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Erzeugung von humanen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten planaren haartragenden Hautorganoiden unter Verwendung eines Luft-Flüssig-Grenzflächenkultursystems

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DOI:

10.3791/69088

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17. Oktober 2025

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1Department of Anatomy and Embryology, Leiden University Medical Center, 2The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW), Leiden University Medical Center, 3CEA, Inserm, IRIG, UA13 BGE, Biomics, University of Grenoble Alpes

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Hautorganoiden, die Haarfollikel aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen enthalten, unter Verwendung eines planaren, physiologisch relevanten Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkultursystems, um die Hautarchitektur und -funktion zu replizieren.

Zusammenfassung

Aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) gewonnene Hautorganoide (SOs), die Haarfollikel enthalten, stellen ein ausgeklügeltes In-vitro-Modell für die Untersuchung interzellulärer Wechselwirkungen innerhalb der Hautmikroumgebung dar. Ursprünglich in einer invertierten zystischen Konfiguration entwickelt, bei der die Dermis der Umgebung ausgesetzt ist und die Epidermis nach innen zum Organoidzentrum zeigt, können SOs anschließend in eine planare Konfiguration in einem Luft-Flüssig-Grenzflächenkultursystem (ALI) übertragen werden, das der menschlichen Hautphysiologie ähnlicher ist. Dieses Manuskript stellt ein umfassendes Protokoll zur Generierung und Selektion zystischer SOs vor, die in planare SOs zerlegt und in einem ALI-Kultursystem weiterentwickelt werden können. Das Protokoll enthält definierte Kontrollpunkte für die makroskopische qualitative Bewertung in kritischen Stadien der Organoidentwicklung, beschreibt die technischen Schritte, die zur Abflachung zystischer SOs in planare Haut erforderlich sind, spezifiziert optimale Bedingungen für die ALI-Kultur und demonstriert die Ergebnisse durch molekulare Analyse. An Tag 27 zeigte die Immunfluoreszenzfärbung mit linienspezifischen Markern ein pluristratifiziertes pigmentiertes Epithel mit Hautanhängen, einschließlich Haarfollikeln und talgdrüsenartigen Strukturen. Dieses Protokoll bietet eine robuste Methode zur Generierung von planaren SOs mit Anhängseln und bietet ein physiologisch relevantes in vitro-Modell. Dieses System unterstützt vielfältige Anwendungen in der Hautforschung und wurde bereits erfolgreich zur Modellierung von Erregerinfektionen, durch ultraviolette Strahlung induzierten Gewebeschäden und Arzneimittelreaktionen eingesetzt.

Einleitung

Die Haut bildet eine wichtige Schutzbarriere zwischen Organismen und ihrer Umwelt und reguliert gleichzeitig die Körpertemperatur, den Wasserhaushalt und die Sinneseindrücke. Es besteht aus drei Hauptschichten: der Epidermis, einem geschichteten Keratinozytenepithel mit einer verhornten Oberfläche; die Dermis, ein Bindegewebe, das reich an extrazellulärer Matrix, Fibroblasten, Nerven, Blutgefäßen und Immunzellen ist; und die Hypodermis, die hauptsächlich aus subkutanen Adipozyten besteht. Die Funktion der menschlichen Haut hängt auch von spezialisierten Anhängseln wie Haarfollikeln (HFs), Talgdrüsen und Schweißdrüsenab 1.

Hauterkrankungen gehören zu den häufigsten Erkrankungen weltweit 2,3. In der Vergangenheit wurden die meisten hautfokussierten Studien mit Tiermodellen4 durchgeführt, die die physiologische Komplexität des Organs in einem systemischen Kontext nachbilden. Signifikante Unterschiede zwischen den Spezies4 und wachsende ethische Bedenken haben jedoch die Entwicklung physiologisch relevanter menschlicher Hautmodelle vorangetrieben.

Konventionelle menschliche Hautmodelle lassen sich in zwei Kategorien einteilen: die rekonstruierte menschliche Epidermis, die aus geschichteten Keratinozyten besteht, und die rekonstruierte menschliche Haut, die zusätzlich ein darunter liegendes Hautkompartiment enthält, das aus Fibroblasten besteht, die in eine Kollagenmatrix eingebettet sind5. Obwohl beide Modelltypen unser Verständnis der Hautphysiologie erheblich verbessert haben, fehlt ihnen die volle architektonische Treue und zelluläre Vielfalt der nativen menschlichen Haut. Eine wesentliche Einschränkung dieser Modelle ist das Fehlen von Hautanhangseln wie HFs, was sie für die Forschung und Medikamententests im Zusammenhang mit Hauterkrankungen, die das Haarwachstum und die Haarregeneration betreffen, ungeeignet macht6. Es wurde zwar über fortschrittlichere Systeme mit HFs berichtet, aber sie können die Komplexität der HF-Struktur und der Mikroumgebung entweder nicht vollständig rekapitulieren oder stützen sich auf komplexe Technologien wie Bioprinting oder Mikrospritzguss 7,8,9,10.

Ein neuartiges Hautmodell, das mehrere dieser Herausforderungen angeht, ist das Hautorganoid (SO), das aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) erzeugt wird11. In Anlehnung an die Embryonalentwicklung können hiPS-Zellen auf die Linien des Schädeloberflächenektoderms und der kranialen Neuralleiste gerichtet werden und sich selbst zu zystischen Strukturen organisieren, die der menschlichen Haut sehr ähnlich sind. Diese SOs enthalten fast alle nicht-immunen Hautzelltypen, die in eine geschichtete Epidermis und eine extrazelluläre Matrix-reiche Dermis unterteilt sind. Wichtig ist, dass SOs die Entwicklung von Hautanhängseln unterstützen: HFs und Talgdrüsen. Angesichts der praktisch unbegrenzten Skalierbarkeit von hiPSCs ermöglichen SOs eine ausgeklügelte Gentechnik und die Entwicklung neuer funktioneller Werkzeuge. Als solche stellen SOs einen großen Fortschritt auf diesem Gebiet dar und sind vielversprechend für Anwendungen in der Entwicklungsbiologie, der Krankheitsmodellierung, der Arzneimitteltests und der regenerativen Medizin.

