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Methodenartikel

Automatisierte Analyse von C. elegans-Fluoreszenzbildern mit SegElegans

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DOI:

10.3791/69094

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10. Oktober 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Basic Sciences, Faculty of Medicine, University of Crete, 2Institute of Molecular Biology and Biotechnology, Foundation for Research and Technology-Hellas, 3Instituto de Automática e Informática Industrial, Universitat Politècnica de València

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier finden Sie eine Anleitung zur effektiven Nutzung von SegElegans, einem von uns entwickelten Deep-Learning-System zur automatisierten Segmentierung einzelner Würmer in Weitfeldmikroskopiebildern, für die anschließende Verwendung in Bildanalysesoftware wie ImageJ. Wir bieten Möglichkeiten, das System sowohl online als auch offline zu nutzen.

Zusammenfassung

Die Mikroskopie, insbesondere die fluoreszierende Art, ist ein häufig verwendetes Werkzeug in der C. elegans-Forschung . Die Analyse von Daten aus Mikroskopie-Experimenten kann jedoch recht mühsam und zeitaufwändig sein. Daher ist eine Automatisierung wünschenswert. Wir haben SegElegans entwickelt, ein zweiköpfiges U-Net-basiertes Convolutional Neural Network-System, das speziell für die automatisierte Segmentierung von Würmern entwickelt wurde, selbst in Bildern mit einer großen Anzahl von sich berührenden oder überlappenden Individuen. Der erste Teil von SegElegans besteht aus einem Encoder und zwei Decodern. Der Encoder, der auf dem SmaAt AT-Modell basiert, wendet doppelte Faltungsschichten an, gefolgt von einem Convolutional Block Attention Module (CBAM). Beide Decoder verwenden Convolutional LSTMs: Einer führt eine semantische Segmentierung von Wurmbildern (Körper, Kante, Hintergrund oder Überlappung) durch, während der andere ein lineares Skelett entlang jedes Wurms extrahiert. Der zweite Teil ist ein Nachbearbeitungsalgorithmus, der die Ausgaben der beiden Decoder kombiniert und sie verwendet, um genaue Instanzsegmentierungen zu erzeugen. Diese Segmentierungen können dann in ImageJ oder andere geeignete Bildanalysetools eingespeist werden. Hier finden Sie Anweisungen zum Zugriff auf und zum Ausführen dieses Systems. Wir bieten eine Online-, Cloud-Computing-basierte Implementierung sowie zwei Methoden, um die SegElegans-Modelle offline, auf einem lokalen Rechner, zu verwenden, falls die erforderliche Hardware verfügbar ist.

Einleitung

Caenorhabditis elegans ist ein eukaryotischer Modellorganismus mit breiter Anwendung in der Zell- und Molekularbiologie 1,2,3. Es handelt sich um einen kleinen (~1 mm für erwachsene Wildtyp) bodenlebenden Fadenwurm mit einem schnellen Lebenszyklus (~drei Wochen) und einer großen Anzahl von Nachkommen (typischerweise genetisch identisch mit dem selbstbefruchtenden hermaphroditischen Elternteil). Trotz seiner relativen Einfachheit ist das Tier immer noch ein komplexer mehrzelliger Organismus mit definierten und unterschiedlichen Geweben und Organen, der dank seiner geringen Größe und Transparenz in vivo untersucht werden kann, ohne dass Fixierungen oder andere invasive Behandlungen erforderlich sind4. Die Fähigkeit des Wurms für In-vivo-Studien durch Mikroskopie kann durch die Verwendung von Fluoreszenzreportern weiter verstärkt werden, die die einfache Unterscheidung einzelner Zellen oder sogar die direkte Visualisierung von subzellulären Organellen/Komponenten wie Mitochondrien, Lipidtröpfchen oder Proteinaggregaten und von Prozessen wie Signaltransduktion, Genexpression, Vesikelfusion, Autophagie, neuronale und Muskelaktionspotentiale usw.5,6,7,8,9,10,11. Darüber hinaus ist der Fadenwurm auch sehr anfällig für genetische Manipulationen durch Mutagenese12, Transgenese durch Mikroinjektion oder Mikropartikelbeschuss13, CRISPR-Editierung14 und vor allem, wenn es um ein einfaches und kostengünstiges genetisches Screening geht, RNAi15. Diese Manipulation ermöglicht es, Gene und ihre Rolle im Fadenwurm selbst umfassend zu untersuchen und gleichzeitig dank der signifikanten genetischen Homologie, die C. elegans zu anderen Modellorganismen aufweist, grundlegende Entdeckungen zu machen, die bis hin zum Menschen relevant sind16,17. Schließlich macht diese Homologie/Konservierung den Wurm auch zu einem idealen ersten Testgelände für Arzneimittel und chemische Wirkstoffe, das die Aufklärung der Mechanismen der Arzneimittelaktivität, die Identifizierung potenzieller aktivitätsmodifizierender genetischer Variationen und die Entdeckung potenzieller unerwünschter Wechselwirkungen und Off-Target-Effekte ermöglicht 18,19,20.

