Eine innovative Methode zur Isolierung von Endosomen aus Herzgewebe von Mäusen und Co-Kultur mit Kardiomyozyten

Zusammenfassung

Endosomen sind eine Ansammlung intrazellulärer Sortierorganellen, die Teil des endozytären Membrantransportwegs sind. Wir haben eine neue Methode zur Isolierung von Endosomen aus Herzgewebe mit Hilfe einer automatischen Nanofiltrationsanlage etabliert und die zelluläre Aufnahme von Endosomen untersucht, indem wir sie mit primären Kardiomyozyten co-kultiviert haben.

Zusammenfassung

Endosomen sind membrangebundene Organellen, die eine wesentliche Rolle beim intrazellulären Transport, der Signaltransduktion und dem Membranrecycling spielen. Obwohl ihre Funktionen in der kardiovaskulären Biologie immer mehr anerkannt werden, bleibt die effiziente Isolierung von Endosomen aus Herzgewebe eine große technische Herausforderung. Wir haben ein schnelles und ergiebiges Protokoll für die Isolierung von Endosomen aus Herzgewebe von Mäusen entwickelt, indem wir die subzelluläre Fraktionierung mit einer ultraschnellen Nanofiltrations-Isolationsplattform kombiniert haben. Diese Methode umfasst sequentielle Zentrifugation, Nanofiltration und nanoporöse membranbasierte Entnahme von Vesikel. Die isolierten Endosomen wurden durch Western Blotting, dynamische Lichtstreuung (DLS) und Nano-Durchflusszytometrie (NanoFCM) charakterisiert. Um die Bioaktivität zu beurteilen, wurden gereinigte Endosomen mit primären neonatalen Kardiomyozyten co-kultiviert. Die endosomalen Marker EEA1 und Rab7 waren in isolierten Vesikeln stark angereichert. Die DLS-Analyse ergab einen mittleren Vesikeldurchmesser von 187,30 ± 23,42 nm und ein Zetapotential von -26,60 ± 5,79 mV (n = 12). Die NanoFCM-Quantifizierung ergab etwa 1,07 ± 0,31 × 10¹² Partikel/ml (n = 12) aus 100 mg Herzgewebe. Die funktionelle Aufnahme von Endosomen durch Kardiomyozyten wurde nach einer In-vitro-Co-Kultur beobachtet, was auf die Erhaltung der Vesikelintegrität und -aktivität hinweist. Diese integrierte Isolationsplattform bietet eine reproduzierbare und effiziente Methode für die Extraktion von hochreinen Endosomen aus Herzgewebe. Das Protokoll erleichtert nachgelagerte biochemische und funktionelle Studien und bietet ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der Rolle von Endosomen in der kardiovaskulären Physiologie und Erkrankung.

Einleitung

Endosomen sind essentielle intrazelluläre Organellen, die die Endozytose, die Frachtsortierung und die Signalwege regulieren ^1,2. Aktivierte Signalrezeptoren und andere herunterregulierte Proteine werden zunächst in frühen Endosomen (EEs) in intralumenale Vesikel (ILVs) einsortiert, die dann zu multivesikulären Körpern (MVBs) oder endosomalen Trägervesikeln (ECVs) heranreifen. Diese Vesikel verschmelzen anschließend mit späten Endosomen (LEs), die als sekundäre Sortierzentren dienen, um die Fracht in Richtung lysosomalen Abbaus oder alternativer Wege zu leiten. ILVs können auch als Exosomen nach Endosomenfusion mit der Plasmamembran sezerniert werden ^3,4 . Parallel dazu liefert der Autophagie-Signalweg zytosolisches Material über Autophagosomen an LEs, die durch Fusion mit späten endozytären Kompartimenten eine abbaufähige Kapazität erlangen⁵. Endosomen sind heute als kritische Regulatoren des Rezeptorrecyclings⁶, der Ionenkanallokalisierung⁷, der Exosomenbiogenese⁸ und der interzellulären Kommunikation⁹ anerkannt, die besonders in spezialisierten Zellen wie Neuronen und Kardiomyozyten relevant sind.

Neue Erkenntnisse haben die zentrale Rolle endosomaler Signalwege für die kardiovaskuläre Funktion hervorgehoben. Das Eps15-Homologiedomänenprotein 3 (EHD3) reguliert das endosomale Recycling wichtiger kardialer Ionentransporter, einschließlich des Na⁺/^Ca2+ -Austauschers und der Ca²⁺ -Kanäle vom L-Typ. EHD3-Mangel bei Mäusen führt zu Bradykardie, Leitungsanomalien und veränderter Ca2⁺ -Behandlung¹⁰. Der funktionelle Endosomen-Lysosomen-Transport in den glatten Gefäßmuskelzellen verhindert die phosphatinduzierte mediale Verkalkung, die für chronische Nierenerkrankungen und Atherosklerose relevant ist¹¹. Dennoch sind die funktionelle Rolle von Endosomen bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen und ihr Potenzial als therapeutische Ziele noch nicht vollständig verstanden, was weitere Untersuchungen rechtfertigt.

Mehrere Methoden haben die biochemische Isolierung von funktionell intakten Endosomen ermöglicht. Marsh und Kollegen kombinierten zunächst die Dichtegradientenzentrifugation mit der Freiflusselektrophorese, um frühe und späte Endosomen zu gewinnen und ihre Versauerung und strukturelle Integrität zu erhalten¹². Neuere Methoden, wie z. B. der Saccharosegradientenansatz, bieten einen standardisierten Weg zur Trennung von frühen und späten endosomalen Populationen, der für nachgelagerte proteomische und lipidomische Studien unerlässlich^{ist 13}. Spin-Säulen-basierte kommerzielle Kits wurden für Anwendungen mit hohem Durchsatz entwickelt.