Eine erhebliche Einschränkung bleibt jedoch bestehen: SOs bilden invertierte zystische Strukturen, bei denen sich die Epidermis im Inneren der dermalen Zyste befindet, geschützt vor mechanischen Kräften und in wässriges Medium getaucht. Diese Konfiguration ist nicht nur physiologisch ungenau, sondern schließt auch die Etablierung einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche (ALI) aus. Infolgedessen sind zystische SOs nur begrenzt für Studien geeignet, die die epidermale Barriere, mechanische Kräfte oder direkte apikale Behandlungen einbeziehen. Um dieses Problem zu lösen, wird im Folgenden eine reproduzierbare Methode vorgestellt, um zystische SOs mechanisch abzuflachen und anschließend als planare Haut unter ALI-Bedingungen zu kultivieren. Dieser Ansatz, der ursprünglich von Jung et al. berichtet wurde, reorganisiert die Gewebearchitektur so, dass die apikale Epidermis der Luft ausgesetzt ist, wodurch eine weitere Schichtung und Barrierefunktion gefördertwird 12. Die so entstehenden planaren, haartragenden Organoide behalten die komplexe Architektur der menschlichen Haut bei und spiegeln gleichzeitig die physiologisch genaue Gewebeorientierung wider, was einen experimentellen Zugang zur apikalen Oberfläche ermöglicht. Obwohl das Verfahren langwierig ist (~100 Tage) und einige technisch anspruchsvolle Schritte erfordert, insbesondere bei der Zerlegung zystischer SOs in planare SOs, könnte es von besonderem Interesse für Forscher sein, die bereits mit SOs oder anderen menschlichen Hautäquivalenten arbeiten und die physiologische Relevanz ihrer Modellsysteme erhöhen möchten.

Protokoll

Abbildung 1 zeigt den Workflow für die Generierung planarer SOs unter Verwendung eines ALI-Kultursystems. Der erste Abschnitt skizziert die Generierung zystischer SOs aus hiPS-Zellen auf der Grundlage der von Karl R. Köhlerentwickelten Methodik 11, mit geringfügigen Modifikationen (Abbildung 2). Der zweite Abschnitt beschreibt das Verfahren zur Weiterentwicklung zystischer SOs zu planaren SOs unter Verwendung eines ALI-Kultursystems, wie zuvor beschrieben12, mit Modifikationen (Abbildung 3). Alle Chemikalien und Materialien sind in der Materialtabelle aufgeführt. Drei zuvor beschriebene hiPSC-Linien (LUMCi001-A, LUMCi004-A und WT2) wurden zur Erzeugung von SOs (https://hpscreg.eu/)13 verwendet.

1. Erzeugung zystischer SOs

Abbildung 2 zeigt erwartete und abweichende Morphologien bei Schlüsselschritten.

