Optimierte Analyse von Proteinen aus Xenopus-Eizellen und Embryonen durch Immunoblotting

Um zelluläre Mechanismen zu verstehen, müssen bestimmte Proteinspezies überwacht werden. Häufige Fragen sind, wie sie sich in ihrer Expression räumlich und zeitlich verändern, mit welchen Proteinen sie interagieren und ob sie als Reaktion auf unterschiedliche Bedingungen modifiziert werden. Immunoblotting, umgangssprachlich als "Western Blotting" bekannt, ist eine Schlüsselmethode, um diese Herausforderungen zu bewältigen. Ein Immunoblot-Experiment trennt Proteine aus einer komplexen Probe - zum Beispiel Ganzzelllysat - und identifiziert sie mit Hilfe von Antikörpern. Konkret werden Proteine denaturiert und dann durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) nach Größe getrennt. Die größenfraktionierten Proteine werden auf einen festen Träger, wie z. B. eine Nitrocellulosemembran, übertragen, und das Protein von Interesse wird unter Verwendung von Antikörperreagenzien identifiziert. Immunoblotting ist zu einem Standardbestandteil des Werkzeugkastens des Molekularbiologen geworden. Es wird häufig zur Überwachung der Proteinexpression in verschiedenen Kontexten oder als Endpunkt für Experimente wie Immunpräzipitationsassays verwendet. Trotz dieser Vorteile erweist sich die Analyse von Steady-State-Proteinspiegeln mit Immunblotting als Herausforderung, da der Assay für jeden Schritt und jeden experimentellen Kontext optimiert werden muss (Abbildung 1).

Eine Herausforderung ist die Analyse von Material des afrikanischen Krallenfrosches Xenopus laevis. X. laevis ist ein wichtiger Organismus für die Untersuchung von RNA-Protein-Interaktionen. Dieses System hat zahlreiche Vorteile, vor allem die Tatsache, dass X. laevis Hunderte von Eizellen produziert und sich anschließend synchron entwickelnde Embryonen auf einmal produziert. Jede Eizelle enthält ~25 μg Nicht-Dotter-Protein¹ und bietet damit reichlich Material für biochemische Experimente. Die große Größe (~1250 μm)¹ von Eizellen und Embryonen erleichtert auch die mRNA-Mikroinjektion, um markierte oder mutierte Proteine im Maßstab² exogen zu exprimieren. Diese Eigenschaften ermöglichen leistungsfähige Experimente zur Diagnostik der Translationskontrolle in X. laevis, wie z. B. den Tethered Function Assay, bei dem die Auswirkungen eines translationalen regulatorischen Proteins auf eine mRNA unabhängig von der Fähigkeit dieses Proteins zur RNA-Bindung getestet werden können ^3,4,5,6. Das Immunblotting in Xenopus-Eizellen und -Embryonen ist jedoch mit Schwierigkeiten verbunden, einschließlich der Interferenz durch große Massen von Dotterplättchen in diesen frühen Zellen⁷, die die Ergebnisse verschleiern, wenn sie nicht entfernt werden.

Hier stellen wir ein optimiertes Protokoll für effektives Immunblotting in X. laevis vor, wobei der Schwerpunkt auf dem Nachweis translationaler regulatorischer Proteine liegt. Wir geben Anweisungen zur Entnahme und Verarbeitung von Eizellen und Embryonen für die Bildgebung des endgültigen Immunoblots. Ebenfalls enthalten sind detaillierte Anweisungen für eine optimale Proteinbeladung und Bildgebung sowie zur Verhinderung einer Dotterkontamination der Probe. Darüber hinaus diskutieren wir mögliche Protokollmodifikationen und Strategien, um Antikörper zu finden, die mit Xenopus-Proteinen kompatibel sind. Wir beabsichtigen, Forschern eine Anleitung zur Verfügung zu stellen, wie sie Immunblotting im Rahmen ihrer eigenen Experimente in diesem wenig genutzten Modellorganismus mühelos durchführen können.

Abbildung 1: Arbeitsablauf für die Xenopus-Probenvorbereitung und die anschließende Immunoblot-Analyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Alle Arbeiten mit Tieren (X. laevis), die in diesem Protokoll dargestellt sind, entsprechen den Bestimmungen des UW-Madison Institutional Animal Care and Use Committee und wurden von diesem genehmigt. Einzelheiten zu den Geräten, den verwendeten Reagenzien und den verwendeten Antikörperkonzentrationen sind in der Materialtabelle aufgeführt. Eine Auswahl der Geräte ist in Abbildung 2 unten zu sehen.