Die Exosomenisolierung über das automatische ultraschnelle Isolationssystem nutzt die innovative Ultraschall-Nanofiltrationstechnologie, die über ein Dual-Membran-Nanofiltrationssystem verfügt, das mit periodischen Unterdruckoszillationen und doppelt gekoppelten harmonischen Oszillationen integriert ist, um die Isolierung hochreiner Exosomen aus Bioflüssigkeiten^{zu ermöglichen 14}. Hier haben wir die subzelluläre Fraktionierung mit der Endosomenisolierung unter Verwendung des automatischen Ultrafast-Isolationssystems kombiniert, um eine neue Methode zur schnellen Endosomenisolierung mit hoher Ausbeute und hoher Reinheit aus Mausherzgewebe zu erreichen.

Darüber hinaus haben wir die extrahierten Endosomen mit primären Kardiomyozyten (CM) in vitro co-kultiviert und festgestellt, dass die exogenen Endosomen erfolgreich in die CM eingedrungen sind. Unter Verwendung eines Endosomenreporters, in dem das endosomenlokalisierte Protein Numb mit dem rot fluoreszierenden mCherry-Protein ^15,16 fusioniert wurde, beobachteten wir eine mCherry-Fluoreszenz, die in CMs mit einem Punktmuster lokalisiert war.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden nach den Richtlinien der National Institutes of Health on the Use of Laboratory Animals und mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee an der University of Houston durchgeführt.

HINWEIS: Vor Beginn des Isolierungsverfahrens muss unbedingt sichergestellt werden, dass alle erforderlichen Puffer frisch vorbereitet und auf 4 °C abgekühlt wurden. Sterilisierte Instrumente, Gewebekulturplatten und geeignete Röhrchen sollten an ausgewiesenen Arbeitsplätzen angeordnet werden, wobei alle Materialien auf Eis oder bei 4 °C aufbewahrt werden sollten, sofern nicht anders angegeben. Zentrifugen und Rotoren müssen vor dem Gebrauch mindestens 2-3 Stunden lang auf 4 °C voräquilibriert werden. Der Fraktionierungspuffer sollte vor dem Tag des Versuchs hergestellt und bei 4 °C gelagert und während des Versuchs bis zur Verwendung auf Eis gelagert werden. Sofern nicht anders angegeben, sollten alle Inkubations- und Zentrifugationsschritte bei 4 °C durchgeführt werden.

1. Zubereitung des Herzlysats

1. Desinfizieren Sie den Operationsbereich mit 70 % Ethanol und legen Sie anschließend ein steriles saugfähiges Kissen auf die Arbeitsfläche, auf dem die sterilisierten chirurgischen Instrumente angeordnet sind.
2. Einschläferung von Mäusen (C57BL/6 Männchen, 8-12 Wochen, 20-25 g und mCherry: NumbKI Männchen, 8-12 Wochen, 20-25 g) durch CO₂ -Inhalation (10-30 % CO₂ für 3-5 min) oder durch eine alternative Methode, die vom zuständigen institutionellen Ausschuss für Tierpflege und -verwendung genehmigt wurde.
   ACHTUNG: Bitte arbeiten Sie in einem offenen Raum und stellen Sie sicher, dass die CO₂ -Flasche rechtzeitig schließt, um ein Auslaufen zu vermeiden. Mäuse sollten während der Euthanasie überwacht werden, um den Bewusstseinsverlust und das ordnungsgemäße Verfahren zu bestätigen. Sobald Sie bewusstlos sind, verwenden Sie eine sekundäre Methode, wie z. B. Gebärmutterhalsluxation, Thorakotomie oder Blutentblutung, um den Tod sicherzustellen.
3. Positionieren Sie die Maus in Rückenlage und reinigen Sie den Brustbereich mit 70% Ethanol.
   1. Öffnen Sie die Brusthöhle schnell, um das Herz zu entnehmen, und geben Sie das Herz in eiskalte Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) in einer 60-mm-Schale, die auf Eis gestellt wird.
   2. Entfernen Sie das Restblut vorsichtig mit einer Pinzette aus den Herzkammern und waschen Sie das Herz sehr gut, bis kein Blut mehr in den Kammern verbleibt. Halten Sie das Herz während der gesamten Verarbeitung auf Eis.
      HINWEIS: Bewahren Sie 50-100 mg Herzgewebe für die Western-Blot-Analyse (WB) als Positivkontrolle auf. Das Herz kann in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zu 6 Monate bei -80 °C gelagert werden.
4. Geben Sie 8 ml Fraktionierungspuffer (Tabelle 1) in ein 50-ml-Röhrchen auf Eis. Übertragen Sie 100-120 mg frisches oder gefrorenes Mausherzgewebe in ein Röhrchen, das den Fraktionierungspuffer enthält.
   HINWEIS: Jeder Teil des Herzgewebes der Maus kann zur Extraktion von Endosomen verwendet werden. Mindestens 100 mg Herzgewebe sind erforderlich, um genügend Endosomen für nachfolgende Analysen zu erhalten. Um die Konsistenz in den Versuchsgruppen zu gewährleisten, sollte das Gewebe vor der Zugabe zum Fraktionierungspuffer genau gewogen werden.
   ACHTUNG: Tragen Sie beim Betrieb des Fraktionierungspuffers geeignete PSA, um direkten Kontakt mit dem Körper zu vermeiden.
5. Hacken Sie das Gewebe mit einer mikrochirurgischen Schere in Fraktionierungspuffer auf Eis in ca. 1 mm³ Stücke.
6. Homogenisieren Sie mit einem elektrischen Homogenisator bei mittlerer Drehzahl, in einem 40 s Arbeitszyklus mit 30 s Stopp. Homogenisieren Sie für 5-7 Zyklen (Abbildung 1A).
   HINWEIS: Ein gründlicher Homogenisierungsprozess ist unerlässlich und trägt dazu bei, die Endkonzentration der Endosomen zu erhöhen.
7. Beschallen Sie das homogenisierte Herzlysat für 10 min im Eiswasserbad mit einem Ultraschallbad (Abbildung 1A).

