Methodenartikel

Modell der Amputation unterhalb des Kniens bei Ratten und sofortige gezielte Muskelwiedernervation

DOI:

10.3791/69119

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22. Mai 2026

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1Department of Plastic Surgery, Medical College of Wisconsin

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll zeigt, wie man bei Ratten eine unterknienahe Amputation durchführen und gezielte Muskelrenervation (iTMR) sofort durchführen kann, um Strategien zur Behandlung und Vorbeugung von amputationsbedingten Schmerzen zu untersuchen und die mit der Amputation verbundenen Schmerzmechanismen besser zu verstehen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Amputationsbedingte Schmerzen verringern die Lebensqualität der Patienten, tragen zum Opioidkonsum bei und können die funktionelle Rehabilitation und den Einsatz von Prothesen verringern. Präklinische Modelle, die zuverlässig nach der Amputation Schmerzen verursachen und gleichzeitig die Mobilität erhalten, sind unerlässlich, um die biologischen Mechanismen dieser Ergebnisse zu untersuchen. Hier präsentieren wir ein detailliertes, reproduzierbares Nagetier-Operationsprotokoll mit Sprague-Dawley-Ratten zur Modellierung der Amputation der Hintergliedmaßen unterhalb des Kniens. Der Eingriff umfasst die Isolierung und Durchschneidung der Ischias-Äste, einschließlich des Tibias-, des Gewöhnlichen Peronealnervs und des Suralnervs, was zu anhaltenden Nervenpathologien nach der Amputation und schmerzbedingten Verhaltensweisen führt. Ratten erholen sich gut von diesem Eingriff und können sich unmittelbar nach der Operation ohne Schwierigkeiten beim Essen oder Trinken bewegen. Tiere können anschließend mit reflexartigen und spontanen Schmerzmaßnahmen untersucht werden. Die Schmerzverhaltensweisen, die durch dieses Verfahren entstehen, sind über die Zeit robust, und aus dem Stumpf können standardmäßige reflexive Schmerzverhaltensweisen erzeugt werden. Wichtig ist, dass erhaltene Mobilität longitudinale Verhaltenstests ermöglicht, ohne motorische Beeinträchtigungen zu stören. Obwohl dieses Protokoll auf die Amputation ausgerichtet ist, lässt es sich leicht anpassen, um gezielte Muskelrenervation (TMR) als postamputative Intervention einzubeziehen, indem durchschnittene Nerven an nahegelegene motorische Zweige der Nerven bis zum Bizeps femoris und Semimembranosus koaptiert werden, was die Untersuchung von Reinnervationsinterventionen und deren Auswirkungen auf Schmerzen nach der Amputation ermöglicht. Dieses Modell haben wir bereits erfolgreich verwendet, um geschlechtsspezifische Unterschiede im Schmerzverhalten nach einer Amputation zu bewerten und die Auswirkungen von TMR zu untersuchen. Dieses Protokoll bietet eine robuste und flexible Plattform zur Untersuchung amputationsbedingter Schmerzen, Neurombildung und funktioneller Ergebnisse mit Anwendbarkeit auf translationale Studien, die darauf abzielen, Schmerzen nach der Amputation zu verbessern.

Einleitung

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Chronische Schmerzen sind eine der lähmendsten Komplikationen nach einer größeren Gliedmaßenamputation und betreffen bis zu 70 % der Patienten 1,2,3. Konventionelle Schmerztherapiestrategien wie pharmakologische Interventionen, Physiotherapie, Nervenblockaden und psychologische Therapien bieten oft begrenzte oder vorübergehende Linderung4. Daher besteht weiterhin ein erheblicher klinischer Bedarf an effektiven langfristigen Schmerzmanagementstrategien.