All die oben genannten Vorteile haben C. elegans zu einem attraktiven Modell für zell- und molekularbiologische Studien gemacht, insbesondere für Wissenschaftler, die sich für die In-vivo- und oft Echtzeit-Überwachung von Prozessen mittels Mikroskopie interessieren. Solche Studien beinhalten in der Regel einen erheblichen Aufwand an Bildanalyse durch spezielle Software, wobei die am weitesten verbreitete Option ImageJ 21,22,23 ist. Ein gemeinsames Merkmal der Analyse mit einer solchen Software ist die Notwendigkeit, dass der Benutzer/Forscher die für die Analyse relevanten Regionen (ROIs) mithilfe von Auswahlwerkzeugen spezifiziert. Sehr häufig wird jeder einzelne Wurm in einem Bild als sein eigener ROI ausgewählt, mit dem Ziel, Informationen pro Wurm über einfache morphologische Merkmale (wie Körperabmessungen) oder "fortgeschrittenere" experimentelle Messwerte wie die Expressionsniveaus eines Gens (gemessen mit einem fluoreszierenden Reporter), die Auslesung eines ratiometrischen Reporters, die Anzahl und Größe von Lipidtröpfchen zu erhalten, die Bildung von Proteinaggregaten, die Morphologie einzelner Organellen und ihrer Netzwerke usw.5,8,10,24,25,26,27. Diese Auswahl pro Wurm wird in der Regel manuell getroffen, da automatische Auswahlmethoden, die auf Standard-Bildverarbeitungsalgorithmen basieren, in der Regel nicht in der Lage sind, die Formen und Merkmale des Wurms zu unterscheiden, insbesondere in Dunkelfeldbildern, bei denen die Umrisse der Würmer nicht klar sichtbar sind, oder in Hellfeldbildern mit einer signifikanten Anzahl von Tieren, die sich berühren und überlappen. Der manuelle Prozess ist jedoch langsam (20 s bis 1 min pro Wurm, abhängig von der erforderlichen Präzision und der Erfahrung des Benutzers), mühsam und anfällig für Voreingenommenheit und Fehler des Benutzers.

Ein alternativer und viel leistungsfähigerer Ansatz für die Generierung individueller C. elegans-ROIs (eine Aufgabe, die im Bereich des maschinellen Sehens typischerweise als Segmentierung bezeichnet wird) ist die Automatisierung mit Hilfe von Deep Learning/neuronalen Netzwerktechniken. Convolutional Neural Networks, die hauptsächlich auf der Mask R-CNN28 und den U-net-Architekturen29 basieren, haben bei Segmentierungsaufgaben auf verschiedenen biologischen Modellsystemen 30,31,32 einschließlich in C. elegans 33,34,35,36,37,38,39 gute Ergebnisse erzielt , aber keine hat eine zufriedenstellende Lösung für das Problem der Erzeugung von Ganzkörpersegmentierungen geliefert, die einzelne Tiere in hochauflösenden Bildern mit einer großen Anzahl von sich berührenden oder sich völlig überlappenden Würmern korrekt unterscheiden (Instanzsegmentierung). Um diesem Bedarf gerecht zu werden, haben wir SegElegans entwickelt, ein Deep-Learning-Modell, das speziell für diese Aufgabe entwickelt und optimiert wurde40.

SegElegans besteht aus zwei Hauptteilen (Abbildung 1). Der erste Teil ist ein zweiköpfiges U-Net-Varianten-Convolutional Neural Network. Er besteht aus einem Encoder-Block und zwei Decoder-Blöcken. Der Encoderblock basiert auf dem SmaAt AT Modell41 und verwendet doppelte Faltungsblöcke für jede Schicht, die in ein Convolutional Block Attention Module (CBAM)42 eingespeist wird. Die beiden Decoderblöcke basieren auf dem Convolutional Long Short-Term Memory (LSTM) Netzwerk43. Ein Decoder ist für die Kategorisierung jedes Pixels der Bilder als Teil des Hauptkörpers eines Wurms, als Teil des Randes eines Wurms, als Teil des Hintergrunds oder als Teil eines Bereichs verantwortlich, in dem sich Würmer überlappen (dies wird in der Regel als semantische Segmentierung bezeichnet). Der andere Decoder ist dafür verantwortlich, ein lineares "Skelett" entlang der Länge jedes Wurms zu zeichnen. Der zweite Teil ist ein Nachbearbeitungsalgorithmus, der die Ausgaben der beiden Decoder kombiniert und sie verwendet, um genaue Instanzsegmentierungen zu erzeugen. Es identifiziert zunächst die Segmente der echten Überlappungen, indem es die Ausgabe der semantischen Segmentierung mit der des Skeletts vergleicht. Dann gibt es die Instanzsegmentierung direkt für Würmer ohne Überlappungen aus oder durch Zusammensetzen aus Segmenten für überlappendeWürmer 40. Diese Segmentierungen werden sowohl als binäre Masken als auch als ImageJ-kompatible ROIs gespeichert.

