Optimierte Analyse von Proteinen aus Xenopus-Eizellen und Embryonen durch Immunoblotting

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Analyse von Proteinen aus Xenopus-Eizellen und -Embryonen mittels Immunblotting. Die Entnahmeschritte werden beschrieben, gefolgt von Schritten, die der Probenverarbeitung, der SDS-PAGE, dem Transfer, der Antikörperfärbung und der Bildgebung entsprechen. Das Protokoll konzentriert sich auf die Untersuchung translationaler regulatorischer Proteinkomplexe mit endogenen Antikörpern und Antikörpern gegen Proteinaffinitätsmarkierungen.

Zusammenfassung

Die Analyse von Proteinen mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) mit anschließendem Immunblotting (Western Blotting) ist ein wichtiger Bestandteil des Werkzeugkastens des Molekularbiologen. Bei dieser Technik wird eine komplexe Proteinmischung nach Molekulargewicht getrennt und dann das Vorhandensein von Zielproteinen mit spezifischen Antikörpern getestet. Immunoblotting hat eine Vielzahl von Anwendungen. Beispiele hierfür sind die Verwendung als gezielter Ansatz zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktoren oder als Kontrolle zur Bestätigung der Expression oder Depletion von Proteinzielen. Die erfolgreiche Durchführung des Immunblottings erfordert jedoch komplizierte, mehrstufige Experimente. Die Protokolle müssen für jeden Organismus, jedes Zielprotein und jede Anwendung optimiert werden. Daher bestehen Wissenslücken für die Verwendung von Immunoblots in vielen Modellen, so auch beim Modellfrosch Xenopus laevis.

Aufgrund ihrer Größe, des reichlich vorhandenen Materials für biochemische Experimente und der einfachen Handhabung waren X . laevis-Eizellen und -Embryonen für die Untersuchung der Prinzipien der Translationskontrolle von entscheidender Bedeutung. Dieser Spezies fehlen jedoch spezifische Protokolle für ein robustes und routinemäßiges Immunblotting. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll für Western Blotting an, das für Proben aus mehreren Xenopus-Entwicklungsstadien optimiert ist. Anschließend analysieren wir translationale Regulatoren über die gesamte Entwicklung hinweg.

Einleitung

Um zelluläre Mechanismen zu verstehen, müssen bestimmte Proteinspezies überwacht werden. Häufige Fragen sind, wie sie sich in ihrer Expression räumlich und zeitlich verändern, mit welchen Proteinen sie interagieren und ob sie als Reaktion auf unterschiedliche Bedingungen modifiziert werden. Immunoblotting, umgangssprachlich als "Western Blotting" bekannt, ist eine Schlüsselmethode, um diese Herausforderungen zu bewältigen. Ein Immunoblot-Experiment trennt Proteine aus einer komplexen Probe - zum Beispiel Ganzzelllysat - und identifiziert sie mit Hilfe von Antikörpern. Konkret werden Proteine denaturiert und dann durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) nach Größe getrennt. Die größenfraktionierten Proteine werden auf einen festen Träger, wie z. B. eine Nitrocellulosemembran, übertragen, und das Protein von Interesse wird unter Verwendung von Antikörperreagenzien identifiziert. Immunoblotting ist zu einem Standardbestandteil des Werkzeugkastens des Molekularbiologen geworden. Es wird häufig zur Überwachung der Proteinexpression in verschiedenen Kontexten oder als Endpunkt für Experimente wie Immunpräzipitationsassays verwendet. Trotz dieser Vorteile erweist sich die Analyse von Steady-State-Proteinspiegeln mit Immunblotting als Herausforderung, da der Assay für jeden Schritt und jeden experimentellen Kontext optimiert werden muss (Abbildung 1).

Eine Herausforderung ist die Analyse von Material des afrikanischen Krallenfrosches Xenopus laevis. X. laevis ist ein wichtiger Organismus für die Untersuchung von RNA-Protein-Interaktionen. Dieses System hat zahlreiche Vorteile, vor allem die Tatsache, dass X. laevis Hunderte von Eizellen produziert und sich anschließend synchron entwickelnde Embryonen auf einmal produziert. Jede Eizelle enthält ~25 μg Nicht-Dotter-Protein¹ und bietet damit reichlich Material für biochemische Experimente. Die große Größe (~1250 μm)¹ von Eizellen und Embryonen erleichtert auch die mRNA-Mikroinjektion, um markierte oder mutierte Proteine im Maßstab² exogen zu exprimieren. Diese Eigenschaften ermöglichen leistungsfähige Experimente zur Diagnostik der Translationskontrolle in X. laevis, wie z. B. den Tethered Function Assay, bei dem die Auswirkungen eines translationalen regulatorischen Proteins auf eine mRNA unabhängig von der Fähigkeit dieses Proteins zur RNA-Bindung getestet werden können ^3,4,5,6. Das Immunblotting in Xenopus-Eizellen und -Embryonen ist jedoch mit Schwierigkeiten verbunden, einschließlich der Interferenz durch große Massen von Dotterplättchen in diesen frühen Zellen⁷, die die Ergebnisse verschleiern, wenn sie nicht entfernt werden.

Hier stellen wir ein optimiertes Protokoll für effektives Immunblotting in X. laevis vor, wobei der Schwerpunkt auf dem Nachweis translationaler regulatorischer Proteine liegt. Wir geben Anweisungen zur Entnahme und Verarbeitung von Eizellen und Embryonen für die Bildgebung des endgültigen Immunoblots. Ebenfalls enthalten sind detaillierte Anweisungen für eine optimale Proteinbeladung und Bildgebung sowie zur Verhinderung einer Dotterkontamination der Probe. Darüber hinaus diskutieren wir mögliche Protokollmodifikationen und Strategien, um Antikörper zu finden, die mit Xenopus-Proteinen kompatibel sind. Wir beabsichtigen, Forschern eine Anleitung zur Verfügung zu stellen, wie sie Immunblotting im Rahmen ihrer eigenen Experimente in diesem wenig genutzten Modellorganismus mühelos durchführen können.

Abbildung 1: Arbeitsablauf für die Xenopus-Probenvorbereitung und die anschließende Immunoblot-Analyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Protokoll

Alle Arbeiten mit Tieren (X. laevis), die in diesem Protokoll dargestellt sind, entsprechen den Bestimmungen des UW-Madison Institutional Animal Care and Use Committee und wurden von diesem genehmigt. Einzelheiten zu den Geräten, den verwendeten Reagenzien und den verwendeten Antikörperkonzentrationen sind in der Materialtabelle aufgeführt. Eine Auswahl der Geräte ist in Abbildung 2 unten zu sehen.

