Methodenartikel

Multi-Organ-Sammlung aus Mausmodellen für Alterungsstudien

DOI:

10.3791/69128

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12. Dezember 2025

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1Department of Biochemistry and Biophysics, University of California, San Francisco

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll bietet eine standardisierte Methode zur Organentnahme bei jungen und älteren Mäusen, um altersbedingte anatomische und histologische Veränderungen über mehrere Gewebe hinweg zu bewerten und unterstützt sowohl ethische als auch kosteneffiziente Versuchsplanung.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Altern ist ein systemischer und multifaktorieller biologischer Prozess, der nahezu alle Organe und Gewebe schrittweise beeinflusst und zu strukturellen, zellulären und molekularen Veränderungen führt. Dieses Protokoll beschreibt einen standardisierten und reproduzierbaren Ansatz zur Bewertung altersbedingter anatomischer und morphologischer Veränderungen bei Mäusen durch umfassende Organentnahme für anschließende histologische und molekulare Analysen. Mit jungen (2-3 Monaten) und alten (20-24 Monaten) Mäusen erläutern wir Schritt-für-Schritt-Verfahren für die grobe anatomische Dissektion und systematische Entnahme der Hauptorgane für nachgelagerte Schnitte, histologische Färbung und mikroskopische Begutachtung. Das Protokoll ermöglicht die Sammlung einer breiten Palette von Organen und Geweben (darunter Gehirn, Augen, Speiseröhre, Thymus, Herz, Aorta, Lunge, Lymphknoten, Leber, Bauchspeicheldrüse, Magen, Dünndarm, Darm, Darm, Milz, Nere, Blase, Haut, Skelettmuskel, Knochen und Fettgewebe) aus einem einzigen Tier. Durch die Maximierung der Datenerträge pro Versuchsperson unterstützt dieser Workflow ethische Tiernutzung durch Reduzierung, verbessert die Reproduzierbarkeit in allen Studien und erleichtert integrative Analysen des Alterns von Organismen.

Einleitung

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Altern ist ein systemischer Prozess, der nahezu alle Organe betrifft, doch konzentrieren sich die meisten experimentellen Studien auf ein einzelnes Gewebe und schränken Einblicke darin, wie altersbedingte Veränderungen im Körper gemeinsam auftreten oder miteinander interagieren. Das Altern äußert sich sowohl in gewebespezifischen als auch in systemischen Veränderungen, darunter Immundysfunktion, metabolische Verschiebungen, Verlust der Regenerationskapazität und strukturelle Degeneration 1,2. Obwohl organspezifische Untersuchungen wertvolle Einblicke geliefert haben, ist eine breitere Perspektive erforderlich, um zu verstehen, wie zelluläre Alterung über verschiedene Systeme hinweg zum Rückgang des gesamten Organismus beiträgt. Multi-Organ-Analyse in präklinischen In-vivo-Modellen, wie etwa Mäusen, ist unerlässlich, um koordinierte strukturelle, zelluläre und molekulare Veränderungen zu identifizieren, die zu altersbedingten Erkrankungen und dem Verlust physiologischer Resilienz beitragen 3,4.

Die Labormaus bleibt aufgrund ihrer genetischen Überhandhabbarkeit, kurzer Lebensdauer, konservierten Alterungswege und ihrer Fähigkeit, wichtige Merkmale des menschlichen Alterns nachzubilden, darunter Immunfunktionsstörungen, Gewebefibrose, metabolischer Rückgang und erhöhte Neoplasie 5,6,7ein wesentliches und gut etabliertes präklinisches Modell für die Altersforschung 5,6,7. Effiziente und standardisierte Mehrorgan-Dissektionsprotokolle werden jedoch nicht weit verbreitet verwendet. Solche Protokolle sind notwendig, um histologische Vergleiche zu optimieren, die Nutzung von Tieren zu reduzieren und Omics-Datensätze über Gewebe desselben Probandenhinweg zu integrieren 8,9.

Hier präsentieren wir ein reproduzierbares, zeiteffizientes Protokoll für die Perfusion, Dissektion und Konservierung mehrerer Organe bei Mäusen. Dieses Protokoll bietet einen Schritt-für-Schritt-Leitfaden für die anatomische Zerlegung und Sammlung wichtiger Organe von jungen (2–3 Monaten) und älteren (20–24 Monaten) Mäusen, darunter Gehirn, Augen, Thymus, Herz, Lunge, Aorta, Leistenlymphknoten, Magen-Darm-Trakt (Speiseröhre, Magen, Dünndarm, Dickdarm), Leber, Bauchspeicheldrüse, Milz, Nieren, Blase, Fettgewebe, Skelettmuskeln, Knochen und Haut. Detaillierte Anweisungen zur Gewebekonservierung, die mit histologischen, molekularen und Kryosektions-Workflows kompatibel sind, sind enthalten. Dieser standardisierte Ansatz ermöglicht es Forschern, organspezifische und systemische Merkmale des Alterns innerhalb derselben Versuchspersonen zu bewerten und unterstützt integrierte, hochwertige Alterungsforschung 4,10,11,12.