Abbildung 2: Verarbeiteter Embryoextrakt und Ausrüstung für das Immunblotting. (A) Zentrifugierter Eizellenextrakt aus X. laevis Stadium VI. Lipide und fettlösliche Proteine steigen an die Spitze, während Vitellogenin (Eigelb) und pigmentierte Ablagerungen ein Pellet bilden. (B) Ausrüstung für SDS-PAGE zur Trennung von Proteinen nach Molekulargewicht. (i) Stromversorgung, (ii) Vertikaler Elektrophoresetank, (iii) Deckel des Elektrophoresetanks, (iv) Elektrodenanordnung, (v) Pufferdamm, (vi) Vorgefertigtes Elektrophoresegel; Beachten Sie den grünen Kamm (oben) und den blauen Aufkleber (unten), die jeweils entfernt werden müssen. (C) Ausrüstung für den Membrantransfer. Der vertikale Elektrophoresetank und der Deckel werden nach einer gründlichen Spülung für den Transfer wiederverwendet. (i) Walze zum Entfernen von Blasen, (ii) Transferclip, (iii) kleiner Rührstab, (iv) Nitrozellulosemembran zwischen zwei schützenden blauen Papierblättern, (v) Zellulosechromatographie-Filterpapier, (vi) Transferschwammkissen, (vii) Glasauflaufform für die Transfermontage, (viii) Eisbeutel, (ix) Transferkern. (D) Sonstige Ausrüstung. (i) Gel-Trenner (zum Trimmen von Gel-Wells vor dem Transfer), (ii) Öffnungshebel für die Gelkassette, (iii) Pinzette (für die Handhabung der Membran), (iv) Behälter (zum Halten der Membran), (v) Behälterdeckel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

1. Entnahme von Xenopus-Eizellen und -Embryonen

1. Vorbereitung der Eizelle
   1. Beziehen Sie defollikulierte X. laevis-Eizellen von einem kommerziellen Anbieter (Ecocyte Bio Science, Austin, Texas) oder isolieren und defollikulieren Sie wie beschrieben⁸.
   2. Kulturieren Sie isolierte Eizellen in modifizierter Barth-Lösung (MBS; 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,4 mM CaCl₂, 0,33 mM Ca(NO₃)₂, 0,8 mM MgSO₄, 5 mM Tris-HCl, 2,4 mM NaHCO₃, pH 7,4) bis zur Verwendung.
2. Vorbereitung des Embryos
   1. Isolieren Sie die Eier von X. laevis und befruchten Sie sie wie beschrieben ^9,10.
   2. Kulturbefruchtete Embryonen in 0,25x Marc's Modified Ringer's Solution¹¹ (MMR) (1x MMR: 0,1 M NaCl, 2,0 mM KCl, 1 mM MgSO₄, 2 mM CaCl₂, 5 mM HEPES).
   3. Bereiten Sie eine Lösung von 2 % Cystein in 0,1x MMR mit einem pH-Wert von 8,2 unter Verwendung von NaOH vor.
   4. Entfernen Sie 0,25x MMR aus der Schale, die für die Befruchtung verwendet wird, und bedecken Sie die Embryonen mit der Cysteinlösung, um die Geleeschicht^{zu entfernen 12}. Mischen Sie die Lösung vorsichtig, damit die Embryonen gleichmäßig freigelegt werden.
   5. Überwachen Sie die Embryonen mit einem Stereomikroskop mit 2- bis 25-facher Vergrößerung. Nachdem sich die Geleehülle aufgelöst hat (typischerweise 3-5 Minuten), packen sich die Embryonen dicht aneinander. Vermeiden Sie eine längere Exposition gegenüber Cystein.
   6. Entfernen Sie die Cysteinlösung und spülen Sie die Embryonen mehrmals mit 0,25x MMR aus.
   7. Kultur in 0,25x MMR bis zum gewünschten Wachstumsstadium.
3. Entnehmen Sie die gewünschte Anzahl von Embryonen oder Eizellen (empfohlen mindestens fünf pro Probe) in einem 1,5-ml-Röhrchen.
4. Entfernen Sie überschüssiges Medium mit einer Pipette, um eine Beschädigung der Zellen zu vermeiden.
5. Proben sofort verwenden oder bis zur Verwendung bei -80 °C lagern. Eizellen und Embryonen können mehrere Jahre gelagert werden.