Abbildung 2: Verarbeiteter Embryoextrakt und Ausrüstung für das Immunblotting. (A) Zentrifugierter Eizellenextrakt aus X. laevis Stadium VI. Lipide und fettlösliche Proteine steigen an die Spitze, während Vitellogenin (Eigelb) und pigmentierte Ablagerungen ein Pellet bilden. (B) Ausrüstung für SDS-PAGE zur Trennung von Proteinen nach Molekulargewicht. (i) Stromversorgung, (ii) Vertikaler Elektrophoresetank, (iii) Deckel des Elektrophoresetanks, (iv) Elektrodenanordnung, (v) Pufferdamm, (vi) Vorgefertigtes Elektrophoresegel; Beachten Sie den grünen Kamm (oben) und den blauen Aufkleber (unten), die jeweils entfernt werden müssen. (C) Ausrüstung für den Membrantransfer. Der vertikale Elektrophoresetank und der Deckel werden nach einer gründlichen Spülung für den Transfer wiederverwendet. (i) Walze zum Entfernen von Blasen, (ii) Transferclip, (iii) kleiner Rührstab, (iv) Nitrozellulosemembran zwischen zwei schützenden blauen Papierblättern, (v) Zellulosechromatographie-Filterpapier, (vi) Transferschwammkissen, (vii) Glasauflaufform für die Transfermontage, (viii) Eisbeutel, (ix) Transferkern. (D) Sonstige Ausrüstung. (i) Gel-Trenner (zum Trimmen von Gel-Wells vor dem Transfer), (ii) Öffnungshebel für die Gelkassette, (iii) Pinzette (für die Handhabung der Membran), (iv) Behälter (zum Halten der Membran), (v) Behälterdeckel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

1. Entnahme von Xenopus-Eizellen und -Embryonen

1. Vorbereitung der Eizelle
   1. Beziehen Sie defollikulierte X. laevis-Eizellen von einem kommerziellen Anbieter (Ecocyte Bio Science, Austin, Texas) oder isolieren und defollikulieren Sie wie beschrieben⁸.
   2. Kulturieren Sie isolierte Eizellen in modifizierter Barth-Lösung (MBS; 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,4 mM CaCl₂, 0,33 mM Ca(NO₃)₂, 0,8 mM MgSO₄, 5 mM Tris-HCl, 2,4 mM NaHCO₃, pH 7,4) bis zur Verwendung.
2. Vorbereitung des Embryos
   1. Isolieren Sie die Eier von X. laevis und befruchten Sie sie wie beschrieben ^9,10.
   2. Kulturbefruchtete Embryonen in 0,25x Marc's Modified Ringer's Solution¹¹ (MMR) (1x MMR: 0,1 M NaCl, 2,0 mM KCl, 1 mM MgSO₄, 2 mM CaCl₂, 5 mM HEPES).
   3. Bereiten Sie eine Lösung von 2 % Cystein in 0,1x MMR mit einem pH-Wert von 8,2 unter Verwendung von NaOH vor.
   4. Entfernen Sie 0,25x MMR aus der Schale, die für die Befruchtung verwendet wird, und bedecken Sie die Embryonen mit der Cysteinlösung, um die Geleeschicht^{zu entfernen 12}. Mischen Sie die Lösung vorsichtig, damit die Embryonen gleichmäßig freigelegt werden.
   5. Überwachen Sie die Embryonen mit einem Stereomikroskop mit 2- bis 25-facher Vergrößerung. Nachdem sich die Geleehülle aufgelöst hat (typischerweise 3-5 Minuten), packen sich die Embryonen dicht aneinander. Vermeiden Sie eine längere Exposition gegenüber Cystein.
   6. Entfernen Sie die Cysteinlösung und spülen Sie die Embryonen mehrmals mit 0,25x MMR aus.
   7. Kultur in 0,25x MMR bis zum gewünschten Wachstumsstadium.
3. Entnehmen Sie die gewünschte Anzahl von Embryonen oder Eizellen (empfohlen mindestens fünf pro Probe) in einem 1,5-ml-Röhrchen.
4. Entfernen Sie überschüssiges Medium mit einer Pipette, um eine Beschädigung der Zellen zu vermeiden.
5. Proben sofort verwenden oder bis zur Verwendung bei -80 °C lagern. Eizellen und Embryonen können mehrere Jahre gelagert werden.

2. Zubereitung von Xenopus-Extrakt

1. Tauen Sie die Proben auf Eis auf, wenn sie gefroren sind.
2. 10 μl gekühlter 10x Zelllysepuffer, verdünnt auf 1x mit doppelt deionisiertem Wasser (siehe Materialtabelle) pro Embryo/Eizelle zugeben und die Proben mit einem Mikrostößel auf Eis homogenisieren.
3. Proben mit 5000 g bei 4 °C 10 Minuten lang in einer Tischzentrifuge schleudern, um Rückstände, einschließlich Eigelb und unlösliche Pigmente, zu pelletieren.
4. Entfernen Sie den Überstand eines separaten 1,5-ml-Röhrchens und achten Sie darauf, das Granulat zu vermeiden (Abbildung 2A).
5. Geben Sie ein gleiches Volumen von 2x Laemmli-Probenpuffer, ergänzt mit 5 % w/v 2-Mercaptoethanol, in den Überstand und kochen Sie 10 min bei 95-100 °C, um die Probenproteine zu denaturieren.
6. Verwenden Sie die Proben sofort oder lagern Sie sie monate- bis jahrelang bei -20 °C.

3. SDB-SEITE

1. Vorbereitung des SDS-Laufpuffers: 1x Tris-MOPS-SDS-Puffer (6,06 g Trisbase, 10,46 g 3- (N-Morpholinos)propansulfonsäure [MOPS], 1,0 g SDS, 0,3 g Ethylendiamintetraessigsäure [EDTA], doppelt deionisiertes Wasser auf 1000 mL).
2. Nehmen Sie ein 4-12% Bis-tris SDS-Fertiggel aus der Verpackung. Entfernen Sie den Aufkleber am unteren Rand des Gels.
3. Führen Sie das Gel in die Elektrodenanordnung gegenüber einem Pufferdamm ein. Setzen Sie die Elektrodeneinheit in den vertikalen Elektrophoresebehälter ein (Abbildung 2B).
4. Füllen Sie die Elektrodeneinheit und den Boden des Elektrophoresebehälters mit 1x Tris-MOPS-SDS-Laufpuffer.
5. Entfernen Sie vorsichtig den Gelkamm aus dem Gel und pipettieren Sie den Puffer in die Vertiefungen, um Blasen zu entfernen und den Puffer auszugleichen.
6. Laden Sie vorsichtig 5 μl vorgefärbter Proteinstandards in die erste Vertiefung und 10 μl jeder Probe in die zusätzlichen Vertiefungen.
7. (FAKULTATIV) Befüllen Sie die verbleibenden Wells mit 10 μL 1x Laemmli Probenpuffer, damit das Gel gleichmäßiger läuft.
8. Setzen Sie den Deckel auf den Elektrophoresebehälter und schließen Sie ihn an eine Stromversorgung an. Legen Sie 200 V an.
9. Stoppen Sie die Elektrophorese, wenn die Farbstofffront des Probenpuffers das Gel verlässt.