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Protokoll

Die folgenden Abschnitte enthalten detaillierte Anweisungen zur effektiven Nutzung von SegElegans (Abbildung 2). Sie enthalten Anweisungen zur vorbereitenden Bilderfassung (Abschnitt 1), zum Ausführen des Modells online (Abschnitt 2) oder offline (Abschnitte 3-5) und zum Importieren von ROIs in ImageJ oder andere Tools (Abschnitt 6). Da für die Auswertung von Bildern über das Modell ein PC mit einer CUDA-kompatiblen GPU (Graphics Processing Unit) erforderlich ist, die über mindestens 6 GB (idealerweise mehr) Video-VRAM (Random Access Memory) verfügt, wird den meisten Benutzern (sofern sie Zugriff auf die Google-Dienste haben) empfohlen, die Online-Version des Modells zu verwenden, die diese Hardwareanforderungen durch Cloud Computing erfüllt und übertrifft (Abschnitt 1 > Abschnitt 2 > Abschnitt 6). Alternativ können Benutzer, die Zugang zu entsprechend leistungsfähiger Hardware und ein grundlegendes Verständnis der Verwendung von Befehlszeilen/Terminals haben (oder Benutzer, die keinen Zugang zu den oben genannten Cloud-Computing-Optionen haben), das Modell möglicherweise bequemer lokal ausführen (Abschnitt 1 > Abschnitt 3 > Abschnitt 4 oder 5 > Abschnitt 6).

1. Aufnahme von Beispiel- und Leitbildern

  1. Verwenden Sie SegElegans, um Segmentierungen von adulten Würmern aus jedem Wurmstamm zu erfassen, unabhängig davon, welche fluoreszierenden Reporter sie exprimieren oder nicht. Wenn der/die Phänotyp(en)/Daten von Interesse in Hellfeldbildern gemessen werden, erfassen Sie sie normalerweise mit einem Weitfeldmikroskop und einer kompatiblen Software unter Verwendung eines 4-fach- oder ähnlichen Objektivs.
    HINWEIS: SegElegans kann Bilder mit einem breiten Helligkeits- und Kontrastbereich analysieren, obwohl es vorzuziehen ist, dass keine gesättigten hellen oder dunklen Pixel vorhanden sind. In Bezug auf die Abmessungen wurde das System mit Bildern im Format 1328 x 1048 trainiert, sollte aber mit jedem Bild funktionieren, das mindestens 512 x 512 groß ist.
  2. Wenn der/die Phänotyp(en)/Daten von Interesse in Dunkelfeldbildern gemessen werden (typisch bei der Verwendung eines oder mehrerer transgener fluoreszierender Reporter oder Farbstoffe), erfassen Sie Hellfeldbilder zusammen mit den Daten, die als Leitbilder verwendet werden sollen (wie in Schritt 1.1 erläutert). Stellen Sie sicher, dass die Leitbilder räumlich und zeitlich so nah wie möglich perfekt mit den Dunkelfeldbildern des Fluoreszenzkanals bzw. der Fluoreszenzkanäle übereinstimmen, idealerweise durch die Verwendung der Mehrkanal-Aufnahmeoptionen, die von der Betriebssoftware des Mikroskops bereitgestellt werden. Speichern Sie die Leitbilder in einem von den entsprechenden Dunkelfeld-Datenbildern getrennten Ordner unter demselben Namen für beide.