2. Zubereitung von Xenopus-Extrakt

1. Tauen Sie die Proben auf Eis auf, wenn sie gefroren sind.
2. 10 μl gekühlter 10x Zelllysepuffer, verdünnt auf 1x mit doppelt deionisiertem Wasser (siehe Materialtabelle) pro Embryo/Eizelle zugeben und die Proben mit einem Mikrostößel auf Eis homogenisieren.
3. Proben mit 5000 g bei 4 °C 10 Minuten lang in einer Tischzentrifuge schleudern, um Rückstände, einschließlich Eigelb und unlösliche Pigmente, zu pelletieren.
4. Entfernen Sie den Überstand eines separaten 1,5-ml-Röhrchens und achten Sie darauf, das Granulat zu vermeiden (Abbildung 2A).
5. Geben Sie ein gleiches Volumen von 2x Laemmli-Probenpuffer, ergänzt mit 5 % w/v 2-Mercaptoethanol, in den Überstand und kochen Sie 10 min bei 95-100 °C, um die Probenproteine zu denaturieren.
6. Verwenden Sie die Proben sofort oder lagern Sie sie monate- bis jahrelang bei -20 °C.

3. SDB-SEITE

1. Vorbereitung des SDS-Laufpuffers: 1x Tris-MOPS-SDS-Puffer (6,06 g Trisbase, 10,46 g 3- (N-Morpholinos)propansulfonsäure [MOPS], 1,0 g SDS, 0,3 g Ethylendiamintetraessigsäure [EDTA], doppelt deionisiertes Wasser auf 1000 mL).
2. Nehmen Sie ein 4-12% Bis-tris SDS-Fertiggel aus der Verpackung. Entfernen Sie den Aufkleber am unteren Rand des Gels.
3. Führen Sie das Gel in die Elektrodenanordnung gegenüber einem Pufferdamm ein. Setzen Sie die Elektrodeneinheit in den vertikalen Elektrophoresebehälter ein (Abbildung 2B).
4. Füllen Sie die Elektrodeneinheit und den Boden des Elektrophoresebehälters mit 1x Tris-MOPS-SDS-Laufpuffer.
5. Entfernen Sie vorsichtig den Gelkamm aus dem Gel und pipettieren Sie den Puffer in die Vertiefungen, um Blasen zu entfernen und den Puffer auszugleichen.
6. Laden Sie vorsichtig 5 μl vorgefärbter Proteinstandards in die erste Vertiefung und 10 μl jeder Probe in die zusätzlichen Vertiefungen.
7. (FAKULTATIV) Befüllen Sie die verbleibenden Wells mit 10 μL 1x Laemmli Probenpuffer, damit das Gel gleichmäßiger läuft.
8. Setzen Sie den Deckel auf den Elektrophoresebehälter und schließen Sie ihn an eine Stromversorgung an. Legen Sie 200 V an.
9. Stoppen Sie die Elektrophorese, wenn die Farbstofffront des Probenpuffers das Gel verlässt.