Die gezielte Muskelrenervation (TMR), ursprünglich entwickelt zur Verbesserung der Kontrolle von myoelektrischen Prothesen, hat sich als vielversprechender Ansatz zur Schmerzlinderung nach einer Gliedmaßenamputationerwiesen. Die chirurgische Technik beinhaltet die umgeleitete gemischt motorische Nerven zu nahegelegenen motorischen Ästen. Klinisch hat TMR deutliche Reduktionen von Phantomschmerzen, Restschmerzen und neurombezogenen Symptomen 6,7,8 gezeigt. Regenerative periphere Nervenschnittstellen (RPNI) sind eine weitere chirurgische Behandlung bei Schmerzen durch Nervenverletzungen und Amputationen. Amputierte Nervenenden werden angenäht und dann in ein freies (denerviertes, avaskuläres) Muskeltransplantat9 eingewickelt. Die amputierten Axone neurotisieren die denervierten neuromuskulären Übergänge, um eine Muskelkontraktion im Transplantat zu erzeugen, die als Signal zur Myoprosthese-Kontrolle genutzt werden kann. Im Gegensatz zu TMR wurde RPNI umfassend in einem Nagetiermodell untersucht. Ähnlich wie TMR wurde gezeigt, dass RPNI die Bildung von Neuromen verhindert und Schmerzen im Zusammenhang mit einer Nervendurchquerungsverletzung10,11 reduziert. Klinisch wurde gezeigt, dass RPNI sowohl Phantom- als auch Restschmerzen in der Gliedmaße bei Amputiertenreduziert 12.

Trotz klinischer Einführung sind die biologischen Mechanismen, die den analgetischen Effekten von TMR und RPNI zugrunde liegen, weiterhin schlecht verstanden. Präklinische Modelle sind entscheidend, um diese Mechanismen aufzuklären. Frühere Arbeiten haben Nervendurchschnittsmodelle mit Modifikation verwendet, um den Nerv zu superficialisieren und direkt auf Neuromschmerzenzu testen 10,11. Diese Modelle können neuromatöse Schmerzen mit direkter Stimulation und neuropathische Schmerzen quantifizieren, indem sie wirbelsäulenartige Reflexverhalten in der intakten Nervenverteilung im Fuß untersuchen. Die verschonte Nervenverletzung zum Beispiel erhält den Nervus Suralia, und der Tibianerv sowie der Nervus common peronealis werden durchschnitten. Der Schmerzverhaltenstest wird am seitlichen Fuß13 durchgeführt. Das Modell der Amputation der Hintergliedmaßen stellt die schwerwiegendste mögliche Verletzung der Gliedmaße dar. Daher gibt es einen weit verbreiteten neuronalen Verlust sowie die erheblichen entzündlichen und heilenden Anforderungen, die mit einer solchen Verletzung verbunden sind. Bei einer Nervenverletzung helfen die gesunden Neuronen im DRG, die verletzten Neuronen aufrechtzuerhalten. Bei der Amputation wird die Anzahl der verfügbaren gesunden Neuronen stark reduziert, und für jeden verletzten Nerv gibt es einen größeren neuronalen Verlust, als wenn nur ein einziger Nerv verletzt wäre 14,15,16. Frühere Berichte über Überlebensoperationen zur Überlebensamputation der Hintergliedmaßen sind selten:17,18. Es gibt jedoch Vorteile gegenüber einer Amputation der oberen Gliedmaßen, wie etwa die Fülle historischer Daten, die Schmerzen und Regeneration im Zusammenhang mit dem Ischiasnerv untersuchen, sowie mehrere ambulante Verhaltenstests19,20.

Um diese Lücke zu schließen, haben wir kürzlich ein Modell der Ratten-Hintergliedmaßenamputation entwickelt, das die unmittelbare TMR einbezieht (Abbildung 1). Die Technik zur Erstellung von RPNI wurde bereits veröffentlicht und kann an das Hintergliedmaßenamputationsmodell21 angepasst werden. Dieses Modell spiegelt klinische Verfahren eng wider und ermöglicht es uns, verschiedene Schmerzverhaltensweisen, Neurombildung und Neuronenerhaltung zu bewerten (Abbildung 2)22. Unsere Arbeit hat signifikante schmerzlindernde Vorteile von TMR gegenüber Standardamputationen, Neuromprävention und sexuell dimorphe Reaktionen bei Kältesensitivitätgezeigt 22,23.

