In vitro Resident Memory CD8 T-Zell-Differenzierung mit dem epithelialen Organoid-T-Zell-Kokultursystem

Zusammenfassung

Um die Differenzierung und Funktion der CD8-T-Zellen in vitro zu untersuchen, können CD8-T-Zellen aus der Maus isoliert werden, um langfristig mit vorgefertigten infizierten vaginalen Epithelorganoiden der Maus kultiviert zu werden. Hier beschreiben wir diesen Prozess und bewerten den Erwerb von Markern der ansässigen Gedächtnis-T-Zellen bei Kokultur.

Zusammenfassung

Barriereschleimhaut spielt eine wichtige Rolle bei der Differenzierung und Funktion der ansässigen T-Zellen. Unter den vielfältigen Zellpopulationen in diesen Geweben sind Epithelzellen ein Schlüsseltreiber der T-Zell-Differenzierung. Unser Verständnis der epithelial-abgeleiteten Signale, die die T-Zellbiologie in mukosalen Umgebungen prägen, bleibt jedoch begrenzt, was vor allem auf das Fehlen spezifischer Werkzeuge und die Komplexität verfügbarer Modellsysteme zurückzuführen ist. Hier beschreiben wir ein musinales vaginales Epithel-Organoid-CD8-T-Zell-Kokultursystem, das dynamische Interaktionen zwischen infiziertem Epithel und virusspezifischen CD8-T-Zellen modelliert. Dieses Protokoll ermöglicht eine phänotypische und funktionelle Analyse der T-Cell-Antworten innerhalb einer physiologisch relevanten dreidimensionalen epithelialen Mikroumgebung. Mit diesem System demonstrieren wir die Differenzierung von Effektor-CD8-T-Zellen in geweberesidente Gedächtnis-T-Zellen (TRM). Dieses vielseitige In-vitro-Kultursystem bietet reduktionistische Möglichkeiten, molekulare Details der epithelialen Hinweise hinter der CD8-T-Zelldifferenzierung zu untersuchen, die die schützende Immunität und Immunpathologie in Barriereorganen steuern.

Einleitung

CD8-residente Gedächtnis-T-Zellen (TRMs) stellen eine einzigartige Population von Gedächtnis-CD8-T-Zellen dar, die dauerhaft in den peripheren Geweben zurückgehalten werden, ohne routinemäßig durch Blut- und lymphoides Gewebe zirkulieren zu müssen. Diese TRM-Zellen sind strategisch in Barriereorganen positioniert, darunter Haut, Lunge, Darm und den Fortpflanzungstrakt, wo sie als Wächter gegen Krankheitserreger und entstehende Tumore^agieren. Bei der Entdeckung des Erregers setzen CD8-TRM-Zellen schnell zytotoxische Granulen frei, um infizierte Zellen direkt zu eliminieren, während sie gleichzeitig entzündliche Zytokine absondern, die die umliegenden Gewebezellen alarmieren, und zirkulierende Immuneffektoren rekrutieren, um die Verbreitung des Erregers^zu kontrollieren ^3,4. Die Wirksamkeit von CD8-TRMs bei der Antipathogenimmunität sowie in der Krebsimmuntherapie wurde bereits^{nachgewiesen 5,6}. Daher ist es ein zentrales Ziel für Impfstoffe und immuntherapeutische Strategien, eine große Menge funktionell kompetenten CD8-TRM in Barriereschleimhaut zu platzieren.

Die Bildung und Erhaltung von CD8 TRM in peripheren Organen hängt kritisch von lokaler gewebespezifischer Programmierung ab. Diese lokalen Umwelthinweise umfassen einzigartige gewebeabgeleitete Zytokine und Stoffwechselagenten sowie interzelluläre Interaktionen, die gemeinsam die gewebespezifische TRM-Identität ^7,8,9 durchsetzen. Diese Gewebeprogrammerung ermöglicht es TRM, sich an gewebespezifische Anforderungen bei der Ausführung ihrer Immunüberwachungsaufgaben anzupassen. Unser Verständnis der Natur dieser Wechselwirkungen ist jedoch unvollständig, da robuste Modellsysteme fehlen, die diese Prozesse getreu erfassen. Kleintiermodelle sind zwar sehr informativ, leiden aber oft unter einem hoch vernetzten, komplexen Netz von Interaktionen, das schnelle Hochdurchsatzstudien behindert.