2. Subzelluläre Fraktionierung

1. Legen Sie ein 40-μm-Zellsieb über ein 50-ml-Zentrifugationsröhrchen und filtrieren Sie das homogenisierte Herzlysat durch das Sieb (Abbildung 1A).
2. Für das Kernpellet: Zentrifugieren Sie das Herzlysat bei 1.000 × g für 5 min bei 4 °C. Übertragen Sie den Überstand und geben Sie ihn in ein frisch beschriftetes Röhrchen.
   HINWEIS: Sammeln Sie das Pellet, bei dem es sich um die Kernfraktion handelt, und resuspendieren Sie das Kernpellet in 200 μl WB-Lysepuffer, wenn die Kernfraktion für WB benötigt wird. Pipettieren Sie das nukleare Pellet vorsichtig 20 Mal mit dem Puffer des Radioimmunpräzipitationsassays (RIPA) auf und ab und beschallen Sie es 10 Minuten lang. Das Kernlysat wird bei 14.000 × g für 10 min zentrifugiert. Sammeln Sie den Überstand und lagern Sie ihn zur weiteren Verwendung bei -80 °C. Schritt 2.2 ist optional; Es kann übersprungen werden, wenn nur Vesikel benötigt werden.
3. Für die mitochondriale Fraktion: Den Überstand erneut bei 10.000 × g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren. Das Pellet enthält die mitochondriale Fraktion. Den Überstand umfüllen und in ein frisches, ultrazentrifugiertes Röhrchen geben.
   HINWEIS: Wenn eine mitochondriale Fraktion für WB gewünscht wird, speichern Sie das Pellet wie in Schritt 2.2 beschrieben, wie in der vorherigen NOTIZ beschrieben.
4. Balancieren Sie die Schläuche vorsichtig aus. Wiegen Sie jedes Röhrchen und fügen Sie dem leichteren Röhrchen zusätzlichen Kaltfraktionierungspuffer hinzu, um ein gleichmäßiges Gewicht zu gewährleisten. Kühlen Sie den Ultrazentrifugenrotor und die Adapter 2-3 h bei 4 °C vor. Der Überstand wird bei 160.000 × g für 30 min bei 4 °C ultrazentrifugiert.
   HINWEIS: Während des Ultrazentrifugationsschritts ist es wichtig sicherzustellen, dass alle Ultrazentrifugenröhrchen richtig ausbalanciert und bis zu einem Abstand von ca. 0,5 bis 1 cm unter dem Rand mit Puffer gefüllt sind. Eine unzureichende Füllung kann aufgrund der hohen Zentrifugalkräfte zu einer Verformung oder einem Kollaps des Rohrs führen.
5. Den Überstand in ein frisches Röhrchen entfernen. Der Überstand enthält Endosomen. Setzen Sie eine 10-ml-Spritze, die an einem 0,45-μm-Spritzenvorsatzfilter befestigt ist, auf ein 50-ml-Zentrifugationsröhrchen und filtrieren Sie den Überstand in das Röhrchen. Fügen Sie 5 ml sterilisierten PBS-Puffer hinzu, um die Lösung zu verdünnen und ein Verstopfen des Filters zu vermeiden.
   HINWEIS: Der Filterschritt stellt sicher, dass alle Endosomen im Überstand zu Beginn der Isolationsschritte <450 nm betragen.
6. Resuspendieren Sie das Pellet mit 5 mL sterilisiertem PBS-Puffer aus Schritt 2.4 und pipettieren Sie mindestens 20 Mal auf und ab, um das Pellet gut zu mischen. Das Pellet enthält weitere intrazelluläre Vesikel. Setzen Sie eine 10-ml-Spritze, die an einem 0,45-μm-Spritzenvorsatzfilter befestigt ist, auf ein 50-ml-Zentrifugationsröhrchen und filtrieren Sie die Pelletlösung in das Röhrchen. Fügen Sie weitere 5 ml sterilisierten PBS-Puffer hinzu, um die Lösung zu verdünnen und ein Verstopfen des Filters zu vermeiden.
   HINWEIS: Der Filterschritt stellt sicher, dass alle Vesikel aus dem Pellet <450 nm betragen, wenn die Isolationsschritte gestartet werden.