4. Nasstransfer von Proteinen auf eine Membran

1. Während der Elektrophorese der Proben ist 1 l Transferpuffer (3,0 g Trisbase, 4,08 g Bicine, 900 mL doppelt deionisiertes Wasser, 100 mL Methanol) vorzubereiten. Den Transferpuffer auf 4 °C vorkühlen.
   ACHTUNG: Behandeln Sie konzentrierte Methanolvorräte in einem Abzug und vermeiden Sie den Kontakt mit der Haut. Methanol kann durch Ethanol substituiert werden.
2. Bevor die Elektrophorese abgeschlossen ist, beginnen Sie mit dem Zusammenbau des Transfer-"Sandwiches" in den Transferclip (Abbildung 2C).
   1. Füllen Sie eine Auflaufform aus Glas mit gekühltem Transferpuffer. Stellen Sie in den nachfolgenden Schritten der Sandwichmontage sicher, dass die Materialien in diesen Puffer eingetaucht sind.
   2. Legen Sie den Transferclip so in die Schale, dass die schwarze Hälfte am Boden der Schale anliegt, die weiße Hälfte offen und nach oben zeigt und der Transferclip nach links offen ist.
   3. Lege ein oder zwei Faserschwämme flach auf die schwarze Hälfte des Transferclips.
   4. Schneiden Sie zwei 0,35 mm Zellulosechromatographiepapiere (Filterpapiere) zu und legen Sie eines auf die Schwämme.
3. Entfernen Sie nach Abschluss der Elektrophorese das Gel aus dem Elektrophoresetank.
4. Hebeln Sie die Platten des Gels vorsichtig mit dem Öffnungshebel der Gelkassette auseinander und stellen Sie sicher, dass das Gel an einer der Platten befestigt bleibt (Abbildung 2D). Schneiden Sie die Vertiefungen von der Oberseite des Gels mit dem Geltrenner ab.
5. Legen Sie das Gel, das noch an einer Hälfte der Kunststoffkassette befestigt ist, auf das Filterpapier. Entfernen Sie die Kassettenhälfte, so dass das Gel auf dem Filterpapier verbleibt.
6. Schneiden Sie ein Quadrat aus 0,45 μm Nitrozellulosemembran so zu, dass es den Abmessungen des Gels entspricht. Entfernen Sie die Membran vom Schutzpapier, befeuchten Sie sie kurz mit Transferpuffer und legen Sie sie auf das Gel.
   HINWEIS: Fassen Sie die Membran vorsichtig mit Handschuhen oder Pinzetten an den Ecken an, um eine unerwünschte Proteinkontamination der Membran zu vermeiden.
7. Legen Sie ein zweites Filterpapier auf die Nitrozellulosemembran. Entfernen Sie vorsichtig aber sicher alle Blasen mit einer Rolle auf dem Filterpapier.
8. Stapeln Sie ein bis zwei weitere Faserschwämme auf das Filterpapier.
9. Schließen Sie die Transferkassette und klemmen Sie sie fest zu, um das "Sandwich" zu vervollständigen.
10. Führen Sie das Transfersandwich mit dem Transferclip nach oben und der schwarzen Seite des Transferclips zur schwarzen Seite des Kerns in den Transferkern ein.
11. Setzen Sie den Transferkern in den Elektrophoresebehälter ein. Lege einen Eisbeutel und einen Rührstab in den Tank, damit sich der Rührstab frei drehen kann.
    HINWEIS: Zusätzlich zu oder anstelle eines Kühlakkus kann der Transfer in einem Kühlraum bei 4 °C in Schritt 4.13 durchgeführt werden.
12. Füllen Sie den Tank mit gekühltem Transferpuffer. Befestigen Sie den Deckel fest auf der Oberseite.
13. Schließen Sie das Übertragungsgerät an die Stromversorgung an und achten Sie darauf, dass die Elektrodenfarben ausgerichtet sind. Lassen Sie den Transfer 1 h lang bei 100 V bei 4 °C laufen, wobei sich der Rührstab dreht.

5. Membranverarbeitung nach dem Transfer

1. Bereiten Sie 10x Tris-gepufferte Kochsalzlösung (100 mM Tris-Base; 1,5 M NaCl) vor. Stellen Sie den pH-Wert auf 8 ein und sterilisieren Sie den Filter.
2. Bereiten Sie 1x Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit Tween-20 (TBSTw) vor, indem Sie 10x TBS-Lösung 1:10 in 500 mL doppelt deionisiertem Wasser verdünnen und 500 μL Tween-20 hinzufügen.
3. Bereiten Sie Blockierungspuffer vor (500 ml TBSTw, 25 g fettfreies Milchpulver).
   HINWEIS: Fettfreie Milch kann durch 2-5 % Rinderserumalbumin (BSA) im Blockierungspuffer ersetzt werden. BSA sollte verwendet werden, wenn die experimentelle Anwendung die Visualisierung biotinylierter Proteine umfasst, da Milch Biotin enthält.
4. Sobald die Übertragung abgeschlossen ist, entfernen und zerlegen Sie das Sandwich vorsichtig und entfernen Sie die Nitrozellulosemembran. Markieren Sie, welche Seite der Membran mit dem Gel in Kontakt gekommen ist, und halten Sie diese Seite in den folgenden Schritten nach oben.
5. Bereiten Sie 50 ml Ponceau-Färbung (0,5 % Ponceau S, 1 % Essigsäure) vor, eine reversible Färbung zur Proteinvisualisierung.
   ACHTUNG: Ponceau-Fleck ist ätzend. Vermeiden Sie den Kontakt mit der Haut.
6. Legen Sie die Membran in einen kleinen Behälter (wie in Abbildung 2D gezeigt), so dass sie bündig mit dem Boden des Behälters abschließt. Die Membran bis zum Eintauchen mit Ponceau-Beize abdecken und auf einer Wippe 5-10 Minuten lang sanft schaukeln.
7. Gießen Sie den Ponceau-Fleck ab.
   HINWEIS: Ponceau-Beize kann mehrfach wiederverwendet werden.
8. Spülen Sie die Membran in wiederholten Wäschen mit doppelt deionisiertem Wasser, bis überschüssiges Ponceau entfernt ist und sich die Proteinbanden in den Bahnen zu lösen beginnen.
9. Bestätigen Sie die Effizienz der Übertragung durch das Vorhandensein gerader, ebener Fahrspuren mit klar aufgelösten Banden.
10. Gießen Sie die restliche Flüssigkeit ab und tauchen Sie den Blot in einen Blockierungspuffer, um eine unspezifische Antikörperbindung an die Membran in nachgeschalteten Schritten zu verhindern.
11. Auf einer Wippe 30-60 min bei Raumtemperatur sanft schaukeln.