Hier beschreiben wir eine in-vitro-Alternative zum Mausmodell, die eine Untersuchung der molekularen Details epithelzellbasierter Hinweise hinter der CD8-TRM-Differenzierung ermöglicht. Durch Kokultivierung von vorgefertigten vaginalen Epithelorganoiden (VEOs) mit aktivierten CD8-T-Zellen erzeugten wir CD8-TRM in vitro. Eine detaillierte Beschreibung des CD8-T-Zellaktivierungs- und Kokultivierungsprozesses ermöglicht eine breitere Übernahme dieses Prozesses über Gewebe hinweg und führt zu einem besseren Verständnis zellulärer Interaktionen, die das CD8-T-Zellgedächtnis in Frontliniengeweben prägen.

Protokoll

Alle Verfahren mit Tieren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Brown University überprüft und genehmigt (Protokollnummer 22-10-0001).

1. Grundlegende Einrichtung und Vorbereitung einer Aktivierungsplatte

1. Bereiten Sie einen Tag vor Beginn des Experiments eine unbehandelte Gewebekulturplatte für die Aussaat mit naiven CD8-T-Zellen vor. Bereite eine Lösung aktivernder Antikörper in sterilem dPBS mit einer Endkonzentration von 1 μg/mL für Anti-CD3ε (2C11) und 0,167 μg/mL für B7-1 Fc vor. Für eine 24-Well-Platte dosieren Sie 600 μL dieser Lösung pro Bohrloch. Über Nacht bei 4 °C inkubieren, bis es einsatzbereit ist.
2. Bereiten Sie den Lymphozytenanreicherungspuffer in sterilem dPBS vor, indem Sie 2 % kohlegestreiften FBS und 1 mM EDTA zu sterilem dPBS hinzufügen. Lagern Sie bei 4 °C, bis sie einsatzbereit ist.
3. Bereiten Sie einen Ammoniumchlorid-Kalium-Rotblutkörperchen (ACK RBC) Lysepuffer in ddH₂O vor, indem Sie 10 mM Kaliumbicarbonat, 155 mM Ammoniumchlorid und 0,1 mM EDTA hinzufügen. Filtersterilisieren und bei Zimmertemperatur aufbewahren.
4. Bereiten Sie die passende Menge Erntemedium in RPMI vor, indem Sie 5 % kohlegestreiftes FBS hinzufügen. Lagern Sie bei 4 °C, bis sie einsatzbereit ist. Für jede zu fangende Maus werden 50 ml Erntemedium empfohlen.
   HINWEIS: Penicillin/Streptomycin und Amphotericin B sind optional, aber eine Endkonzentration von 100 Einheiten/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin und 0,2 μg/mL Amphotericin B kann helfen, eine bakterielle und pilzbedingte Kontamination der T-Zellkultur während der Gewebeisolation zu verhindern, falls dies ein Problem darstellt.
5. Bereiten Sie das T-Zellmedium in RPMI vor, indem Sie 10 % kohlegestreiften FBS, 2 mM L-Glutamin, 100 Einheiten/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin, 1x nicht-essentielle Aminosäuren und 1 mM Natriumpyruvat hinzufügen. Für eine 24-Well-Platte verwenden Sie pro Bohrloch 2 ml T-Zell-Medium und 50 ml T-Zell-Medium für eine vollständige Platte. Lagern Sie bei 4 °C, bis sie einsatzbereit ist.
6. Bereiten Sie Dissektionswerkzeuge (0,4 mm Mikro-Sezieren-Schere und 0,8 mm fein gebogene Mikro-Zerschneidungs-Zangen) vor, indem Sie sie in einem Sterilisationsbeutel autoklavieren oder in 70 % Ethanol einweichen.