4. Nasstransfer von Proteinen auf eine Membran

1. Während der Elektrophorese der Proben ist 1 l Transferpuffer (3,0 g Trisbase, 4,08 g Bicine, 900 mL doppelt deionisiertes Wasser, 100 mL Methanol) vorzubereiten. Den Transferpuffer auf 4 °C vorkühlen.
   ACHTUNG: Behandeln Sie konzentrierte Methanolvorräte in einem Abzug und vermeiden Sie den Kontakt mit der Haut. Methanol kann durch Ethanol substituiert werden.
2. Bevor die Elektrophorese abgeschlossen ist, beginnen Sie mit dem Zusammenbau des Transfer-"Sandwiches" in den Transferclip (Abbildung 2C).
   1. Füllen Sie eine Auflaufform aus Glas mit gekühltem Transferpuffer. Stellen Sie in den nachfolgenden Schritten der Sandwichmontage sicher, dass die Materialien in diesen Puffer eingetaucht sind.
   2. Legen Sie den Transferclip so in die Schale, dass die schwarze Hälfte am Boden der Schale anliegt, die weiße Hälfte offen und nach oben zeigt und der Transferclip nach links offen ist.
   3. Lege ein oder zwei Faserschwämme flach auf die schwarze Hälfte des Transferclips.
   4. Schneiden Sie zwei 0,35 mm Zellulosechromatographiepapiere (Filterpapiere) zu und legen Sie eines auf die Schwämme.
3. Entfernen Sie nach Abschluss der Elektrophorese das Gel aus dem Elektrophoresetank.
4. Hebeln Sie die Platten des Gels vorsichtig mit dem Öffnungshebel der Gelkassette auseinander und stellen Sie sicher, dass das Gel an einer der Platten befestigt bleibt (Abbildung 2D). Schneiden Sie die Vertiefungen von der Oberseite des Gels mit dem Geltrenner ab.
5. Legen Sie das Gel, das noch an einer Hälfte der Kunststoffkassette befestigt ist, auf das Filterpapier. Entfernen Sie die Kassettenhälfte, so dass das Gel auf dem Filterpapier verbleibt.
6. Schneiden Sie ein Quadrat aus 0,45 μm Nitrozellulosemembran so zu, dass es den Abmessungen des Gels entspricht. Entfernen Sie die Membran vom Schutzpapier, befeuchten Sie sie kurz mit Transferpuffer und legen Sie sie auf das Gel.
   HINWEIS: Fassen Sie die Membran vorsichtig mit Handschuhen oder Pinzetten an den Ecken an, um eine unerwünschte Proteinkontamination der Membran zu vermeiden.
7. Legen Sie ein zweites Filterpapier auf die Nitrozellulosemembran. Entfernen Sie vorsichtig aber sicher alle Blasen mit einer Rolle auf dem Filterpapier.
8. Stapeln Sie ein bis zwei weitere Faserschwämme auf das Filterpapier.
9. Schließen Sie die Transferkassette und klemmen Sie sie fest zu, um das "Sandwich" zu vervollständigen.
10. Führen Sie das Transfersandwich mit dem Transferclip nach oben und der schwarzen Seite des Transferclips zur schwarzen Seite des Kerns in den Transferkern ein.
11. Setzen Sie den Transferkern in den Elektrophoresebehälter ein. Lege einen Eisbeutel und einen Rührstab in den Tank, damit sich der Rührstab frei drehen kann.
    HINWEIS: Zusätzlich zu oder anstelle eines Kühlakkus kann der Transfer in einem Kühlraum bei 4 °C in Schritt 4.13 durchgeführt werden.
12. Füllen Sie den Tank mit gekühltem Transferpuffer. Befestigen Sie den Deckel fest auf der Oberseite.
13. Schließen Sie das Übertragungsgerät an die Stromversorgung an und achten Sie darauf, dass die Elektrodenfarben ausgerichtet sind. Lassen Sie den Transfer 1 h lang bei 100 V bei 4 °C laufen, wobei sich der Rührstab dreht.

5. Membranverarbeitung nach dem Transfer

1. Bereiten Sie 10x Tris-gepufferte Kochsalzlösung (100 mM Tris-Base; 1,5 M NaCl) vor. Stellen Sie den pH-Wert auf 8 ein und sterilisieren Sie den Filter.
2. Bereiten Sie 1x Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit Tween-20 (TBSTw) vor, indem Sie 10x TBS-Lösung 1:10 in 500 mL doppelt deionisiertem Wasser verdünnen und 500 μL Tween-20 hinzufügen.
3. Bereiten Sie Blockierungspuffer vor (500 ml TBSTw, 25 g fettfreies Milchpulver).
   HINWEIS: Fettfreie Milch kann durch 2-5 % Rinderserumalbumin (BSA) im Blockierungspuffer ersetzt werden. BSA sollte verwendet werden, wenn die experimentelle Anwendung die Visualisierung biotinylierter Proteine umfasst, da Milch Biotin enthält.
4. Sobald die Übertragung abgeschlossen ist, entfernen und zerlegen Sie das Sandwich vorsichtig und entfernen Sie die Nitrozellulosemembran. Markieren Sie, welche Seite der Membran mit dem Gel in Kontakt gekommen ist, und halten Sie diese Seite in den folgenden Schritten nach oben.
5. Bereiten Sie 50 ml Ponceau-Färbung (0,5 % Ponceau S, 1 % Essigsäure) vor, eine reversible Färbung zur Proteinvisualisierung.
   ACHTUNG: Ponceau-Fleck ist ätzend. Vermeiden Sie den Kontakt mit der Haut.
6. Legen Sie die Membran in einen kleinen Behälter (wie in Abbildung 2D gezeigt), so dass sie bündig mit dem Boden des Behälters abschließt. Die Membran bis zum Eintauchen mit Ponceau-Beize abdecken und auf einer Wippe 5-10 Minuten lang sanft schaukeln.
7. Gießen Sie den Ponceau-Fleck ab.
   HINWEIS: Ponceau-Beize kann mehrfach wiederverwendet werden.
8. Spülen Sie die Membran in wiederholten Wäschen mit doppelt deionisiertem Wasser, bis überschüssiges Ponceau entfernt ist und sich die Proteinbanden in den Bahnen zu lösen beginnen.
9. Bestätigen Sie die Effizienz der Übertragung durch das Vorhandensein gerader, ebener Fahrspuren mit klar aufgelösten Banden.
10. Gießen Sie die restliche Flüssigkeit ab und tauchen Sie den Blot in einen Blockierungspuffer, um eine unspezifische Antikörperbindung an die Membran in nachgeschalteten Schritten zu verhindern.
11. Auf einer Wippe 30-60 min bei Raumtemperatur sanft schaukeln.