Protokoll

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C57BL/6J-Mäuse wurden an der University of California, San Francisco, gehalten. Alle Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt und vom Laboratory Animal Resource Center überwacht. Die Mäuse wurden in einem 12-Stunden-Hell-Dunkel-Zyklus gehalten, mit weniger als fünf erwachsenen Mäusen pro Käfig. Die Euthanasie erfolgte gemäß den Richtlinien der American Veterinary Medical Association (AVMA) für die Euthanasie von Tieren13. Bei diesem Protokoll wurden junge Mäuse mit 3 Monaten geopfert und gealterte Mäuse mit 22 Monaten. Bevor Sie mit der Sektion und der Organentnahme beginnen, drucken und füllen Sie die Vorbereitungscheckliste (Tabelle 1) sowie die Checkliste zur Gewebeentnahme (Tabelle 2) aus und füllen Sie sie aus. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Zervikale Verrenkung

HINWEIS: Die zervikale Verrenkung soll von einer geschulten Person durchgeführt werden, um übermäßige Schäden an den Halswirbelstrukturen zu minimieren.

  1. Halten Sie die Maus fest, indem Sie mit einer Hand die Basis des Schwanzes festhalten.
  2. Setzen Sie Daumen und Zeigefinger der gegenüberliegenden Hand an die Basis des Schädels.
  3. Üben Sie festen, schnellen Druck aus, um die Halswirbel auszurenken. Palpieren Sie den Hals, um die Trennung zwischen Schädel und benachbarten Wirbeln zu bestätigen.
  4. Bestätigen Sie eine erfolgreiche Euthanasie (nach institutionell genehmigten Protokollen), indem Sie vor dem Fortschreiten einen Atemstillstand und das Fehlen von Reaktionen auf schädliche Reize sicherstellen.
  5. Zeichnen Sie das Körpergewicht der Maus vor der Perfusion und Gewebeentnahme auf.

2. Thorakotomie und Perfusion

HINWEIS: Perfusion ist optional. Führen Sie alle Verfahren mit Paraformaldehyd (PFA) in einer zertifizierten chemischen Abzugshaube durch, während Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA) tragen, einschließlich Laborkittel, Nitrilhandschuhe und Schutzbrillen. Entsorgen Sie die PFA-Lösungen gemäß den institutionellen Chemikaliensicherheitsrichtlinien. Sammeln Sie alle PFA-Abfälle und kontaminierten Materialien (z. B. Handschuhe, Taschentücher, Behälter) in einem klar gekennzeichneten Behälter für gefährliche Abfälle und entsorgen Sie sie über das Büro für Umweltschutz und Sicherheit der Institution, wobei Protokolle gemäß lokalen, staatlichen und bundesstaatlichen Vorschriften eingehalten werden.

VORSICHT: Wenn Sie Paraformaldehyd (PFA) zur Fixierung verwenden, führen Sie alle Schritte unter einer Abzugshaube aus, um Formaldehyddämpfe zu vermeiden.

  1. Platzieren Sie einen Styropordeckel, der mit einem saugfähigen Material bedeckt ist, um Flüssigkeit aus der Perfusion aufzufangen, in einem Sammelbehälter. Stellen Sie die Maus auf diese Sektionsfläche in Rückenlage und sichern Sie die Gliedmaßen mit Nadeln, um den Körper zu stabilisieren: Die Vordergliedmaßen sind seitlich positioniert, um die Brusthöhle zu öffnen, und die Hintergliedmaßen sind kaudal ausgestreckt, um sanfte Spannung über die Bauchwand zu erzeugen.
    HINWEIS: Diese Positionierung verbessert die Sicht, minimiert Hindernisse und maximiert den Arbeitsraum für die Orgelsammlung.
  2. Trage 70 % Ethanol auf den Brustbereich auf.
  3. Verwenden Sie eine scharfe Schere, um einen Querschnitt auf Höhe der Membran zu machen, gefolgt von zwei V-förmigen Schnitten, die den Brustkorb freilegen (Abbildung 1A).
  4. Mit einer stumpfen Zange heben Sie die Haut vorsichtig an und schneiden Sie vorsichtig alle verbleibenden Ansätze, um den Brustbereich vollständig freizulegen.
  5. Machen Sie zwei etwa 2 cm lange V-förmige Einschnitte entlang beider Seiten des Brustkorbs, um die Brusthöhle zu öffnen.
  6. Ziehe am Brustbein hoch und stecke es über die Schulter der Maus neben dem Kopf.
  7. Mit einer stumpfen Zange legt das Herz vorsichtig frei. Entfernen Sie alle eingeschlossenen Luftblasen aus der Perfusionslinie und führen Sie dann eine Schmetterlingsnadel oder Kanüle in die linke Ventrikelspitze bis zu einer Tiefe von etwa 3–4 mm ein. Machen Sie einen etwa 5 mm langen Schnitt im rechten Vorhof, um den Abfluss des Perfusats zu ermöglichen (Abbildung 1B).
  8. Beginnen Sie mit der Perfusion mit einer calcium- und magnesiumfreien physiologischen Lösung (z. B. PBS, Kochsalzlösung oder HBSS), um das Kreislaufsystem zu reinigen.
    HINWEIS: Die Perfusion kann mit einer 20-mL-Spritze, Pumpe oder einem schwerkraftbetriebenen System durchgeführt werden. Im Durchschnitt sind pro Maus 15–20 ml Perfusionslösung erforderlich, um das Blut vollständig aus dem Gefäß zu entfernen. Eine gute Durchblutung zeigt sich durch das schnelle Klären (Blanchonieren) von Leber und Lunge sowie durch blass erscheinenden Mundbereich und Zunge. Vollständige Durchfluss führt zu einem klaren, blutfreien Abfluss aus dem Herzen.
  9. Wenn gewünscht, wird die PFA-Perfusion initiiert, indem man die Perfusionsleitung von einer calcium- und magnesiumfreien physiologischen Lösung (für die Vorspülung und Blutentfernung verwendet) auf eine 50-mL-Spritze mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) tauscht, während die Nadel an Ort und Stelle bleibt. Achten Sie darauf, keine Luftblasen in die Leitung zu bringen. Lassen Sie weiterhin mit 4 % PFA perfundieren, bis der gewünschte Fixationsgrad durch die fortschreitende Versteifung des Körpers beurteilt wird. Ungefähr 30 ml Fixativ reichen für eine einzelne Maus aus.