2. Entnahme und Dissoziation der sekundären lymphoiden lymphoiden Organe erwachsener Maus

1. Schnelle Kühlung einer Zentrifuge auf 4 °C mit geeigneten Adaptern, um 15 mL konische Röhren aufzunehmen.
2. Bereiten Sie Eis für den Transport von Geweben und Lymphozyten während der Ernte- und Inkubationszeiten vor.
3. Bereiten Sie ein steriles 15-ml-konisches Rohr mit mindestens 5 ml Erntemedium pro Maus vor, das seziert werden soll.
4. Betäuben und euthanatieren Sie eine adulte CD8-T-Zell-Transgene Maus (~8 Wochen alt) gemäß dem institutionellen Protokoll in einer laminaren Flusshaube.
5. Stecken Sie die Gliedmaßen der Maus mit Nadeln beliebiger Größe auf eine saubere Polystyrolschaumoberfläche und sprühen Sie den Oberkörper mit 70 % Ethanol ein, um zu verhindern, dass das Fell den Schnitt verstopft und an Werkzeugen haftet.
6. Mit sauberen Mikro-Sezieren-Scheren und Pinzetten machen Sie einen vertikalen Bauchschnitt und trennen Sie die Haut von der dünnen Bindegewebeschicht darunter. Stecken Sie die Haut mit Nadeln beliebiger Größe auf die Polystyrolschaumoberfläche und schneiden Sie das verbliebene Bindegewebe durch, um die Organe im Oberkörper freizulegen.
7. Sorgfältig lokalisieren und entfernen Sie die Milz, entfernen Sie überschüssiges Fett mit der gebogenen Pinzette und übertragen Sie es in das 15-ml-konische Rohr mit dem Erntemedium. Lassen Sie die Milz auf Eis und isolieren Sie so viele Lymphknoten wie möglich (z. B. Iliaka und Leisten), um sie mit der Milz in derselben konischen Eisröhre zu verbinden.
   HINWEIS: Die iliakalen Lymphknoten befinden sich auf beiden Seiten der Kaudalvena cava im unteren Bauchbereich unter dem Magen-Darm-Trakt, und die leistenalen Lymphknoten befinden sich nahe der Verzweigung der oberflächlichen epigastrischen Vene auf beiden Seiten der unteren Bauchhaut des Rumpfes. Isolieren Sie weitere Lymphknoten, um die Ausbeute der CD8-T-Zellen nach der Anreicherung zu verbessern; allerdings reicht die Isolierung der Milz allein in der Regel aus, um mehrere Millionen CD8-T-Zellen zu liefern.
8. Milz und Lymphknoten werden auf eine geritzte 60-mm-Schale übertragen und mit dem flachen Ende eines 3-ml-Spritzenpümpels mechanisch Milz und Lymphknoten getrennt, indem das Gewebe zermahlen wird, bis keine großen Fragmente mehr übrig sind.
9. Sammeln Sie die Suspension, indem Sie sie durch ein steriles 70-μm-Zellsieb in ein frisches, steriles 15-mL-konisches Rohr führen. Waschen Sie die 60-mm-Schüssel mit 5 ml Erntemedium, um den vollständigen Transfer der disaggregierten Zellen sicherzustellen, und filtern Sie in dasselbe 15-mL-konische Rohr.
10. Zentrifugiere die Suspension bei 584 × g für 5 Minuten bei 4 °C. Verwerfen Sie das Überlagerungsmittel und stellen Sie das Rohr an, indem Sie den Boden schnell und energisch über das Gitter eines Zentrifugenröhrenhalters führen, um das Pellet zu lockern.
11. Erythrozyten wird durch Resuspendierung des gelockerten Pellets in 2 mL ACK RBC-Lysepuffer verwendet. Vortex und 2 Minuten bei Zimmertemperatur inkubieren.
12. Nach 2 Minuten neutralisieren Sie den Lysepuffer, indem Sie 2 ml Erntemedium hinzufügen. Saugen Sie die Suspension mit einer 5-mL serologischen Pipette ab und filtern Sie durch einen sterilen 70-μm-Filter zurück in dasselbe 15-mL konische Rohr.
    HINWEIS: Diese Filtration ist wichtig, um die Entfernung aller Klumpen sicherzustellen.
13. Zentrifugiere die Suspension bei 584 × g für 5 Minuten bei 4 °C. Entsorgen Sie das Supernatant und setzen Sie das Pellet in 950 μL Lymphozytenanreicherungspuffer wieder auf.

3. CD8-T-Zellanreicherung und Aktivierung

1. Beginnen Sie damit, naive CD8-T-Zellen aus Lymphozyten mit einem kommerziell erhältlichen Isolationskit zu bereichern. Folgen Sie dem Protokoll des Herstellers.
2. Sobald CD8 T-Zellen angereichert sind, wird die angereicherte Suspension in ein neues, steriles 15-mL konisches Rohr übertragen und das Volumen bis zu 10 mL mit Erntemedium gefüllt.
3. Zähle mit einem Hämozytometer.
   HINWEIS: Von einer erwachsenen Maus ist es möglich, mindestens 5–10 Millionen naive CD8-T-Zellen bei >95 % Reinheit zu isolieren.
4. Plattieren Sie mindestens 500.000 Zellen in 2 mL T-Zellmedium pro Brunnen einer 24-Well-Platte. T-Zellen werden vor der Beschichtung gründlich gemischt, um eine homogene Einzelzellsuspension sicherzustellen. Ergänzen Sie das T-Zellmedium mit einer Endkonzentration von 100 Einheiten/mL IL-2, 2,5 ng/mL IL-12 und 55 μM Beta-Mercapttoethanol.
5. Entfernen Sie die zuvor antikörperbeschichtete Gewebekulturplatte aus der 4 °C Zone und aspirieren Sie vorsichtig die Beschichtungslösung, ohne den Boden der Bohrungen zu berühren.
6. Sofort Platten-T-Zellen. Inkubiere bei 37 °C mit 5 % CO2_{für 2} Tage.