Das hier vorgestellte Protokoll bietet eine detaillierte, standardisierte visuelle Demonstration der chirurgischen Technik und stellt so Reproduzierbarkeit und Konsistenz in experimentellen Ansätzen sicher. Indem zentrale Schritte wie Nervenisolierung, präzise Durchtrennung und spannungsfreie Nervenkoaptation, bietet dieses Protokoll den Forschern einen robusten Rahmen zur Untersuchung der Mechanismen hinter TMR-vermittelter Analgesie und Neuromprävention.

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Protokoll

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Alle Tierverfahren müssen vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt und den Leitlinien der National Institutes of Health (NIH) für die Pflege und Nutzung von Labortieren entsprechen.

1. Präoperative Vorbereitung

HINWEIS: Männliche und weibliche Sprague-Dawley-Ratten (Charles River Laboratories) im Alter von 8–10 Wochen und mit einem Gewicht von 250–300 g wurden verwendet.

  1. Schalten Sie das Wärmepad ein und bereiten Sie ein steriles Operationsfeld vor. Setzen Sie ein steriles Pad senkrecht zum Körper der Ratte für eine optimale Belichtung.
  2. Ordnen Sie alle chirurgischen Werkzeuge und Materialien an: sterile Kochsalzlösung (0,9 % Natriumchlorid), Povidon-Jod-Antiseptikumlösung, Meloxicam, Kauterie, 10-0 Mikronaht, 4-0 resorbierbare geflochtene Nähte, Lineal und Hautklebstoff.
    HINWEIS: Alle chirurgischen Instrumente sollten durch Autoklavierung oder Heißperlensterilisation sterilisiert werden.
  3. Führen Sie die Anästhesie ein, indem Sie die Ratte in eine Induktionskammer mit 4 % Isofluran, Sauerstoff bei 10 L/min und Luft bei 60 % legen. Nach 4 Minuten oder einmal ohne Reaktion wechselst du zu einem Nasenkegel und passe das Isofluran je nach Rattengröße auf 1,5–2,0 % an.
  4. Rasieren Sie die Operationsstelle vom unteren Rücken bis zum gesamten Hinterbein. Führen Sie eine dreifache Vorbereitung mit abwechselnder Povidon-Jod-Antiseptikumlösung und Alkoholabstrichen durch, abschließend mit Alkohol.
  5. Geben Sie 1 mg/kg Meloxicam subkutan mit einer Tuberkulinspritze (typischerweise 0,2 ml bei einer 200-g-Ratte).

2. Unterknieamputation (Abbildung 1)

  1. Verwenden Sie ein Lineal, um die Kniegelenklinie zu markieren, und machen Sie zwei weitere Markierungen 2 cm und 3 cm distal vom Knie.
  2. Machen Sie mit einem Skalpell einen umlaufenden Hautschnitt 3 cm distal vom Knie.
  3. Verwenden Sie eine stumpfe und scharfe Sektion, um die Haut umkreisend von der darunterliegenden Muskulatur zu trennen, bis sie sich frei zurückzieht.
  4. Wiederholen Sie diesen Unterminierungsprozess mit den darunterliegenden Muskeln, wobei Sie vorsichtig bis zum Knochen dissektionieren und dabei die Gewebeflächen erhalten. Markiere die Tibia/Fibula 1 cm proximal zum umlaufenden Schnitt mit einer sterilen Kauterierung oder einem Marker.
  5. Verwenden Sie eine kleine Knochenschere, um das Tibia und das Wadenbein an der markierten Stelle zu durchschneiden. Verwenden Sie eine Kauterisation, um eine Hämostase zu erreichen. Untersuchen Sie das Knochenende auf scharfe Kanten und stumpfen oder schneiden Sie es bei Bedarf ab.
  6. Mit einer 4-0-resorbierbaren geflochtenen Naht schließen Sie die vorderen und hinteren Muskelkompartimente über dem Knochen zusammen, um ein Muskelpolster zu bilden. Beginnen Sie damit, die vordere Kante über dem Schienbein, dem primären Druckpunkt, zu nähen. Typischerweise werden 4–6 unterbrochene Nähte verwendet.
  7. Schließen Sie die Haut seitlich mit unterbrochenen, absaugbaren 4-0 geflochtenen Nähten, wobei Sie vermeiden, direkt auf den tragenden Stumpf zu platzieren. Tragen Sie Hautkleber entlang der Schnittlinie auf.