3. Organ- und Gewebesammlung

HINWEIS: Die Abfolge der Organentnahme ist beim Vergleich junger und alter Mäuse entscheidend. Organe bei älteren Tieren sind tendenziell empfindlich und anfällig für Autolyse oder mechanische Schäden, weshalb eine schnelle und konsequente Gewebehandhabung unerlässlich ist. Die Standardisierung der Entnahmereihenfolge minimiert die Variabilität nach dem Tod, reduziert die Handhabung von Artefakten und gewährleistet eine einheitliche Fixierungsqualität bei Tieren14,15. Konsistenz ist entscheidend, um subtile, altersbedingte morphologische Veränderungen zu erkennen, da verzögerte oder inkonsistente Stichprobennahme zu Verzerrungen führen kann. Wenn keine PFA-Perfusion durchgeführt wurde, sollten die Organe schnell entnommen werden. Die Bauchspeicheldrüse, der Magen, die Lunge und das Gehirn sind besonders anfällig für schnelle Autolyse und histologischen Abbau, wenn sie nicht sofort verarbeitet werden. Da ältere Mäuse häufig neoplastische Läsionen entwickeln, sollten Sie Milz, Leber, Lymphknoten, Lunge und Thymus sorgfältig auf Asymmetrie, Vergrößerung, Knötchen oder Verfärbungen untersuchen. Erfassen Sie diese Befunde als Teil der Gesamtkrankheitslast (siehe Tabelle 2).