6. Inkubation von Antikörpern

1. Verdünnen Sie den Primärantikörper in 10 ml frischem Blockierungspuffer auf die gewünschte Konzentration.
   HINWEIS: Die optimale Konzentration muss für jeden neuen Antikörper empirisch bestimmt werden. Ein typischer Ausgangspunkt ist 1:1000, oder folgen Sie den Empfehlungen des Herstellers.
2. Entfernen Sie den Blockierungspuffer und ersetzen Sie ihn durch das Antikörpergemisch. Inkubieren, sanft schaukeln, über Nacht (~16 h) bei 4 °C.
3. Gießen Sie die primäre Antikörperlösung ab und spülen Sie die Membran mit TBSTw aus, indem Sie sie in die Lösung eintauchen und schnell abgießen.
   HINWEIS: Die meisten Antikörpermischungen können zwei- bis dreimal aufbewahrt und wiederverwendet werden. Dies muss für jeden Antikörper empirisch bestimmt werden.
4. Waschen Sie die Membran, indem Sie sie in TBSTw tauchen und 5 Minuten lang leicht bei Raumtemperatur schaukeln. Führen Sie insgesamt drei 5-minütige Wäschen durch.
5. Verdünnen Sie den Sekundärantikörper in 30 ml TBSTw auf die gewünschte Konzentration.
   HINWEIS: Die Konzentration muss für jeden Antikörper empirisch bestimmt werden. In der Regel verwenden wir 1:30.000.
6. Gießen Sie die TBSTw-Waschlösung ab und ersetzen Sie sie durch das sekundäre Antikörpergemisch. Unter leichtem Schaukeln 45 min bei Raumtemperatur inkubieren.
7. Spülen Sie die Membran einmal schnell mit TBSTw aus, gefolgt von drei 5-minütigen TBSTw-Wäschen.

7. Abbildung der Membran auf einem Filmentwickler

1. Schalten Sie in einer Dunkelkammer den Filmentwickler ein und lassen Sie ihn aufwärmen.
2. Schneide zwei Quadrate Plastikfolie aus, die groß genug sind, um die Membran zu umschließen. Legen Sie die Nitrozellulosemembran mit einer Pinzette mit der Vorderseite nach oben auf das erste Quadrat der Plastikfolie.
3. Mischen Sie in einem 1,5-ml-Röhrchen gleiche Mengen der Luminol- und Enhancer-Reagenzien für die verstärkte Chemilumineszenz (ECL). Die Verwendung von 1 ml der gemischten Lösung sollte die meisten Membranen bedecken.
4. Pipettieren Sie das ECL-Reagenz auf die Membran und manipulieren Sie die Membran vorsichtig mit der Plastikfolie, um eine vollständige Abdeckung zu gewährleisten. 1 Min. inkubieren.
5. Entfernen Sie überschüssiges ECL-Reagenz, indem Sie die Membran mit einer Pinzette greifen und die Flüssigkeit vorsichtig abschütteln oder ableiten, indem Sie eine Ecke der Membran mit einem Papiertuch berühren.
6. Legen Sie die Membran mit der Vorderseite nach oben auf das zweite Quadrat Frischhaltefolie und falten Sie die Frischhaltefolie über die Folie, bis sie locker verschlossen ist. Kleben Sie die eingewickelte Membran sicher in eine Autoradiographie-Kassette.
7. Legen Sie in der Dunkelkammer einen Film in die Kassette ein, der die abgeklebte Membran abdeckt. Verschließen Sie die Kassette fest und belichten Sie die Folie 1 Minute lang mit der Membran.
8. Entfernen Sie die Folie vorsichtig und achten Sie darauf, die belichtete Folie nicht an der Membran entlang zu ziehen. Geben Sie es in den Filmentwickler ein.
9. Nach der Evaluierung des entwickelten Films wird die Belichtungszeit mit den nachfolgenden Filmen angepasst, bis die gewünschte Proteinvisualisierung erreicht ist. Wenn die Proteinvisualisierung ein schwaches Signal liefert, wiederholen Sie den Inkubationsschritt des ECL-Reagenzes mit einem empfindlicheren ECL-Reagenz und bilden Sie es erneut ab.
10. Richten Sie den entwickelten Film an den im Dunkeln leuchtenden Markern aus und verwenden Sie diese Referenz, um die Position der vorgefärbten Proteinstandards auf der Membran auf dem Film zu markieren.
11. Sobald die Bildgebung abgeschlossen ist, entfernen Sie die Membran vorsichtig aus der Plastikfolie und tauchen Sie sie in TBSTw, um das restliche ECL-Reagenz abzuwaschen.

