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Räumliche molekulare Bildgebung des Glycomes mittels Massenspektrometrie

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DOI:

10.3791/69154

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28. November 2025

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1Center for Advanced Spatial Biomolecule Research (CASBR), University of Florida, Gainesville, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Florida, Gainesville, 3Markey Cancer Center, University of Kentucky, 4Department of Pathology & Laboratory Medicine, University of Kentucky

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die wichtigsten Schritte, um eine rigorose und reproduzierbare Messung sowohl von Glykogen- als auch von N-gebundenen Glykanen mittels Massenspektrometrie-Bildgebung zu ermöglichen.

Zusammenfassung

Die räumliche Organisation des Glycomes innerhalb von Geweben ist entscheidend für die molekulare Grundlage der physiologischen Funktion. Das vielfältige und dynamische Glykom ist entscheidend für grundlegende zelluläre Prozesse, einschließlich Stoffwechsel, Signalübertragung und Adhäsion. Innovationen in der räumlichen Biologie haben neue Wege für die räumliche molekulare Bildgebung verschiedener Glykomklassen eröffnet. Hier beschreiben wir ein optimiertes Protokoll zur räumlichen biomolekularen Bildgebung des Glycomes in frisch gefrorener Mausleber. Der Arbeitsablauf umfasst (1) schnelles Entnehmen und Einfrieren, (2) Kryostatschnitt bei optimaler Dicke und Position, (3) Gewebevorbereitung und Enzymverdauung auf dem Gewebe mit kohlenhydrataktiven Enzymen, (4) Matrixanwendung und Datenerfassung mittels matrixunterstützter Laser-Desorptions-/Ionisationsmassespektrometrie-Bildgebung (MALDI-MSI) sowie (5) Datenverarbeitung und Visualisierung, um die Ergebnisse in einen biologischen Kontext zu stellen. Der Einsatz dieses Ansatzes ermöglicht die Erfassung detaillierter räumlicher Karten von N-gebundenen Glykanen und Glykogen, die wichtige physiologische und zelluläre Merkmale offenbaren. Diese Daten ermöglichen die Definition der zentralen räumlichen glykomischen Heterogenität, die mit der Leberfunktion und -dysfunktion verbunden ist. Dieser Arbeitsablauf ermöglicht hochreproduzierbare und empfindliche räumliche Glykomiken der Mausleber. Darüber hinaus ist sie leicht an andere Gewebe oder Arten anpassbar, was neuartige räumliche Einblicke in die Glykombiologie bei Gesundheit und Krankheit ermöglicht.

Einleitung

Das Feld der räumlichen Biologie wächst rasant und liefert entscheidende Einblicke in die dynamische räumliche biomolekulare Komplexität lebender Organismen. Es werden verschiedene Ansätze eingesetzt, um unterschiedliche Biomoleküle im biologischen Kontext zu untersuchen. Während einige hochspezialisierte Techniken sind, hat sich die Massenspektrometrie (MS) als wichtige allgemeine Methode etabliert, um eine breite Palette von Biomolekülen im Kontext von Zellen, Geweben oder Organismen zu quantifizieren.

Die matrixunterstützte Laser-Desorption/Ionisationsmassenspektrometrie-Bildgebung (MALDI-MSI) ist eine der aufkommenden allgemeinen Techniken für multiomische räumliche Biomolekülbildgebung. Ursprünglich wurde es zur Visualisierung von Proteinen und Peptiden in Gewebeschnitten1. Seitdem wurde es auf viele verschiedene biologische Proben und Moleküleausgeweitet. Die Technik kann auf Zellproben3, Organoide4, Modelltiere5 und Patientenproben 6,7 angewendet werden. Einige Molekularklassen können direkt mit MSI-basierten Ansätzen gemessen werden, darunter viele Metaboliten und Lipide, während andere Arten komplexerer Biomoleküle, wie Proteine und Glykane, enzymatische oder chemische Behandlung erfordern, um für MSI-basierte Detektion geeignet zu sein 2,8.