6. Inkubation von Antikörpern

1. Verdünnen Sie den Primärantikörper in 10 ml frischem Blockierungspuffer auf die gewünschte Konzentration.
   HINWEIS: Die optimale Konzentration muss für jeden neuen Antikörper empirisch bestimmt werden. Ein typischer Ausgangspunkt ist 1:1000, oder folgen Sie den Empfehlungen des Herstellers.
2. Entfernen Sie den Blockierungspuffer und ersetzen Sie ihn durch das Antikörpergemisch. Inkubieren, sanft schaukeln, über Nacht (~16 h) bei 4 °C.
3. Gießen Sie die primäre Antikörperlösung ab und spülen Sie die Membran mit TBSTw aus, indem Sie sie in die Lösung eintauchen und schnell abgießen.
   HINWEIS: Die meisten Antikörpermischungen können zwei- bis dreimal aufbewahrt und wiederverwendet werden. Dies muss für jeden Antikörper empirisch bestimmt werden.
4. Waschen Sie die Membran, indem Sie sie in TBSTw tauchen und 5 Minuten lang leicht bei Raumtemperatur schaukeln. Führen Sie insgesamt drei 5-minütige Wäschen durch.
5. Verdünnen Sie den Sekundärantikörper in 30 ml TBSTw auf die gewünschte Konzentration.
   HINWEIS: Die Konzentration muss für jeden Antikörper empirisch bestimmt werden. In der Regel verwenden wir 1:30.000.
6. Gießen Sie die TBSTw-Waschlösung ab und ersetzen Sie sie durch das sekundäre Antikörpergemisch. Unter leichtem Schaukeln 45 min bei Raumtemperatur inkubieren.
7. Spülen Sie die Membran einmal schnell mit TBSTw aus, gefolgt von drei 5-minütigen TBSTw-Wäschen.

7. Abbildung der Membran auf einem Filmentwickler

1. Schalten Sie in einer Dunkelkammer den Filmentwickler ein und lassen Sie ihn aufwärmen.
2. Schneide zwei Quadrate Plastikfolie aus, die groß genug sind, um die Membran zu umschließen. Legen Sie die Nitrozellulosemembran mit einer Pinzette mit der Vorderseite nach oben auf das erste Quadrat der Plastikfolie.
3. Mischen Sie in einem 1,5-ml-Röhrchen gleiche Mengen der Luminol- und Enhancer-Reagenzien für die verstärkte Chemilumineszenz (ECL). Die Verwendung von 1 ml der gemischten Lösung sollte die meisten Membranen bedecken.
4. Pipettieren Sie das ECL-Reagenz auf die Membran und manipulieren Sie die Membran vorsichtig mit der Plastikfolie, um eine vollständige Abdeckung zu gewährleisten. 1 Min. inkubieren.
5. Entfernen Sie überschüssiges ECL-Reagenz, indem Sie die Membran mit einer Pinzette greifen und die Flüssigkeit vorsichtig abschütteln oder ableiten, indem Sie eine Ecke der Membran mit einem Papiertuch berühren.
6. Legen Sie die Membran mit der Vorderseite nach oben auf das zweite Quadrat Frischhaltefolie und falten Sie die Frischhaltefolie über die Folie, bis sie locker verschlossen ist. Kleben Sie die eingewickelte Membran sicher in eine Autoradiographie-Kassette.
7. Legen Sie in der Dunkelkammer einen Film in die Kassette ein, der die abgeklebte Membran abdeckt. Verschließen Sie die Kassette fest und belichten Sie die Folie 1 Minute lang mit der Membran.
8. Entfernen Sie die Folie vorsichtig und achten Sie darauf, die belichtete Folie nicht an der Membran entlang zu ziehen. Geben Sie es in den Filmentwickler ein.
9. Nach der Evaluierung des entwickelten Films wird die Belichtungszeit mit den nachfolgenden Filmen angepasst, bis die gewünschte Proteinvisualisierung erreicht ist. Wenn die Proteinvisualisierung ein schwaches Signal liefert, wiederholen Sie den Inkubationsschritt des ECL-Reagenzes mit einem empfindlicheren ECL-Reagenz und bilden Sie es erneut ab.
10. Richten Sie den entwickelten Film an den im Dunkeln leuchtenden Markern aus und verwenden Sie diese Referenz, um die Position der vorgefärbten Proteinstandards auf der Membran auf dem Film zu markieren.
11. Sobald die Bildgebung abgeschlossen ist, entfernen Sie die Membran vorsichtig aus der Plastikfolie und tauchen Sie sie in TBSTw, um das restliche ECL-Reagenz abzuwaschen.

8. (Optional) Zusätzliche Antikörper-Inkubationen

HINWEIS: Das eines Immunoblots bezieht sich auf die Entfernung der anfänglichen primären und sekundären Antikörper mit einer denaturierenden Lösung (Stripping-Puffer), damit der Blot mit einem anderen Antikörper erneut untersucht werden kann. Die erneute Sondierung ermöglicht es, denselben Immunoblot auf die Expression verschiedener Proteinziele zu analysieren und unbekannte Proteine mit gut charakterisierten Proteinen zu vergleichen, die als Standards fungieren. Sondieren Sie zuerst mit dem Antikörper, der das vergleichsweise schwächste Signal erzeugt. Auf diese Weise werden Artefakte vermieden, die durch unvollständig abgestreifte Antikörper bei nachfolgenden Expositionen verursacht werden, und die Auswirkungen des Proteinverlusts durch wiederholtes eines Blots minimiert.

1. Sie die gebundenen Antikörper, indem Sie die Membran in Stripping-Puffer tauchen und 5-10 Minuten lang leicht schaukeln.
2. Entfernen Sie die Membran vom Stripping-Puffer und spülen Sie kurz in TBSTw, um eventuelle Reste der Stripping-Lösung zu entfernen.
3. Tauchen Sie die Membran in Blocking-Puffer und schütteln Sie sie 30 Minuten lang sanft.
4. Stellen Sie eine neue Lösung des Primärantikörpers in einem Blockpuffer mit der gewünschten Konzentration her.
5. Geben Sie die neue Primärantikörperverdünnung in die Membran und inkubieren Sie sie sanft schaukelnd über Nacht bei 4 °C.
6. Fahren Sie ab Schritt 6.3 fort. Die Membran kann bis zu drei weitere Male abisoliert und erneut geprüft werden.