8. (Optional) Zusätzliche Antikörper-Inkubationen

HINWEIS: Das eines Immunoblots bezieht sich auf die Entfernung der anfänglichen primären und sekundären Antikörper mit einer denaturierenden Lösung (Stripping-Puffer), damit der Blot mit einem anderen Antikörper erneut untersucht werden kann. Die erneute Sondierung ermöglicht es, denselben Immunoblot auf die Expression verschiedener Proteinziele zu analysieren und unbekannte Proteine mit gut charakterisierten Proteinen zu vergleichen, die als Standards fungieren. Sondieren Sie zuerst mit dem Antikörper, der das vergleichsweise schwächste Signal erzeugt. Auf diese Weise werden Artefakte vermieden, die durch unvollständig abgestreifte Antikörper bei nachfolgenden Expositionen verursacht werden, und die Auswirkungen des Proteinverlusts durch wiederholtes eines Blots minimiert.

1. Sie die gebundenen Antikörper, indem Sie die Membran in Stripping-Puffer tauchen und 5-10 Minuten lang leicht schaukeln.
2. Entfernen Sie die Membran vom Stripping-Puffer und spülen Sie kurz in TBSTw, um eventuelle Reste der Stripping-Lösung zu entfernen.
3. Tauchen Sie die Membran in Blocking-Puffer und schütteln Sie sie 30 Minuten lang sanft.
4. Stellen Sie eine neue Lösung des Primärantikörpers in einem Blockpuffer mit der gewünschten Konzentration her.
5. Geben Sie die neue Primärantikörperverdünnung in die Membran und inkubieren Sie sie sanft schaukelnd über Nacht bei 4 °C.
6. Fahren Sie ab Schritt 6.3 fort. Die Membran kann bis zu drei weitere Male abisoliert und erneut geprüft werden.

Um die Effizienz unseres Immunblotting-Protokolls zu demonstrieren, analysierten wir affinitätsmarkierte und endogene translationale Kontrollproteine in drei Arten von X. laevis-Proben: Eizellen im Stadium VI, Embryonen im Stadium 7 (Blastula) und Embryonen im Stadium 10,5 (Gastrula). Diese Stadien wurden ausgewählt, weil sie den Übergang der mittleren Blastula (Stadium 8.5) überspannen, der den Beginn einer robusten zygotischen Transkription markiert13,14. Da die Entwicklung vor dem Übergang in der Mitte der Blastula ohne Transkription erfolgt, verlassen sich präzygotische (d. h. mütterlich kontrollierte) Embryonen stark auf translationale Kontrollmechanismen, um Zellschicksalsproteine mit der richtigen zeitlichen und räumlichen Auflösung zu exprimieren15. Daher ist der Übergang in der Mitte der Blastula ein wichtiger Kontext, um RNA-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen.

Um die Proteinexpression mittels Immunblotting zu analysieren, wurden X. laevis Eizellen und Embryonen mit 500 pg mRNA injiziert, die für die C-terminale Hälfte von X. laevis Bicaudal-C (Bicc1) kodiert, die mit 3x Hämagglutinin (HA)-Affinitätsmarkierungen fusioniert ist. Wir haben uns für die Analyse von Bicc1 entschieden, da es für die Xenopus-Biologie und Protein-RNA-Interaktionen relevant ist. Bicc1 ist ein mRNA-bindendes Protein und ein translationaler Repressor, der Entscheidungen über das Zellschicksal im frühen Embryo steuert 16,17,18. Später in der Entwicklung beeinflusst es die Links-Rechts-Musterung 19,20,21 und die Funktion der Organe, einschließlich der Nieren 22,23,24,25. Bicc1 enthält eine Region, die die translationale Repression5 und hnRNP K Homology (KH)-Domänen steuert, die die Bindung an spezifische mRNAsvermitteln 5,26,27,28.