MALDI-MSI wurde auch zur räumlichen Analyse von N-gebundenen Glykanen und Glykogen angewandt, wobei Workflows verwendet werden, die enzymatische Verarbeitung erfordern, um Glykanfragmente zu erzeugen, die für die MSI-Detektiongeeignet sind. N-Glykane werden mit PNGase F aus dem Asparaginrest von Proteinen gespalten, und Glukoseketten von Glykogen werden mit Isoamylase gespalten. Wesentliche Vorteile der MALDI-Glykogenanalyse sind, dass sie eine räumliche Definition der Glykogenverteilung in der biologischen Probe, relative Quantifizierung und Informationen über die Verzweigung der Glukoseketten liefert. Da sowohl N-Glykan- als auch Glykogen-Workflows eine enzymatische Verarbeitung der Probe für die MSI-Analyse erfordern, wurden sie zu einem integrierten Workflow für die Glykomanalyse zusammengeführt (Abbildung 1A). Dieser Arbeitsablauf erfordert eine sorgfältige Vorbereitung biologischer Proben und eine spezifische Verarbeitung, um eine MS-Analyse des Glycomes zu ermöglichen, gefolgt von Datenerfassung und -verarbeitung. Obwohl der Workflow eine Reihe spezialisierter Schritte erfordert, erzeugt er reichhaltige, hochwertige räumliche Glykomdaten, die hochgradig reproduzierbar sind und für vieleverschiedene Probentypen angepasst werden können. Zusätzlich ist der Arbeitsablauf modular, sodass die Probenverarbeitungsschritte von unabhängigen Forschungslaboren durchgeführt werden können, bevor die Proben an spezialisierte Einrichtungen eingereicht werden, die die letzten Schritte der MALDI-MSI-Datenerfassung und -analyse durchführen.

Protokoll

Diese Forschung wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien des institutionellen Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of Florida durchgeführt. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Leberentnahme

  1. Tier-Euthanasie und Sektion
    1. Führe eine Zervikalverrenkung und Enthauptung durch, um die Maus einzuschläfern (nach institutionell genehmigten Protokollen).
      HINWEIS: Für dieses Beispiel wurde eine 6 Monate alte Wildtyp-Maus C57BL/6J verwendet. In diesem Alter wiegen Mäuse ~25-33 g. Eine große Bandbreite an Altern, Größen und Stämmen eignet sich gut für diese Analyse.
    2. Setzen Sie das Tier sofort auf eine saugfähige Unterlage und legen Sie die Bauchhöhle mit einem sterilen Skalpell frei.
    3. Mit steriler Pinzette und Schere isolieren Sie die Leber mit minimaler Manipulation und Gewebeschäden.
      HINWEIS: Stoffwechselveränderungen treten schnell auf. Vermeiden Sie Perfusion oder Sedierung, wenn möglich, und stellen Sie sicher, dass die Dissektionsschritte so schnell wie möglich durchgeführt werden17.
  2. Waschen und reinigen Sie das Gewebe schnell.
    1. Tauchen Sie die Leber vorsichtig in 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), um eventuell Blut zu entfernen.
    2. Tauchen Sie das Gewebe zweimal in deionisiertes (DI) Wasser.
    3. Tupfen Sie überschüssiges Wasser ab, indem Sie das Taschentuch vorsichtig auf einen sauberen Tücher legen.
      HINWEIS: Proben, die größer sind als das, was auf einen Standard-Mikroskopobjektträger passt, sollten vor dem Einfrieren in Stücke geschnitten werden.
  3. Probeneinfrieren
    1. Legen Sie die gereinigte Leber direkt in ein vorgekühltes Einweg-Polystyrol-Wiegeboot, das auf flüssigem Stickstoff schwimmt.
    2. Sobald das Gewebe die Farbe zu einem glänzenden, undurchsichtigen Zustand verändert hat, gibt es etwa 3 Minuten und legt das Gewebe in vorgefertigte und beschriftete Alufolie-Päckchen auf Trockeneis.
    3. Legen Sie die Alufolie-Päckchen zusammen mit den Proben in einen -80 °C Gefrierfach zur Aufbewahrung. Die Proben können langfristig bei -80 °C gelagert werden.

