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Methodenartikel

Radiochemische Bewertung der Aktivität von Glykogensynthase-Enzymen in tierischem Gewebe

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DOI:

10.3791/69103

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24. Oktober 2025

 , 
1Indiana University School of Medicine-Muncie and Ball State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Der tierische Gewebeassay nutzt die Detektion von Kernszintillation, um die enzymatische Aktivität der Glykogensynthase zu bestimmen, indem der Einbau von radioaktiv markierter Glukose in Glykogen gemessen wird.

Zusammenfassung

Glykogen ist ein wichtiger Metabolit für viele eukaryotische Zellen, der für die Energiespeicherung und die schnelle Energiefreisetzung unerlässlich ist. Der Aufbau des Moleküls hängt von der Glykogensynthase ab, einem hochregulierten Enzym, dessen Hauptfunktion darin besteht, die sequentielle Bindung von Glukoseeinheiten in einem wachsenden Glykogenpolymer zu erleichtern. Dieses Enzym wird allosterisch durch Glucose-6-phosphat aktiviert und an mehreren Stellen durch Phosphorylierung gehemmt. Das Wissen über die enzymatische Aktivität der Glykogensynthase ist eine Schlüsselkomponente für das Verständnis des Glykogenstoffwechsels, des Muskelenergieniveaus und von Stoffwechselstörungen wie Diabetes und Glykogenspeicherkrankheiten. Hier wird ein hochsensitives und effektives Verfahren zur Bestimmung der Aktivität der Glykogensynthase in tierischem Muskelgewebe beschrieben, indem die Menge an integrierter Glukose, von radiomarkierter [14C]-UDP-Glukose, in Glykogenmoleküle gemessen wird. Bei diesem Verfahren wird radioaktives 14 °C verwendet und es sind die entsprechende Genehmigung und Laborräume für die Verwendung und Entsorgung erforderlich. Für dieses Verfahren ist auch der Zugang zu einem Flüssigszintillationszähler erforderlich.

Einleitung

Glykogen, ein stark verzweigtes Polysaccharid, das aus Glukoseeinheiten besteht, dient als wichtige Energiereserve in verschiedenen Geweben, darunter Muskeln, Leber und Gehirn1. Seine Synthese und sein Abbau werden durch ein komplexes System aus spezialisierten Enzymen und regulatorischen Proteinen orchestriert. Entscheidend für seine Biosynthese ist das Enzym Glykogensynthase (GYS), von dem es zwei Isoformen (GYS1 und GYS2) gibt. GYS1 ist ein regulatorisches Enzym, das direkt für die Bildung von Glykogen aus Glukose in Nicht-Leberzellen verantwortlich ist, während GYS2 in der Leber wirkt. Dieser Prozess, der als Glykogenese bekannt ist, ist die sequentielle Addition einer einzelnen Einheit Glukose an eine wachsende Glykogenkette. GYS katalysiert den Transfer von Glukose vom Zwischenprodukt Uridindiphosphatglukose (UDP-Glukose) an das Ende einer Glykogenkette, wodurch eine alpha-1,4-glykosidische Bindung entsteht2. In Abstimmung mit dem Glykogenverzweigungsenzym verlängert diese Reaktion die Glykogenmoleküle und sorgt so für eine effiziente Energiespeicherung und -freisetzung.

Es gibt Assay-Verfahren zur Messung der Aktivität des Enzyms, wobei eine der gebräuchlichsten Gruppierungen von Methoden aus denen der spektrophotometrischen Sorte 3,4 besteht. Diese Assays beruhen in der Regel auf einem System indirekter gekoppelter Reaktionen und messen die Absorption des nachgeschalteten Produkts, NADH, bei 340 nm. Für jede Einheit UDP, die durch die Glykogensynthase von UDP-Glukose befreit wird, wird eine Einheit NADH verbraucht, wodurch eine messbare Anregung erzeugt wird, die direkt mit der Glykogensynthaseaktivität korreliert 5,6. Spektrophotometrie-Assays sind zwar relativ kostengünstig und zugänglich, haben aber den kleinen Nachteil, dass sie auf einer indirekten Reaktion beruhen, und große Nachteile der Interferenz durch Probentrübung und geringere Empfindlichkeit, insbesondere ein Problem für kleinere Proben oder Proben mit weniger/stark phosphorylierter Glykogensynthase. Fluorometrische Assays, die die oben beschriebenen gekoppelten Reaktionen verwenden, wurden entwickelt, um die Empfindlichkeit im Muskelgewebe von Mensch7 und Maus8 zu verbessern. Es gibt andere Techniken zur Quantifizierung der Glykogensynthase, wie z. B. Immunblot9 und Immunhistochemie10; Diese Techniken sind jedoch nur in der Lage, die physikalische Menge des Enzyms zu quantifizieren und bestenfalls die Aktivität aus der Phosphorylierung abzuleiten, aber nicht direkt die Enzymaktivität zu quantifizieren11.