4. Entfernen von Aktivierungssignalen und ruhender aktivierter CD8 T-Zellen

1. Beobachten Sie aktivierte Bohrlöcher unter einem Lichtmikroskop. Nach 2 Tagen Aktivierung suchen Sie nach kleinen Clustern von T-Zellen in den Wells. Größere Cluster deuten auf mehr Aktivierung hin. Wenn keine oder nur wenige Cluster vorhanden sind, brüten Sie die Platte bei 37 °C mit 5 %_CO2 für einen weiteren Tag aus, bevor Sie mit der Ruhe fortfahren.
2. Bereiten Sie Eis zur Aufbewahrung von T-Zell-Suspension während der Inkubationszeit und bei Nichtbenutzung vor.
3. T-Zellen werden mit einer P1000-Pipette wieder aufgehängt, indem man mehrmals in jeder Ecke des Bohrlochs auf und ab pipettiert. Wenn die T-Zellen angehoben sind, wird der Inhalt des Brunnens in ein steriles 50-mL konisches Rohr übertragen und gezählt.
   HINWEIS: Das Reinigen jedes Bohrlochs mit 1 ml dPBS ist optional, aber das Kombinieren von dPBS-Wash mit der T-Zell-Suspension kann die T-Zell-Ausbeute erhöhen.
4. Schichten Sie die T-Zellen in der gleichen Konzentration wie in Schritt 3.4 neu an, also 250.000 Zellen/mL bei 2 mL pro Bohrloch. Bereite die passende Menge T-Zell-Medium vor, ergänzt mit 100 Einheiten/mL IL-2 und 55 μM Beta-Mercapttoethanol.
5. Zentrifugiere die Suspension bei 584 × g für 5 Minuten bei 4 °C, entsorge Supernatant und suspendiere das Pellet erneut im entsprechenden Volumen des T-Zellmediums, das im vorherigen Schritt für die Anzahl der zu verplattenden Bohrungen vorbereitet wurde. Gründlich mischen, um eine homogene Einzelzell-Suspension zu gewährleisten.
6. Platte 2 mL T-Zell-Suspension (500.000 Zellen/Bohrloch) in einer neuen, nicht behandelten Gewebekulturplatte ohne Antikörperbeschichtung. Inkubiere bei 37 °C mit 5 % CO2_{für 2} Tage.

5. Infizierung von vorformten vaginalen Epithelorganoiden der Maus mit dem Virus

HINWEIS: Wir haben sowohl das Herpes-Simplex-Virus-2 (HSV-2) als auch das lymphozytäre Choriomeningitis-Virus (LCMV) verwendet, um eine virale Infektion der Organoide durchzuführen. Beide gelten als Biosicherheits-Level-2 (BSL-2)-Agenten. Führen Sie alle Verfahren mit Infektionserregern in einem zertifizierten BSL-2-Biosicherheitsschrank durch. Reinigen Sie Arbeitsbereiche mit 70 % Ethanol sowohl vor als auch nach der Nutzung und entsorgen Sie alle Materialien gemäß den institutionellen Biosicherheitsrichtlinien. Für dieses Protokoll etablierten wir VEOs aus vaginalen Epithelzellen, die aus dem vaginalen Epithel von C57BL/6 weiblichen Mäusen entnommen wurden, wie vor¹⁰ beschrieben.

1. Platten-VEOs mit einer Dichte von 10.000 Zellen in 20 μL Basalmembranextrakt (BME) pro Bohrloch einer 24-Well-Platte 7–10 Tage vor der Infektion.
2. Einen Tag vor der Kokultivierung wird ein Brunnen mit VEOs zur Trypsinisierung und Zählung bereitgestellt, um eine genaue Infektionsmultiplikation (MOI) zu erhalten. Vorwärme 0,25 % Trypsin-EDTA in einem 37 °C Wasserbad für 5 Minuten.
   HINWEIS: 0,25 % Trypsin-EDTA werden während der Infektion nicht verwendet; sie ist nur notwendig, um die VEOs während MOI-Berechnungen zu dissoziieren. Die Beschichtung von Kunststoffwaren (z. B. Pipettenspitzen, konische Röhren) mit 2,5 % BSA in dPBS ist in diesem Schritt optional, kann aber helfen, den Verlust von Organoiden und Zellen zu reduzieren, um eine genauere Zählung zu ermöglichen.
3. Zellkulturmedium aus dem vorgesehenen Brunnen aspirieren und mit dPBS waschen.
4. Geben Sie 600 μL vorgewärmtes 0,25%iges Trypsin-EDTA in den Brunnen ab und suspendieren Sie gründlich mit einer BSA-beschichteten P1000-Pipette, um das BME mechanisch zu stören. Übertragen Sie den Inhalt des Brunnens in ein BSA-beschichtetes, steriles 15-ml-konisches Rohr.
5. Inkubieren Sie in einem 37 °C Wasserbad für 5 Minuten. Nach 5 Minuten 10 ml 10 % FBS in RPMI hinzufügen, um die Trypsinisierung zu dämpfen.
6. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 500 x g für 5 Minuten bei 4 °C. Entsorgen Sie das Überdachungsmittel und suspendieren Sie es mit einer BSA-beschichteten Pipettenspitze in 100–300 μL T-Zellorganoid-Kulturmedium oder einfachem DMEM/F12.
   HINWEIS: Das Volumen hängt von der Größe des Pellets ab. Wenn das Pellet kaum sichtbar ist, schaffe es in einem niedrigeren Volumen wieder auf.
7. Zähle mit einem Hämozytometer. Berechnen Sie die angemessene Menge an Virus, die benötigt wird, um 0,1 MOI anhand des bekannten viralen Titers und der Zelldichte pro VEO-Welle gemäß folgender Gleichung zu erreichen:
   