3. Isolierungsprozess von Endosomen und anderen intrazellulären Vesikeln

1. Der filtrierte Überstand aus Schritt 2.5 und die filtrierte Pelletlösung aus Schritt 2.6 mit sterilisiertem PBS-Puffer werden in 50-ml-Röhrchen auf ein Endvolumen von 30 ml verdünnt. Lagern Sie die Proben bei 4 °C (Abbildung 1A).
   HINWEIS: Die Proben können 24 h lang bei 4 °C gelagert werden. Wenn die Zeit nicht ausreicht, um die folgenden Schritte am selben Tag durchzuführen, können sie im Kühlschrank bei 4 °C gelagert werden und dann auf den nächsten Tag warten, um das Experiment fortzusetzen.
2. Schalten Sie das Gerät ein und starten Sie das tägliche Reinigungsprogramm, das in der Regel 20 Minuten dauert.
3. Wählen Sie für die Isolierung das Medium EXODUS Isolationsgerät (M EID). Installieren Sie einen 50-ml-Röhrchenadapter und setzen Sie das 50-ml-Röhrchen mit der Probe in die Probenposition ein. Tippen Sie auf dem Bildschirm auf EID und laden Sie M EID.
   HINWEIS: Die mittlere EID gilt für eine Probe von 20-50 ml und empfiehlt 30 ml.
4. Programm einrichten:
   1. Geben Sie den Namen der Probe und das Volumen der Probe ein.
   2. Wählen Sie den Probentyp: Plasma.
   3. Wählen Sie das Programm: Plasma. Stark-MA. A03.
   4. Wählen Sie ein Zentrifugenröhrchen: 50 mL.
   5. Aktivieren Sie den Modus "Hohe Reinheit".
   6. Wählen Sie die Programmoption 3000 aus.
   7. Tippen Sie zum Starten auf OK .
      HINWEIS: Der gesamte Isolationsprozess dauert 1-2 Stunden. Eine höhere Konzentration von Proben dauert länger.
5. Wiederherstellung von Endosomen und anderen intrazellulären Vesikel:
   1. Holen Sie sich die EID und bringen Sie sie für die nächsten Schritte zur Motorhaube.
   2. Übertragen Sie 200 μl sterilisierten PBS-Puffer mit einer 200-μl-Pipette in die EID. Spülen Sie beide Seiten der nanoporösen Membran jeweils 20 Mal ab.
   3. Sammeln Sie die Endosomen oder andere intrazelluläre Vesikel, resuspendieren Sie sie in 200 μl in einem 1,5 ml-Röhrchen. Lagern Sie es bei 4 °C, wenn es in 24-48 h verwendet wird, oder bei -80 °C für die Langzeitlagerung.
      HINWEIS: Das Eluat enthält die Endosomen oder andere intrazelluläre Vesikel und wird für die weitere Analyse und Co-Kultur mit Kardiomyozyten verwendet. Die Probe der Endosomen ist stabil, wenn sie 5 Monate lang bei -80 °C gelagert wird, basierend auf den erhaltenen Daten.
6. Eluieren von Endosomen und anderen intrazellulären Vesikeln für WB:
   1. Rufen Sie die EID ab. 80 μl WB-Lysepuffer in die EID überführen. Spülen Sie beide Seiten der nanoporösen Membran jeweils 20 Mal ab.
   2. Inkubieren Sie die EID 30 Minuten lang auf Eis, um eine vollständige Solubilisierung zu gewährleisten, pipettieren Sie den Puffer alle 10 Minuten in die EID. Sammeln Sie die Endosomen oder andere intrazelluläre Vesikellysate in 1,5-ml-Röhrchen. 10 min bei 14.000 × g bei 4 °C zentrifugieren. Überstand auffangen und bei -80 °C für die Langzeitlagerung lagern. Entsorgen Sie das Pellet, wenn noch Pellets im Rohr verbleiben.