2: Vorbereitung einer biologischen Probe

  1. Vorbereitung auf die Kryosektion
    1. Stellen Sie sicher, dass der Kryostat eingeschaltet und auf eine für das Gewebe geeignete Temperatur zwischen -16 °C und -20 °C ausgeglichen wird. Die genaue Temperatur hängt vom Gewebetyp ab. Die Leber sollte bei etwas wärmerer Temperatur, etwa -16 °C bis -17 °C, geschnitten werden, um Risse im Gewebe zu vermeiden, während andere Gewebe bei -20 °C geschnitten werden sollten.
    2. Stellen Sie sicher, dass mindestens zwei Chucks, zwei dünne Pinsel, eine dünne Pinzette und ein 70-mm-Glaseinsatz bei der Temperatur im Kryostat vorhanden sind. Außerdem sollten Sie Dias mit Bleistift beschriften, bevor Sie sie in den Kryostat legen, um sich einzugewöhnen.
    3. Transferiere das Gewebe aus dem -80 °C Gefrierfach auf Trockeneis in den Kryostat.
    4. Lassen Sie das Gewebe sich mindestens 30 Minuten an die Temperatur im Kryostat gewöhnen.
    5. Stellen Sie sicher, dass der Rand des Glaseinsatzes nicht beschädigt ist und dass dieser glatt ist, wo das Gewebe auf die Antiroll-Führung trifft, indem Sie mit einem behandschuhten Finger am Rand entlangfahren.
    6. Setzen Sie den Glaseinsatz in die Anti-Roll-Führung.
    7. Nimm eine flachprofilige Klinge und schiebe sie vorsichtig in den offenen Klingenhalter, und schließe den Klingenhalter. Lege den roten Klingenschutz bis zum Schneiden über die Klinge.
    8. Befestigen Sie das Gewebe mit M1-Montagemedium, das mit MS kompatibel ist, auf das Chuck. Platzieren Sie das M1-Montagemedium bei Raumtemperatur im Kryostat auf das Bohrloch, sodass mindestens zwei Ringe am Bohrloch bedeckt sind, damit das Gewebe befestigt ist.
      HINWEIS: Die optimale Schneidetemperatur (OCT) Verbindung wird häufig bei der Kryosektion verwendet; es verursacht jedoch Ionenunterdrückung bei MS-Anwendungen und muss vermieden werden. Wenn OCT verwendet werden muss, sollte ein zusätzliches mehrstufiges Protokoll verwendet werden, um das OCT zu minimieren oder zu entfernen. Außerdem analysieren einige MS-Ressourcenzentren keine Proben, die in OCT eingebettet wurden.
    9. Nimm eine gekühlte Pinzette und entferne das Taschentuch aus der Alufolie. Verwenden Sie die Pinzette, um das Gewebe in der gewünschten Ausrichtung auf dem Chuck zu positionieren.
    10. Stelle das Chuck in den Kryostat, damit das Montagemedium gefriert, etwa 2 Minuten. Sobald sie eingefroren ist, wird sie gehärtet und wirkt undurchsichtig.
  2. Kryoschnitt von Lebergewebe
    1. Lege das Chuck mit dem montierten Taschentuch in den Chuckhalter. Positioniere das Chuck so, dass das Gewebe im 90°-Winkel zur Klinge schneidet.
    2. Ziehe den Chuckhalter so lange ein, bis das Gewebe keinen Kontakt mehr mit der Klinge hat. Führe das Chuck langsam ein, bis das Gewebe unmittelbar an der Klinge liegt, um mit dem Schneiden zu beginnen.
    3. Beginnen Sie mit dem Schneiden mit einer Dicke von 30 μm, um unerwünschtes Gewebe zu entfernen.
    4. Stellen Sie sicher, dass die Tiefe der Walzenplatte einen glatten Abschnitt erzeugt und das Gewebe nicht auf der Rollenplatte rollt. Wenn das der Fall ist, dann lockere die Walzplatte leicht. Wenn das Gewebe die Rollenplatte bewegt und sie beim Zurücksetzen der Rotation ein zweites Mal trifft, zieh die Rollenplatte leicht fest.
    5. Wenn der gewünschte Abschnitt näher rückt, wird die beabsichtigte Dicke der Scheibe auf 10 μm oder eine für die jeweilige Anwendung geeignete gewünschte Dicke reduziert.
    6. Mach 10 Umdrehungen, damit das Chuck die richtige Dicke hat, um Verzögerungen und ungleichmäßige Abschnitte zu vermeiden.
    7. Benutze einen gekühlten Pinsel, um die Stufe zu reinigen und dich auf das Segmentieren vorzubereiten. Schließe die Rollplatte über der Klinge und entwickle langsam einen Abschnitt des Gewebes.
    8. Heben Sie die Walzplatte an und verwenden Sie die beiden gekühlten, dünnen Pinsel, um den Abschnitt sanft von der Klinge wegzuziehen. Ziehen Sie den Abschnitt zur Seite der Bühne, um die Montage auf der Folie zu erleichtern.
    9. Nehmen Sie einen gekühlten Objektträger aus einem Objektträger im Kryostat und legen Sie einen Zeigefinger auf die gegenüberliegende Seite des Objektträgers, wo das Gewebe für 10 Sekunden positioniert wird.
    10. Legen Sie den Objektträger vorsichtig auf das Gewebe und heben Sie ihn wieder an. Drücken Sie nicht zu stark, da dies das Gewebe zerreißt. Das Gewebe sollte auf dem Objektträger schmelzen und durchsichtig werden.
    11. Bringen Sie die Objektträger schnell in einen Desiccator zum Trocknen. Trockne den Schlitten 1 Stunde lang im Desiccator ab.
    12. Nach dem Trocknen können die Objektträger direkt für MS verarbeitet oder vakuumversiegelt und bei -80 °C gelagert werden.