  1. Zellaggregation (Tag -2)
    1. Kultivieren Sie hiPSCs in einer Standard-6-Well-Platte, bis sie eine Konfluenz von 70-80 % erreichen.
    2. Waschen Sie die Zellen mit 1 ml Dulbecco-Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (DPBS). Fügen Sie 1 mL Zelldissoziationsreagenz (CDR) hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C mit 5% CO2 für ~6 min, um die hiPSCs zu lösen, ohne sie von der Matrix zu lösen (Überverdauung vermeiden).
    3. Aspirieren Sie die CDR und fügen Sie 1 ml hiPSC-Erhaltungsmedium (hiMM) hinzu, das 10 μM ROCK-Inhibitor enthält. Trennen Sie die Zellen vorsichtig, indem Sie mit einer P1000-Pipette auf und ab pipettieren und eine Zellsuspension bei 3,5 × 103 Zellen/ml herstellen.
    4. Geben Sie 100 μl der Zellsuspension mit einer Mehrkanalpipette in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit U-Boden und extrem geringer Anhaftung. Die Platte wird bei 110 × g 6 min bei Raumtemperatur zentrifugiert und bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert.
  2. Verdünnung des ROCK-Inhibitors (Tag -1)
    1. Bereiten Sie hiMM mit 100 μg/ml Antibiotika-Antimykotika-Supplement (AAS) vor.
    2. Geben Sie 100 μl pro Vertiefung ab und inkubieren Sie bei 37 °C mit 5 % CO2.
  3. Induktion des Oberflächenektoderms (Tag 0)
    1. Tauen Sie das entsprechende Volumen der Basalmembranmatrix auf dem Eis auf, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Bereiten Sie hiPSC-Minimalmedium (hiMinM) zu, das mit Basalmembranmatrix (2%), BMP4 (2,5 ng/ml), SB431542 (10 μM) und bFGF (4 ng/ml) (als hiMinM+SFB bezeichnet) auf Eis ergänzt wird.
      HINWEIS: Die BMP4-Konzentration muss je nach verwendeter Zelllinie möglicherweise angepasst werden (siehe Diskussion).
    2. Sammeln Sie die Zellaggregate in einem 2-ml-Röhrchen mit rundem Boden unter Verwendung einer P200-Pipettenspitze mit breiter Öffnung.
      HINWEIS: Verwenden Sie handelsübliche Spitzen mit breiter Öffnung. Wählen Sie eine Blende mit einem Innendurchmesser von mindestens 2 mm, um Schäden an den Aggregaten zu minimieren. Alternativ können Sie ein Skalpell mit einem Infrarot-Schlaufensterilisator erhitzen und damit aus einer herkömmlichen Pipettenspitze eine breite Öffnung erzeugen.
    3. Lassen Sie die Zuschlagstoffe am Boden des Rohrs absetzen. Saugen Sie das Medium vorsichtig ab und fügen Sie 2 mL hiMinM hinzu, um die Zuschlagstoffe zu waschen. Wiederholen Sie den Waschgang insgesamt 3x.
    4. Übertragen Sie die Zellaggregate in kaltem hiMinM+SFB mit einer P1000-Pipettenspitze mit breiter Öffnung in eine Vertiefung einer vorgekühlten 6-Well-Platte. Übertragen Sie dann jedes Aggregat in 100 μl hiMinM+SFB mit einer P200-Pipettenspitze mit breiter Öffnung auf eine 96-Well-Platte mit U-Boden und extrem niedriger Befestigung. Stellen Sie die Platte wieder bei 37 °C und 5 % CO2 in den Inkubator.
      HINWEIS: Verwenden Sie für diesen Schritt ein Stereomikroskop, das unter einer LAF-Haube (Laminar Airflow) platziert ist.
  4. Induktion von nicht-epithelialen Zellpopulationen (Tag 3)
    1. Bereiten Sie hiMinM vor, das LDN193189 (1 μM), bFGF (250 ng/ml) und AAS (100 μg/ml) enthält. Geben Sie 25 μl mit einer Mehrkanalpipette in jede Vertiefung.
    2. Bewegen Sie die Platte vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung des Mediums zu gewährleisten. Stellen Sie die Platte wieder bei 37 °C und 5 % CO2 in den Inkubator.
  5. Versorgung mit Nährstoffen (Tag 6)
    1. Bereiten Sie hiMinM vor, das AAS (100 μg/ml) enthält. Geben Sie 75 μl mit einer Mehrkanalpipette in jede Vertiefung.
    2. Bewegen Sie die Platte vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung des Mediums zu gewährleisten. Stellen Sie die Platte wieder bei 37 °C und 5 % CO2 in den Inkubator.
  6. Mittlere Erfrischung (Tag 8 und Tag 10)
    1. Bereiten Sie hiMinM vor, das AAS (100 μg/ml) enthält. Entnehmen Sie vorsichtig 100 μl Medium mit einer Mehrkanalpipette aus jeder Vertiefung. Geben Sie 100 μl frisches Medium mit einer Mehrkanalpipette in jede Vertiefung.
    2. Bewegen Sie die Platte vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung des Mediums zu gewährleisten. Stellen Sie die Platte wieder bei 37 °C und 5 % CO2 in den Inkubator.
  7. Umstellung auf 24-Well-Platten mit geringer Bindung (Tag 12)
    1. Tauen Sie das entsprechende Volumen der Basalmembranmatrix auf dem Eis auf, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Bereiten Sie Organoid-Reifungsmedium (OMM) mit Advanced-Medium (49 % v/v), neuronalem Basalmedium (49 % v/v), Glutamin-Supplement (1x), B-27-Supplement minus Vitamin A (0,5x), N2-Supplement (0,5x), 2-Mercaptoethanol (0,1 mM) und AAS (100 μg/ml) vor. Bereiten Sie das entsprechende Volumen kaltes OMM mit 1 % Basalmembranmatrix (OMM1 %M) vor und bewahren Sie es auf Eis auf.
      HINWEIS: Verwenden Sie persönliche Schutzausrüstung und arbeiten Sie in einem gut belüfteten Bereich, wenn Sie mit 2-Mercaptoethanol umgehen.
    2. Sammeln Sie die Zellaggregate in einem 2-ml-Röhrchen mit rundem Boden unter Verwendung einer P1000-Pipettenspitze mit breiter Öffnung.
    3. Lassen Sie die Zuschlagstoffe am Boden des Rohrs absetzen. Saugen Sie das Medium vorsichtig an. Fügen Sie 1,5 ml Advanced Medium hinzu, um die Zuschlagstoffe zu waschen. Wiederholen Sie den Waschgang insgesamt 3x.
    4. Übertragen Sie die Zellaggregate in kaltem OMM1%M mit einer P1000-Pipettenspitze mit breiter Öffnung in eine Vertiefung einer vorgekühlten 6-Well-Platte. Übertragen Sie dann jedes Aggregat in 500 μl OMM1 %M mit einer P1000-Pipettenspitze mit breiter Öffnung auf eine 24-Well-Platte mit niedrigem Aufsatz. Stellen Sie die Platte wieder bei 37 °C und 5 % CO2 in den Inkubator.
      HINWEIS: Verwenden Sie für diesen Schritt ein Stereomikroskop, das unter einer LAF-Haube platziert ist.
  8. Mittlere Erfrischung (Tag 15)
    1. Tauen Sie das entsprechende Volumen der Basalmembranmatrix auf dem Eis auf, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Bereiten Sie die entsprechende Menge kaltes OMM1%M vor. Auf Eis legen.
    2. Entfernen Sie mit P1000-Spitzen vorsichtig 250 μl Medium aus jeder Vertiefung. Geben Sie dann 250 μl OMM1%M in jede Vertiefung. Die Platte wird wieder bei 37 °C mit 5 % CO2 auf einen auf 65 U/min eingestellten Orbitalschüttler in den Inkubator gestellt.
  9. Führen Sie zwischen Tag 18 und Tag 45 montags, mittwochs und freitags einen halben Medienwechsel (250 μl) mit OMM durch.
  10. Führen Sie zwischen Tag 45 und Tag 90 montags und mittwochs einen halben Medienwechsel (250 μl) mit OMM und freitags einen vollständigen Medienwechsel durch.