  1. Beginnen Sie mit dem Tier in Rückenlage nach einer Perfusion oder zervikalen Verrenkung, um die Hauptorgane der Brust- und Bauchhöhle zu sammeln (Abbildung 1C).
  2. Tragen Sie nach dem Anstecken vorsichtig 70 % Ethanol mit Gaze oder einer Sprühflasche auf, was die Fellkontamination minimiert und die Feuchtigkeit des Gewebes in empfindlichen Bereichen gewährleistet. Diese Methode hat sich in unseren Händen als wirksam erwiesen, um Fellreste zu reduzieren und die Sichtbarkeit während der Dissektion zu verbessern, während die Nachteile einer vollständigen Immersion vermieden werden.
  3. Mit einer Schere und einer stumpfen Zange öffnen Sie vorsichtig die Bauchhöhle, indem Sie einen Mittellinienschnitt vom Zwerchfell zum Becken machen, gefolgt von zwei seitlichen Schnitten, wie die roten Linien in Abbildung 1A zeigen. Ziehe Haut und Bauchwand hoch, um die inneren Organe vollständig freizulegen.
  4. Magen, Dünndarm und Dickdarm: Den Magen am Speiseröhrenübergang ablösen, wobei das pylorische Ende mit dem Dünndarm verbunden bleibt. Befreien Sie vorsichtig den Magen-Darm-Trakt, indem Sie die unterstützenden Bänder durchtrennen, und entfernen Sie dann den Trakt, einschließlich Dünndarm und Dickdarm. Schneide distal am Rektum.
    1. Um den luminalen Inhalt zu beseitigen, wird der Dünndarm proximal an der Duodenojejunalbeugung und distal am ileozekalen Übergang abgetrennt. Für den Dickdarm abschneiden Sie proximal am Blinddarm. Spülen Sie den Dünndarm und den Dickdarm mit etwa 20 ml physiologischer Lösung mit einer Spritze mit einer Futternadel durch, während Sie das Gewebe vorsichtig mit einer feinen Pinzette sichern, um Schäden zu vermeiden.
  5. Speiseröhre: Isolieren Sie die Speiseröhre vom Halswirbel bis zum Magenübergang.
  6. Milz und Bauchspeicheldrüse: Isolieren Sie Milz und Bauchspeicheldrüse von den umliegenden Geweben mittels Feindissektion, um mechanische Schäden zu minimieren. Lösen Sie vorsichtig die Bauchspeicheldrüse von der Milz. Sofort werden die Bauchspeicheldrüse in kleine Stücke (≤5 mm) zerlegt und innerhalb von 5 Minuten nach der Euthanasie in ein Fixativ eingetaucht, um die Autolyse zu minimieren und die optimale Gewebemorphologie zu erhalten. Untersuchen Sie die Milz, wobei Sie Größe, Farbe, Form und sichtbare Auffälligkeiten beachten.
  7. Leber: Mit einer feinen Pinzette greifen Sie das zentrale Bindegewebe zwischen den Leberlappen und ziehen Sie sanft nach oben, um Spannung zu erzeugen. Mit einer Sektionsschere werden alle Ansätze zwischen Leber und benachbarten Organen vorsichtig durchtrennt. Untersuchen Sie die Leber auf Farbe, Konsistenz und das Vorhandensein von Knoten oder anderen Auffälligkeiten.
  8. Viszerales Fett: Sammelt Proben von viszeralen Fettdepots.
    HINWEIS: Junge Tiere haben typischerweise minimales viszerales Fett, während ältere Tiere oft eine erhöhte Fettansammlung aufweisen, insbesondere um Darm, Nieren und Gonadenregionen.
  9. Nieren und Blase: Entfernen Sie beide Nieren sowie die angesetzten Harnleiter und die Blase. Lösen Sie die Nieren vorsichtig von dem umgebenden Fettgewebe und den Bindestrukturen mit feinen Scheren oder einer stumpfen Zange ab. Folgen Sie den Harnleitern distal zur Blase und schneiden Sie alle verbliebenen Ansätze, um den gesamten Harnweg zu isolieren. Untersuchen Sie die Nieren und die Blase vor der weiteren Untersuchung auf Größe, Farbe und Auffälligkeiten.
  10. Lymphknoten: Ziehen Sie die Haut vom Peritoneum zurück, um den Leistenbereich freizulegen. Identifizieren Sie die Lymphknoten im Fettpad der Milch entlang der Lymphgefäße. Isolieren und entfernen Sie die Knoten mit einer feinen Pinzette, um die Zerstörung des umliegenden Fetts und Bindegewebes zu minimieren.
  11. Herz: Entfernen Sie das Herz vorsichtig, indem Sie die Hauptgefäße durchtrennen.
  12. Thymus: Entfernen Sie den Thymus sorgfältig, um seine Struktur zu erhalten. Beachten Sie, dass der Thymus mit dem Alter eine Involution durchläuft und bei gealterten Mäusen nur minimales oder gar kein thymisches Gewebe vorhanden sein kann.
  13. Lunge: Mit einer scharfen Schere und einer feinen Pinzette werden die Lungen sowie die angeschlossene Luftröhre vorsichtig in einem Stück entfernt.
  14. Aorta: Schließende Pinzette zwischen Aorta und Wirbelsäule einführen und die Aorta sanft lösen, sodass sie entlang der dorsalen Seite getrennt wird. Achte darauf, das Gefäß nicht zu zerreißen. Entfernen Sie mit einer feinen Pinzette vorsichtig das umliegende Fett- und Bindegewebe von der Aorta unter einem Dissektionsmikroskop.
  15. Skelettmuskulatur: Schneiden Sie die Haut über den Hintergliedmaßen ab, um den Oberschenkelknochen und die umliegende Muskulatur freizulegen. Isolieren Sie mit einer feinen Schere sorgfältig die am Oberschenkelknochen befestigten Muskeln, indem Sie sie vom umgebenden Bindegewebe lösen und an den Sehneneinsätzen abtrennen, um die Faserintegrität zu erhalten.
  16. Knochen (Tibia): Mit einer Dissektionsschere wird die darüber liegende Haut und der Muskel entfernt und das Tibia freigelegt. Mit einer Dissektionsschere und einer stumpfen Zange lösen Sie vorsichtig das Tibia an den Knie- und Sprunggelenken. Entfernen Sie verbleibendes Weichteil, ohne den Knochen zu beschädigen.
  17. Augen: Mit einer großen Sektionsschere die Maus enthaupten. Entfernen Sie die Augen vorsichtig mit einer feinen Pinzette.
  18. Gehirn: Schneide die Kopfhaut ab, um den vorderen Schädel freizulegen. Mit einer scharfen Schere oder einem Skalpell folgen Sie den Schädelnähten und heben Sie die Knochensegmente ab, um das Gehirn freizulegen (Abbildung 1D). Trennen Sie die Riechbläbeln und ventralen Aufsätze. Entfernen Sie vorsichtig das Gehirn aus der Schädelhöhle. Verarbeiten Sie das Gewebe sofort, um die Morphologie zu erhalten.
  19. Haut: Wenn Haarentfernung für nachgelagerte Anwendungen erforderlich ist, entfernen Sie Haare mit einem elektrischen Trimmer. Kneifen Sie einen Teil der Rückhaut mit einer stumpfen Zange ab, entfernen Sie es mit einer Schere und sammeln Sie das Gewebe für die weitere Verarbeitung.
  20. Nachdem alle interessanten Organe entfernt wurden, wird der gesamte Mäusekadaver in einen 450-ml-Behälter gelegt, der mit 4 % PFA vorgefüllt ist, um unerwartete Erkenntnisse zu archivieren oder Fragen der Gutachter zu beantworten, die eine Rückkehr zu feuchtfixiertem Gewebe erfordern könnten.

4. Gewebekonservierung und -verarbeitung

HINWEIS: Um die Gewebeintegrität zu erhalten, sollten Sie die Zeit zwischen Dissektion und Erhaltung minimieren. Verzögerungen können die Gewebemorphologie und molekulare Qualität beeinträchtigen; weitere Details zum kritischen Zeitpunkt der Gewebesammlung und -konservierung sind in Tabelle 2 dargestellt.