3. TMR-Interventionsoperation (Abbildung 1)

  1. Machen Sie einen 1,5–2 cm langen längsliegenden Glutealspaltungsschnitt etwa 5 mm hinter dem Oberschenkelknochen.
  2. Verwenden Sie eine stumpfe Dissektion, um die Gluteal- und Oberschenkelmuskulatur zu trennen, wodurch der Ischiasnerv direkt proximal zu seiner Dreiteilung in den Tibias-, den Nervus Common Peronealis (CP) und den Suralnerv freiliegt.
  3. Identifizieren Sie proximale motorische Zweige: Ein großer Ast verläuft unter dem Caudofemoralis (CFM) hindurch und bildet den Ast zu CFM, semimembranosus (SM) und Biceps femoris (BF).
  4. Heben Sie das CFM mit einem Wattestäbchen an und teilen Sie es. Neurolysieren Sie die SM- und BF-Verzweigungen sorgfältig mit stumpfer Dissektion unter chirurgischem Mikroskop und mikrochirurgischer feiner Dumont-Zange.
    1. Verwenden Sie eine Pinette, um das Epineurium zu greifen, und öffnen Sie mit einer feinen gebogenen Federschere das Epineurium und teilen es längs und trennen die verschiedenen Äste voneinander.
    2. Den CFM-Zweig erhalten und die anderen in der Nähe des Ischiasstamms aufteilen. Der Kurvenmotor verzweigt sich unterhalb, um die Koaptation zu erleichtern.
  5. Neurolysieren Sie die Ischias-Trifurkation, indem Sie das Epineurium öffnen und mit einer feinen gebogenen Federschere teilen. Ziehe die Nervverzweigungen vorsichtig mit feinen Zangen auseinander. Greifen Sie jeden der drei Zweige (CP, Tibial, Sural) 5–10 mm distal zur Trifurkation mit einer Pinzette.
  6. Ziehe Spannung und durchschneide jeden Nerv so weit wie möglich. Greifen Sie das abgeschnittene distale Ende und machen Sie einen sauberen Schnitt zum proximalen Ende, indem Sie mindestens 5–10 mm herausschneiden.
  7. Führen Sie die Koaptationen mit 10-0 Nylonnähte durch: die CP zu SM mit einer Naht, Tibial zum großen BF-Ast mit ein bis zwei Nähten und surial zum kleinen BF-Ast mit einer Naht. Verwenden Sie mindestens 3 Knoten pro Naht, sorgen Sie für eine spannungsfreie Platzierung, vermeiden Sie es, den Nerv so stark anzuspannen, dass sie den Nerv falten, und legen Sie Koaptationen ohne scharfe Winkelung an.

4. Nur Amputationsgruppe

  1. Ligiere CP, Tibia- und Suralnerven mit einer 5-0-Seidennaht. Behandle die Seide mit einer Dumont-Nahtzange zum Binden. Stellen Sie sicher, dass die Ligatur den Nerv krümmert und mit 4 quadratischen Knoten befestigt ist.
  2. Ziehen Sie vorsichtig jeden Nerv proximal mit dem Knoten und schneiden Sie 1–2 mm distal zur Ligatur durch. Entfernen Sie 10 mm des distalen Nervensegments.
  3. Fahren Sie mit der Amputation wie in Abschnitt 2 beschrieben fort.