4. Quantifizierung von Endosomenproteinen und Charakterisierung von Vesikeln

1. Western-Blot-Analyse
   1. Sparen Sie 5 μl von jeder Probe, um die Proteinkonzentration mit einem Bicinchoninsäure (BCA)-Assay zu quantifizieren.
   2. Die Proben in 4× Laemmli Probenpuffer verdünnen und durch Vortexen gründlich mischen. Erhitzen Sie die Proben 10 Minuten lang auf 95 °C, um die Proteine zu denaturieren.
   3. Die denaturierten Proben werden bei 14.000 × g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert und der resultierende Überstand für die Analyse entnommen.
   4. Montieren Sie Polyacrylamidgele in der Elektrophoreseapparatur und füllen Sie die Kammer mit Natriumdodecylsulfat (SDS) Laufpuffer.
   5. Laden Sie einen Molekulargewichtsmarker und die vorbereiteten Proteinproben auf das Gel und wählen Sie einen geeigneten Acrylamidanteil basierend auf dem Molekulargewicht der Zielproteine aus.
      HINWEIS: In der Regel werden 20 μg Protein pro Vertiefung sowohl für Herzgewebelysate als auch für Endosomenlysate geladen.
   6. Lassen Sie das Gel ca. 120 Minuten lang bei 6 V laufen oder bis die Farbstofffront den Boden des Gels erreicht.
   7. Übertragen Sie Proteine aus dem Gel auf eine Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran unter Verwendung eines Western-Blotting-Transfersystems.
      HINWEIS: Die Nasstransfermethode funktioniert auch gut.
   8. Spülen Sie die PVDF-Membran kurz mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,05 % Tween-20 (TBST).
   9. Blockieren Sie die Membran mit TBST, ergänzt mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA), für 1 h bei Raumtemperatur.
   10. Die Membran wird über Nacht bei 4 °C mit einem primären Antikörper (Materialtabelle) inkubiert, der für den ausgewählten endosomalen Marker spezifisch ist, und zwar unter leichtem Schaukeln.
   11. Waschen Sie die Membran am nächsten Tag dreimal mit TBST, wobei jeder Waschgang 10 Minuten bei Raumtemperatur auf einer Wippe dauert.
       HINWEIS: Richtiges Waschen ist unerlässlich, um unspezifischen Hintergrund zu reduzieren. Stellen Sie sicher, dass die Membran während des gesamten Prozesses vollständig hydratisiert bleibt.
   12. Inkubieren Sie die Membran mit dem entsprechenden Sekundärantikörper (Materialtabelle) für 1 h bei Raumtemperatur.
   13. Waschen Sie die Membran dreimal mit TBST, wobei jeder Waschgang 10 Minuten auf einer Wippe bei Raumtemperatur dauert.
   14. Tragen Sie ein chemilumineszierendes Substrat auf die Membran auf, um antikörpergebundene Proteine nachzuweisen.
   15. Verwendung eines Gel-Imaging-Systems, um die Membran freizulegen und Bilder der Proteine aufzunehmen.
2. Analyse der dynamischen Lichtstreuung (DLS)
   1. Die Partikelgröße und das Zetapotenzial von Endosomen werden mit der Technik der dynamischen Lichtstreuung (DLS)^{gemessen 17}. mit einem Litesizer 500 (Anton Paar), der mit der Kalliope-Software Version 2.10.4 ausgestattet ist. DLS-Messungen werden in dreifacher Ausfertigung mit einem 658 nm Laser mit einem Erfassungswinkel von 90° bei 25 °C durchgeführt.
   2. Nehmen Sie eine Verdünnung von "Nanokügelchen der Größe" in Reinstwasser vor, geben Sie 1 ml Volumen in die Einwegküvette und legen Sie sie in die Kammer.
      HINWEIS: Verwenden Sie Standard-Nanokugeln (entweder klein oder groß) entsprechend der erwarteten Größe der unbekannten Probe.
   3. Öffnen Sie die DLS-Software und klicken Sie auf die Registerkarte Neue Messung . Wählen Sie die Partikelgröße aus dem Messmodus aus. Benennen Sie die Datei im Feld Unbenannt, geben Sie die eingegebenen Parameter (Lösungsmittel, Temperatur usw.) ein und klicken Sie auf Start. Nachdem Sie die Größe der Standardpartikel bestimmt haben, nehmen Sie die Küvette aus der Kammer.
   4. Nehmen Sie eine Verdünnung des "Zetapotential-Referenzmaterials" in Reinstwasser vor, geben Sie es in die Zetapotential-Omega-Küvette und legen Sie es in die Küvettenkammer. Klicken Sie in der Software auf die Registerkarte "Neue Messung ". Wählen Sie das Zetapotenzial aus dem Messmodus aus. Benennen Sie die Datei im Feld Unbenannt, geben Sie die eingegebenen Parameter (Lösungsmittel, Temperatur usw.) ein und klicken Sie auf Start.
   5. Zur Bestimmung der Partikelgröße und des Zetapotentials von Endosomen verdünnen Sie die Endosomenprobe in Reinstwasser, geben Sie sie in die entsprechenden Küvetten und legen Sie sie in die Küvettenkammer. Nehmen Sie Messungen auf die gleiche Weise vor, wie sie für die Normen beschrieben sind.
      HINWEIS: Verdünnen Sie die unbekannten Proben entsprechend der Konzentration der Proben in Reinstwasser.
3. NanoFCM-Analyse
   HINWEIS: Die Konzentrationen von Endosomenpartikeln werden mit dem NanoFCM Flow NanoAnalyzer mit der Software Professional Suite V2.3 bestimmt.¹⁸. Die Partikelsignalerfassung erfolgt 2 Minuten lang mit einem blauen 488-nm-Laser mit 20 mW und 0,2 % SS-Zerfall und/oder einem roten 638-nm-Laser mit 8 mW und 10 % SS-Zerfall bei einem Abtastdruck von 1,0 kPa, der von einem luftgestützten Druckmodul moduliert und aufrechterhalten wird. Die Probe wird mit ultrareinem Wasser als Mantelflüssigkeit über eine Schwerkraftzufuhr auf 1,4 μm fokussiert. Die optimale Laserausrichtung wird mit Hilfe von Siliziumdioxid-Nanokugel-Cocktail-QC-Kügelchen (S16M-Exo) getestet und kalibriert. Größenkalibrierungsmessungen werden vor der Analyse mit S16M-Exo-Standardkügelchen durchgeführt (Siliziumdioxid-Nanopartikel-Cocktail mit Partikeln mit Durchmessern von 68, 91, 113 und 155 nm und bekannten Konzentrationen von 2,17 × 10¹⁰/mL).
