepasst werden.
    Gleichung:
    figure-protocol-3
    Beispiel:
    figure-protocol-4
  3. Berechnen Sie den Konzentrationsmodifikator (kConc). Dieser Modifikator wird verwendet, um einen konzentrierteren Arbeits-Mastermix zu erzeugen, der sich beim Mischen mit cDNA auf das 1-fache verdünnt.
    Gleichung:
    figure-protocol-5
    Beispiel:
    figure-protocol-6
  4. Berechnen Sie das Volumen der Sonde (20x).
    Gleichung:
    figure-protocol-7
    Beispiel:
    figure-protocol-8
  5. Berechnen Sie das Volumen des Mastermix-Materials (2x).
    Gleichung:
    figure-protocol-9
    Beispiel:
    figure-protocol-10
  6. Bringen Sie den Arbeits-Mastermix mit H2O in Molekularqualität auf das berechnete Volumen.
    Gleichung:
    figure-protocol-11
    figure-protocol-12
    figure-protocol-13
    figure-protocol-14
    figure-protocol-15
    Beispiel:
    figure-protocol-16
    figure-protocol-17
    figure-protocol-18
    figure-protocol-19
    figure-protocol-20

Ergänzende Datei 1: Ein R-Quellcode für einen Volumenrechner. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Ergebnisse

Linsenepithel und Fasern wurden von 6 bis 7 Wochen alten Wildtyp-Mäusen isoliert. Für diese Experimente wurden drei Mäuse verwendet, und 2 Linsenkapseln oder 2 Faserzellmassen von jeder Maus wurden für ein biologisches Replikat zusammengepoolt. Wie im Protokoll beschrieben, wurde die RNA mittels TRIzol-Reagenzien-Phasentrennung extrahiert. Im Durchschnitt ergab ein Paar Linsenepithel- und Fasermassen 0,8 μg (SD ± 0,2) bzw. 9,7 μg (SD ± 2,3) RNA. Die durchschnittliche Konzentration in einer 15-μl-Elution betrug 55,4 ng/μl...

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Diskussion

Die hier vorgestellten Schritte demonstrieren die Fähigkeit, RNA aus separaten Linsenkompartimenten zu isolieren, die erfolgreich in cDNA für molekularbiologische Methoden revertiert werden kann. Aufgrund der Empfindlichkeit der Analysemethoden ist es wichtig, dass die Linse in der Dissektionsphase von anhaftendem Gewebe gereinigt wird. Dies kann einige Iterationen des Rollens der Linse auf einem Kimwipe erfordern, um eine ausreichende Sauberkeit zu erreichen. Es muss darauf geachtet wer...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch das Stipendium R01 EY032056 (an CC) des National Eye Institute finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Zentrifuge und RotorFisher ScientificArtikel-Nr.: 14285554PM
Chloroform, HPLC-QualitätAlfa Aesar22920
Ethanol (190-proof)Dekon-Labore2801
Ethanol (200-prozentig)Fisher BioReagenzienNr. BP2818
Fisherbrand Pellet-StößelFisher Scientific12-141-363
Pinzette, gebogen; Schüler-Pinzette #7Welt Präzisionsinstrumente501981
Pinzette, gerade; Dumont #5Werkzeuge für die Feinwissenschaft11252-40
Pinzette, gerade; Schüler-Pinzette #4Welt Präzisionsinstrumente501978
Kimwipes, kleinKimberly-Clark34155Zartes Arbeitstuch
MicroAmp Klebefilm-ApplikatorAngewandte Biosysteme4333183
MicroAmp EnduraPlate Optische 96-Well Fast Clear Reaktionsplatte mit BarcodeAngewandte Biosysteme4483485
MikropipettenEppendorf  01-671-120
Mikroskop, PräparierenCarl ZeissSteREO Discovery.V8
MiniAmp Optische KlebeabdeckungAngewandte Biosysteme4360954
MiniAmp ThermocyclerAngewandte BiosystemeNr. A37834
MixMate Teller-Vortex-MischerEppendorf5353000529
Wasser in molekularer QualitätFisher ScientificBP28191
Nanodrop One Mikrovolumen UV-Vis SpektralphotometerThermo ScientificND-ONE-W
Nunc MicroWell MiniTraysFisher Scientific12-565-154Präparier-Tablett
PCR-RöhrchenVWR201007-012
Petrischale, 60 mm x 15 mmFisher ScientificFB0875713A
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, 1x Dulbecco'sGibco14190-136
Pipettenspitzen, 10 & Mikro; L graduiertUSA Wissenschaftlich1161-3700
Pipettenspitzen, 1250 µ L XL GraduiertUSA Wissenschaftlich1161-1720
Pipettenspitzen, 200 & micro; L-Profil graduiertUSA Wissenschaftlich1163-1700
QuantStudio 3 Echtzeit-PCR-SystemAngewandte BiosystemeNr. A28567
Reverse Transkriptase, SuperScript IV VILO Invitrogen11756050Hochprozessive und thermostabile reverse Transkriptase
RNA Clean und Concentrator 5 KitZymoZR1013
RNase-freies WasserFisher BioReagenzienNr. BP2819
RNaseZapSigmaNr. R2020RNase Dekontaminationslösung
SealRite Mikrozentrifuge 1,5 mL RöhrchenUSA Wissenschaftlich1615-5500
SuperFine Vannas 8 cmWelt Präzisionsinstrumente501778Schere
TaqMan FAST Advanced Master Mix für qPCRAngewandte Biosysteme4444557
TaqMan Genexpressionsassay (FAM) Sonde (MTO)ThermoFisher Scientific4448892
TRIzolInvitrogen15596026Säure-Guanidinium-Phenol-Lösung
Vortex-MischerThermo Scientific88880017

Referenzen

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