3. Präparation des Objektträgers für MSI der Glykomik

  1. Herstellung von Enzymen
    HINWEIS: MS-haltiges, salzarmes lyophilisiertes PNGase F kann gekauft und direkt verwendet werden.
    1. Isoamylase erfordert Dialyse, um überschüssiges Salz für MS-Anwendungen zu entfernen. Bereiten Sie einen oder mehrere Dialysebecher vor, indem Sie sie 15 Minuten lang in HPLC-Wasser legen.
    2. Dialyse 200 μL Standardisoamylase mit einem 500 μL Dialysebecher in 14,3 ml HPLC-Wasser für 2 Stunden bei 4 °C, ohne zu rühren. Ersetzen Sie die 14,3 ml HPLC-Wasser durch frisches HPLC-Wasser und dialysieren Sie für weitere 16 Stunden (über Nacht) bei 4 °C. Ersetzen Sie die 14,3 ml HPLC-Wasser durch frisches HPLC-Wasser und dialysieren Sie für weitere 8 Stunden bei 4 °C.
    3. Entfernen Sie die Isoamylase vorsichtig mit einer Pipette aus dem Becher und legen Sie sie in ein 1,5-Mikrozentrifugenrohr. Messen Sie das Gesamtvolumen der Isoamylaselösung nach der Dialyse (in μL). Aus der Anfangsaktivität des Lagers, typischerweise 200 Einheiten/mL, und dem Endvolumen wird das Gesamtvolumen berechnet, das für 3 Einheiten Isoamylase benötigt wird.
    4. Pipettenaliquoten von 3 Einheiten Isoamylase werden in dünnwandige PCR-Röhren eingelagert. Gefrierrohre in flüssigem Stickstoff einsetzen. Bei -80 °C lagern. Für jedes Sprühprotokoll kann eine Tube dialysierte Isoamylase-Lösung verwendet werden, was für vier Objektträger ausreicht. Vermeide Einfrier-/Tauzyklen, um die Enzymaktivität aufrechtzuerhalten.
  2. Fixierung und Waschen von Gewebe
    1. Lege die Objektträger in einen Träger und tauche sie für 1 Stunde in einen Glasbehälter, der mit 10 % neutralem gepuffertem Formalin (NBF) gefüllt ist.
    2. Entfernen Sie die Objektträger aus dem NBF. Die Objektträger 2 Stunden lang in 70 % Ethanol tauchen.
    3. Bereiten Sie vier Coplin-Gläser mit 70 %, 80 %, 90 % und 100 % Ethanol vor. Beschriften Sie jedes Glas deutlich, um Verwechslungen beim Spülen in der Folge zu vermeiden.
    4. Der Transferverlauf folgt nacheinander: 70 % Ethanol für 5 Minuten, 80 % Ethanol für 5 Minuten, 90 % Ethanol für 5 Minuten, 100 % Ethanol für 5 Minuten.
    5. Geben Sie die Objektträger in eine Glas-Petrischale mit frischem, 100 % Xylen. Stellen Sie sicher, dass die Rutschen vollständig untergetaucht sind. Inkubieren Sie die Objektträger auf einem Shaker bei 70 U/min für 1 Stunde, abhängig vom Lipidgehalt des Gewebes. Wiederhole diesen Schritt zweimal zusätzlich mit frischem Xylen pro Wasch.
      HINWEIS: Dieses Protokoll ist darauf ausgelegt, maximale Delipidisierung zu ermöglichen, da bekannt ist, dass Lipide zur Ionensuppression führen und somit maximale Reproduzierbarkeit verursachen. Dies führt jedoch zu einer Delokalisierung der Signale, wodurch die erreichte Auflösung verringert wird. Verkürzte Waschschritte, begrenzte Verarbeitungszeit und sorgfältige Kontrolle der Luftfeuchtigkeit können die Delokalisierung verringern und dadurch zu einer verbesserten Datenauflösung führen.
    6. Stellen Sie die Folien über Nacht zum Trocknen in einen Desiccator.
    7. Legen Sie die Folien für 1 Minute in 70%-Ethanol zum Rehydrieren. Platziere die Rutschen 3 Minuten lang in DI-Wasser. Wiederhole die DI-Wasserwäsche mit frischem DI-Wasser.