Es wurden Extrakte aus fünf HA-Bicc1-injizierten Eizellen oder Embryonen hergestellt, zusammen mit entsprechenden nicht injizierten Proben als Negativkontrollen. Ein Zehntel jedes Extrakts wurde auf einem Bis-Tris-Gel mit einem Gradienten von 4-12 % elektrophoresiert und nass auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. Die Ponceau-Färbung der Membran zum Nachweis des Gesamtproteins bestätigte den erfolgreichen Transfer (Abbildung 3A). Im Rahmen unserer Studien haben wir bei Kaninchen einen Antikörper erzeugt, der die C-terminale Hälfte des humanen Bicc1-Proteins erkennt. Dieser Antikörper wurde zum Nachweis des endogenen und exogenen Xl-Bicc1-Proteins verwendet (Abbildung 3B). Frühere Arbeiten zeigten, dass das Bicc1-Protein in den Oozyten von X. laevis nicht vorhanden ist, aber in Prä-MBT-Embryonen exprimiert wird, bevor das zygotische Genom aktiv ist16. Dies deutet darauf hin, dass sich Bicc1-mRNA zwar während der Oogenese ansammelt, aber translational unterdrückt wird. In Übereinstimmung mit dieser früheren Arbeit wurde endogenes Bicc1 in Eizellen nicht nachgewiesen. Im Gegensatz dazu erkannte der Antikörper endogenes Bicc1 (~MW 107 kDa) sowohl in Embryonen im Stadium 7 als auch in 10,5 Embryonen. Zusammengenommen bestätigen diese Ergebnisse, dass der Antikörper das endogene Bicc1-Protein erkennt (Abbildung 3B, oberes Bild, rote Pfeilspitze). Der Bicc1-Antikörper erkannte ein kleineres Protein von etwa 70 kDa in Extrakten, die aus mRNA-injizierten Proben hergestellt wurden (Abbildung 3B, oberes Bild, schwarze Pfeilspitze, vergleichen Sie die Spuren 2, 4 und 6 mit den Spuren 1, 3 und 5). Um die Spezifität des Bicc1-Antikörpers zu kontrollieren, wurde die Membran abgestreift und erneut mit einem Antikörper gegen den HA-Affinitätstag untersucht. Der HA-Antikörper identifizierte das 70-kDa-Protein in den injizierten Proben, erkannte jedoch nicht das endogene Bicc1 (Abbildung 3B, zweites Feld, schwarze Pfeilspitze). Der Nachweis des HA-Bicc1 C-Terms variiert in der Intensität zwischen den Stadien aufgrund von Unterschieden in der Proteinexpression aus injizierter mRNA in den verschiedenen Zelltypen.

Als nächstes erweiterten wir die Ergebnisse, indem wir die Expression endogener translationaler regulatorischer Proteine testeten, die mit Bicc1 interagieren. Zunächst analysierten wir die Expression von Ccr4-Not Transcription Complex Subunit 1 (Cnot1), einem großen Gerüstprotein und Teil des Ccr4-Not Deadenylase (CNOT) Komplexes. Der Multi-Subunit-CONT-Komplex ist eine der wichtigsten eukaryotischen Deadenylasen und ist vor allem dafür bekannt, den Poly(A)-Schwanz am Ende von Boten-mRNAs als Auftakt zu deren Abbau zu kürzen. Dieser Komplex hat jedoch vielfältige Rollen in der Translationskontrolle, die über die Deadenylierung hinausgehen29. Wir waren an der Untersuchung der Cnot1-Expression interessiert, da der CNOT-Komplex für die mRNA-Regulation wichtig ist und frühere Beobachtungen gezeigt haben, dass Cnot1 mit Bicc1 interagiert20,30. Um die Cnot1-Expression zu analysieren, verwendeten wir einen Antikörper, der das endogene Cnot1-Protein erkennt. Es wurden zwei Proteine mit 250 kDa und 270 kDa in jeder Probe identifiziert, was der vorhergesagten Größe von Cnot1 entspricht (Abbildung 3B, drittes Panel). Dieses Protokoll ermöglicht es uns also, eine kritische Komponente eines regulatorischen Komplexes leicht zu identifizieren. Darüber hinaus unterstützen diese Daten die Fähigkeit des Protokolls, Proteine mit hohem Molekulargewicht erfolgreich zu identifizieren.

Um die Verallgemeinerbarkeit dieser Ergebnisse weiter zu testen, analysierten wir als nächstes Proben auf das Vorhandensein einer prominenten DEAD-Box-Helikase, die an der translationalen Repression beteiligt ist, der DEAD-Box-Helikase 6 (Ddx6, früher bekannt als xp54 in Xenopus und me31b in Drosophila). Ddx6 ist ein wichtiger Bestandteil von Ribonukleoprotein-Granula, ist an der mRNA-Speicherung beteiligt und interagiert mit Bicc1 und Cnot1 6,31,32. Ein Antikörper, der das endogene Ddx6 erkennt, identifizierte in jeder Probe ein Protein von etwa 54 kDa (Abbildung 3B, viertes Feld). Die Expression war in zygotischen Embryonen reduziert (Abbildung 3B, vergleiche die Spuren 5 und 6 mit 1-4), wie zuvor berichtet33.