Unter diesen Enzymassay-Techniken sind radiochemische Methoden nach wie vor die am weitesten verbreiteten zur Bestimmung der Glykogensynthase-Aktivität in Säugetiergewebe, da sie nicht durch die Trübung der Probe gestört werden und eine hohe Empfindlichkeit aufweisen 8,9. Diese Assays enthalten radioaktiv markierte Glukose aus UDP-Glukose, die entweder mit 14C12 oder 3H13 markiert ist, in Glykogen, was eine direkte Messung der Enzymaktivität über einen festgelegten Zeitraum ermöglicht. Im folgenden Verfahren wird eine Gewebeprobe, die Glykogensynthase enthält, mit UDP-Glukose und Glykogenprimer beaufschlagt. Die Glykogensynthase katalysiert die in der folgenden Gleichung gezeigte Reaktion:

UDP-[14C]Glukose + (Glykogen)n → (Glykogen)n+1[14C] + UDP

Nach einer festgelegten Zeitspanne wird die Reaktion beendet und das Glykogen, das radioaktiv markierte Glukose enthält, wird entweder auf Filterpapier12 ausgefällt (wie unten beschrieben) oder einer Gelfiltration unterzogen, wie von Niederwanger et al.14 beschrieben, und unter Verwendung eines Szintillationsdetektors gemessen. Dieses Verfahren umfasst auch eine separate identische Reaktion, die Glucose-6-phosphat (G6P), einen allosterischen Aktivator der Glykogensynthase, enthält. Unter Bedingungen mit ausreichenden G6P-Gehalten wird die Glykogensynthase-Aktivität maximal aktiviert, was das absolute Potenzial für die Glykogensynthase-Aktivität einer gegebenen Probe zeigt. Das hier beschriebene Verfahren wurde von Suzuki und Kollegen15 auf ein 96-Well-Format modifiziert und ist für den Einsatz in Mausmuskelgewebe optimiert; Das Protokoll kann jedoch für andere Gewebe und Tierarten geändert werden.

Trotz der inhärenten Kosten- und Sicherheitsüberlegungen, die mit radioaktiven Materialien verbunden sind, bieten radiochemische Assays erhebliche Vorteile gegenüber nicht-radioaktiven Alternativen, sofern Instrumente verfügbar sind. Das folgende Verfahren beschreibt ein hochempfindliches und robustes Mittel zur Bestimmung der Aktivität der Glykogensynthase, einem Schlüsselenzym im Glykogenstoffwechsel, in tierischem Muskelgewebe.

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Protokoll

Alle Verfahren wurden vom Animal Care and Use Committee der Ball State University genehmigt. Männliche und weibliche Kohorten von B6; 129-Gaatm1Rabn/J Wildtyp-Mäuse im Alter von 3 Monaten werden in diesem Manuskript als repräsentatives Beispiel verwendet. Die verwendeten Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung vor dem Assay