    8. Trocknen Sie die Objektträger 10 Minuten in einem Desikator oder bis sie vollständig trocken sind.
  3. Vorbereitung von Objektträgern zur Enzymanwendung
    1. Bereiten Sie eine HTX-Feuchtigkeitskammer für die Inkubation vor, indem Sie ein mit DI-Wasser getränktes Papiertuch unter das Metallgestell legen. Stellen Sie die Kammer in einen Inkubator mit 37 °C.
    2. Bereiten Sie einen Dämpfer vor, indem Sie den Wasserbehälter bis zum Rand mit Leitungswasser füllen. Stell den Timer auf 60 Minuten, um das Gerät einzuschalten.
    3. Bereiten Sie einen citrakonischen Puffer vor, indem Sie 50 ml HPLC-haltiges Wasser, 25 μL Citraconsäureanhydrid und 2 μL 12 M HCl in ein 50 mL Falcon-Rohr geben. Wirbeln Sie die Lösung 10 Sekunden lang vor, damit sie gründlich vermischt. Jede 50-mL-Zentrifugenröhre mit citraconischem Puffer reicht für vier Schlitten aus. Überprüfen Sie den pH-Wert der Lösung bei 3,0 (akzeptabler Bereich: 2,5–3,5).
    4. Füllen Sie jeden Versandbehälter mit dem vorbereiteten Citraconic-Puffer. Legen Sie den Objektträger so ein, dass das Gewebe nach innen zeigt, um zu verhindern, dass das Gewebe die Seiten berührt, und um eine effektive Antigenentnahme zu ermöglichen. Pro Mailer können zwei Dias verwendet werden, wobei die beiden Kantenpositionen verwendet werden, wobei beide Dias das Gewebe nach innen zeigen.
    5. Überprüfen Sie, ob der Dämpfer Dampf abgibt. Die Verpackungen in den Futterdämpfer legen und 30 Minuten inkubieren.
    6. Die Versandbriefe werden für 5 Minuten in ein DI-Wasserbad geworfen. Ersetze die Hälfte des Citracon-Puffers im Mailer durch DI-Wasser und lasse es weitere 5 Minuten stehen. Wiederhole diese Verdünnung noch zweimal.
    7. Entferne alle Lösungsmittel und wasche die Objektträger, indem du 100% DI-Wasser in den Dia-Mailer gibst und dann das DI-Wasser entfernst. Mit einem Labortücher stellen Sie sich um alle Stellen mit Gewebe trocken.
    8. Zeichne auf der Rückseite jeder Folie einen Kreis und ein Dreieck, um die internen Standardpositionen zu markieren. Tragen Sie 1 μL 1 mg/mL Meerrettichperoxidase (HRP; Kreis) und 1 μL 10 mg/mL Kaninchenleberglykogen (Dreieck) auf die Vorderseite des Objektträgers auf.
    9. Lege die Objektträger für 15 Minuten in den Desiccator, damit sie vollständig trocknen.
  4. Enzymsprühen und -verdauung
    1. Entferne eine Tube mit 100 μg lyophilisierter PNGase F (500 Einheiten/μg) und eine Tube mit 3 Einheiten Isoamylase und lasse sie 10 Minuten auftauen. Drehrohre mit ~2000 x g für 5 Sekunden in einer Mikrozentrifugenröhre. Das reicht aus, um vier Objektträger zu sprühen.
    2. Pipette 50 μL DI Wasser in jedes lyophilisierte PNGase-F-Rohr, wirbe 10 s sanft vortex und spinde in einer Mikrofuge bei ~2000 x g für 5 s. Pipettieren Sie die Lösung von 50 μL PNGase F direkt in das Isoamylaserohr. Fügen Sie HPLC-Wasser zu einem Endvolumen von 1 ml hinzu.
    3. Wirbel das duale Enzym Mikrozentrifugenröhre um 10 s und drehe bei ~2000 x g für 5 s nach unten.
    4. Schalte die HTX M5-Sprühmaschine ein und öffne die HTX M5-Software. Stellen Sie sicher, dass der Tray-Typ unter dem System-Tab auf Ambient gesetzt ist.
    5. Schalten Sie die Knauer-Pumpe aus, indem Sie den Stoppknopf vorne rechts drücken. Schalten Sie die externe Spritzenpumpe mit dem Schalter an der Rückseite ein.