2. Übergang von zystischen SOs zu planaren SOs

HINWEIS: Zystische SOs weisen eine umgekehrte Morphologie auf, wobei die Epidermis nach innen zum Zentrum des Organoids zeigt und die Dermis in Kontakt mit der äußeren Umgebung steht. Zwischen dem 70. und 90. Tag ist die frühe suprabasale Differenzierung der Epidermis je nach Zelllinie und Differenzierungseffizienz weit fortgeschritten und es bilden sich Haarklammern. Dies ist das Stadium, in dem die zystischen SOs in ein ALI-Kultursystem überführt werden, um Gewebe zu erhalten, das der nativen menschlichen Haut ähnlicher ist.

  1. Auswahl zystischer SOs zwischen Tag 70 und Tag 90 für den Übergang zu planaren SOs
    1. Auswahl zystische SOs mit einem Durchmesser von mindestens 5 mm und minimalem Nebenproduktgehalt (mesenchymale Zellen, die sich an einem Pol der Zyste ansammeln und auch Knorpel enthalten können). Verwenden Sie das Vorhandensein von Haarplakoden/-stiften als Qualitätsindikator für die Entwicklung von Hautorganoiden (Abbildung 1A und Abbildung 2B).
      HINWEIS: Glätten Sie 2-4 planare SOs von jedem zystischen SO, abhängig von ihrer Größe.
  2. Vorbereitung des kollagenbeschichteten Einsatzes (12-Well-Format)
    1. Bereiten Sie eine NaOH-Lösung (1 M) vor, indem Sie die entsprechende Menge NaOH-Pellets in destilliertem Wasser auflösen. Sterilisieren Sie die NaOH-Lösung mit einem Membranfilter mit einer Porengröße von 0,2 μm.
      HINWEIS: Verwenden Sie persönliche Schutzausrüstung und arbeiten Sie in einem gut belüfteten Bereich, wenn Sie die NaOH-Lösung (1 M) manipulieren.
    2. Verdünnen Sie die Kollagen-Typ-I-Lösung auf Eis auf eine Endkonzentration von 2 mg/ml mit 10x PBS (bis zu einer endgültigen 1x-Konzentration), NaOH (5 mM) und destilliertem Wasser, um das endgültige Volumen einzustellen. Verteilen Sie 150 μl der Kollagenlösung in jedem Einsatz, der in eine Standard-12-Well-Platte gelegt wird. Inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang bei 37 °C, damit das Kollagengel polymerisieren kann.
  3. Abflachung der zystischen SO (Abbildung 3)
    HINWEIS: Verwenden Sie für diesen Schritt ein Stereomikroskop, das unter einer LAF-Haube platziert ist.
    1. Geben Sie die ausgewählte zystische SO mit einer kleinen Menge Medium mit einer P1000-Pipette mit breiter Öffnung auf den Deckel einer 10-cm-Petrischale. Die Nebenprodukte der SO werden vorsichtig mit einem sterilen Skalpell herausgeschnitten. Verwenden Sie eine sterile Pinzette auf der gegenüberliegenden Seite, um das Organoid während der Exzision zu stabilisieren (Abbildung 3A).
      HINWEIS: In diesem Stadium ähnelt die zystische SO einem entleerten Ballon mit zwei Hautschichten, die übereinander angeordnet sind.
    2. Mit einem Skalpell etwa 1 mm von den Enden des Organoids neben dem ersten Schnitt exzidieren (Abbildung 3B, F). Entfalten Sie die obere Hautschicht vorsichtig mit einer sterilen Pinzette (Abbildung 3C,G).
    3. Schneide das Stück Taschentuch je nach Größe in 2-4 Stücke. Übertragen Sie jedes Gewebestück vorsichtig und legen Sie es mit einer sterilen Pinzette mit der Epidermis nach oben auf einen kollagenbeschichteten Einsatz (Abbildung 3D, H).
      HINWEIS: Beurteilen Sie die Stifte unter einem Stereomikroskop, um die korrekte Ausrichtung der Epidermis sicherzustellen.
    4. Übertragen Sie den Einsatz zurück auf eine Standard-12-Well-Platte mit 600 μl OMM. Stellen Sie die Platte wieder bei 37 °C und 5 % CO2 in den Inkubator (Abbildung 3E).
  4. Langfristige Wartung der Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkultur
    1. Führen Sie zwischen Tag 1 und Tag 21 nach der Abflachung montags, mittwochs und freitags einen vollständigen Medienwechsel (600 μl) mit OMM durch. Stellen Sie die Platte bei 37 °C mit 5 % CO2 und 95 % relativer Luftfeuchtigkeit wieder in den Inkubator.
    2. Legen Sie die Platte zwischen dem 21. und 27. Tag nach dem Glätten in einen Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2 ohne Feuchtigkeit, um die Hautbarriere zu stärken. Führen Sie täglich einen vollständigen Medienwechsel (800 μl) mit OMM durch.

Ergebnisse

Die Optimierung und die Checkpoints für die Erzeugung zystischer SOs wurden ausführlich beschrieben14. Die hier vorgestellte Methode konzentriert sich daher auf die wichtigsten Kontrollpunkte, die während der Entwicklung zystischer Organoide zu bewerten sind (Abbildung 2A), die Auswahl derjenigen, die für den Übergang in planare SOs geeignet sind (Abbildung 2B), und die Kriterien, die zur Bewertung der Qualität der resultierenden planaren SOs verwendet werden (Abbildung 1B-D und Abbildung 4).