  1. Gewebe durch zervikale Dislokation16 entnehmen und sofort in flüssigem N2 einfrieren, um die Glykogenspeicher zu erhalten, und bis zum Beginn des Assays in flüssigem N2 oder Ultratiefkühlschrank lagern.
  2. Bereiten Sie die Stammlösungen vor Beginn des Glykogensynthase-Assays vor (Tabelle 1).
  3. Bestimmen Sie die Anzahl der für den Assay gewünschten replizierten Mausproben und Kontrollen. Jede Mausprobe benötigt insgesamt vier Replikate, zwei für jede Reaktion (Vorhandensein oder Fehlen von G6P) (siehe Abbildung 1 und Tabelle 2).
  4. Chromatographiepapier in 4 cm große Streifen schneiden. Glykogen bindet sich an dieses Papier und bleibt während des Waschvorgangs gebunden. Mit der Breite (6 mm) eines Aktenvernichters wird Chromatographiepapier in dünne Einzelsegmente zerkleinert.
  5. Beschriften Sie die gekennzeichneten Papierstreifen mit einem Bleistift mit Mauserkennung, Leerzeichen und Summen. Vermeiden Sie die Verwendung von Tinte.
  6. Legen Sie Chromatographiepapiere in die Holzblockschablone ein. Jede Schablone fasst bis zu 12 Papiere, was einer Reihe einer 96-Well-Platte entspricht.
  7. Besorgen Sie sich Chromatographie-Papierklammern (Klemmbrettplatten).
  8. Bereiten Sie eine Klemme für jede Reaktionsreihe vor, indem Sie die Kanten der Chromatographiepapiere festklemmen, wobei der größte Teil der Papieroberfläche freiliegt. Stellen Sie sicher, dass die beschrifteten Kanten sichtbar sind.
  9. Beschriften Sie 1,7 mL Mikrofuge-Röhrchen mit Probenidentifikation. Zwei Röhrchen pro Probe; eine für Homogenat und eine für Überstand.
  10. Bereiten Sie vor Beginn des Assays sowohl die + als auch die - G6P-Reaktionsgemische vor, weitere Informationen finden Sie in Tabelle 3 . Von jedem Reaktionsgemisch werden 2.400 μl Aliquots hergestellt.

2. Radiochemische Glykogensynthase-Aktivitätsreaktion

ACHTUNG: In diesem Schritt wird [14C]-UDP-Glucose verwendet, bei dem es sich um ein radioaktives Material handelt. Handhabung, Lagerung und Entsorgung in einer von der Nuclear Regulatory Commission (NRC) genehmigten Weise.