2. Ausführen der Online-Version von SegElegans

  1. Melden Sie sich über einen Webbrowser bei einem Google-Konto an. Es wird empfohlen, zu diesem Zweck ein neues, dediziertes Lab-Konto zu erstellen.
  2. Geben Sie Google Drive (https://drive.google.com) ein und laden Sie den Ordner mit den Hellfeldbildern (Daten oder Anleitung) hoch. Wie bereits erwähnt, sollten Sie, wenn Hilfsbilder verwendet werden, um ROIs für Dunkelfeldbilder zu generieren, diese Dunkelfelddatenbilder nicht in diesen Ordner aufnehmen.
  3. Gehen Sie zu https://github.com/KonstantinosKounakis/SegElegansOnline/tree/v1.0 und klicken Sie auf die Datei SegElegans Body Prediction Interface.ipynb . Klicken Sie auf die Schaltfläche In Colab öffnen oben in der Datei, die sich öffnet. Das Jupyter Notebook/Interface für SegElegans wird auf Google Colab geöffnet.
  4. Führen Sie Codeblock 1 aus, indem Sie die Play-Taste (figure-protocol-1) unter dem Titel drücken. Erteilen Sie der Runtime die Berechtigung zum Ausführen des Codes, und beobachten Sie die Ausgabe nach Beendigung der Ausführung (ein grünes Häkchen wird neben der Wiedergabeschaltfläche angezeigt). Colab sollte automatisch die korrekte, CUDA-kompatible Runtime ausführen und eine NVIDIA-SMI-Ausgabetabelle anzeigen. Andernfalls erzwingen Sie die Verwendung einer T4-GPU-Runtime über das Menü Runtime > Change Runtime Type .
  5. Führen Sie Codeblock 2 aus, um die Inhalte von Google Drive in die Runtime zu laden. Akzeptieren Sie alle Bestätigungsdialoge und erteilen Sie alle angeforderten Berechtigungen.
  6. Führen Sie die Codeblöcke 3 und dann 4 aus. Es dauert ein paar Minuten, bis Block 3 abgeschlossen ist, also stellen Sie sicher, dass das grüne Häkchen angezeigt wurde, bevor Sie mit 4 fortfahren.
  7. Öffnen Sie das Symbol mit der Ordnerregisterkarte links neben der Colab-Oberfläche. Dadurch werden die Dateien, die in die Runtime geladen werden, einschließlich der importierten Inhalte von Drive als /content/drive/MyDrive angezeigt. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Ordner mit den Bildern, kopieren Sie den Pfad und fügen Sie ihn in das test_images Eingabeformular von Codeblock 5 ein. Stellen Sie sicher, dass es wie folgt aussieht: /content/drive/MyDrive/Imagefolder. Geben Sie auf ähnliche Weise einen Pfad für die Analyseausgabe an (z. B. /content/drive/MyDrive/Imagefolder/Output). Beachten Sie, dass Pfade in dieser Umgebung einen Schrägstrich verwenden, um Ordner (/) zu trennen.
  8. Führen Sie den Codeblock 5 aus.
  9. Geben Sie die genaue Ausdehnung der Bilder an, die vom Modell analysiert werden sollen, in der bereitgestellten Form von Codeblock 6. Für die Zwecke dieser Eingabe ".tif", ". TIF" und ".tiff" werden als unterschiedliche Erweiterungen behandelt.
  10. Passen Sie die batch_crop_img Eingabe in Codeblock 6 nicht an, wenn das System in der standardmäßigen T4-GPU-Runtime ausgeführt wird (die allen Benutzern je nach Nutzungsgrad für eine begrenzte Anzahl von Stunden pro Tag kostenlos zur Verfügung gestellt wird). Reduzieren Sie sie, wenn die Laufzeit Probleme mit der Speicherverfügbarkeit aufwirft.
  11. Führen Sie Codeblock 6 aus. Dies wird einige Zeit dauern, also stellen Sie sicher, dass das grüne Häkchen angezeigt wurde, bevor Sie fortfahren.
  12. Führen Sie Codeblock 7 aus. Passen Sie die Eingaben nicht für die standardmäßige T4-Laufzeit an, sondern reduzieren Sie die Anzahl der Unterprozesse, oder deaktivieren Sie die parallele Verarbeitung vollständig, wenn Probleme mit der Speicherverfügbarkeit auftreten. Auch dies wird viel Zeit in Anspruch nehmen.
  13. Greifen Sie in einem anderen Browserfenster oder Tab auf Google Drive zu und navigieren Sie zu dem in 2.7 angegebenen Ausgabeordner.
    HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt hat SegElegans die Erstauswertung und Nachbearbeitung der Segmentierungen abgeschlossen und mehrere Unterordner mit Ausgaben angelegt. 0_summary Ergebnisse enthalten Diagramme, die die Ausgabe für jedes Bild zusammenfassen, wobei jedem Wurm eine Indexnummer zugewiesen ist. 1_complete_mask enthält die kuratierten binären Masken für alle Segmentierungen, die der Algorithmus für die Analyse als gut erachtet hat. 1_edge_small_mask enthält binäre Masken für alle Segmentierungen, die der Algorithmus abgelehnt hat, weil die Tiere am Bildrand zu klein oder teilweise verdeckt sind. 1_overlap_mask enthält binäre Masken für alle Segmentierungen von Würmern, die echte Überlappungen aufwiesen und standardmäßig nicht zur kuratierten Ausgabe hinzugefügt werden. 1_all_rois_results enthält die Segmentierungen ALLER 3 Typen, unabhängig von der Kuration, im ImageJ-Format (Zip-Dateien mit ROIs).
  14. Wählen Sie an dieser Stelle eine der drei Optionen aus:
    1. Verwenden Sie die in 1_all_rois_results bereitgestellten ROIs in ImageJ und lehnen Sie unerwünschte ROIs nach dem Import dort ab (siehe Protokollabschnitt 6).
    2. Akzeptieren Sie die kuratierten guten Masken ohne manuelle Korrektur (und ohne Einbeziehung von überlappenden Würmern) (springen Sie zu 2.16).
    3. Passen Sie die Kuration manuell an, indem Sie die Würmer (einschließlich der überlappenden) auswählen, die in die Ausgabe aufgenommen werden sollen (weiter zu 2.15).
  15. Um die Kuration manuell anzupassen, verwenden Sie den Codeblock 8. Untersuchen Sie die Ergebnisse der ersten Kuratierung anhand der Zusammenfassungsdiagramme im Ordner 0_summary Ergebnisse . Geben Sie für jedes Bild, das korrigiert werden muss, den vollständigen Namen (mit Erweiterung) des ursprünglichen Eingabebildes in das Formular "name_image_change" und die Nummern der aufzubewahrenden Masken (aus dem Zusammenfassungsdiagramm) ein, getrennt durch Kommas im Formular "index_images". Führen Sie den Codeblock 8 aus. Wiederholen Sie diesen Schritt für jedes andere Bild, das korrigiert werden muss.
  16. Nach der Korrektur oder wenn Benutzer sich dafür entscheiden, die anfängliche Kuration ohne Korrekturen (und ohne die überlappenden Würmer) zu akzeptieren, führen Sie Codeblock 9 aus. Im Ausgabeordner in Google Drive wird ein neuer Unterordner mit dem Namen 2_curated_rois_results erstellt. Es enthält alle endgültigen kuratierten Segmentierungen im ImageJ-Format (Zip-Dateien mit ROIs).
  17. Um den Vorgang für einen anderen Ordner mit Bildern erneut auszuführen, setzen Sie die Runtime über das Menü Runtime > Restart Session zurück zurück und beginnen Sie von vorne.