8. Aspirieren Sie Zellkulturmedien aus den VEE-Brunnen, um infiziert zu werden und mit 500 μL vorgewärmtem (37 °C) dPBS zu waschen. Inkubieren Sie die Brunnen mit dPBS für 5 Minuten bei 37 °C.
9. Nach 5 Minuten entsorgt man das dPBS und fügt 500 μL organoides Medium pro Bohrloch mit genügend viralen Partikeln hinzu, um ein MOI von 0,1 zu erreichen. Inkubieren Sie bei 37 °C mit 5 % CO2_{für 1} Stunde, wobei die Gewebekulturplatte alle 20-30 Minuten sanft manuell gewirbelt wird.
10. Nach der 1-stündigen Inkubation wird das virale organoide Medium aspiriert und mit 500 μL vorgewärmten (37 °C) dPBS gewaschen. Aspirieren Sie dPBS und ersetzen Sie es durch frisches organoides Medium.

6. Kokultivierung von CD8-T-Zellen mit virusinfizierten, vorgeformten vaginalen Epithelorganoiden der Maus

1. Vor der Kokultur (idealerweise 4–24 Stunden im Voraus) wird das BME vom -80 °C auf 4 °C zum Auftauen übertragen. Erwarten Sie die angemessene Menge an BME zum Auftauen basierend auf dem Co-Culture-Experimentaldesign: Planen Sie, 8 μL BME pro Bohrloch einer 96-Bohrloch-Platte und 20 μL BME pro Bohrloch einer 24-Bohrloch-Platte zu platieren.
   HINWEIS: BME ist viskos, und eine längere Auftauzeit bei 4 °C verringert die Viskosität und verbessert die Manövrierfähigkeit.
2. Bereite 2,5 % BSA in dPBS vor und filtere sterilisieren. Verwenden Sie diese BSA-Lösung, um jede Kunststoffoberfläche, die mit den VEOs in Kontakt kommt, zu beschichten (z. B. Pipettenspitzen, konische Schläuche).
   HINWEIS: Diese Beschichtung verhindert, dass VEOs an der Kunststoffoberfläche haften bleiben und beim Handling verloren gehen.
3. Überprüfen Sie VEOs unter einem Lichtmikroskop auf Größe und allgemeine Gesundheit. Bestätigen Sie, dass VEOs 7-10 Tage nach der Kultur erfolgen und im Durchschnitt ~100 Mikrometer im Durchmesser haben. Gesunde VEOs weisen wenige oder keine einzelnen Zellen auf und weisen eine einheitliche, runde Morphologie auf.
   HINWEIS: VEOs 1:1 in Kokultur neu zu beschichten, wenn sie in einer 24-Well-Platte gezüchtet und in einer 24-Well-Platte neu plattiert werden (d. h. eine VEO-Well besetzt eine T-Zell-organoid-Co-Kultur). Wenn eine 96-Well-Platte von einer 24-Well-Platte neu plattiert wird, werden VEOs 1:2 neu plattiert (d. h. ein Brunnen mit VEOs besetzt zwei Wellen mit T-Zell-Organoid-Kokultur).
4. Platzieren Sie die erforderliche Anzahl steriler 96- oder 24-Well-Gewebekulturplatten, die für die Kokultur verwendet werden sollen, in den 37 °C Inkubator.
   HINWEIS: Eine erwärmte Platte beschleunigt die Haftung und Verhärtung des BME.
5. Bereiten Sie T-Zell-Organoid-Kulturmedium in DMEM/F12 vor, indem Sie 2 % B-27-Supplement, 2 mM L-Glutamin, 100 Einheiten/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin, 1x nicht-essentielle Aminosäuren, 1 mM Natriumpyruvat und 0,2 μg/mL Amphotericin B vorbereiten. Lagern Sie in 4 °C, bis es gebrauchsfertig ist.
6. Zellkulturmedium aus VEE-Brunnen aspirieren und jedes Bohrloch mit 500 μL kaltem (2-8 °C) sterilem dPBS waschen.
7. Saugen Sie dPBS ab und fügen Sie 200–500 μL kalte (2–8 °C) organoide Entsorgungslösung hinzu (mindestens das 10-fache Volumen organoiden BME-Tröpfchens). Pipette mit einer BSA-beschichteten P200-Pipette auf und ab, um die BME mechanisch zu stören.