  1. 30 μl [14C]-UDP-glucose (0,1 μCi/μl) zu 2.400 μl Aliquots beider (+/- G6P) Reaktionsmischungen für eine Endkonzentration von 0,0012 μCi/μl hinzufügen. Dieses Rezept ist für 18 Proben geeignet.
    HINWEIS: Das Volumen von [14C]-UDP-Glukose kann geändert werden, um den Verbrauch zu schonen und eine angemessene Empfindlichkeit zu gewährleisten. Verwenden Sie zum Beispiel 50 μl für Maushirngewebe und 25 μl für Mausherzen.
  2. Vortex-Reaktionsgemische und aliquotieren Sie 50 μl in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte, die Proben, Leerproben und Summen aufnehmen kann (Tabelle 2). Anschließend mit Plattenfolie abdecken und bei 4 °C erhitzen.
  3. Legen Sie die Proteasehemmer so aus, dass sie bei Raumtemperatur auftauen. Diese Inhibitoren sind in Tabelle 4 mit zusätzlichen Informationen aufgeführt.
  4. Massieren Sie 30-50 mg gefrorenes Gewebe ein. ~30 mg ist optimal für Skelettmuskel- und Herzproben; ~50 mg für das Gehirn. Bewahren Sie Gewebe und Mikrofuge-Röhrchen in flüssigem N2 auf und wiegen Sie das Gewebe schnell, um sicherzustellen, dass das Gewebe gefroren bleibt. Verwenden Sie einen abgekühlten Stößel, um das Gewebe weiter zu zerkleinern.
  5. Bereiten Sie einen Homogenisierungspuffer mit Proteaseinhibitoren auf Eis vor.
  6. Bewegen Sie das Röhrchen mit dem Röhrchen mit dem Gewebe von flüssigem N2 für 1 Minute auf Eis mit einer kalten Kappe. Geben Sie eine kalte Kappe (Röhrchenkappe mit drei kleinen Löchern, die in Flüssigkeit N2 gekühlt sind) in das Probenröhrchen, solange es sich noch in Flüssigkeit N2 befindet. Dadurch wird Gewebeverlust vermieden, da die Restflüssigkeit N2 im Schlauch verdampft. Sobald sie das flüssige N2 verlassen haben, sollten die Proben im Eis verbleiben.
  7. Sobald Sie auf Eis sind, fügen Sie der Probe Volumen (10-30 μl/mg Gewebe) Homogenisierungspuffer hinzu und homogenisieren Sie die Probe mit Tissue-Tearor. Nachdem Sie diese beiden Schritte abgeschlossen haben, fahren Sie mit dem nächsten Beispiel fort.
    HINWEIS: Das Volumen des Puffers, der den Proben zugesetzt wird, kann je nach Gewebequelle optimiert werden. Zum Beispiel: 30 μl /mg für die Skelettmuskulatur, 15 μl /mg für das Herz und 10 μl /mg für das Gehirn.
  8. Die Proben werden 5 min lang bei 4 °C bei 3.600 g zentrifugiert und in ein sauberes Mikrofurugeröhrchen überführt. Achten Sie darauf, das Pellet nicht zu berühren. Vortexen und ~150 μL in die entsprechenden Vertiefungen in einer 96-Well-Platte mit V-Boden auf Eis geben. Bewahren Sie den Rest für den Überstand für den Bradford-Assay auf (siehe Schritt 2.15)
    HINWEIS: Falls gewünscht, können zusätzliche Probenaliquoten für spätere Assays, wie z. B. Immunblotting, aufbewahrt werden.
    ACHTUNG: Die Schritte 2.9 bis 2.14 erfordern den Umgang mit 14 °C. Entsorgen Sie alle kontaminierten Materialien in einer von der NRC zugelassenen Weise.
  9. Die Reaktionsmischplatte von 4 °C entfernen und auf dem Thermocycler bei entfernter Folie auf 30 °C erhitzen. Während dieser Zeit 1 L -20 °C 66%iges Ethanol erhalten und mit einem Rührstab auf der Rührplatte in ein Waschbecherglas geben.
  10. Initiieren Sie die Reaktion, indem Sie 25 μl Probenüberstand in die Reaktionsvertiefungen und 25 μl Homogenisierungspuffer in die Blind- und Gesamtvertiefungen geben. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um jeweils 1 Reihe auf der Reaktionsplatte hinzuzufügen, und warten Sie mindestens 1 Minute zwischen den Reihen. Notieren Sie für jede Reihe den Zeitpunkt, zu dem die Reaktion eingeleitet wurde. Weitere Informationen finden Sie in Tabelle 2 . Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette und stellen Sie sicher, dass gleiche Mengen Flüssigkeit hinzugefügt werden.
  11. Warten Sie 10-15 Minuten, bis die Reaktion abläuft; Die Laufzeit sollte jedoch zwischen den Zeilen identisch sein.
  12. Aspirieren Sie 55 μl aus jeder Vertiefung mit einer Mehrkanalpipette und geben Sie sie auf die entsprechenden zuvor vorbereiteten Chromatographiepapiere. Mischen Sie die Reaktion, indem Sie vor der Aspiration auf und ab pipettieren. Spotten Sie die Flüssigkeit in der Mitte der Chromatographiepapiere.
  13. Entfernen Sie Papiere mit Summen mit einer Pinzette von der Klemme, nachdem Sie Flüssigkeit aus der Vertiefung entdeckt haben. Diese können zum Trocknen sicher auf Alufolie ausgelegt werden. Lassen Sie alle anderen Chromatographiepapiere in das Rührbad mit 66 % Ethanol fallen. Glykogen ist in 66%igem Ethanol unlöslich, während [14C]-UDP-Glukose löslich ist und Chromatographiepapier abwäscht.
  14. Die Schritte 2.11 und 2.12 für jede Reihe auf der Reaktionsplatte wiederholen. Stellen Sie sicher, dass die Reaktionszeit jeder Zeile gleich ist, indem Sie die Start- und Stoppzeiten der Reaktion aufzeichnen.
  15. Sobald alle Reihen zum Rühren von 66% Ethanol gegeben wurden, 15 min waschen.
    ANMERKUNG: Während dieses Schritts und der nachfolgenden Waschschritte können Probenaliquote für komplementäre Assays vorbereitet werden, wie z. B. der Bradford-Assay, der für die Bestimmung des Gesamtvolumens des Proteins für die Normalisierung verantwortlich ist, was für die Berechnung der enzymatischen Aktivität erforderlich ist.
  16. Entsorgen Sie 66% Ethanol, ohne Chromatographiepapier zu verlieren. Mit 1 l neuem 66%igem Ethanol für 30 min waschen. Dieses 66%ige Ethanol kann bei Raumtemperatur sein.
  17. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt für insgesamt drei 30-minütige Wäschen mit 66 % Ethanol.
    HINWEIS: Falls gewünscht, kann das 66%ige Ethanol aus dem letzten Waschschritt gespeichert und bei -20 °C für nachfolgende Assays gelagert werden.
  18. Nach der Entfernung von 66 % Ethanol werden alle Chromatographiepapiere im Waschbecherglas in Aceton getaucht. Aceton erleichtert den Trocknungsprozess.
  19. Entfernen Sie Chromatographiepapiere von Aceton und legen Sie sie auf Aluminiumfolie. Bewahren Sie Aceton auf oder entsorgen Sie es.
  20. Trocknen Sie die Chromatographiepapiere 15 Minuten lang unter einer Wärmelampe.
    HINWEIS: Trockenes Papier kann unbegrenzt gelagert werden. Papiere können sicher aufbewahrt werden, bis sie mit der Szintillationserkennung fortfahren können.