3. Vorbereitung der Offline-Version von SegElegans vor der ersten Nutzung

  1. Als Alternative zum Online-Ausführen von SegElegans auf Colab steht eine Offline-Version von SegElegans für Benutzer zur Verfügung, die die Cloud-Computing-Dienste von Google nicht nutzen können oder möchten. Dazu ist ein PC (Windows oder Linux) mit einer CUDA-kompatiblen GPU (https://developer.nvidia.com/cuda-gpus) erforderlich, die über mindestens 6 GB VRAM verfügt (obwohl 16 empfohlen werden, wenn verfügbar und erschwinglich).
    HINWEIS: Die folgenden Anweisungen in den Abschnitten 3-5 beziehen sich auf Windows, aber die Software kann auch auf Linux-basierten Systemen ausgeführt werden, mit einigen kleinen Änderungen an den verwendeten Befehlen.
  2. Laden Sie das Installationsprogramm für das CUDA-Toolkit von https://developer.nvidia.com/cuda-downloads herunter und befolgen Sie die Anweisungen, um die Version zu erhalten, die für das verwendete Gerät geeignet ist.
    HINWEIS: SegElegans wurde mit den Versionen 12.9 und 13.0 des Toolkits und CUDA Version 11 unter Windows getestet, es wird jedoch erwartet, dass zukünftige Versionen die Abwärtskompatibilität beibehalten.
    1. Installieren Sie das Toolkit und befolgen Sie die Anweisungen des Installationsprogramms selbst. Visual Studio ist nicht erforderlich.
  3. Laden Sie die entsprechende Version des Python-Installationsprogramms für das Gerät von https://www.python.org/downloads/ herunter. Installieren Sie Python, befolgen Sie die Anweisungen des Installationsprogramms selbst und stellen Sie sicher, dass python.exe zu PATH hinzugefügt wird.
    HINWEIS: SegElegans wurde auf Python 3.13 erstellt und getestet, aber es wird erwartet, dass zukünftige Versionen die Abwärtskompatibilität beibehalten.
  4. Gehen Sie zu https://github.com/KonstantinosKounakis/SegElegansOffline/releases/tag/v1 . Klicken Sie auf den Link Quellcode (zip), um das Paket mit den erforderlichen Dateien herunterzuladen, um SegElegans lokal einzurichten und auszuführen.
  5. Extrahieren Sie die ZIP-Datei. Platzieren Sie es in einem Ordner auf hoher Ebene oder sogar auf oberster Ebene, z. B. C:\SegElegans. Der Inhalt der Zip-Datei befindet sich bereits in einem Unterordner SegElegansOffline-1.
  6. Öffnen Sie die Windows-Eingabeaufforderung (cmd.exe). Geben Sie den Befehl python -m venv "fullsegeleganspath" ein, wobei "fullsegeleganspath" der vollständige Pfad in Anführungszeichen ist, in den Unterordner SegElegansOffline-1 .
    HINWEIS: Wenn die ZIP-Datei beispielsweise in C:\SegElegans extrahiert wurde, lautet der vollständige Pfad C:\SegElegans\SegElegansOffline-1 und der Befehl lautet python -m venv "C:\SegElegans\SegElegansOffline-1" . Beachten Sie, dass Pfade in dieser Umgebung einen umgekehrten Schrägstrich verwenden, um Ordner ("\") zu trennen.
  7. Verwenden Sie in der Eingabeaufforderung die Standardsteuerelemente, um im Ordner SegElegansOffline-1 zu navigieren, und führen Sie den Befehl Scripts\activate aus. Vor dem nächsten Eingabeaufforderungscursor sollte eine Beschriftung (SegElegansOffline-1) angezeigt werden, die darauf hinweist, dass die Python-Umgebung jetzt aktiv ist.
  8. Führen Sie in der aktiven Umgebung (SegElegansOffline-1) den Befehl pip install -r requirements.txt aus. Der Vorgang wird einige Zeit in Anspruch nehmen.
  9. Geben Sie den Befehl python assemblenetworks.py ein und führen Sie ihn aus.
    HINWEIS: SegElegans ist jetzt laufbereit. Es gibt zwei Möglichkeiten, dies zu erreichen: ein Schnellskript, das automatisch alle Segmentierungen als ImageJ-ROIs bereitstellt, ohne die Möglichkeit, die Kuration manuell zu korrigieren (Abschnitt 4), und ein lokales Jupyter-Notebook, das die Option bietet, die Kuration zu überblicken und zu korrigieren (Abschnitt 5). Der letztere Ansatz wird für die meisten Benutzer empfohlen.