Der erste wichtige Schritt bei der Entwicklung zystischer SOs ist die Bildung eines einzelnen, dichten zellulären Aggregats, das die Mehrheit der Zellen umfasst, die an Tag 0 in der Vertiefung vorhanden sind (Abbildung 2A). Dies wird durch eine sorgfältige und schnelle Handhabung der hiPS-Zellen in Kombination mit einer effizienten Zentrifugation erreicht, was zu einer homogenen Verteilung der Zellen in der Mitte der Vertiefung führt (Abbildung 2A, Tag -2). Die richtige Induktion des Oberflächenektoderms führt zur Bildung eines dünnen, klaren Epithels auf der äußersten Schicht des Aggregats bis zum Tag 3 (Abbildung 2A), das sich anschließend nach der Induktion mesenchymaler Zellen bis zum 8. Tag zu transparenten zystischen Aggregaten entwickelt, die einen dunklen Kern aus mesenchymalen Zellen enthalten. Zwischen dem 12. und 20. Tag wird die Epithelzyste von einer dünnen Schicht mesenchymaler Zellen bedeckt, die sich an einem Pol der Zyste ansammeln (Abbildung 2A, Tag 12). Die erfolgreiche Co-Induktion von Epithel- und Mesenchymzellen führt schließlich zu einem geschichteten Epithel, das die Bildung von Haarplakoden und -stiften ermöglicht, die zwischen dem 50. und 80. Tag sichtbar werden (Abbildung 2A,B). Durch die Auswahl geeigneter SOs auf der Grundlage dieser Entwicklungs-Checkpoints kann die morphologische und Größenvariabilität zum Zeitpunkt des Übergangs zu planaren SOs minimiert werden.

Das Vorhandensein von Haarplakoden oder -pegs ist das primäre Einschlusskriterium für die Selektion zystischer SOs für die Weiterentwicklung zu planaren SOs. Das Fehlen sichtbarer Plakoden resultiert in der Regel aus einem Defekt in der epidermalen Schichtung, die dann extrem dünn erscheint (Abbildung 2B, Tag 50, mittleres Bild). Für die Abflachung werden nur große Zysten (mindestens 5 mm Durchmesser) mit Nebenprodukten, die an einem Pol konzentriert sind, und insgesamt minimalen Nebenprodukten verwendet, während solche mit nicht polarisierten Nebenprodukten ausgeschlossen werden (Abbildung 2B).

Sobald sie sich in ihrer planaren Konfiguration befinden, beruht die primäre Qualitätsprüfung von SOs auf der makroskopischen Überwachung des HF-Wachstums unter einem Stereomikroskop. HFs verlängern sich im Laufe der 27 Tage der ALI-Kultur fortschreitend, wobei die Talgdrüsen um den 14. Tag herum sichtbar werden und die Pigmentierung im Laufe der Zeit allmählich zunimmt (Abbildung 1B, C). Aufgrund der räumlichen Einschränkungen, die durch die Insertionsmembran auferlegt werden, die direkt unter dem dünnen Kollagengel liegt, können nur HFs, die sich an der Peripherie des planaren SO befinden, vollständig wachsen, und zwar in einer Orientierung parallel zum Insert (Abbildung 1C). Bemerkenswert ist, dass der Haarschaft selten über die Hautoberfläche hinausragt. Um die Qualität der entwickelten planaren SOs weiter zu beurteilen, können sie in Paraffin oder OCT eingebettet, geschnitten und gefärbt werden, um ihre Zusammensetzung und Morphologie zu untersuchen. Die H&E-Färbung zeigt, dass ihre Struktur der menschlichen Haut sehr ähnlich ist (Abbildung 4A), mit einem vollständig geschichteten Epithel und einer Dermis, die durch eine Basalmembran getrennt sind. Die Immunfluoreszenzfärbung mit spezifischen Markern für die verschiedenen Epidermisschichten, Talgdrüsen und Melanozyten bestätigt die menschliche hautähnliche Gewebearchitektur der planaren SOs (Abbildung 1D und Abbildung 4B).