5. Postoperative Versorgung

  1. Bringen Sie die Ratte zurück in einen beheizten Käfig, bis sie wieder gehüpft ist. Geben Sie 24 Stunden später eine zweite Meloxikam-Dosis (0,2 ml) subkutan.
  2. Überwachen Sie täglich 7 Tage lang die Wundintegrität, Anzeichen einer Infektion, Schmerzen oder Beschwerden und greifen Sie bei Bedarf gemäß den IACUC-Richtlinien ein.

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Ergebnisse

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Dieses Modell der Amputation der Hintergliedmaßen induzierte zuverlässig neuropathische, schmerzbezogene Verhaltensweisen, während es bei Ratten die Bewegungs- und Erkundungsfähigkeit bewahrte. Wie in Abbildung 2 gezeigt, führt die Durchtrennung des peripheren Nervs während der Amputation ohne distales Ziel zu einem desorganisierten axonalen Wachstum und der Neurombildung an der Ligatur-Stelle, sichtbar durch die Immunfärbung von B-Tubulin und Calcitonin-gen...

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Diskussion

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Dieses Protokoll beschreibt wesentliche chirurgische Schritte, um die Reproduzierbarkeit des Amputationsmodells der Hintergliedmaßen sicherzustellen und demonstriert die Erhaltung der Beweglichkeit und der Verhaltensbeteiligung bei den Tests nach der Amputation. Wichtige chirurgische Prinzipien, darunter sorgfältige anatomische Identifikation, minimale Nervenmanipulation und spannungsfreie Handhabung durchschnittener Nerven, werden betont, um Konsistenz und Reproduzierbarkeit zwischen de...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

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Diese Forschung wurde vom Medical College of Wisconsin Neuroscience Research Center, der Rita Allen Foundation und der Plastic Surgery Foundation unterstützt. Die Autoren danken der Comparative Medicine Unit für die Tierpflege und -unterstützung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10-0 Nylon-Mikronaht (Arosurgical)AROSurgicalT04A10N07-13Feine Nerven-Koaptationsnaht. 10-0 Mikronaht. 
4-0 Polyglykolsäure-NahtEthiconAQ1268Verschlussnaht für Muskel und Haut. Resorbierbare 4-0 Naht. 
5-0 Seiden-ChirurginnahtGenericGenericNervenligatur-Naht
Ausgewachsene Sprague-Dawley-RattenCharles River LaboratoriesGenericExperimentelles Tier
Alkohol-DesinfektionspadsDukal CorporationGenericHautantiseptikum
Betadine 10%Avrio Health LPGenericAntiseptikum
KnochenschereFST16030Knochenschneideinstrument
KautergerätFST18010-00Hämostasegerät
Wattestäbchen-Applikator (ProAdvantage)ProAdvantageRef 76100Gewebemanipulation
Gebogene Mikrodissektor-SchereFST15019-10Feinschere für Neurolyse
Pinzette (feine Dumont)FST11254-20Nervenhandhabungsinstrument
Pinzette (Sutura-Knoten-Dumont)FST11063-07Nähhandhabungsinstrument
Gauze USP Typ VII (Cardinal Health)Cardinal HealthRef 2146Erhaltung des sterilen Feldes
Wärmekissen (TC1000-Temperaturregler)GenericTC1000Temperaturkontrollgerät
Induktionskammer (Braintree Scientific)Braintree Scientific Inc.GenericFür die Anästhesieeinleitung
Isofluran (Isospire)PhoenixGenericAnästhetikum
Meloxicam (Ostilox)VetONE5 mg/mLAnalgetikum
LinealGenericGenericMessinstrument für anatomische Orientierungspunkte
Sterile KochsalzlösungBaxter0,9 Natrium-Lot Y425131Spüllösung
Chirurgisches Messer 15 FST10015-00Hautschnittwerkzeug
TuberkulinspritzeGenericGenericMedikamentengabe
Verdampfer (Surgivet Modell 100)SurgivetModell 100 S/N W2211123Für die Anästhesieaufrechterhaltung
Vetbond GewebekleberWorld Precision InstrumentsGenericHautkleber

Referenzen

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