4. Ausführen der Offline-Version von SegElegans mit einem Quick-Script

  1. Öffnen Sie die Windows-Eingabeaufforderung (cmd.exe). Navigieren Sie, wie in Schritt 3.7 beschrieben, zum Umgebungsordner SegElegans und aktivieren Sie diesen.
  2. Um das Quick-Script zu verwenden, geben Sie in der Eingabeaufforderung mit der aktiven Umgebung (SegElegansOffline-1) den Befehl python SegElegansBodyQuickEval.py -i "pathtoinputfolder" -x aus, wobei "pathtoinputfolder" der vollständige Pfad in Anführungszeichen zum Ordner mit den Hellfeldbildern ist (z. B. "D:\Data\Experiment12365\Condition 1") und die genaue Dateierweiterung der Bilder ist, die Benutzer analysieren möchten (Beispiel ". TIF"). Geben Sie den Befehl python SegElegansBodyQuickEval.py -h ein, um Anweisungen zu zusätzlichen Parametern zu erhalten, die geändert werden können, um die Verarbeitung durch das Skript zu beschleunigen, wenn das Gerät damit umgehen kann.
    HINWEIS: Der Ausgabeordner wird in diesem Fall innerhalb des Eingabeordners erstellt (also für das obige Beispiel: "D:\Data\Experiment12365\Condition 1\Output"). Im Inneren gibt es eine Reihe von Unterordnern. 0_summary Ergebnisse enthalten Diagramme, die die Ausgabe für jedes Bild zusammenfassen, wobei jedem Wurm eine Indexnummer zugewiesen ist. 1_complete_mask enthält die kuratierten binären Masken für alle nicht überlappenden Segmentierungen, die der Algorithmus für die Analyse als gut erachtet hat. 1_edge_small_mask enthält binäre Masken für alle Segmentierungen, die der Algorithmus abgelehnt hat, weil die Tiere am Bildrand zu klein oder teilweise verdeckt sind. 1_overlap_mask enthält binäre Masken für alle Segmentierungen von Würmern, die echte Überlappungen aufwiesen. 1_all_rois_results enthält die Segmentierungen ALLER 3 Typen, unabhängig von der Kuration, im ImageJ-Format (Zip-Dateien mit ROIs). Da es hier keine Möglichkeit gibt, die Kuratierung manuell zu korrigieren, enthält 2_curated_rois_results standardmäßig alle Segmentierungen, die vom Algorithmus als gut erachtet werden, UND alle überlappenden Segmentierungen im ImageJ-Format (Zip-Dateien mit ROIs).