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Abbildung 1: Arbeitsablauf zur Generierung von planaren SOs, die HFs aus hiPSCs enthalten, unter Verwendung eines ALI-Kultursystems. Es werden schematische Darstellungen und repräsentative Bilder der wichtigsten Schritte gezeigt. (A) Bildung von zystischen SOs, im Wesentlichen wie zuvor beschrieben10, bis sich um Tag 80 herum sichtbare Haarplakoden/-stifte bilden. (B) Zystische SOs werden mit der Epidermisseite nach oben auf einem mit Kollagen beschichteten Zellkultureinsatz vom Typ I eingeschnitten und abgeflacht. ALI-Kulturen werden 21 Tage lang unter befeuchteten Bedingungen aufbewahrt, gefolgt von 6 Tagen unter trockenen Bedingungen. (C) Ansicht einer in (B) gezeigten Region mit hoher Vergrößerung, die das Wachstum der Haarfollikel, die Entwicklung der talgdrüsenartigen Struktur (Pfeilspitzen) und die fortschreitende Pigmentierung im Laufe der Zeit zeigt. (D) Konfokale Bilder von planaren SO-Schnitten an Tag 27 nach der Abflachung, markiert mit Anti-Typ-IV-Kollagen-Antikörpern zusammen mit entweder Nilrot, das talgdrüsenähnliche Strukturen markiert, oder Anti-PMEL-Antikörper, der Melanozyten färbt. Die Zellkerne werden mit DAPI gegengefärbt. Maßstabsleisten: 200 μm (A); 500 μm (B,C); 50 μm (D). Abkürzungen: SOs = Hautorganoide; HFs = Haarfollikel; hiPSCs = humane induzierte pluripotente Stammzellen; ALI = Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche; Col IV = Kollagen Typ IV; PMEL = Prämelanasomenprotein; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Repräsentative Bilder der Morphologie von Zellaggregaten bei Schlüsselschritten während der SO-Produktion. (A) Repräsentative Bilder von zystischen SOs mit geeigneten (linkes Bild) und unzureichenden (mittleres und rechtes Bild) Morphologien in verschiedenen Stadien. An Tag -2 sollten die Zellaggregate eine gleichmäßige Verteilung aufweisen (linkes Bild), während eine unsachgemäße Handhabung der Platte nach der Zentrifugation die Zellverteilung stören kann (rechtes Bild). An Tag 0 erscheinen wohlgeformte Aggregate als kompakte, dichte zelluläre Cluster (linkes Bild), während eine geringe Zellviabilität zu einem weit verbreiteten Zelltod und Verlust der kompakten 3D-Strukturen führt (rechtes Bild). An Tag 3 wird eine deutliche äußere Epithelschicht sichtbar (linkes Bild), deren Fehlen darauf hindeuten könnte, dass die BMP4-Konzentration optimiert werden muss (rechtes Bild). An Tag 12 akkumulieren sich mesenchymale Zellen an einem Pol und wandern, um die Epithelzyste zu umhüllen (linkes Bild), während eine übermäßige epitheliale (mittleres Feld) oder mesenchymale (rechtes Bild) Differenzierung die korrekte epitheliale Stratifizierung behindert. An Tag 50 zeigen die SOs eine bipolare Morphologie mit zystischer Haut auf der einen Seite und Nebenprodukten, hauptsächlich Knorpel, auf der anderen Seite (linkes Bild). Eine übermäßige epitheliale (mittleres Feld) oder mesenchymale (rechtes Bild) Differenzierung behindert die richtige Hautentwicklung. (B) Repräsentative Bilder von zystischen SOs mit sichtbaren Haarklammern um den 80. Tag. Beachten Sie den variablen Anteil von Nebenprodukten (links neben der gestrichelten Kurve) im Verhältnis zur Haut. Die drei Panels ganz links erlauben die Erzeugung von 2-4 planaren SOs, während das Panel ganz rechts ein SO von unzureichender Qualität für die Abflachung zeigt. Maßstabsleisten: 500 μm für Tag -2, Tag 50 und Tag 80; 200 μm für Tag 0, Tag 3 und Tag 12. Abkürzung: SO = Hautorganoid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Schematische Darstellung der technischen Schritte zur Herstellung planarer SOs. Führen Sie die Abflachung von zystischen SOs unter einem Stereomikroskop in einer LAF-Haube durch. (A) Der Pol, an dem sich Nebenprodukte aus der zystischen SO ansammeln, wird mit einem sterilen Skalpell herausgeschnitten. (B) Trimmen Sie die oberen und unteren Extremitäten des SO, um die Gewebeentfaltung zu erleichtern. (C) Schneiden Sie das planare Gewebe in 2-4 Stücke. Übertragen und glätten Sie jedes Stück mit der epidermalen Seite nach oben mit einer sterilen Pinzette auf eine kollagenbeschichtete Einlage. (D) Setzen Sie den Kultureinsatz mit dem abgeflachten Gewebe in eine Standard-12-Well-Platte mit 600 μl Medium ein. (E) Die Platte wird bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert. (F) Schematische Queransicht des in (B) dargestellten Hautorganoids. (G) Schematische Querschnittsansicht des in (C) dargestellten Hautorganoids. (H) Bild einer planaren SO, die auf ein Typ-I-Kollagengel aufgebracht wurde, das auf einen Zellkultureinsatz gegossen wurde, der in einer 12-Well-Platte mit 600 μl Medium positioniert war. Abkürzungen: SO = Hautorganoid; LAF = laminare Luftströmung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Charakterisierung von hiPSC-abgeleiteten planaren SOs. (A) Repräsentative Hellfeldbilder von H&E-gefärbtem planarem SO an den Tagen 1 und 27 nach der Abflachung. Am 27. Tag zeigen die planaren SOs eine Hautreifung mit einer pluristratifizierten Epidermis und HFs, die talgdrüsenartige Strukturen (Pfeilspitzen) enthalten. (B) Konfokale Bilder von planaren SO-Schnitten, die mit Anti-β4-Integrin und entweder Anti-Keratin 10- oder Anti-Loricrin-Antikörpern gefärbt wurden, zeigen eine frühe suprabasale Differenzierung (KRT10+ -Zellen) an Tag 1 und eine späte Differenzierung (LOR+ -Schicht) an Tag 27. Die Zellkerne werden mit DAPI gegengefärbt. Maßstabsleisten: 50 μm (A); 100 μm (B). Abkürzungen: SO = Hautorganoid; hiPSC = humane induzierte pluripotente Stammzelle; H&E = Hämatoxylin und Eosin; β4 = B4 Integrin; KRT10 = Keratin 10; LOR = Loricrin; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll überwindet eine wesentliche Einschränkung des zystischen SO-Systems, indem es die native Gewebeorientierung und -umgebung durch Gewebeabflachung und Exposition der apikalen Epidermis gegenüber Luft wiederherstellt. Diese Methode bewahrt die intrinsische zelluläre und strukturelle Komplexität des Organoids, fördert die physiologisch relevante Organisation und ermöglicht einen direkten Zugang zur pluristratifizierten Epidermisoberfläche für experimentelle Manipulationen.

Mehrere Schritte im Protokoll sind entscheidend für das Erreichen hochwertiger planarer SOs, beginnend mit der Generierung hochwertiger zystischer SOs. Wichtige Qualitätskontrollprüfungen und mögliche Protokolländerungspunkte wurden vor12 ausführlich beschrieben. Kurz gesagt, der Ausgangspunkt sollten gut gepflegte, undifferenzierte hiPSC-Kulturen mit einer Konfluenz von 70-80 % sein, die dicht gepackte Zellen mit einem hohen Kern-zu-Zytoplasma-Verhältnis aufweisen. Die Erzeugung zystischer SOs erfordert eine präzise Modulation des BMP4-Signalwegs während der Induktion des Oberflächenektoderms12. Da die BMP4-Sensitivität zwischen den hiPSC-Linien variieren kann, kann eine Titration erforderlich sein, um optimale Ergebnisse zu erzielen. Es wird empfohlen, BMP4-Konzentrationen zwischen 2,5 und 15 ng/ml zu testen, da keine erfolgreichen Fälle außerhalb dieses Bereichs gemeldet wurden. Die Konsistenz der Reagenzienquelle ist ebenfalls wichtig. Daher sollten Massenbestände von einem einzigen Lieferanten unter den empfohlenen Bedingungen vorbereitet und gelagert und vor ihrem Verfallsdatum verwendet werden, um die volle biologische Aktivität zu gewährleisten und die Variabilität zu minimieren.