Ergebnisse

Um die Effizienz unseres Immunblotting-Protokolls zu demonstrieren, analysierten wir affinitätsmarkierte und endogene translationale Kontrollproteine in drei Arten von X. laevis-Proben: Eizellen im Stadium VI, Embryonen im Stadium 7 (Blastula) und Embryonen im Stadium 10,5 (Gastrula). Diese Stadien wurden ausgewählt, weil sie den Übergang der mittleren Blastula (Stadium 8.5) überspannen, der den Beginn einer robusten zygotischen Transkription markiert^13,14. Da die Entwicklung vor dem Übergang in der Mitte der Blastula ohne Transkription erfolgt, verlassen sich präzygotische (d. h. mütterlich kontrollierte) Embryonen stark auf translationale Kontrollmechanismen, um Zellschicksalsproteine mit der richtigen zeitlichen und räumlichen Auflösung zu exprimieren¹⁵. Daher ist der Übergang in der Mitte der Blastula ein wichtiger Kontext, um RNA-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen.

Um die Proteinexpression mittels Immunblotting zu analysieren, wurden X. laevis Eizellen und Embryonen mit 500 pg mRNA injiziert, die für die C-terminale Hälfte von X. laevis Bicaudal-C (Bicc1) kodiert, die mit 3x Hämagglutinin (HA)-Affinitätsmarkierungen fusioniert ist. Wir haben uns für die Analyse von Bicc1 entschieden, da es für die Xenopus-Biologie und Protein-RNA-Interaktionen relevant ist. Bicc1 ist ein mRNA-bindendes Protein und ein translationaler Repressor, der Entscheidungen über das Zellschicksal im frühen Embryo steuert 16,17,18. Später in der Entwicklung beeinflusst es die Links-Rechts-Musterung 19,20,21 und die Funktion der Organe, einschließlich der Nieren 22,23,24,25. Bicc1 enthält eine Region, die die translationale Repression⁵ und hnRNP K Homology (KH)-Domänen steuert, die die Bindung an spezifische mRNAs^{vermitteln 5,26,27,28}.

Es wurden Extrakte aus fünf HA-Bicc1-injizierten Eizellen oder Embryonen hergestellt, zusammen mit entsprechenden nicht injizierten Proben als Negativkontrollen. Ein Zehntel jedes Extrakts wurde auf einem Bis-Tris-Gel mit einem Gradienten von 4-12 % elektrophoresiert und nass auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. Die Ponceau-Färbung der Membran zum Nachweis des Gesamtproteins bestätigte den erfolgreichen Transfer (Abbildung 3A). Im Rahmen unserer Studien haben wir bei Kaninchen einen Antikörper erzeugt, der die C-terminale Hälfte des humanen Bicc1-Proteins erkennt. Dieser Antikörper wurde zum Nachweis des endogenen und exogenen Xl-Bicc1-Proteins verwendet (Abbildung 3B). Frühere Arbeiten zeigten, dass das Bicc1-Protein in den Oozyten von X. laevis nicht vorhanden ist, aber in Prä-MBT-Embryonen exprimiert wird, bevor das zygotische Genom aktiv ist¹⁶. Dies deutet darauf hin, dass sich Bicc1-mRNA zwar während der Oogenese ansammelt, aber translational unterdrückt wird. In Übereinstimmung mit dieser früheren Arbeit wurde endogenes Bicc1 in Eizellen nicht nachgewiesen. Im Gegensatz dazu erkannte der Antikörper endogenes Bicc1 (~MW 107 kDa) sowohl in Embryonen im Stadium 7 als auch in 10,5 Embryonen. Zusammengenommen bestätigen diese Ergebnisse, dass der Antikörper das endogene Bicc1-Protein erkennt (Abbildung 3B, oberes Bild, rote Pfeilspitze). Der Bicc1-Antikörper erkannte ein kleineres Protein von etwa 70 kDa in Extrakten, die aus mRNA-injizierten Proben hergestellt wurden (Abbildung 3B, oberes Bild, schwarze Pfeilspitze, vergleichen Sie die Spuren 2, 4 und 6 mit den Spuren 1, 3 und 5). Um die Spezifität des Bicc1-Antikörpers zu kontrollieren, wurde die Membran abgestreift und erneut mit einem Antikörper gegen den HA-Affinitätstag untersucht. Der HA-Antikörper identifizierte das 70-kDa-Protein in den injizierten Proben, erkannte jedoch nicht das endogene Bicc1 (Abbildung 3B, zweites Feld, schwarze Pfeilspitze). Der Nachweis des HA-Bicc1 C-Terms variiert in der Intensität zwischen den Stadien aufgrund von Unterschieden in der Proteinexpression aus injizierter mRNA in den verschiedenen Zelltypen.

Als nächstes erweiterten wir die Ergebnisse, indem wir die Expression endogener translationaler regulatorischer Proteine testeten, die mit Bicc1 interagieren. Zunächst analysierten wir die Expression von Ccr4-Not Transcription Complex Subunit 1 (Cnot1), einem großen Gerüstprotein und Teil des Ccr4-Not Deadenylase (CNOT) Komplexes. Der Multi-Subunit-CONT-Komplex ist eine der wichtigsten eukaryotischen Deadenylasen und ist vor allem dafür bekannt, den Poly(A)-Schwanz am Ende von Boten-mRNAs als Auftakt zu deren Abbau zu kürzen. Dieser Komplex hat jedoch vielfältige Rollen in der Translationskontrolle, die über die Deadenylierung hinausgehen²⁹. Wir waren an der Untersuchung der Cnot1-Expression interessiert, da der CNOT-Komplex für die mRNA-Regulation wichtig ist und frühere Beobachtungen gezeigt haben, dass Cnot1 mit Bicc1 interagiert^20,30. Um die Cnot1-Expression zu analysieren, verwendeten wir einen Antikörper, der das endogene Cnot1-Protein erkennt. Es wurden zwei Proteine mit 250 kDa und 270 kDa in jeder Probe identifiziert, was der vorhergesagten Größe von Cnot1 entspricht (Abbildung 3B, drittes Panel). Dieses Protokoll ermöglicht es uns also, eine kritische Komponente eines regulatorischen Komplexes leicht zu identifizieren. Darüber hinaus unterstützen diese Daten die Fähigkeit des Protokolls, Proteine mit hohem Molekulargewicht erfolgreich zu identifizieren.

Um die Verallgemeinerbarkeit dieser Ergebnisse weiter zu testen, analysierten wir als nächstes Proben auf das Vorhandensein einer prominenten DEAD-Box-Helikase, die an der translationalen Repression beteiligt ist, der DEAD-Box-Helikase 6 (Ddx6, früher bekannt als xp54 in Xenopus und me31b in Drosophila). Ddx6 ist ein wichtiger Bestandteil von Ribonukleoprotein-Granula, ist an der mRNA-Speicherung beteiligt und interagiert mit Bicc1 und Cnot1 ^6,31,32. Ein Antikörper, der das endogene Ddx6 erkennt, identifizierte in jeder Probe ein Protein von etwa 54 kDa (Abbildung 3B, viertes Feld). Die Expression war in zygotischen Embryonen reduziert (Abbildung 3B, vergleiche die Spuren 5 und 6 mit 1-4), wie zuvor berichtet³³.