3. Messung der Aktivität mit Szintillationsdetektion

  1. Bringen Sie die Chromatographiepapiere mit einer Pinzette in Szintillationsfläschchen, die in Szintillationsgestellen aufbewahrt werden. Notieren Sie, wie die Musterpapiere ausgerichtet sind.
  2. Geben Sie 5 ml Szintillationsflüssigkeit mit der Deckelpumpe in jede Durchstechflasche. Schrauben Sie die Kappen für jedes Fläschchen auf.
  3. Laden Sie die Proben in den Szintillationsdetektor und beladen Sie das Stopp-Rack hinter den Proben. Stellen Sie sicher, dass das Programm zur Überwachung von 14C ausgewählt ist. Starten Sie die Erkennung, indem Sie Automatische Zählung auswählen.
  4. Ergebnisse drucken
  5. Entsorgen Sie Szintillationsröhrchen und deren Inhalt in einer von der NRC zugelassenen Weise.

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Ergebnisse

Gemäß dem Protokoll enthält ein vom Szintillationsdetektor erstellter Ausdruck die gemessene Menge an ionisierender Strahlung, die von jedem Chromatographiepapier emittiert wird, das das Fläschchen enthält, und korreliert direkt mit dem Aktivitätsniveau der Glykogensynthase. Der Szintillationsdetektor berechnet die Anzahl pro Minute (CPM) der detektierten Strahlung für jede Probe, Blindprobe und Gesamtprobe über einen festgelegten Zeitraum. Rechnen Sie zunächst CPM in DPM (Desintegration...

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Diskussion

Die Messung der Glykogensynthase-Enzymaktivität ist ein wertvolles Instrument zur Überwachung des Glykogenstoffwechsels in verschiedenen Stoffwechsel- und Krankheitszuständen. Die Messung in Abwesenheit und Gegenwart von Glucose-6-phosphat (G6P) bietet Aufschluss über den regulatorischen Status des Enzyms und einen indirekten Index des Phosphorylierungszustands. Der [U-14C]-UDP-Glukoseeinbau-Assay ist eine effiziente und gut dokumentierte Technik zur Messung der enzymatischen ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Die Finanzierung wurde zum Teil von der Ball State University, der Indiana University School of Medicine-Muncie und Aro Biotherapeutics bereitgestellt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
[14C] Uridin-5-DiphosphoglukoseAmerikanische radiolabelte ChemikalienARC 0154
31 ETCHR-ChromatographiepapierWhatman3031 915
BenzamidinhydrochloridhydratSigmaB6506
Beta-MercapptoethanolSigmaM3148
TrockenbadTorey Pines ScientificSC25
Ethanol (200 Proof)PharmcoAaper111000200
Ethylenglykol-Tetraessigsäure (EGTA)SigmaE4378
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)SigmaE5134
Glukose-6-phosphat-NatriumsalzSigmaG7879
Glykogen aus Kaninchenleber (Typ III)SigmaG8876
Mikroplatten, flacher Boden, 96-BrunnenGreiner655101
Mikroplatten-, PCR-, 96-BrunnenDOT Wissenschaftlich951-PCR
Mehrzweck-SzintillationszählerBeckman CoulterLS 6500
KaliumfluoriddihydratSigma221872
Proteaseinhibitor-CocktailGoldBioGB-108-2
ScintillationscocktailReasearch Products International111195
SzintillationsphiolenReasearch Products International125509
NatriumfluoridSigmaS7920
GewebereißerBiospec-ProdukteModell 398
Tosyllysinchloromethylketon (TLCK)SigmaT7254
Trizma-Basis (99,9 %)SigmaT1503
TrizmahydrochloridSigmaT3253
Uridin-5-Diphospo-GlukoseSigmaU-4625

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

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