VORSICHT: Wenn Sie Paraformaldehyd (PFA) zur Fixierung verwenden, führen Sie alle Schritte in einer Abzugshaube aus, um die Exposition gegenüber Formaldehyddämpfen zu vermeiden.

  1. Gewebe wird unmittelbar nach der Dissektion verarbeitet und das passende Protokoll (Schritt 4.1, 4.2 oder 4.3) entsprechend der beabsichtigten nachgelagerten Anwendung ausgewählt.
    1. Paraformaldehyd (PFA)-Fixierung: Gewebe für die histologische Analyse in 4 % PFA bei 4 °C für 12–24 Stunden platzieren. Nach der Fixierung wird das Gewebe gründlich mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, um das Restfixativ zu entfernen, und es dann auf 70 % Ethanol zur Lagerung bis zur Paraffineinbettung und Sektionierung übertragen.
  2. Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound-Einbettung: Frisches Gewebe in OCT-Compound einbetten. Gewebe werden in Einbettformen mit OCT-Substanz gelegt, um Luftblasen zu vermeiden, 5 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert und dann in der Dampfphase mit flüssigem Stickstoff eingefroren. Versiegeln Sie mit Alufolie und bewahren Sie die OCT-Blöcke bis zum Segmentieren bei −80 °C auf.
  3. Schnappfrost in der flüssigen Stickstoffdampfphase: Schnappsfrostgewebe, die für RNA-, Protein- oder Metabolitenanalyse in der Dampfphase von flüssigem Stickstoff bestimmt sind, um die Bildung von Eiskristallen zu minimieren. Lege Gewebe in beschriftete Kryoröhren und hänge sie über flüssigem Stickstoff für ein schnelles Einfrieren. Sobald sie vollständig eingefroren sind, werden die Proben in einen −80 °C Speicher übertragen.

Ergebnisse

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Während der Obduktion zeigen alte Mäuse häufig neoplastische Läsionen und benötigen eine sorgfältige Untersuchung, um pathologische Befunde zu dokumentieren 13,14,16,17,18. Abbildung 2A zeigt eine 22 Monate alte männliche C57BL/6-Maus in Rückenposition nach der Perfusion. Eine vollständige Blanchierung der Lunge bestätigt eine wirksame Perfusion, während die Leber nur teilweise blanchiert. Eine genauere Untersuchung der Leber zeigte mehrere bösartige Knötchen (Abbildung 2B), begleitet von vergrößerten Samenbläschen (Abbildung 2A) und einer Splenomegalie (Abbildung 2C). Diese Befunde sind bei älteren Mäusen häufig und sollten als Teil der Gesamtlastder Krankheit 18 dokumentiert werden.

Abbildung 3 zeigt makroskopisch normale Organe, die nach Dissektion und Perfusion gesammelt wurden, was die Beurteilung der anatomischen Integrität und Perfusionseffizienz ermöglicht. Der Magen-Darm-Trakt wurde mit physiologischer Lösung gespült, um den verdauten Inhalt zu entfernen, was zu einem sauberen, durchscheinenden Erscheinungsbild von Magen, Dickdarm und Dünndarm führte (Abbildung 3A). Weitere Strukturen, darunter Speiseröhre, Bauchspeicheldrüse, Milz, viszerale Fettdepots, Nieren mit Blase, Lymphknoten, Herz und Thymus, waren klar nachweisbar und konnten für nachgelagerte Analysen isoliert werden (Abbildung 3B, C, E-I).

Die Perfusionsqualität wurde durch Blanchieren in stark vaskularisierten Geweben untersucht. Wie in Abbildung 3D und Abbildung3J gezeigt, zeigten Leber und Lunge deutliche Unterschiede zwischen nicht perfundierten, gut perfundierten und teilweise perfundierten Zuständen. Vollständiges Blanchieren bestätigte eine erfolgreiche Perfusion, während unvollständiges Blanchieren auf technische Variabilität oder zugrundeliegende Auffälligkeiten hindeutete. Weitere Gewebe, darunter Aorta, Skelettmuskel, Schienbein, Gehirn, Auge und Haut, wurden mit erhaltener Morphologie isoliert, die für weitere histologische, molekulare oder bildgebende Anwendungen geeignet ist (Abbildung 3K-P). Dieses standardisierte Dissektionsverfahren ermöglicht eine konsistente Wiederherstellung intakter, gut erhaltener Gewebe und Organe und ermöglicht eine grobe anatomische Beurteilung zur Unterstützung verschiedener nachgelagerter Analysen. Die Sektion und Organentnahme dauerten je nach Erfahrung des Bedieners und dem Vorliegen pathologischer Befunde etwa 40–60 Minuten pro Tier.

Abbildung 4 zeigt beispielhafte altersassoziierte Veränderungen der gesammelten Organe nach Paraffin-Einbettung, Sektionierung sowie Hämatoxylin- und Eosin-(H&E)-Färbung. In Hautabschnitten alter Mäuse wurden im Vergleich zu jungen Kontrollpersonen eine epitheliale Ausdünnung und der Verlust der Haarfollikel beobachtet (Abbildung 4A). Nierenschnitte zeigten eine Vergrößerung der Bowman-Kapseln sowie fibrotische und nekrotische Veränderungen sowie Regionen, die mit Lymphomen übereinstimmen (Abbildung 4B). Bei Pankreasschnitten wurde bei älteren Tieren ein Anstieg der apoptotischen Körper19 und lymphomatäter Regionen beobachtet, was auf eine mit dem Alter beeinträchtigte Gewebeintegrität hinweist (Abbildung 4C). Milzabschnitte zeigten Amyloidablagerungen und Lymphomregionen bei gealterten Tieren, was zusätzliche Merkmale altersbedingter Pathologie widerspiegelt (Abbildung 4D).