Die Auswahl zystischer SOs mit geeigneter Morphologie und Größe ist entscheidend für eine erfolgreiche SO-Abflachung. Die Reifung von zystischen SOs und folglich die Bildung von Stiften und Haarplakoden kann zwischen den hiPSC-Linien variieren, daher kann der Zeitpunkt der Abflachung zwischen Tag 70 und Tag 90 liegen. Die Zugabe von CHIR99021, einem GSK3-Inhibitor und WNT-Signalagonisten, an Tag 3 der zystischen SO-Bildung kann in Betracht gezogen werden, da gezeigt wurde, dass es die Organoidgröße erhöht und die Knorpelbildung reduziert, indem es die Proliferation fördert und die Neuralleistenmigration hemmt12. Obwohl vielversprechend, haben wir bei dieser Modifikation in unseren Kulturen keine konsistenten Ergebnisse beobachtet.

Der Abflachungsprozess erfordert manuelles Geschick und Vertrautheit mit dem Gewebe. Insbesondere bei der Übertragung des Hautfragments auf die beschichtete Einlage muss auf eine korrekte Gewebeausrichtung geachtet werden. Es empfiehlt sich, die Ausrichtung mit einer feinen Pinzette unter einem Stereomikroskop zu überprüfen und das Gewebe vorsichtig zu justieren, bis die apikale Seite nach oben zeigt. Bei richtiger Positionierung sollten Stifte/Haarplakoden nach unten zeigen. Nach dem Transfer von planaren SOs in die ALI-Kultur zeigen die HFs in der Regel innerhalb weniger Tage ein auffälliges Wachstum und eine Pigmentierung des Haarschafts.

Die Haupteinschränkungen des beschriebenen Modells sind der Zeitaufwand und der hohe Wartungsaufwand sowie die Unreife des Modells. Die Entwicklung von zystischen SOs, die mit Haarklammern ausgestattet sind, dauert zwischen 70 und 90 Tagen und wird von einer 4-wöchigen ALI-Kultur gefolgt. Dieser verlängerte Zeitrahmen, kombiniert mit einem aufwendigen Abflachungsverfahren, macht das System weniger geeignet für Anwendungen mit hohem Durchsatz, insbesondere im Vergleich zu kommerziell erhältlichen Äquivalenten aus der menschlichen Haut. Während kleinere Optimierungen die Kulturzeit leicht verkürzen können, ist eine wesentliche Reduzierung unwahrscheinlich. Die hohe zelluläre und strukturelle Diversität der Haut hängt von einer komplexen Abfolge epithelial-mesenchymaler Wechselwirkungen und mechanischer Signale ab, die wahrscheinlich nicht durch die Zugabe exogener Faktoren in vitro beschleunigt werden können 15,16,17,18. Die Bildung von zystischen SOs und deren Fortschreiten in die planare Form erfordern ein hohes Maß an Erhaltung. Eine der handhabungsintensivsten Perioden - abgesehen von den ersten 18 Tagen der zystischen Kultur - tritt auf, wenn planare SOs in einer Atmosphäre mit niedriger Luftfeuchtigkeit gehalten werden und täglich mit dem Medium aufgefüllt werden müssen. Ähnlich wie bei anderen hiPSC-abgeleiteten Modellen behalten SOs in vitro einen fötalen Phänotyp bei. Darüber hinaus fehlen Schweißdrüsen und Arrector-Pili-Muskeln in SOs14 weitgehend, wahrscheinlich aufgrund des Mangels an Vaskularisation, Immunzellen und mechanischen Kräften wie Scherspannung, Dehnung und Reibung - die alle für eine ordnungsgemäße Reifung unerlässlich sind 15,16,17,18,19. Einige dieser Einschränkungen können durch eine Erhöhung der Komplexität des Modells behoben werden. Die Co-Kultur mit autologen hiPSC-abgeleiteten Makrophagen17, die Integration eines Perfusionssystems9 oder die Anwendung von mechanischer Dehnung17 können zur Förderung der Modellreife beitragen20,21.

Es ist zu beachten, dass das Transwell-Insert-Format das Abwärtswachstum von HFs in den planaren SOs etwas einschränkt. Infolgedessen neigen HFs dazu, sich seitlich auszubreiten und können der Luft ausgesetzt werden. Da HFs in vivo normalerweise in der Haut geschützt sind, sollte dies bei der Planung von Experimenten berücksichtigt werden. Die Modifikation der Einlegebeschichtung durch Auftragen einer dickeren Hydrogelschicht kann helfen, dieses Problem zu mildern. Darüber hinaus ragen Haarschäfte bei diesem Modell selten über die Hautoberfläche hinaus. Unsere Beobachtungen deuten darauf hin, dass HFs in planaren SOs bis zum Tag 27 der ALI-Kultur im Anagen, der aktiven Wachstumsphase, verbleiben. Angesichts der verlängerten Dauer von Anagen in menschlichen HFs ist dies nicht ganz unerwartet. Obwohl eine langfristige Kultur den Phasenübergang schließlich unterstützen kann, ist dies unwahrscheinlich, da es keine systemischen Hinweise gibt. Die Identifizierung und Ergänzung der molekularen Signale, die für den Follikelzyklus erforderlich sind, kann eine künstliche Induktion der Katagen- und Telogenphase ermöglichen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Protokoll zur Generierung planarer SOs eine breite Palette von experimentellen Ansätzen ermöglicht, die bei zystischen SO nicht durchführbar oder relevant sind. Planare SOs wurden bereits erfolgreich zur Modellierung von bakteriellen11 und viralen Infektionen22, durch ultraviolette Strahlung induzierten Gewebeschäden22 und damit verbundenen Arzneimittelreaktioneneingesetzt 12,22,23. Die Möglichkeit, auf die apikale Oberfläche eines physiologisch relevanten, komplexen Hautäquivalents zuzugreifen, stellt einen wesentlichen Fortschritt für das Fachgebiet dar und öffnet die Tür zu einer Vielzahl neuartiger Anwendungen in der Hautforschung.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Danksagungen