8. Inkubieren Sie die Platte mit sanftem Schütteln (~100 U/min) auf einem Orbitalshaker bei 4 °C für 20 Minuten. Wenn kein kalter Orbitalshaker verfügbar ist, inkubieren Sie die Platte auf Eis und schütteln Sie manuell alle 5 Minuten. Wenn BME nach 20 Minuten nicht depolymerisiert ist, verlängern Sie die Inkubationszeit bei Bedarf.
9. Übertragen Sie den Inhalt der Brunnen mit einer BSA-beschichteten Pipettenspitze in ein BSA-beschichtetes steriles 15 mL oder 50 mL konisches Rohr auf Eis. Zentrifugiere die Suspension bei 500 × g für 5 Minuten bei 4 °C.
10. Entsorgen Sie das Supernatant und waschen Sie VEOs mit 5–10 ml kaltem (2–8 °C) dPBS (mindestens 10-faches Volumen kombinierter organoider BME-Tröpfchen). Zentrifugiere die Suspension bei 500 × g für 5 Minuten bei 4 °C.
11. Entsorgen Sie das dPBS und suspendieren Sie das Pellet in 1 ml T-Zell-Organoid-Kulturmedium mit einer BSA-beschichteten P1000-Pipettenspitze. Lassen Sie die VEE-Suspension auf Eis, bis die T-Zellen bereit sind, kokultiviert zu werden.
12. Beginnen Sie mit dem Sammeln der T-Zellen für die Kokultur. Überprüfen Sie ruhende T-Zellen unter einem Lichtmikroskop auf Größe und allgemeine Gesundheit. Ohne aktivierende Signale verlangsamen T-Zellen ihre Vermehrung, sollten aber dennoch einige Cluster gebildet haben. Bestätigen Sie, dass keine Zellreste oder -fragmente vorhanden sind und T-Zellen eine vergrößerte Morphologie besitzen. Setzen Sie T-Zellen mit einer P1000-Pipette wieder auf- und ab, indem Sie in jeder Ecke des Bohrlochs mehrmals auf und ab pipettieren und die Gesamtzahl der lebenden CD8-T-Zellen zählen.
    HINWEIS: Pro Bohrloch einer 96-Well-Platte Samen 100.000 T-Zellen pro Kokultur in 8 μL BME. Pro Brunnen einer 24-Brunnen-Platte werden 200.000 T-Zellen pro Kokultur in 20 μL BME gesaat.
13. Zentrifugiere die Suspension bei 584 × g für 5 Minuten bei 4 °C. Entsorgen Sie das Supernatant und suspendieren Sie das Pellet in 10 ml T-Zell-Organoid-Kulturmedium. Kombinieren Sie T-Zellen mit VEOs, indem eine angemessene Anzahl von T-Zellen für die zu verplattenden Bohrungen in das konische Rohr mit den VEOs übertragen wird.
14. Zentrifugiere bei 584 × g für 5 Minuten bei 4 °C. Entsorgen Sie das Supernatant und setzen Sie VEOs und T-Zellen in der entsprechenden Menge BME wieder auf. Gründlich mit einer BSA-beschichteten Pipettenspitze mischen und auf eine vorgewärmte Gewebekulturplatte verlagern, 20 μL pro Muld einer 24-Well-Platte oder 8 μL pro Bohrloch einer 96-Well-Platte.
    HINWEIS: Lassen Sie BME beim Anrichten auf Eis oder in einem Kühlblock bei 4 °C aufbewahren. Das Platzieren der Pipettenspitzen für 30 Minuten im 4 °C-Kühlschrank vor dem Anrichten kann helfen, eine vorzeitige Verhärtung des BME zu verhindern.
15. Stellen Sie die Platte kopfüber in den 37 °C Inkubator und warten Sie 30 Minuten auf vollständige BME-Haftung und Verfestigung.
16. Während dieser Inkubationszeit bereitet man das vollständige T-Zell-Organoid-Kulturmedium vor, indem man 100 ng/mL murines EGF, 55 μM Beta-Mercapttoethanol und 10 Einheiten/mL murines IL-2 zum vorgefertigten T-Zell-Organoid-Kulturmedium hinzufügt.
17. Nach der Inkubationszeit wird vorsichtig 500 μL vollständiges T-Zell-Organoid-Kulturmedium pro Bohrloch einer 24-Well-Platte oder 250 μL vollständiges T-Zell-Organoid-Kulturmedium pro Bohrloch einer 96-Well-Platte hinzugefügt. Geben Sie Medien an die Seiten des Brunnens ab, um eine Störung des BME-Tropfens zu vermeiden. Wechsle das Medium alle 2 Tage, bis es zur Analyse geerntet wird.