Diese Ergebnisse heben repräsentative histopathologische Merkmale des Alterns über mehrere Gewebe hinweg hervor und zeigen den Nutzen dieses Protokolls zur Erkennung struktureller Merkmale altersbedingten Abbaus.

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Abbildung 1: Schematische Übersicht der Mausdissektion und Organexpositionsverfahren. (A) Schnittstellen zur Öffnung der Brust- und Bauchhöhlen (rote Linien), einschließlich eines Querschnitts auf Höhe des Zwerchfells, gefolgt von V-förmigen Schnitten auf beiden Seiten des Brustkorbs zur Öffnung der Brusthöhle sowie einem Mittellinienschnitt vom Zwerchfell bis zum Becken mit beidseitigen Schnitten, um die Bauchhöhle vollständig freizulegen. (B) Perfusionsaufbau mit dem Einführen einer Schmetterlingsnadel in den linken Ventrikel und dem Schnitt des rechten Vorhofs, um einen effektiven Blutabfluss zu ermöglichen. (C) Anatomische Anordnung der wichtigsten Thorax- und Bauchorgane nach Kariesexposition. (D) Kopfdissektionsschritte, einschließlich Entfernung der Kopfhaut und Öffnung des Schädels entlang der Schädelnähte, um das Gehirn freizulegen. Rote Linien zeigen Schnittstellen an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 2: Identifikation neoplastischer Läsionen bei alten Mäusen. (A) Repräsentativer 22 Monate alter männlicher C57BL/6-Maus in Rückenposition nach Perfusion mit 4 % PFA. Eine vollständige Blanchierung der Lunge (rosa Pfeilspitze) bestätigt eine wirksame Perfusion, während die Leber (grüne Pfeilspitze) nur teilweise Blanchieren zeigt. Blaue Pfeilspitzen stehen für vergrößerte Samenbläschen. (B) Detaillierte Ansicht der Leber, die mehrere bösartige Knötchen (schwarze Pfeilspitzen) zeigt. (C) Vergrößerte Milz einer gealterten C57BL/6-Maus (rechte Seite) im Vergleich zu einer normalen Milz eines jungen Tieres (linke Seite). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 3: Überblick über die wichtigsten Mausorgane und die Gewebeintegrität nach Dissektion und Perfusion. (A) Magen, Dünndarm und Dickdarm vor und nach dem Spülen mit physiologischer Lösung zur Entfernung des verdauten Inhalts. (B) Speiseröhre. (C) Bauchspeicheldrüse mit angesetzter Milz. (D) Leber ohne Perfusion, mit vollständigem Blanchieren nach der wirksamen Perfusion und mit partieller Blanchierung, die auf eine unvollständige Durchfluss oder eine zugrundeliegende Pathologie hinweist. (E) Viszerales Fettgewebe. (F) Nieren mit angesetzter Blase. (G) Leistenlymphknoten. (H) Herz. (I) Thymus. (J) Lungen ohne Durchblutung, mit vollständigem Blanchieren nach der effektiven Durchblutung und mit partieller Blassierung. (K) Aorta. (L) Skelettmuskulatur, isoliert vom Hintergliedmaßen. (M) Schienbein mit erhaltener Knochenstruktur. (N) Gehirn. (O) Auge. (P) Haut. Skala-Balken: 5 mm in A, C, D, E, F, J, L, N, P; 1 mm in allen anderen Paneelen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 4: Histologische Analyse der Hauptorgane unter Verwendung von Hämatoxylin- und Eosin-(H&E)-Färbungen. (A) Hautschnitte von 3 Monate alten (jungen) und 22 Monate alten (alten) Mäusen. Schnitte von gealterten Tieren zeigen epithelale Ausdünnung und Verlust von Haarfollikeln. (B) Nierenabschnitte, die Bowmans Kapseln hervorheben. Schnitte von gealterten Tieren zeigen Kapselvergrößerung, fibrotische und nekrotische Veränderungen sowie Lymphome (orangefarbene Pfeilspitzen). (C) Bauchspeicheldrüsenschnitte von jungen und älteren Tieren, wobei gealterte Tiere vergrößerte apoptotische Körper (blaue Pfeilspitzen) und Lymphomregionen (orangefarbene Pfeilspitzen) aufweisen. (D) Milzschnitte von 3 Monate alten (jungen) und 22 Monate alten (alten) Mäusen. Schnitte von gealterten Tieren zeigen Amyloidablagerungen (limettengrüne Pfeilspitzen) und Lymphomregionen. Skala (A-C) 100 μm. Skala (D) 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Tabelle 1: Vorbereitungscheckliste. Eine Schritt-für-Schritt-Liste wesentlicher Vorbereitungen für die Teilnahme und Konservierung von Mausgewebe, einschließlich Tuben- und Formkennzeichnung, Puffer- und Fixationsvorbereitung, Vorbereitung für Kryo-Einbettung, Sterilisation von Sektionswerkzeugen, Arbeitsplatzanordnung und Dokumentationsplanung. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Checkliste zur Gewebesammlung. Nutzen Sie die Tabelle, um gesammelte Gewebe zu protokollieren. Fügen Sie die Abholungszeit und Notizen zu Zustand oder Auffälligkeiten hinzu. Priorisieren Sie die für Ihre Studie entscheidenden Gewebe; Sammeln Sie die relevantesten Organe innerhalb des empfohlenen Zeitraums, um eine Gewebeautolyse oder -degradierung zu vermeiden.*Beachten Sie alle Auffälligkeiten (einschließlich Organverfärbungen, Knoten, bösartiges Wachstum, abnormale Organgröße). **Erwägen Sie, die Erhaltungsmethode zu dokumentieren (einschließlich PFA-Fixierung, OCT-Einbettung oder Snap Freezing). Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Diskussion