   1. Erfassung des Konzentrationsstandards:
      1. Starten und initialisieren Sie die Fluidik von nanoFCM. Verdünnen Sie die QC-Kügelchen (1:100) in 0,22 μm membrangefiltertem Reinstwasser, geben Sie sie in ein 0,5-ml-Röhrchen und stellen Sie sie in die Ladebucht. Wählen Sie QC FL SiNPs aus dem Dropdown-Menü Sample Inf aus und geben Sie den Verdünnungsfaktor der QC-Beads-Probe ein.
      2. Wählen Sie im Dropdown-Menü "Probenfluss " die Option "Boosting" aus, um die QC-Probe mit hoher Geschwindigkeit einzuführen und die Reinigungslösung 45 s lang aus dem System zu entfernen. Stellen Sie während des Boostings die Laserleistung auf 20/50 mV für den blauen 488-nm-Laser und 20/100 mW für den roten 638-nm-Laser ein, mit 0,2 % SS-Zerfall.
      3. Wählen Sie Sampling aus dem Dropdown-Menü Sample Flow und nehmen Sie die Schwellenwertanpassung für das große Signal vor. Passen Sie während der Probenahme die Ausrichtung der Signalverdichtungslinse manuell und die Ausrichtung der Laserfokussierungslinse bei Bedarf über die Software an. Die automatische Schwellenwertanpassung für ein großes Signal muss zwischen 50 und 120 für den seitlichen Streukanal und weniger als 75 für beide Fluoreszenzkanäle liegen.
      4. Klicken Sie auf Aufzuzeichnende Zeit , um die Daten für 120 s zu erfassen. Stellen Sie sicher, dass der ROI (Region of Interest) beim Abrufen der Daten zwischen 1500 und 15000 liegt. Speichern Sie die Ergebnisdatei im Popup-Ordner mit der Erweiterung "nfa" und entladen Sie das Probenröhrchen.
         HINWEIS: Verwenden Sie nach jedem Probenlauf eine Reinigungslösung (1x), um die verarbeitete Probe aus dem Schlauch zu entfernen, indem Sie sie 45 s lang verstärken. Tauchen Sie dann die Kapillarspitze in ultrreines Wasser, um Reste der Reinigungslösung von der Außenseite der Kapillare zu entfernen, bevor Sie die nächste Probe laden.
   2. Größe Standard Erfassung:
      1. Die "Größenstandardperlen" (1:100) in 0,22 μm membrangefiltertem Ultrpaurewasser verdünnen und in die Laderampe stellen. Wählen Sie 68-155 S16M-Exo aus dem Dropdown-Menü Sample Inf und geben Sie den Verdünnungsfaktor der Standardbeads-Probe ein.
      2. Wählen Sie im Dropdown-Menü "Probenfluss " die Option "Boosting" aus, um die Standardperlen der Größe einzuführen und die Reinigungslösung für eine Dauer von 45 s aus dem System zu entfernen. Stellen Sie während des Boostens die Laserleistung auf 8/50 mV für den blauen 488-nm-Laser und 20/100 mW für den roten 638-nm-Laser ein, mit 10 % SS-Zerfall.
      3. Wählen Sie Sampling aus dem Dropdown-Menü "Sample Flow " und nehmen Sie die Schwellenwertanpassung für ein kleines Signal vor. Vier unterschiedliche Peaks (68 nm, 91 nm, 113 nm, 155 nm) sollten im Fenster sichtbar sein. Klicken Sie auf Aufzuzeichnende Zeit , um die Daten für 120 s zu erfassen. Speichern Sie die Ergebnisdatei im Popup-Ordner mit der Erweiterung "nfa" und entladen Sie das Probenröhrchen.
   3. Blanko-Standard-Erfassung:
      1. Verwenden Sie Reinstwasser oder (Puffer/Verdünnungsmittel der Probe), um die Messung auf die gleiche Weise wie oben beschrieben durchzuführen, speichern Sie die Datei mit dem Namen "blank" in dem Ordner mit der Erweiterung "nfa" und entladen Sie das Probenröhrchen.
   4. Bestimmung der Partikelkonzentration von Endosomen
      1. Verdünnen Sie die Endosomenprobe in Reinstwasser und legen Sie sie in die Ladebucht.
      2. Klicken Sie nach dem Boosten und Sampling der Probe auf Zeit bis zur Aufnahme , um die Messungen zu starten. Wenn der Schwellenwert für den seitlichen Streukanal nicht im Bereich von 50 bis 120 liegt oder der ROI mehr als 15.000 beträgt, sollten Sie eine Verdünnung der Probe in Betracht ziehen.
   5. Datenanalyse:
      1. Wechseln Sie in der Software von der Registerkarte "Erfassung" auf die Registerkarte "Analyse " und öffnen Sie die gespeicherten "nfa"-Dateien. Stellen Sie den Konzentrationsstandard ein, indem Sie die gespeicherte Datei mit den QC-Ergebnissen date__QC FL SnNPs.nfa öffnen, stellen Sie den Schwellenwert für ein großes Signal ein, indem Sie auf das Werkzeug zum Festlegen des Schwellenwerts klicken.
      2. Wählen Sie die Partikelkonzentration mit dem Kreis-Gating-Werkzeug aus. Klicken Sie auf STD zählen und überprüfen Sie die Konzentration der QC-Kügelchen (2,17 ×^{10 10}/ml), bevor Sie das Fenster schließen.
      3. Um den Größenstandard festzulegen, öffnen Sie die Datei date_68-155 S16M-Exo.nfa. Klicken Sie auf das Größenwerkzeug, um das Standardfenster zur Kurvengenerierung zu öffnen, und legen Sie den Schwellenwert für das kleine Signal fest, indem Sie auf das Werkzeug zum Festlegen des Schwellenwerts klicken.
      4. Wählen Sie S16 exo 68-155 nm aus dem Dropdown-Menü Benutzerdefiniert aus. Klicken Sie auf Spitzen suchen , um die SS-Spitzenintensitäten der vier Grundgesamtheiten zu identifizieren.
      5. Wählen Sie die leere Datei aus und klicken Sie auf "Als leer setzen ", um die Anzahl der falsch positiven Ergebnisse für die Entfernung der Probe zu ermitteln. Um die Endosomenkonzentration zu analysieren, wählen Sie zunächst die Probe aus und stellen Sie den Schwellenwert für ein kleines Signal ein, indem Sie auf das Werkzeug zum Festlegen des Schwellenwerts klicken. Präsentieren Sie die quantifizierten Daten als Bericht über Größe (nm) und Konzentration (Partikel/ml).