7. Sammeln von kokultivierten CD8-T-Zellen für die Analyse der Durchflusszytometrie

1. Sobald die Kokulturen mindestens Tag 7 der Kultur erreicht haben, wird zur Analyse geerntet. Wenn T-Zellen bis Tag 7 keine TRM-ähnlichen Marker in der Kokultur exprimieren, wird das Erntedatum zwischen Tag 7 und 14 optimiert, abhängig von phänotypischer Aufnahme sowie der Viabilität von VEO und T-Zellen.
2. Bereite einen fluoreszierenden aktivierten Zell-Sortierpuffer (FACS) für die Färbung und Analyse der Durchflusszytometrie vor, indem du 0,2 % w/v rinderserumalbumin und 0,1 % w/v Natriumazid zu dPBS gibst.
   HINWEIS: Natriumazid ist eine akut giftige Chemikalie. Befolgen Sie institutionelle Empfehlungen bei der Handhabung und Entsorgung aller Abfälle in Übereinstimmung mit institutionellen Biosicherheitsvorschriften.
3. Bereiten Sie einen fluoreszierenden Antikörpercocktail im FACS-Puffer für die Oberflächenfärbung vor, je nachdem, welche Marker für die Analyse gewünscht werden. Für jedes Bohrloch sind mindestens 50 μL Antikörpercocktail berücksichtigt.
4. Bereiten Sie einen fluoreszierenden Viability-Farbstoff in dPBS vor. Für jedes Bohrloch sind mindestens 50 μL Lebensfähigkeitsfarbe berücksichtigt.
5. Entferne das Medium in jedem Brunnen vorsichtig und suspendiere es gründlich in kaltem (2–8 °C) FACS-Puffer, wobei du 10–20 Mal auf und ab pipettierst, um das BME mechanisch zu stören. Übertragen Sie den Inhalt jedes Brunnens auf eine beschriftete 96-Bohrloch-Platte mit rundem Boden.
6. Zentrifugiere bei 859 × g für 2 Minuten bei 4 °C. Senken Sie die Verzögerungsrampe für alle Zentrifugationsschritte weiter, um Probenverlust durch das Pellet-Remixing zu verhindern.
7. Entfernen Sie den Überstandsmittel, indem Sie die Platte umdrehen und die Flüssigkeit mit einer einzigen, festen Abwärtsbewegung ausstoßen. Wieder in 50 μL Antikörpercocktail suspendieren. Pipettieren Sie mindestens 5 Mal auf und ab mit einer Mehrkanalpipette, um eine gründliche Resuspension des Zellpellets sicherzustellen.
8. Inkubieren Sie 30 Minuten bei 4 °C oder Raumtemperatur bei Bedarf, geschützt vor Licht. Am Ende der Inkubationszeit werden 150 μL dPBS zu jedem Brunnen mit einer Mehrkanalpipette hinzugefügt und bei 859 × g für 2 Minuten bei 4 °C Zentrifugiert.
9. Dekantieren Sie das Supernatant, indem Sie die Platte auf den Kopf drehen und sie einmal in einer kontinuierlichen Bewegung nach unten schnippen. Resuspendieren Sie in 50 μL Wirksamkeitsfarbe. Pipettieren Sie mindestens 5 Mal auf und ab mit einer Mehrkanalpipette, um eine gründliche Resuspension des Zellpellets sicherzustellen.
10. Inkubiere 15 Minuten bei Zimmertemperatur, geschützt vor Licht. Am Ende der Inkubationszeit werden 150 μL FACS-Puffer zu jedem Brunnen mit einer Mehrkanalpipette und einer Zentrifuge bei 859 × g für 2 Minuten bei 4 °C hinzugefügt.
11. Dekantieren Sie das Überlagerungsmittel wie zuvor und suspendieren Sie es in 150 μL FACS-Puffer, falls die Proben sofort mit einem Durchflusszytometer durchgeführt werden, oder fixieren Sie 150 μL 0,5 % Paraformaldehyd und lassen Sie es bei 4 °C zurück. Pipettieren Sie mindestens 5 Mal auf und ab mit einer Mehrkanalpipette, um eine gründliche Resuspension des Zellpellets sicherzustellen. Filtern Sie feste Proben, um Verstopfungen des Instruments zu verhindern, und laufen Sie innerhalb von 12–36 Stunden mit einem Durchflusszytometer, um den Fluoreszenzverlust zu verhindern.
    HINWEIS: Paraformaldehyd gilt als gefährliche Chemikalie. Befolgen Sie institutionelle Biosicherheitsvorschriften bei der Handhabung und Entsorgung.