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Dieses Protokoll bietet eine reproduzierbare Strategie für die systematische Sammlung mehrerer Organsysteme bei jungen und älteren Mäusen und ermöglicht anatomische, histologische und molekulare Analysen. Mehrere technische Überlegungen können die Ergebnisqualität beeinflussen und die Einschränkungen der beschriebenen Methode adressieren. Erstens ist die Variabilität der Perfusionsqualität ein wichtiger Faktor. Eine unvollständige Perfusion kann Blutreste hinterlassen, die die Histologie, Immunhistochemie und molekulare Analysen beeinträchtigen. Eine Perfusion nach einer zervikalen Verrenkung kann Traumata am Halsgewebe verursachen und zu einer Blutkontamination der Lunge führen. Eine zervikale Verrenkung sollte daher nur von geschultem Personal durchgeführt werden. Für optimale Ergebnisse sollte die Perfusion unter terminaler Anästhesie durchgeführt werden, wie an anderer Stellebeschrieben 20,21 gemäß den IACUC- und AVMA-Richtlinien13. Zweitens ist die Fixierung ein entscheidender Faktor für die Gewebeintegrität. Obwohl 4 % Paraformaldehyd (PFA) weit verbreitet sind, kann es unzureichend in große oder dichte Organe eindringen, was zu einer schlechten Histologie und Antigenkonservierung führt. Diese Einschränkung kann durch die Verwendung von 10 % neutralem Formalin (NBF) oder das Zerschneiden von Geweben in ≤5 mm Abschnitte ausgeglichen werden, um die Durchdringungzu verbessern. Drittens durchlaufen einige Gewebe, insbesondere Bauchspeicheldrüse, Magen und Gehirn, eine schnelle Autolyse, was eine Fixierung oder Einfrieren innerhalb von 5–10 Minuten nach der Euthanasie und den Einsatz von vorgekühlten Dissektionswerkzeugenerforderlich macht. Bei gealterten Mäusen kann Neoplasie die Anatomie weiter verzerren und die Dissektion erschweren. Zusätzliche Artefakte können durch unzureichende Fixierungsvolumen oder Einfrieren entstehen, was zu Schrumpfung und Randeffekten führt; diese können minimiert werden, indem ein Fixativ-Gewebe-Verhältnis von mindestens 10:1 eingehalten wird, Überfüllung vermieden und OCT-Formen vor dem Einbetten vorabkühlen. Schließlich stellt die Verwendung von PFA und Formalin Sicherheits- und Entsorgungsbedenken dar; Glyoxalbasierte Fixativen bieten weniger giftige Alternativen. Standardisierte Handhabung, optimierte Fixierung und sorgfältiges Timing sind daher unerlässlich, um die Reproduzierbarkeit, Gewebequalität und die Zuverlässigkeit von nachgelagertenAnalysen zu maximieren.

Durch die Entnahme von Geweben aus über 15 Organen desselben Tieres maximiert dieser Arbeitsablauf den biologischen Ertrag pro Versuchsperson und entspricht ethischen Vorgaben zur Reduzierung der Tiernutzung. Das systematische Verfahren lässt sich leicht auf mittlere Durchsatzstudien hochskalieren, die altersbedingten physiologischen Abbau und organspezifische Pathologien untersuchen25.

Eine schnelle Verarbeitung autolyseanfälliger Gewebe ist unerlässlich, um die histologische Integrität zu bewahren. Die Verwendung von calcium- und magnesiumfreien physiologischen Lösungen, gefolgt von 4 % PFA, erhält zuverlässig die Organarchitektur und minimiert die Autolyse in empfindlichen Geweben wie der Bauchspeicheldrüse und dem Verdauungssystem. Im Gegensatz zu Protokollen, die sich auf einzelne Organe oder Krankheitsmodelle konzentrieren, ermöglicht dieser Ansatz eine schnelle und konsistente Sammlung mehrerer Organe, wodurch die Variabilität reduziert und der Durchsatz verbessert wird. Die gesamte Dissektion, von der Perfusion bis zur finalen Gewebeexzision, kann innerhalb von 60 Minuten pro Tier abgeschlossen werden, was sie für großflächige oder zeitkritische Studien geeignet macht 3,11,26. Die Einhaltung einer präzisen Perfusions-Fixationssequenz minimiert Artefakte und ermöglicht reproduzierbare Ergebnisse.