Um sicherzustellen, dass die von uns beobachteten Unterschiede zwischen den Proben auf Unterschiede in der Expression zurückzuführen waren, entfernten wir den Immunoblot und untersuchten ihn erneut mit einem Antikörper, der das Enzym Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (Gapdh) erkennt. Gapdh dient als allgegenwärtig ausgedrückte "Ladekontrolle". Äquivalente Niveaus der Gapdh-Expression bestätigen die Ponceau-Färbung: Eine gleiche Menge des Gesamtproteins wird über alle Proben hinweg analysiert (Abbildung 3B, fünftes Panel).

Zusammengenommen bestätigen diese Ergebnisse die Wirksamkeit dieser Immunoblot-Methode. Wir waren in der Lage, exogene und endogene Bicc1 über mehrere X. laevis-Entwicklungsstadien hinweg zu identifizieren, die für die Untersuchung von RNA-Protein-Interaktionen relevant sind: Eizellen und Prä-MBT-Embryonen, die nur maternal deponierte mRNAs enthalten, und Post-MBT-Embryonen, die auch zygotisch transkribierte mRNAs enthalten. Wir konnten diese Ergebnisse verallgemeinern, indem wir die Expression mehrerer translationaler Kontrollproteine bei einer Vielzahl von Molekulargewichten (Bicc1, Cnot1 und Ddx6) und einer Belastungskontrolle (Gapdh) analysierten. Wir zeigen auch, dass dieses Protokoll für X. tropicalis-Embryonen verwendet werden kann, wobei die Modifikation vorgenommen werden kann, um die Menge des verwendeten Materials zu erhöhen, um ihrer geringeren Größe Rechnung zu tragen (Ergänzende Abbildung 1).

Abbildung 3: Identifizierung des Gehalts an translationalen regulatorischen Proteinen durch Immunblotting in X. laevis. (A) Ponceau-Färbung des Immunoblots zur Identifizierung des Gesamtproteins aus X . laevis Eizellen im Stadium VI, Embryonen im Stadium 7 und Embryonen im Stadium 10,5. Jede Spur repräsentiert 10 % des Proteins, das aus einem Extrakt (0,5 Eizellen oder Embryo) hergestellt wird. (B) Immunoblot-Analyse ausgewählter translationaler regulatorischer Proteine von X. laevis in Eizellen im Stadium VI, Embryonen im Stadium 7 und Embryonen im Stadium 10,5. Die Spuren 2, 4 und 6 entsprechen Proben, die vor der Analyse mit HA-Bicc1-mRNA mikroinjiziert wurden, während die Spuren 1, 3 und 5 als negative (nicht injizierte) Kontrollen dienen. α-Bicc1-Antikörper wurde verwendet, um die Expression von endogenem Bicc1 in verschiedenen Stadien zu testen (oberes Bild). Der Blot wurde anschließend entfernt und erneut mit einem Antikörper gegen den HA-Affinitätstag untersucht, um die Spezifität des α-Bicc1-Antikörpers zu kontrollieren (zweites Panel). Die Blots wurden entfernt und mit α-Cnot1 (drittes Panel) und α-Ddx6 (viertes Panel) erneut auf zusätzliche regulatorische Proteine untersucht. α-Gapdh (unteres Feld) diente als Kontrolle für eine gleichmäßige Proteinbeladung. Rote Pfeilspitzen markieren die Position des endogenen Bicc1, während schwarze Pfeilspitzen die Position des exogen exprimierten HA-Bicc1 C-Terms markieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: Immunoplot-Analyse des Bicc1-Proteins in Xenopus laevis versus Xenopus tropicalis. α-Bicc1-Antikörper wurde verwendet, um die Expression von endogenem und exogenem Bicc1 über verschiedene Mengen an X. laevis und X. tropicalis Embryoextrakt zu testen. Spur 1: 0,5 nicht injizierte X. laevis-Embryonen . Spur 2: 0,5 HA-Bicc1 injizierter X. laevis Embryo. Spur 3: 3 nicht injizierte X. tropicalis-Embryonen . Spur 4: 1 nicht injizierter X. tropicalis-Embryo . Spur 5: 0,5 nicht injizierte X. tropicalis-Embryonen . Es wurden zwei Antikörper verwendet, die endogenes Bicc1 erkennen: einer gegen humanes Bicc1 (oberes Feld) und der andere gegen X. laevis Bicc1 (mittleres Feld). α-Gapdh (unteres Feld) wurde verwendet, um eine gleichmäßige Proteinbeladung zu kontrollieren. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Obwohl das Konzept einfach ist, ist das Immunblotting in der Praxis schwierig, da es mehrere Schritte gibt, die sich über mehrere Tage erstrecken. Daher ist es oft eine Herausforderung, konsistente, qualitativ hochwertige Ergebnisse zu erzielen. Nichtsdestotrotz ist Immunblotting ein wichtiger und allgegenwärtiger Bestandteil der modernen Biologie. Zum Beispiel ist das Immunblotting entscheidend für die Bestätigung der erfolgreichen Translation und Expression der mikroinjizierten mRNA in X . laevis-Eizellen und -Embryonen, was ihre Bedeutung für die X . laevis-Forschung unterstreicht. Darüber hinaus wird bei Immunpräzipitationsexperimenten Immunblotting eingesetzt, um Protein-Protein-Wechselwirkungen in vivo zu analysieren. Der effiziente Nachweis spezifischer Proteine hängt weitgehend von ihrer Häufigkeit und der Qualität der Antikörpernachweisreagenzien ab. In dieser Studie lagen die geschätzten Konzentrationen des von uns analysierten endogenen Proteins im Xenopus-Ei fast um das 500-fache (Bicc1: 37,22 nM, Cnot1: 115,08 nM, Ddx6: 980,55 nM, Gapdh: 17.907,26 nM)³⁴, aber alle wurden leicht nachgewiesen. Unterhalb dieses Bereichs können bei Bedarf Änderungen am Arbeitsablauf bei praktisch jedem Schritt eines Immunoblots vorgenommen werden – von der Probenentnahme bis zur Bildgebung –, um die Genauigkeit und Effizienz der Detektion zu verbessern.