Ergebnisse

Mikroskopische Visualisierung der CD8-T-Zell-infizierten organoiden Kokultur
Vorgeformte Maus-VEOs wurden mit LCMV infiziert und mit LCMV-spezifischen CD8-T-Zellen kokultiviert. Wir haben diese Kokulturen auch mit dem HSV-2-Infektionsmodell durchgeführt, um die Vielseitigkeit des Protokolls zu belegen, zeigen jedoch mikroskopische Daten für das LCMV-Modell und haben unten T-Zell-Differenzierungsdaten in das HSV-2-Modell aufgenommen. Das LCMV exprimiert gelbes fluoresz...

Diskussion

CD8-TRMs verlassen sich auf lokale Umweltsignale zur Differenzierung und Pflege. Diese Hinweise erzeugen gewebespezifische Programmierung, die es CD8-TRMs ermöglicht, sich an ihre Umgebung anzupassen und ihre Immunüberwachungsaufgaben bei Bedarf auszuführen. Leider konnten TRMs in vitro nach der Extraktion aus dem Gewebe nicht überleben, was ihre detaillierte Analyse^{begrenzt hat}. In diesem Protokoll haben wir eine Method...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
16%-Paraformaldehyd-Wasserlösung	Elektronenmikroskopiewissenschaften	15710-S
24-Bohrloch-Polystyrol-unbehandelte Mehrfachwell-Nährstoffkulturplatten	VWR International	10861-558
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023
3-mL sterile Spritzen	Fisher Scientific	14-955-457
5 mL,  Snap Cap,  Sterile, rundbodenige Polystyrol-Reagenzgläser	Falcon	352058
60 mm Petrischalen	Fisher Scientific	FB0875713A
70 & mu; m sterile Zellsiebe	Fisher Scientific	22-363-548
96-Well-unbehandelte Polystyrol-Mikroplatten mit rundem Boden	Greiner Bio-One	650101
96-Bohrloch-Polystyrol unbehandelte Mehrfachbohrloch-Gewebekulturplatten	VWR International	10861-562
Albuminrinder/Fraktion V	Thermowissenschaftliche Chemikalien	J6465518
Ammoniumchlorid	Fisher Scientific	A661-500
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	A9528-100MG
B-27-Ergänzung	Gibco	17504044
ioTek Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader
DMEM/F12 1:1 Mittel	Cytiva	SH30271. FS
Dulbeccos phosphatgepufferte Salzlösung 1x	Corning	21031CV
Ethylendiamintetraessigsäure (0,5 m Lösung/pH 8,0)	Fisher Scientific	BP2482-500
Extra feine Mikro-Zerschneidungsscheren	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5882
Fetales Rinderserum – mit Holzkohle/Dextran behandelt	R& D-Systeme	S11650
Flowjo v10 Software	Becton, Dickinson und Co.	FlowJo (RRID:SCR_008520)
Graefe Forceps	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5135
HEPES-Lösung	Cytiva	SH30237.01
L-Glutamin (200 mM)	Gibco	A2916801
Magnet 5 ml	Biolegende	480019
Maus CD8 Naï ve T-Zell-Isolationskit	Biolegende	480044
Maus EGF Rekombinantes Protein	Gibco	315091MG
Nicht-essentielle Aminosäurelösung (100x)	Gibco	11140050
Penicillin-Streptomycin-Lösung	Cytiva	SV30010
Kaliumbicarbonat	MP Biomedizin	0215255780
Gereinigtes Anti-Maus-CD3ε Antikörper	Biolegende	100360
Rekombinante Maus B7.1 (CD80)-Fc Chimera (trägerfrei)	Biolegende	555406
Rekombinante Maus IL-12 (p70) (trägerfrei)	Biolegende	577004
Rekombinante Maus IL-2 (trägerfrei)	Biolegende	575406
Reduzierter Wachstumsfaktor-Basementmembran-Extrakt	R& D-Systeme	BME001-10
RPMI 1640 Medien	Cytiva	SH30027.LS
Natriumazid	Fisher Scientific	S227I-25
Natriumpyruvat (100 mM)	Gibco	11360070
Trypsin 0,25 % Protease mit schweinefarbenem Trypsin	Cytiva	SH30042.02
Lebensfähigkeitsfarbe (Rot 780)	Cytek Biosciences	13-0865-T100