    6. In der HTX-Software wählen Sie unter dem Reiter Methoden die passende Methode für das Dual-Enzym-Sprühen aus. Die Parameter müssen auf eine Düsentemperatur von 45 °C, 15 Durchgänge, Durchflussrate von 0,025 mL/min, Geschwindigkeit von 1200 mm/min, Schienenabstand von 3 mm, CC-Muster, Druck auf 10 psi, Gasdurchfluss von 3 L/min und Düsenhochstand von 40 mm eingestellt werden.
    7. Gehen Sie zum Reiter Temperatur und stellen Sie die Sprühdüsetemperatur auf 45 °C ein. Benutze einen Schraubenschlüssel, um die Sprühleitung zum oberen Anschluss zu bewegen.
    8. Öffnen Sie das ultrareine Stickstoffgasventil und stellen Sie sicher, dass der Sprühdruck 10 psi beträgt. Stellen Sie an der Spritzenpumpe die Durchflussrate auf 95 μL/min ein.
    9. Mit einer frischen Spritze und Nadel füllen Sie mit 4 ml HPLC-Wasser. Entferne alle Blasen. Führen Sie 2 ml Wasser durch einen ~6 Zoll langen Abschnitt der Sprühleitung in einen Abwasserbecher.
    10. Schließen Sie die Spritze an die Sprühleitung an und leiten Sie Wasser durch die Spritzpumpe, indem Sie mit 95 μL/min für 5 Minuten starten.
    11. Während Sie die Spritzpumpe spülen, kleben Sie die Objektträger mit einer Metallausrichtungsführung an die untere linke Ecke des beheizten Tabletts, um sicherzustellen, dass das Gewebe im Sprühbereich liegt. Unter dem Reiter Muster definieren Sie die X- und Y-Parameter für den Sprühbereich, wobei ein leichtes Übersprühen erlaubt ist, um eine vollständige Abdeckung des Objekts zu gewährleisten.
    12. Nach 5 Minuten die Pumpe anhalten, die Spritze abkoppeln, Luft hineinziehen und dann Luft durch die Sprühleitung drücken, um restliches Wasser zu entfernen. Wiederhole das bei Bedarf.
    13. Füllen Sie die duale Enzymlösung in eine neue Spritze und verbinden Sie sie mit der Pumpe, wobei keine Blasen zurückbleiben.
    14. Befestige die Spritze an der Sprühleitung. An der Spritzenpumpe stellen Sie den Durchfluss auf 25 μL/min ein.
    15. Sobald die Sprühdüse 45 °C erreicht, drücken Sie unter dem Zyklus-Tab auf Start. Klicken Sie auf Nein, wenn Sie aufgefordert werden, die Knauer-Pumpe einzuschalten. Drücken Sie Start an der Spritzenpumpe, um das Sprühen zu beginnen.
    16. Platziere einen leeren Schlitten unter die Sprühdüse, um die sichtbare Enzymsprayablagerung zu bestätigen. Sobald das beobachtet ist, klicken Sie in der Software auf Fortsetzen , legen Sie die Glasabdeckung auf den Sprüher und beobachten Sie das Sprühen auf eine gleichmäßige Auftragung, wie durch gleichmäßige Befeuchtung angezeigt.
    17. Wenn der Sprühzyklus abgeschlossen ist, drücken Sie Stopp an der Pumpe, schalten Sie das Stickstoffgas ab und klicken Sie auf Ventillast bestätigen. Reinigen Sie die Leitung und die Stufe des Sprühgeräts und schalten Sie den Sprüher aus, um sicherzustellen, dass die Knauer-Pumpe wieder eingeschaltet ist.
    18. Inkubieren Sie die Objektträger in der HTX-Feuchtigkeitskammer bei 37 °C für 2 Stunden und platzieren Sie die Objektträger nach oben. Nach Abschluss legen Sie die Objektträger für 15 Minuten in den Desiccator. Die Objektträger können über Nacht im Desiccator verbleiben oder das Protokoll kann fortgesetzt werden.
  5. Erstellung und Anwendung von MALDI-Matrixen
    1. Vor der Anwendung der Matrix wird mit einem Scanner ein optisches Bild des Objektträgers aufgenommen.