Um sicherzustellen, dass die von uns beobachteten Unterschiede zwischen den Proben auf Unterschiede in der Expression zurückzuführen waren, entfernten wir den Immunoblot und untersuchten ihn erneut mit einem Antikörper, der das Enzym Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (Gapdh) erkennt. Gapdh dient als allgegenwärtig ausgedrückte "Ladekontrolle". Äquivalente Niveaus der Gapdh-Expression bestätigen die Ponceau-Färbung: Eine gleiche Menge des Gesamtproteins wird über alle Proben hinweg analysiert (Abbildung 3B, fünftes Panel).

Zusammengenommen bestätigen diese Ergebnisse die Wirksamkeit dieser Immunoblot-Methode. Wir waren in der Lage, exogene und endogene Bicc1 über mehrere X. laevis-Entwicklungsstadien hinweg zu identifizieren, die für die Untersuchung von RNA-Protein-Interaktionen relevant sind: Eizellen und Prä-MBT-Embryonen, die nur maternal deponierte mRNAs enthalten, und Post-MBT-Embryonen, die auch zygotisch transkribierte mRNAs enthalten. Wir konnten diese Ergebnisse verallgemeinern, indem wir die Expression mehrerer translationaler Kontrollproteine bei einer Vielzahl von Molekulargewichten (Bicc1, Cnot1 und Ddx6) und einer Belastungskontrolle (Gapdh) analysierten. Wir zeigen auch, dass dieses Protokoll für X. tropicalis-Embryonen verwendet werden kann, wobei die Modifikation vorgenommen werden kann, um die Menge des verwendeten Materials zu erhöhen, um ihrer geringeren Größe Rechnung zu tragen (Ergänzende Abbildung 1).

Abbildung 3: Identifizierung des Gehalts an translationalen regulatorischen Proteinen durch Immunblotting in X. laevis. (A) Ponceau-Färbung des Immunoblots zur Identifizierung des Gesamtproteins aus X . laevis Eizellen im Stadium VI, Embryonen im Stadium 7 und Embryonen im Stadium 10,5. Jede Spur repräsentiert 10 % des Proteins, das aus einem Extrakt (0,5 Eizellen oder Embryo) hergestellt wird. (B) Immunoblot-Analyse ausgewählter translationaler regulatorischer Proteine von X. laevis in Eizellen im Stadium VI, Embryonen im Stadium 7 und Embryonen im Stadium 10,5. Die Spuren 2, 4 und 6 entsprechen Proben, die vor der Analyse mit HA-Bicc1-mRNA mikroinjiziert wurden, während die Spuren 1, 3 und 5 als negative (nicht injizierte) Kontrollen dienen. α-Bicc1-Antikörper wurde verwendet, um die Expression von endogenem Bicc1 in verschiedenen Stadien zu testen (oberes Bild). Der Blot wurde anschließend entfernt und erneut mit einem Antikörper gegen den HA-Affinitätstag untersucht, um die Spezifität des α-Bicc1-Antikörpers zu kontrollieren (zweites Panel). Die Blots wurden entfernt und mit α-Cnot1 (drittes Panel) und α-Ddx6 (viertes Panel) erneut auf zusätzliche regulatorische Proteine untersucht. α-Gapdh (unteres Feld) diente als Kontrolle für eine gleichmäßige Proteinbeladung. Rote Pfeilspitzen markieren die Position des endogenen Bicc1, während schwarze Pfeilspitzen die Position des exogen exprimierten HA-Bicc1 C-Terms markieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: Immunoplot-Analyse des Bicc1-Proteins in Xenopus laevis versus Xenopus tropicalis. α-Bicc1-Antikörper wurde verwendet, um die Expression von endogenem und exogenem Bicc1 über verschiedene Mengen an X. laevis und X. tropicalis Embryoextrakt zu testen. Spur 1: 0,5 nicht injizierte X. laevis-Embryonen . Spur 2: 0,5 HA-Bicc1 injizierter X. laevis Embryo. Spur 3: 3 nicht injizierte X. tropicalis-Embryonen . Spur 4: 1 nicht injizierter X. tropicalis-Embryo . Spur 5: 0,5 nicht injizierte X. tropicalis-Embryonen . Es wurden zwei Antikörper verwendet, die endogenes Bicc1 erkennen: einer gegen humanes Bicc1 (oberes Feld) und der andere gegen X. laevis Bicc1 (mittleres Feld). α-Gapdh (unteres Feld) wurde verwendet, um eine gleichmäßige Proteinbeladung zu kontrollieren. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.