5. Primäre Kardiomyozytenkultur

HINWEIS: Isolieren Sie Kardiomyozyten mit einem primären Kardiomyozyten-Isolationskit, das ausreichend Reagenzien für die Isolierung von Kardiomyozyten aus bis zu 50 Neugeborenenherzen von Mäusen oder Ratten enthält. Das Kit enthält auch Komponenten, die zur Unterstützung der primären Kardiomyozytenkultur geeignet sind. Alle Medien und Puffer sollten mit Vorsicht entfernt werden, um störende Zellen zu vermeiden. Empfohlen wird das manuelle Pipettieren mit einer 1000 μL Pipettenspitze, eine Vakuumaspiration sollte vermieden werden. Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) sollte vor Beginn des Verfahrens auf 4 °C vorgekühlt werden.

1. Rekonstituieren Sie das im Kit enthaltene Kardiomyozyten-Isolationsenzym 1 (mit Papain), indem Sie 2 hinzufügen. ml gekühltes HBSS in eine Durchstechflasche. Vorsichtig ca. 5 Minuten lang mischen oder bis sich das Enzym vollständig aufgelöst hat. Bewahren Sie die Enzymlösung während des gesamten Eingriffs auf Eis auf.
   HINWEIS: Eine einzige Durchstechflasche mit rekonstituiertem Enzym 1 ist ausreichend für die Isolierung von Kardiomyozyten aus 10 Neugeborenenherzen. Es kann bis zu 6 Monate bei -20 °C gelagert werden und ist für zwei Gefrier-Tau-Zyklen stabil. Bei Lagerung bei 4 °C sollte die Lösung innerhalb von 1 Woche verwendet werden, um die enzymatische Aktivität zu gewährleisten.
2. Legen Sie frisch präparierte Neugeborenenherzen in einzelne sterile 1. mL Mikrozentrifugenröhrchen und geben Sie sofort 500 μl eiskaltes HBSS in jedes Röhrchen.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, ein Herz pro Röhrchen zu verarbeiten, um die Ausbeute und Reproduzierbarkeit zu maximieren.
3. Zerkleinern Sie das Herzgewebe mit einer sterilen Präparierschere in 1-mm³-Fragmente. Waschen Sie jede Probe zweimal mit 500 μl eiskaltem HBSS, um Blutreste zu entfernen.
4. Geben Sie zu jedem Röhrchen 200 μl rekonstituiertes Kardiomyozyten-Isolationsenzym 1 (Papain) und 10 μl Kardiomyozyten-Isolationsenzym 2 (mit Thermolysin), das im Kit enthalten ist. Die Röhrchen vorsichtig mischen und bei 37 °C 30-35 min inkubieren.
   HINWEIS: Das Kardiomyozyten-Isolationsenzym 2 wird als Suspension in HBSS bereitgestellt und sollte vor der Anwendung auf Eis aufgetaut werden. Homogenisieren Sie das Enzym, indem Sie es auf und ab pipettieren, um eine gleichmäßige Suspension zu gewährleisten, bevor es den Proben zugesetzt wird.
5. Nach dem enzymatischen Aufschluss ist die Enzymlösung vorsichtig einzuatmen und jede Probe zweimal mit 500 μl eiskaltem HBSS zu waschen.
6. Geben Sie in jedes Röhrchen ml vollständiges DMEM für die Isolierung der primären Zelle. Zerreiben Sie das Gewebe vorsichtig, indem Sie es 25-30 Mal mit einer sterilen 1,0-ml-Pipettenspitze auf und ab pipettieren. Minimieren Sie die Bildung von Luftblasen während dieses Schritts.
   HINWEIS: Das Aufbrechen von Gewebe durch Pipettieren verbessert die Zellausbeute. Übermäßiges Pipettieren kann jedoch zu Zellschäden führen.
7. Den Überstand bei 300 × g 5 min zentrifugieren.
8. Entnehmen Sie das Complete DMEM vorsichtig mit einer Pipette. Geben Sie 1 ml frisches Complete DMEM in das Röhrchen und pipettieren Sie mit einer sterilen 1,0-ml-Pipettenspitze 25-30 Mal auf und ab. Vermeiden Sie Luftblasen beim Pipettieren.
9. Nachdem das Gewebe in erster Linie aus einer Einzelzellsuspension besteht, fügen Sie jedem Röhrchen 0,5 ml vollständiges DMEM zur Isolierung der primären Zellen hinzu, um das Gesamtvolumen auf 1,5 ml zu erhöhen. Kombinieren Sie einzelne Zellsuspensionen zur Bestimmung der Zellkonzentration und der Zellviabilität.

6. Co-Kultur-Endosom mit Kardiomyozyten

1. Die Kardiomyozyten in eine 60-mm-Schale aussäen und Complete DMEM zum Gesamtvolumen hinzufügen.
   HINWEIS: Es wird erwartet, dass jedes neugeborene Mausherz in eine Schale ausgesät wird, und das Gesamtvolumen jeder Vertiefung wird voraussichtlich 5 ml betragen (Abbildung 1B).
2. Die 60-mm-Schale bei 37 °C in einem 5 % CO_{2 -} Inkubator für 24 h inkubieren. Ersetzen Sie das Medium nach 24 Stunden durch ein äquivalentes Volumen frisches vollständiges DMEM für die primäre Zellisolierung, das das 1000-fach verdünnte Cardiomyocyte Growth Supplement enthält.
3. Das in Schritt 3 erzeugte Endosomeneluat wird 1 h lang von -80 °C auf -20 °C übertragen. Legen Sie dann die Endosomen auf Eis und tauen Sie sie nach und nach auf.
   HINWEIS: Allmähliches Auftauen auf Eis kann die Membran der Endosomen intakter machen und den Abbau verringern.
4. Mischen Sie nach 48 Stunden alle 100 μl Endosomeneluat mit 5 mL frischem Complete DMEM und ersetzen Sie das alte Medium in jeder Schale. Co-Kultur von Endosomen mit Kardiomyozyten für 24 h.
5. Waschen Sie die Kardiomyozyten mit 2 ml kaltem sterilem PBS. Geben Sie in jede Schale eiskalten Lysepuffer mit 80-100 μl Lysepuffer. Kratzen Sie die Zellen mit einem kalten Kunststoff-Zellschaber ab und sammeln Sie die Zellen in 1,5-ml-Röhrchen.
6. Führen Sie das in Schritt 4.1 beschriebene WB-Protokoll aus.
7. Für die Immunfärbung (IF) befolgen Sie die unten beschriebenen Schritte.
   1. Keimen Sie Kardiomyozyten in einem 8-Well-Kammerobjektträger. Verdünnen Sie die einzellige Suspension mit fertigem DMEM von 1,5 mL auf 3 mL.
   2. 300 μl der Suspension in jede Kammer säen. Wiederholen Sie die Schritte 6.2-6.4.
   3. Fixieren Sie die Kardiomyozyten mit 200 μl 4%igem Paraformaldehyd (PFA) für 20 min bei Raumtemperatur und waschen Sie sie dreimal mit 200 μl sterilem PBS. Der 8-Well-Kammerschieber ist bereit für IF.
      ACHTUNG: Beim Umgang mit 4 % PFA tragen Sie bitte geeignete PSA. Bitte entsorgen Sie 4% PFA nach Gebrauch in einem geeigneten Behälter.