5. Ausführen der Offline-Version von SegElegans mit einem Jupyter-Notebook

  1. Öffnen Sie die Windows-Eingabeaufforderung (cmd.exe). Navigieren Sie, wie in Schritt 3.7 beschrieben, zum Umgebungsordner SegElegans und aktivieren Sie diesen.
  2. Um die Jupyter-Schnittstelle zu verwenden, geben Sie in der Eingabeaufforderung mit der aktiven Umgebung (SegElegansOffline-1) den Befehl jupyter notebook ein, und führen Sie ihn aus. Dadurch wird ein Webbrowser-Fenster/eine Registerkarte mit einer lokal gehosteten Site geöffnet. Wählen Sie auf dem Startbildschirm die Datei SegElegansOfflineJupyterInterface.ipynb aus.
  3. Führen Sie den Code in Codeblock 1 aus, indem Sie ihn auswählen (klicken Sie links außerhalb des eigentlichen Codes) und drücken Sie die Play-Schaltfläche (figure-protocol-2) in der Symbolleiste oben. Eine Bestätigungsmeldung wird unter dem Codeblock angezeigt, wenn die Ausführung abgeschlossen ist.
  4. Führen Sie Codeblock 2 aus. Dadurch werden einige Eingabeformulare in der Auslesung unterhalb des Codeblocks erzeugt. Füllen Sie die generierten Formulare aus mit dem Pfad zum Eingabeordner mit den Hellfeldbildern (Beispiel: "D:\Data\Experiment12365\Condition 1"), dem gewünschten Pfad für die Analyseausgabe (Beispiel: "D:\Data\Experiment12365\Condition 1\Output") und der genauen Dateiendung der zu analysierenden Bilder (Beispiel). TIF"). Passen Sie die zusätzlich bereitgestellten Einstellungen an (erhöhen Sie die Anzahl der Zwischenfrüchte pro Charge auf 9 oder 16 und führen Sie mehrere parallele Nachbearbeitungsprozesse durch), wenn das Gerät ausreichend leistungsfähig ist.
  5. Führen Sie den Codeblock 3 aus.
  6. Führen Sie den Codeblock 4 aus. Dies wird einige Zeit dauern, also stellen Sie sicher, dass es vollständig ist, bevor Sie fortfahren.
  7. Führen Sie den Codeblock 5 aus. Auch dies wird einige Zeit in Anspruch nehmen. Navigieren Sie danach zu dem oben angegebenen Ausgabeordner.
    HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt hat SegElegans die Erstauswertung und Nachbearbeitung der Segmentierungen abgeschlossen und mehrere Unterordner mit Ausgaben angelegt. 0_summary Ergebnisse enthalten Diagramme, die die Ausgabe für jedes Bild zusammenfassen, wobei jedem Wurm eine Indexnummer zugewiesen ist. 1_complete_mask enthält die kuratierten binären Masken für alle Segmentierungen, die der Algorithmus für die Analyse als gut erachtet hat. 1_edge_small_mask enthält binäre Masken für alle Segmentierungen, die der Algorithmus abgelehnt hat, weil die Tiere am Bildrand zu klein oder teilweise verdeckt sind. 1_overlap_mask enthält binäre Masken für alle Segmentierungen von Würmern, die echte Überlappungen aufwiesen und standardmäßig nicht zur kuratierten Ausgabe hinzugefügt werden. 1_all_rois_results enthält die Segmentierungen ALLER 3 Typen, unabhängig von der Kuration, im ImageJ-Format (Zip-Dateien mit ROIs).
  8. Ähnlich wie bei der Online-Version von SegElegans können Sie eine der drei unten aufgeführten Optionen verwenden:
    1. Verwenden Sie die in 1_all_rois_results bereitgestellten ROIs in ImageJ und lehnen Sie unerwünschte ROIs nach dem Import dort ab (siehe Protokoll-Abschnitt 6).
    2. Akzeptieren Sie die automatisch kuratierten guten Masken ohne manuelle Korrektur (und ohne Einbeziehung von überlappenden Würmern) (fahren Sie mit Schritt 5.11 fort).
    3. Passen Sie die Kuration manuell an, indem Sie die Würmer (einschließlich der überlappenden) auswählen, die in die Ausgabe aufgenommen werden sollen (fahren Sie mit Schritt 5.9 fort).
  9. Um die Kuration manuell anzupassen, verwenden Sie die Codeblöcke 6 und 7. Führen Sie zuerst 6 aus. Dadurch werden Eingabeformulare in der Auslesung unterhalb des Codes erstellt.
  10. Untersuchen Sie die Ergebnisse der ersten Kuratierung anhand der Zusammenfassungsdiagramme im Unterordner 0_summary Ergebnisse . Geben Sie für jedes Bild, das korrigiert werden muss, den vollständigen Namen des INPUT-Bildes (mit Erweiterung) in das Formular Image to correct: und die Nummern der aufzubewahrenden Masken (aus dem Zusammenfassungsdiagramm) durch Kommas getrennt in das Formular Zu behaltende Masken ein. Führen Sie Codeblock 7 aus, und stellen Sie sicher, dass die Ausführung abgeschlossen ist. Wiederholen Sie diesen Schritt für jedes andere Bild, das korrigiert werden muss.
  11. Nachdem die Kurationskorrektur abgeschlossen ist oder wenn Benutzer sich dafür entscheiden, die ursprüngliche Kuration ohne Korrekturen (und ohne die überlappenden Würmer) zu akzeptieren, führen Sie Codeblock 8 aus. Ein neuer Unterordner wird im angegebenen Ausgabeordner mit dem Namen 2_curated_rois_results erstellt. Es enthält alle endgültigen kuratierten Segmentierungen im ImageJ-Format (Zip-Dateien mit ROIs).
  12. Um den Vorgang für einen anderen Ordner mit Bildern erneut auszuführen, setzen Sie die Laufzeit über das Menü Kernel > Kernel neu starten und Ausgaben aller Zellen löschen zurück und beginnen Sie von vorne.

6. Importieren der Segmentierungen in ImageJ (oder Alternativen)

  1. Öffnen Sie eines der eigentlichen Datenbilder auf ImageJ.
  2. Öffnen Sie die entsprechende ZIP-Datei mit den ROIs dieses Bildes. Dadurch wird die Auswahl in den ImageJ ROI-Manager geladen. Wenn es sich um ROIs aus dem 2_curated_rois_results Output handelt , sind sie bereit für die Analyse mit den gewünschten Methoden, die normalerweise verwendet werden (vorzugsweise unter Verwendung von Makros, um den Prozess weiter zu automatisieren und zu beschleunigen).
  3. Wenn es sich um ROIs aus der 1_all_rois_results Ausgabe handelt, entfernen Sie unerwünschte Segmentierungen aus dem ROI-Manager. Wählen Sie sie aus und drücken Sie die Schaltfläche Löschen im Managerfenster selbst. Drücken Sie nicht die Entf-Taste auf der Tastatur, da dadurch stattdessen der Inhalt der Auswahl im Bild gelöscht wird.
  4. Wenn für die Analyse eine andere Software als ImageJ benötigt wird, ist das ROI-Format höchstwahrscheinlich nicht kompatibel. Importieren Sie in diesem Fall Segmentierungen in der universell verwendeten Form von Binärmasken, die in den Ordnern 1_complete_mask und 1_overlap_mask bereitgestellt werden. Lesen Sie die Anweisungen der empfangenden Software, um diesen Import durchzuführen.