    2. Wiege 40 mg festes CHCA in ein 15 ml konisches Rohr. Lösen Sie das CHCA-Pulver in einer Lösung aus 0,1 % Trifluoressigsäure und 50 % Acetonitril (ACN) bei einer Konzentration von 7 mg/ml.
    3. Sonikieren Sie die Matrixlösung 10 Minuten lang mit Zyklen von 90 Sekunden an und 30 Sekunden aus. Wiederholen Sie diese Schritte fünfmal, um vollständige Auflösung und Homogenität sicherzustellen.
    4. Schalte die HTX M5-Sprühmaschine ein und öffne die HTX M5-Software. Öffnen Sie das Stickstoffgasventil und stellen Sie den Systemdruck auf 10 psi ein.
    5. In der HTX-Software wählen Sie unter dem Reiter Methoden die passende Methode für das CHCA-Matrixsprühen aus. Die Parameter sind auf eine Düsentemperatur von 79 °C, 10 Durchgänge, Durchflussrate von 0,1 mL/min, Geschwindigkeit von 1300 mm/min, Schienenabstand von 3 mm, CC-Muster, Druck auf 10 psi, Gasdurchfluss von 3 L/min und Düsenhochstand von 40 mm.
    6. Gehen Sie zum Reiter Temperatur, stellen Sie die Sprühdüsetemperatur auf 79 °C ein. Unter dem Pumpen-Tab stellen Sie die Durchflussrate auf 100 μL/min.
    7. Klebe die Verschlüsse mit einer Metallführung an die untere linke Ecke des beheizten Tabletts, um eine korrekte Ausrichtung im Sprühbereich sicherzustellen. Unter dem Reiter Muster definieren Sie die X- und Y-Parameter für den Sprühbereich, wobei ein leichtes Übersprühen erlaubt ist, um eine vollständige Abdeckung des Objekts zu gewährleisten.
    8. Benutze eine Einwegspritze und Nadel, um 5,5 ml 50 % ACN zu entnehmen (Blasen entfernen).
    9. Stelle den Sprüher auf LOAD-Modus . Führe die ACN-Spritze ein und injiziere die ACN. Entfernen Sie die ACN-Spritze und ersetzen Sie sie sofort durch eine neue Spritze mit 5,5 ml gefilterter CHCA-Lösung, wobei Sie darauf achten, Blasen zu vermeiden. Stelle den Sprüher auf SPRAY-Modus .
    10. Sobald die Sprühdüse 79 °C erreicht, drücken Sie unter dem Zyklus-Tab auf Start. Klicken Sie auf Ja, wenn Sie aufgefordert werden.
    11. Benutze einen leeren Testobjektträger und platziere ihn unter die Sprühdüse. Um die sichtbare Matrix-Spritzablagerung zu bestätigen, wird auf dem Objektträger eine gelbe Matrixabscheidung gefunden. Sobald das beobachtet ist, klicken Sie auf Fortsetzen, legen Sie die Glasabdeckung auf das Instrument und überwachen Sie den Sprühstrahl auf Konsistenz. Konsequentes Sprühen erzeugt einen Rutsch mit gleichmäßiger Undurchsichtigkeit.
    12. Wenn der Sprühzyklus abgeschlossen ist, stellen Sie den Sprüher auf LAST-Modus ein und klicken Sie auf Ventillast bestätigen.
    13. Reinigen Sie den Sprüher, indem Sie die Pumpe auf 300 psi stellen und die Temperatur auf 30 °C senken. Aufnehmen und durch die Leitung 5 ml 50 % Acetonitril zweimal und zweimal 5 ml 50 % Methanol durchdrücken. Wisch die Bühne mit 100% Methanol sauber. Sobald die Temperatur 30 °C erreicht, schalten Sie auf LOAD, schalten Sie das Gas aus, schalten Sie den Sprüher aus und stellen Sie sicher, dass die Knauer-Pumpe wieder eingeschaltet ist.
    14. Legen Sie die Objektträger für 15 Minuten in den Desiccator, bis die Matrix vollständig trocken ist. Die Folien sollten so schnell wie möglich nach dem Sprühen durchgeführt werden, maximal innerhalb von 14 Tagen, um eine zuverlässige Datenerfassung mit angemessenem Signal-Rausch-Verhältnis sicherzustellen.