Ergebnisse

Wir untersuchten die Expressionsniveaus von Markern für frühe Endosomen, späte Endosomen, Lysosomen und Autophagosomen in fünf Gruppen: Herzgewebelysat, Kernfraktion, mitochondriale Fraktion, andere intrazelluläre Vesikel aus Schritt 2.6 und Schritt 3.6 und Endosomen aus Schritt 2.5 und Schritt 3.6. Das Western-Blot-Ergebnis zeigte, dass EEA1 (Early Endosome Antigen 1) das höchste Expressionsniveau in Endosomen aufwies und in anderen Gruppen fast nicht exprimiert wurde (Abbildung 2A,

Diskussion

In dieser Studie stellen wir eine schnelle und reproduzierbare Methode zur Isolierung hochreiner Endosomen aus Herzgeweben von Mäusen vor, indem wir die subzelluläre Fraktionierung mit einer ultraschnellen Isolationsplattform kombinieren¹⁴. Traditionelle Ansätze zur Endosomenisolierung, wie z. B. die Dichtegradientenzentrifugation¹² oder die Immunisolierung, sind oft zeit- und arbeitsintensiv und erfordern große Mengen an Gewebe oder spezia...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
µ-Slide 8 Well hoch	Ebd.	80806-90
1,5 mL graduiertes Mikrozentrifugenröhrchen	USA Wissenschaftlich	1615-5500
10x Tris/Glycin Puffer	Bio Rad	1610734
4x Laemmli Probenpuffer	Bio Rad	1610747
Tisch-Zentrifuge	Eppendorf	Eppendorf Zentrifuge 5810R
Rinderserumalbumin	Sigma	Nr. A9418
Sieb für Zellen	Corning	CLS431750	Porengröße 40  μ M, steril
CELLSTAR Gewebekulturschalen	VWR	82050-546	Polystyrol, steril, 60 mm & akut; ca. 15 mm
ChemiDoc Bildgebungssystem	Bio Rad	ChemiDoc XRS+
Reinigungslösung	NanoFCM	17159
DMEM für Pierce Isolationskits für primäre Zellen	Fisher Scientific	PI88287
DVB-T	Fisher Scientific	Nr. BP172
Dulbecco' s phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Thermo Scientific	10010023
ECL Western Blotting Detektionsreagenz	Bio Rad	1705061
EDTA	Sigma	Nr. E4884
EWR1	Zelluläre Signalübertragung	3288S	Weißabgleich (1:1000)
EGTA (EGTA)	Sigma	Nr. E-4378-25
EID	EXODUS	MA03 EID
ERp72	Zelluläre Signalübertragung	5033S	Weißabgleich (1:1000)
Ethanol	UH Research Store		200 Proof, 5 Gallonen
EXODUS H-600	EXODUS	H-600
GAPDH	Proteintech-Technologie	Artikel-Nr.: 10494-1-AP	Weißabstand (1:5000)
Hank' s ausgewogene Salzlösung (HBSS)	Thermo Scientific	14175095
HEPES	Sigma	Nr. H3375
Homogenisator	Fisher Scientific	15340167
Kcl	Sigma	Nr. P3911
Lampe1	Abcam (Englisch)	AB320851	WB (1:2000)
LC3	Zelluläre Signalübertragung	2775S	Weißabgleich (1:1000)
Litesizer 500	Anton Paar	Litesizer 500	Andere Geräte wie Zetasizer (Malvern) oder DLS  (Wyatt) kann verwendet werden
mKirsche	Biorbyt	ORB66657	Weißabgleich (1:500)
MgCl2	Fisher Scientific	Nr. BP214-500
NaCl	Sigma	Nr. S7653
NanoFCM	NanoFCM	Durchfluss NanoAnalysator
Größenstandards für Nanokugeln	Thermo Scientific	3020A
Nikon AXR Konfokalmikroskop	Nikon	AXR
Paraformaldehyd-Lösung 4% in PBS	Santa Cruz Biotechnologie	SC-281692
Phalloidin-Markierungssonden	Invitrogen	Nr. A22284	WENN (1:500)
Pierce BCA Protein Assay Kits	Thermo Scientific	23227
Pierce Primäres Kardiomyozyten-Isolationskit	Thermo Scientific	88028
Polyethersulfon-Spritzenvorsatzfilter	Millipore	SLHPR33RS	Porengröße 0,45  μ M, steril
Vorgefertigte Protein-Gele	Bio Rad	4561093
QC-Perlen	NanoFCM	QS2503
Rab7	Zelluläre Signalübertragung	9367S	Weißabgleich (1:1000)
RIPA Lyse- und Extraktionspuffer	Thermo Scientific	89900
Roche PhosSTOP (PI Cocktail)	Roche	4906837001
Siliziumdioxid-Nanosphären	NanoFCM	S16M-Exo
Saccharose	Sigma	84097
Ausschwingrotor	Beckman Coulter	SW55Ti
Trans-Blot Turbo Transfer System RTA Transfer Kits	Bio Rad	1704270
Tween 20	Bio Rad	1662404
Ultrazentrifuge	Beckman Coulter	Optima XE-90
Ultrazentrifugen-Röhrchen	Beckman Coulter	326819
Ultraschall-Reinigungsbad	Branson Ultraschall	CPX952238R
VWR Tube Cent 50 mL	VWR	89039-656
VWR Röhrchenzentrifuge 15 mL	VWR	89039-666
Potenzielles Referenzmaterial für Zeta	Anton Paar	175108