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Ergebnisse

Durch die Befolgung dieses Protokolls sollten Forscher in der Lage sein, qualitativ hochwertige Wurmsegmentierungen zu extrahieren, selbst für die Analyse von Fluoreszenzbildern ohne sichtbare Wurmränder. Wie in Abschnitt 6 des Protokolls erläutert, können diese Segmentierungen direkt in ImageJ importiert und für die schnelle Messung relevanter Eigenschaften wie die Intensität von Fluoreszenzreportern (die häufig zur Expressionsquantifizierung verwendet werden) oder die Anzahl, Größe und...

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Diskussion

Die hier vorgestellte Methodik sollte es den Anwendern ermöglichen, Mikroskopie-Experimente von C. elegans in einem deutlich schnelleren Zeitrahmen zu analysieren, ohne dass es zu Genauigkeitsverlusten kommt. Da es Segmentierungen aus Hellfeld-Leitbildern unabhängig von der tatsächlichen Fluoreszenz extrahiert (wie in Protokollabschnitt 1 beschrieben), kann es mit jedem Stamm und für jede Anwendung verwendet werden, bei der Phänotypen pro Wurm gemessen werden müssen. Dazu können...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Danksagungen

Die Arbeit im Autorenlabor wird gefördert durch das Generalsekretariat für
Forschung und Innovation des griechischen Entwicklungsministeriums, der
Europäische Union - NextGenerationEU (Projektcode: TAEDR-0535850, Akronym:
BrainPrecision) im Rahmen der Aktion "Leitaktionen in
Interdisziplinäre Wissenschaftsbereiche mit besonderem Interesse an Verbindung
zum produktiven Gefüge" im Rahmen des nationalen Aufbau- und Resilienzprogramms
Plan "Griechenland 2.0", die Exekutivagentur der Europäischen Kommission für die Forschung
Excellence Hub "CHAngeing" (GA-101087071) und die Hellenic Foundation
für Forschung und Innovation (H.F.R.I.) im Rahmen des "1. Aufrufs für H.F.R.I.
Forschungsprojekte zur Unterstützung von Fakultätsmitgliedern und Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftlern sowie der
Beschaffung von teuren Forschungsgeräten" (Projektnummer:
HFRI-FM17C3- 0869, NeuroMitophagie).

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Materialien

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Computer mit Internetzugang (Beispiel: Dell Vostro Desktop)Mehrere (zum Beispiel Dell) -Dies ermöglicht es, SegElegans wie empfohlen online über Cloud-Computing zu betreiben und Bildanalysesoftware wie ImageJ zu verwenden.
CUDA-kompatible Grafikverarbeitungseinheit mit mindestens 6 GB VRAM (Beispiel: MSI Geforce RTX  RTX3050 Ventus 2X 6GB) (optional)NVIDIA + mehrere Hersteller (zum Beispiel Micro Star International)https://developer.nvidia.com/cuda-gpusDies ermöglicht es, SegElegans offline auf einem lokalen Rechner auszuführen.
CUDA-kompatible GPU-Chipsätze sind hier zu finden:
https://developer.nvidia.com/cuda-gpus
Das VRAM hängt von der tatsächlichen Implementierung des Chipsatzes in eine GPU durch den Hersteller ab.
WARNUNG: Sie benötigen eine teure und leistungsstarke CUDA-Karte, die weit über den Mindestanforderungen (16+ GB VRAM) liegt, um die Leistung der Cloud-Computing-Version zu erreichen.
Epifluoreszenzmikroskop (Invitrogen EVOS FL Auto 2)ThermoFisher Scientific AMAFD2000 zum BeispielWir empfehlen die Verwendung eines Systems, das automatisch Bilder von einem oder mehreren Fluoreszenzkanälen fast gleichzeitig aufnehmen kann.
ImageJ (Optional)NIHhttps://imagej.net/software/fiji/downloadsWir empfehlen die Fiji-Distribution, die hier verfügbar ist:
https://imagej.net/software/fiji/downloads
PC mit NVIDIA GPU-Kompatibilität (Beispiel: Dell Vostro Desktop) (optional) Mehrere (zum Beispiel Dell) -Dies wird zusammen mit der GPU benötigt, um SegElegans offline auf einem lokalen Rechner auszuführen.
Eine GPU benötigt Windows-kompatible Hardware mit den passenden PCI-Steckplätzen auf dem Mainboard, Platz für die Karte und ein ausreichend leistungsstarkes Netzteil.
SegElegans-https://github.com/KonstantinosKounakis/SegElegansOnline/tree/v1.0 Siehe Manuskript für vollständige Anleitungen. 

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