Welche Art von SDS-PAGE-Gel und Membran verwendet werden soll, ist eine wichtige Überlegung bei jedem Immunblotting-Experiment. Unserer Erfahrung nach sind Fertiggele einfacher und reproduzierbarer als selbst hergestellte Gele. Vorgefertigte Gele haben den zusätzlichen Vorteil, dass sie in Gradientenformaten erhältlich sind, bei denen die Polyacrylamidkonzentration der Gele von oben nach unten allmählich zunimmt. Gradientengele ermöglichen es Forschern, eine breite Palette von Proteinen mit sehr unterschiedlichen Molekulargewichten aufzulösen und zu analysieren. Auf diese Weise wird der typische Kompromiss zwischen der Wahl eines Gels mit niedrigem Acrylamidanteil (<7 %), das Proteine mit hohem Molekulargewicht auflöst, und einem Gel mit hohem Acrylamidanteil (>12 %), das Proteine mit niedrigem Molekulargewicht besser auflöst, vermieden. Es ist auch wichtig zu überlegen, ob eine Membran aus Nitrozellulose oder Polyvinylidenfluorid (PVDF) für den Proteintransfer verwendet werden soll. Der Mechanismus und die Vorteile der einzelnen Membrantypen wurden ausführlich diskutiert^35,36. Kurz gesagt, PVDF hat eine höhere Proteinbindungskapazität (und damit eine höhere Empfindlichkeit) als Nitrozellulosemembranen und ist bei wiederholter Anwendung haltbarer. PVDF erfordert jedoch eine zusätzliche Handhabung in Form einer Aktivierung durch Methanol-Inkubation und ist teurer. Obwohl wir der Meinung sind, dass beide Membranen für die meisten Anwendungen geeignet sind, verwenden wir aus Kostengründen routinemäßig Nitrozellulose.

Die Bildgebung des Immunoblots ist ein entscheidender Bestandteil des Protokolls. Während dieses Schritts müssen die Forscher ihr Urteilsvermögen ausüben, um ein Bild eines Immunoblots aufzunehmen, das alle notwendigen Informationen vermittelt, aber das Hintergrundrauschen auf ein Minimum reduziert. Es gibt zwei Hauptbildgebungsverfahren für HRP-konjugierte Standard-Antikörper: Röntgenfilm oder digitale Bildgebungssysteme. Unserer Erfahrung nach hat die Aufnahme von Bildern mit Röntgenfilm viele Vorteile. Röntgenfilme sind in der Regel weitaus empfindlicher als digitale Bildgebungssysteme, was den Nachweis von Proteinen mit geringer Häufigkeit erleichtert. Röntgenfilme erzeugen auch eine physische Aufzeichnung des Experiments, die mit hoher Auflösung kommentiert und digitalisiert werden kann. Ein digitales Bildgebungssystem verfügt jedoch über einen weitaus besseren linearen Bereich - das Verhältnis zwischen Signalstärke und Bildintensität - als ein Filmentwickler. Aufgrund seiner Empfindlichkeit kann ein Röntgenfilm schnell überbelichtet werden und dabei quantitative Informationen verloren gehen. Daher sollte ein Forscher, der eine genaue Quantifizierung seiner Ergebnisse anstrebt, ein digitales Bildgebungssystem verwenden oder besonders darauf achten, sich entwickelnde Immunoblots nicht mit Röntgenfilmen zu überbelichten.

Wenn die Immunblotting-Ergebnisse nach Befolgung des Protokolls, wie wir es skizziert haben, unbefriedigend sind, wie z. B. schwache oder "verschwommene" Banden bei der Bildgebung, können mehrere Anpassungen vorgenommen werden, um das Ergebnis zu verbessern. So kann beispielsweise die Menge der analysierten Xenopus-Proteinmischung angepasst werden. Das Gesamtprotein von nur einem Fünftel eines Embryos kann zu starken Ergebnissen führen, obwohl es möglich ist, bis zu zwei Embryonen oder Eizellen pro Gelbahn zu laden. Das Laden von zu viel Protein kann zu Artefakten oder unerwünschten hohen Hintergrundsignalen während der Bildgebung führen. Darüber hinaus führt die Elektrophorese bei einer niedrigeren Spannung (100 V) für eine längere Laufzeit in der Regel zu schärferen Proteinbanden. In ähnlicher Weise kann die Durchführung des Proteintransfers über Nacht bei 4 °C bei niedriger Spannung (30 V) statt einer Stunde bei 100 V den Proteinnachweis verbessern, insbesondere bei Spezies mit hohem Molekulargewicht. Schließlich weisen einige Primärantikörper-Inkubationen ihre Ziele robuster nach, indem sie Inkubationen von 1 Stunde bei Raumtemperatur verwenden, im Gegensatz zu 4 °C über Nacht. Diese Protokollmodifikation muss für jeden Primärantikörper getestet werden.

Die Identifizierung von Antikörpern zum Nachweis endogener Proteine stellt eine große Herausforderung für das Immunblotting bei Xenopus dar, da relativ wenige Xenopus-spezifische Antikörper kommerziell verfügbar sind. Forscher können von nicht-kommerziellen Quellen für Xenopus-Antikörper wie Xenbase³⁷ (https://www.xenbase.org/xenbase/), der Developmental Studies Hybridoma Bank (https://dshb.biology.uiowa.edu/) und dem European Xenopus Resource Centre (https://xenopusresource.org/) profitieren. Alternativ können Antikörper, die zum Nachweis von menschlichem oder Mausprotein erzeugt werden, nützlich sein, um homologe Xenopus-Proteine nachzuweisen, abhängig von der Konservierung der Regionen, die für die Antikörperproduktion verwendet werden. Zum Beispiel wurde ein Bicc1-Antikörper, der in diesem Protokoll vorgestellt wurde, gegen das humane Bicc1-Protein gezüchtet. Für solche Reagenzien muss die Fähigkeit zur Kreuzreaktion mit Xenopus-Proteinen empirisch bestimmt werden. Obwohl die genauen Epitope, die Unternehmen zur Herstellung von Antikörpern verwenden, in der Regel proprietär sind, stellen viele auf Anfrage einen Aminosäurebereich für das Epitop zur Verfügung. Diese Region kann dann mit der entsprechenden Region des homologen Xenopus-Proteins ausgerichtet werden. Obwohl der Erfolg nicht garantiert ist, hatten wir in der Regel Erfolg, wenn das Epitop, das für die Antikörperproduktion in der Zielspezies verwendet wurde, mindestens 75 % oder mehr Ähnlichkeit mit dem vergleichbaren Sequenzabschnitt in Xenopus aufweist. Antikörper, die gegen Nicht-Xenopus-Proteine erzeugt werden, sollten vor einer extensiven Anwendung validiert werden, da eine unsachgemäße Überprüfung von Antikörpern einen wichtigen Beitrag zu nicht reproduzierbarer Forschung leistet^38,39. Dies kann durch Expression eines markierten Xenopus-Proteins, das in Embryonen von Interesse ist, durch mRNA-Mikroinjektion^{erfolgen 40}. Die Analyse derselben Proben mit einem Antikörper gegen den Affinitätstag wird dann verwendet, um zu bestätigen, dass der Antikörper gegen das endogene Protein und der Antikörper gegen das markierte Protein beide dieselbe Entität erkennen (wie in Abbildung 3B).