Wir danken unseren Kollegen vom hiPSC Hotel, Leiden University Medical Center, für die Bereitstellung von hiPSC-Leitungen. Diese Arbeit wurde unterstützt vom Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine, unterstützt von der Novo Nordisk Foundation, Dänemark (Fördernummer NNF21CC0073729) an K.R. K.R. ist Chargé de Recherche am Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Fortgeschrittenes DMEM/F12Thermo Fisher Scientific#12634010im Text als Advanced Medium bezeichnet.
ALK5, Inhib. TGFb Typ 1, SB431542Tocris Bioscience#1614Aliquot, Laden Sie bei -20 &°F ein; C and  Bleiben Sie bei 4 & Grad; C für maximal 7 Tage 
Anti-CD104-Rattenmonoklonaler 439-9B-AntikörperBD Biosciences#555719NA
Antikollagen-Typ-IV-Polyklonaler AntikörperMerckMillipore#Ab769NA
Anti-Cytokeratin 10 polyklonaler KaninchenantikörperBiolegende#905401NA
Anti-lorricrin-Kaninchen-Polyklonaler AntikörperBiolegende#905101NA
anti-PMEL-Maus-monoklonaler AntikörperNovus Biologicals#NBP2-29407 NA
B-27-Präparat ohne Vitamin AThermo Fisher Scientific#12587010Aliquot, Laden Sie bei -20 &°F ein; C 
Zellkultur-EinsätzeGreiner Bio-one#66564112-Well, Porengröße 0,4 & Mikro; m; transparent (48 Einsätze pro Box) ; https://shop.gbo.com/en/row/products/bioscience/3d-cell-culture/thincert/3d-thincert-cell-culture-inserts/665641.html
Kollagen Typ ICorning#354249Lagerlösung auf 4 °F halten; C
Einwegskalpell steril 0507 Nr. 21Swann Morton#0507NA
Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS)Thermo Fisher Scientific#14190094NA
Essential 6 (E6) MediumThermo Fisher Scientific#A1516401bezeichnet als hiPSC Minimalmedium (hiMinM)  im Text.
FasudilLC Labs#F-4660Aliquot eine 1000-fache Lagerlösung und lagere bei -20 °C. Nach dem Auftauen bei 4 & Grad; C für maximal 14 Tage 
Sanfte Zelldissoziation  ReagenzStemcell-Technologien#100-0485NA
GlutaMAX-ErgänzungsmittelThermo Fisher Scientific#35050038NA
Menschliche FGF-2 Basis-Prenium-QualitätMiltenyi Biotec#130-093-842Aliquot, lagern Sie bei -80 °C; C and  Bleiben Sie bei 4 & Grad; C für maximal 7 Tage 
LDN 193189 DihydrochloridTocris#6053Aliquot, lichtempfindlich, bei -20 °C gelagert; C 
Matrigel Growth Factor reduzierte BasementmembranmatrixCorning#354230Aliquot, Laden Sie bei -20 &°F ein; C and  Bleiben Sie bei 4 & Grad; C für maximal 7 Tage 
2-MercaptoethanolThermo Fisher Scientific#21985023Gefährliche Substanzen, giftige, korrosive, reizende, Gesundheits- und Umweltgefahr.
NaOHMerck#567530-250MGGefährliche Substanz, ätzend und reizend. Bereite spontan eine Lösung vor.
NeurobasalmediumThermo Fisher Scientific#21103049bezeichnet als Neuralbasalmedium  im Text.
Normocin 50 mg/mlInvivogen#ant-nr-1Im Test wird es als antibiotisch-antimykotisches Präparat bezeichnet. Aliquot, Laden Sie bei -20 &°F ein; C and  Bleiben Sie bei 4 & Grad; C für maximal 14 Tage 
Nunclon Sphera 96-WellU-Bottom MikroplatteThermo Fisher Scientific#174929NA
Nunclon Sphera 174930 24-Brunnen-MultidishThermo Fisher Scientific#174930NA
N2-ErgänzungThermo Fisher Scientific#17502048Aliquot, Laden Sie bei -20 & Grad ein; C 
OrbitalshakerThermo Fisher Scientific#88881102NA
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher Scientific#15070063NA
Rekombinantes humanes BMP4-ProteinR& D-Systeme#314-BP-010Aliquot, lagern Sie bei -80 °C; C and  Bleiben Sie bei 4 & Grad; C für maximal 7 Tage 
StemFlex (SF) MediumThermo Fisher Scientific#A3349401bezeichnet als hiPSC Maintenance Medium (hiMM)  im Text.
SteriMax smart - Infrarot-Loop-SterilisatorWLD-TEC#4.002.000 Wahlfrei
PinzetteMerck#T4537-1EAStil 5; Feinnadelscharfer, antimagnetischer Edelstahl
VitronektinStemcell-Technologien#07180NA

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Induzierte pluripotente StammzellenHaarfollikelbildungplanare Haut OrganoideImmunfluoreszenzf rbungepidermale Differenzierungmesenchymale InduktionTalgdr senIn vitro Hautmodell

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