Konsistenz bei der Gewebesammlung, Trimmung und Einbettung ist für eine genaue histopathologische Beurteilung unerlässlich, insbesondere bei longitudinalen oder multizentrischen Studien. Variabilität im Umgang mit Geweben kann Artefakte einführen, pathologische Befunde verdunkeln oder zu einer Fehlinterpretation der Krankheitslast führen. Die Revised Guides for Organ Sampling and Trimming in Rats and Mice, wie die RENI-Trimm-Leitfäden, bieten detaillierte, standardisierte Protokolle, um solche Inkonsistenzen zu minimieren22. Die Einführung dieser harmonisierten Methoden verbessert die Datenvergleichbarkeit zwischen Studien und Institutionen, stärkt die Reproduzierbarkeit und stärkt die Integrität pathologiebasierter Ergebnisse in der Altersforschung 4,9.

Das Sammeln einer Vielzahl von Organen ist besonders wichtig in der Alterungsforschung, bei der das Verständnis der Interaktion von Organsystemen unerlässlich ist, um die Prozesse zu entdecken, die den physiologischen Verfall des gesamten Körpers mit dem Alter antreiben. Während dieser Ansatz auch für verschiedene andere Forschungsfragen vorteilhaft sein kann, liegt der Fokus dieses Protokolls darauf, Alterungsstudien zu unterstützen, bei denen altersbedingte Veränderungen mehrere Organsysteme gleichzeitig beeinflussen können. Es kann jedoch auch auf Studien angewendet werden, die sich auf Fibrose, Regeneration und Seneszenz konzentrieren, insbesondere auf solche, die Transkriptomik oder Multi-Gewebe-Biomarker-Entdeckungintegrieren 9,27,28.

Histologische Untersuchungen zeigten charakteristische altersbedingte Veränderungen über mehrere Gewebe hinweg (Abbildung 4). In der Haut zeigten ältere Tiere eine epitheliale Ausdünnung und den Verlust von Haarfollikeln. In der Niere zeigten Schnitte alterter Mäuse die Bowman-Kapselvergrößerung sowie fibrotische, nekrotische und lymphomatische Veränderungen. Bauchspeicheldrüsengewebe alter Tiere zeigte eine Ansammlung apoptotischer Körper und Lymphome, während Milzschnitte Amyloidablagerungen und zusätzliche Lymphomregionen aufzeigten. Diese Beobachtungen stimmen mit etablierten Phänotypen der Mausalterung überein und zeigen den Nutzen dieses Protokolls zur Erkennung repräsentativer histopathologischer Marker desAlterns von 1,18,19,27,29,30,31,32,33,34.

Zusammenfassend bietet dieses Protokoll einen zuverlässigen, skalierbaren Rahmen zur Sammlung und Erhaltung von Geweben in präklinischen Alterungsmodellen. Sie kann sowohl in explorativen als auch hypothesenbasierten Studien eingesetzt werden, um gewebespezifische und systemische Mechanismen von Alterung, Degeneration und Resilienz aufzudecken.

Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde durch einen Start-up Grant der Larry L. Hillblom Foundation, den AFAR and Glenn Foundation for Medical Research Grant für Junior Faculty, einen Edward Mallinckrodt, Jr. Foundation Junior Investigator Award sowie einen Program for Breakthrough Biomedical Research (PBBR) New Frontier Research Award für Hanna Martens unterstützt. Abbildung 1 wurde mit BioRender erstellt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Absorbierendes Pad
Mäuse im Alter von C57BL/6J  Das Jackson-Labor & nbsp;#000664
Sammelbecken 
Kabelloser TrimmerBravMini+ CLP-41590Zur Haarentfernung
Ethanol-Spray 70 %Fisher Scientific50-163-3592
Extra Force 5 INOXDumontF6521-1EAExtra feine Pinzette für Lymphknoten
PinzetteMilliporeSigmaXX6200006PStumpfe Zange
Zange 5 INOXDumontF6521-1EAFeine Spitzen-Pinzette
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) 1x 500 mLGibco14025092
Mikro-Sezierende Schere (gerade, scharf/scharf, 25 mm)Roboz SurgicalRS-5668Standard-Mikroscheren, Edelstahl, 25 mm Klinge (M-37)
Mikro-Dissektionsschere (gerade, scharfe/scharfe, feine Klingen)Roboz SurgicalRS-5918Feine Seztierschere, 4,5" Länge (H-327)
NBFSigma HT501128Zur Fixierung
Normale KochsalzlösungCytiva76081-514
Optimale Schneidetemperatur (OCT)Fisher Scientific23730571
Paraformaldehyd (PFA) 4 %Elektronenmikroskopiewissenschaften15710Zur Fixierung
Petrischalen 100 mL x 15 mLMilliporeSigmaP5856-500EA
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Gibco10010023
PinsEisco LabsDISPINS1Um die Maus während der Dissektion zu sichern
Kunststoffspritze 20 mL, Luer-VerriegelungFisherBrand302830Für Perfusion
Seal'N Freeze Box (Kryobehälter)Ted Pella, Inc.20956
Seal'N Freeze KryotrayTed Pella, Inc.20956-1Zur Positionierung von Proben im Kryobehälter
Sol-Vet Schmetterlingsnadel mit AdapterSol-Millenium Medical110301070003für Perfusion
Styropordeckel
Tissue-Tek Cyromold (Biopsie)Sakura25608-922
Junge C57BL/6J-MäuseDas Jackson-Labor & nbsp;#000664

Referenzen

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