Die Analyse von RNA-bindenden Proteinen, insbesondere von solchen mit regulatorischen Funktionen wie Bicc1, kann sich aufgrund eines Mangels an Reagenzien und einer typischerweise geringen Expression potenter regulatorischer Moleküle als schwierig erweisen. Dieses Problem wird beim Immunblotting deutlicher, wo jedes Reagenz separat optimiert werden muss und es schwierig sein kann, Antikörper mit ausreichender Spezifität und Sensitivität zu finden. Unsere Absicht mit diesem Protokoll ist es, spezifische Einschränkungen des Immunblottings in Xenopus zu untersuchen und Schritte zu erarbeiten, die auf andere Systeme anwendbar sind, so dass Forscher die Schwierigkeiten bei der Analyse von RNA-bindenden Proteinen überwinden können.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
100 Quadratfuß Heavy Duty Premium Wrap	Saran	2570000130
10-facher Zelllysepuffer	Zell-Signaltechnik	#9803
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
2-Quart-längliche Back-/Servierschale	Pyrex	71160010116
2x Laemmli-Samplepuffer	Bio-Rad	#1610737
Anti-HA-Antikörper mit hoher Affinität	Roche	11867423001	Wie vorgeschrieben vorbereitet und bei 1:10.000 Verdünnung verwendet.
Anti-Kaninchen-IgG, HRP-gebundener Antikörper	Zell-Signaltechnik	7074S	Verwendet bei 1:30.000 Verdünnung.
Autoradiographie-Kassette, 5 x 7 Zoll	Research Products International	420057	Nicht notwendig, wenn man ein digitales Bildgebungssystem verwendet.
Bel-Art Einwegstößel	Millipore Sigma	BAF199230001
Bicaudal-C (menschlicher) Kaninchenantikörper	Envigo Bioproducts (jetzt Inotiv)	N/A	Sonderbestellt. Verwendet bei 1:20.000 Verdünnung.
Bicaudal-C (Xenopus) Kaninchenantikörper	Envigo Bioproducts (jetzt Inotiv)	N/A	Sonderbestellt. Verwendet bei 1:20.000 Verdünnung. Ref. Park et al., 2016
Rinderserum-Albumin	Sigma-Aldrich	A3294	Ein Ersatz für fettfreie Milch im Blockpuffer.
Zentrifuge 5425	Eppendorf	13-864-456
CL-XPosure Film	ThermoFisher Scientific	34091	Nicht notwendig, wenn man ein digitales Bildgebungssystem verwendet.
CNOT1 (D5M1K) Monoklonaler Antikörper gegen Kaninchen	Zell-Signaltechnik	#44613	Verwendet bei 1:2.000 Verdünnung.
DDX6/RCK (D26C11) Monoklonaler Antikörper gegen Kaninchen	Zell-Signaltechnik	#8988	Verwendet bei 1:5.000 Verdünnung.
E-Z-Store- und Gussentwickler	MXR-Bildgebung	103633	Nicht notwendig, wenn man ein digitales Bildgebungssystem verwendet.
E-Z Store and Pour Fixer	MXR-Bildgebung	114511	Nicht notwendig, wenn man ein digitales Bildgebungssystem verwendet.
GAPDH Monoklonaler Antikörper	ProteinTech	60004-1-Ig	Verwendet bei 1:40.000 Verdünnung.
Gel Releaser	Bio-Rad	#1653320
Ziegen-Maus-IgG (H+L) Sekundärantikörper, HRP	Invitrogen	A16066	Wie angewiesen vorbereitet und bei Verdünnung von 1:40.000 verwendet.
Eispack, 8 oz, 5 x 3 x 1"	Uline	S-18256
L-Cystein	Sigma-Aldrich	C7352
Medizinischer Filmprozessor	Konica Minolta	SRX-101A	Nicht notwendig, wenn man ein digitales Bildgebungssystem verwendet.
Mini-PROTEAN  Kassettenöffnungshebel	Bio-Rad	#4560000
Mini-PROTEAN  Tetra vertikale Elektrophorese-Zelle	Bio-Rad	#1658004
PRO 700ml Western Blot Elektrophorese-Tank	-Lieferungen	BB2369
Nitrocellulose-Membran, 0,45 & Mikro; m	Bio-Rad	#1620115
Fettarme Trockenmilch	Sanalac	1570000180
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rat IgG (H+L)	Jackson Immunforschung	112-035-003	Wie vorgeschrieben vorbereitet und mit einer Verdünnung von 1:100.000 verwendet.
Polysorbat (Tween) 20	Fisher-Bioreagenzien	BP337-500
Ponceau S	VWR Life Science	K793-500ML	Eine Annäherung lässt sich mit 0,5 % Ponceau S, 1 % Essigsäure annehmen
PowerPac Grundstromversorgung	Bio-Rad	1645050
PR1MA 2D-Kipphebel mit variabler Geschwindigkeit	MidSci	R2D-30
Precision Plus Protein Dual Color Standards Leiter	Bio-Rad	#1610374	Jede bevorzugte Proteinleiter kann verwendet werden.
Reines Cellulosechromatographie-Filterpapier, 0,35 mm	Fisher Scientific	05-714-4
Wiederherstellen des Western Blot Stripping Buffers	ThermoFisher Scientific	#21059
Natriumchlorid	Fisher Chemical	S640-10
Lagerbox 300 mL	Rosti Mepal	RST46608	Für Nitrocellulose-Membranblockierung, Antikörperinkubation und Wascharbeiten
SuperSignal West Femto Substrat für maximale Empfindlichkeit	ThermoFisher Scientific	#34094	Ein verstärktes chemilumineszentes (ECL) Substrat, das zwei Komponenten enthält: Luminol und Enhancer. Dieses ECL-Reagenz hat eine geringe Femtogrammsensitivität.
SuperSignal West Pico PLUS chemilumineszentes Substrat	ThermoFisher Scientific	#34580	Ein verstärktes chemilumineszentes (ECL) Substrat, das zwei Komponenten enthält: Luminol und Enhancer. Dieses ECL-Reagenz hat eine Pikogramm-zu-Femtogramm-Sensitivität.
SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 4– 12 %, 10 Brunnen-Polyacrylamid-Gele	GenScript	M00652
Transferpufferpulver	GenScript	M00652
Tris Base Ultrapure	USBiologisch	77-86-1
Tris-MOPS-SDS laufendes Pufferpulver	GenScript	M00138