4. MALDI-MSI-Glykomik-Datenerhebung

  1. Vorbereitung auf die Datenerhebung
    1. Sichern Sie den Schlitten mit dem Schlittenadapter in den Probenhalter des MALDI-Instruments. Setzen Sie den Probenhalter in den MS ein und stellen Sie sicher, dass er für die Bildgebung richtig sitzt.
    2. Öffnen Sie die flexImaging-Software und importieren Sie das zuvor aufgenommene optische Diabild, siehe Schritt 3.4.1. Falls erforderlich, kalibrieren Sie die Bildausrichtung mit der Instrumentenstufe, sodass die Gewebeschnitte und Standardstellen für die Regionsauswahl korrekt positioniert sind.
    3. Definieren Sie die Bildgebungsbereiche für die Gewebeschnitte, den HRP-Standard, den Glykogenstandard und das Kontrollmatrixquadrat in der Software. Umrisse jede Region als separaten Bereich.
    4. Stellen Sie die Rasterschrittgröße auf 50 μm ein, was eine Pixelauflösung von 50 × 50 μm ergibt.
    5. In der Instrumentensteuerungssoftware wählen Sie den Positiv-Ionen-MS-Modus und stellen Sie den Scanbereich auf m/z 500 - 4000 mit einem Low-Mass-Cutoff von 700,00 m/z ein.
    6. Laden Sie die voroptimierten MALDI-Bildabstimmungsparameter in der Instrumentensteuerungssoftware ein (oder geben Sie die Werte bei Bedarf manuell ein). Überprüfen Sie, dass die Quell- und Ionenoptikspannungen auf die angegebenen Werte eingestellt sind: MALDI Plate Offset 50,0 V; Ablenkung 1 Delta 70,0 V; Schornstein 1 RF 500.0 Vpp; Schornstein 2 RF 500,0 Vpp; Multipol-RF 500,0 Vpp; Ionenenergie 5,0 eV. Bestätigen Sie die Kollisionszelle und die Tof-Zeiteinstellungen: Kollisionsenergie 10,0 eV; Kollision RF 4000.0 Vpp; Übertragungszeit 180,0 μs; Vorpulsspeicherung 25,0 μs.
    7. Bestätige die Lasereinstellungen unter dem Laser-Reiter. Wählen Sie Imaging 50 μm als Anwendungsstandard aus.
    8. Kalibrieren Sie das Massenspektrometer mit einem externen Kalibergemisch, wie zum Beispiel Tune Mix. Führen Sie den Kaliber ein und führen Sie die Kalibrierungsroutine des Instruments durch. Passen Sie die Kalibrierung so an, dass der Massengenauigkeitsfehler innerhalb von 0,001 % liegt und der Kalibrierungsgenauigkeitswert 100 %.
    9. Stellen Sie die Aufnahme so ein, dass sie einen Burst von 320 Laserschüssen mit einer Frequenz von 10.000 Hz ausführt. Die Laserdämpfung sollte auf 37 % eingestellt werden, um die Signalintensität im optimalen Dynamikbereich zu halten. Passen Sie Laserschüsse und Dämpfung bei Bedarf an.
    10. Nutzen Sie die automatische Strahlausrichtungsfunktion, Zielprofilanpassung und Fokusanpassung des Instruments, um sicherzustellen, dass der Laser richtig auf die Probe fokussiert ist. In einem Bereich außerhalb des Gewebes führen Sie die Auto-Beam Adjust unter dem Laser-Tab in der Steuerungssoftware aus, um den Laser mit der Ionenoptik auszurichten. Dies stellt sicher, dass Laser und Stufe für eine optimale Datenerfassung eingestellt sind. Führen Sie schließlich Zielprofilgenerierung und Fokus-Tuning-Anpassungen im Tab Musterträger aus.
    11. Bestätigen Sie, dass die internen Standardpunkte die erwarteten Ionenspitzen erzeugen, was die Bereitschaft zur Datenerhebung anzeigt. Der HRP sollte bei 1211,42 einen ausgeprägten Glykan-Peak haben. Glykogen sollte regelmäßig prominente Spitzen verteilt haben, mit den höchsten Intensitätsspitzen bei 1013,32, 1175,37 und 1337,43.
      HINWEIS: Wenn Probleme mit der Intensität festgestellt werden, sollten Sie die Laserkonfiguration erneut überprüfen. Wenn Probleme mit der Massengenauigkeit festgestellt werden, überprüfen Sie die Kalibrierung erneut.
  2. MALDI-MSI-Datenerhebung
    1. Beginnen Sie mit der MALDI-MS-Bildaufnahme für die definierten Regionen, indem Sie in der Bildgebungssoftware auf die Starttaste klicken. Das Instrument rastert den Laser automatisch über jeden definierten Bereich in 50 μm-Intervallen und erhält bei jedem Pixel ein positives Ionenspektrum (m/z 500–4000). Die typische Datenerfassungszeit für einen Leberschnitt bei dieser Auflösung beträgt 135 Minuten.
      HINWEIS: Nach dem Durchlauf speichert das Instrument automatisch die Spektren für jeden erfassten Pixel und erstellt einen .d-Ordner mit den Rohdaten.

5. MALDI-MSI-Datenanalyse

  1. Datenimport und -export
    1. Importiere den Datensatz in SCiLS Lab oder eine gleichwertige MSI-Analysesoftware, um Intensitätskarten des Glycomes über die Gewebeschnitte zu visualisieren.
    2. Öffne das SCiLS-Labor. Wählen Sie Neu. Wählen Sie die .mis-Datei aus dem MALDI-Run aus.
    3. Sobald die .mis-Datei in SCiLS geöffnet ist, klicke auf Next. Wähle Automatische Reichweite für m/z-Reichweite. Wählen Sie die automatische Achse für Achsenparameter aus. Wähle die absolute Bin-Größe aus. Klicken Sie auf Next und dann auf Import. Wählen Sie den Ordner aus, in dem die Datei gespeichert wird.
    4. Nachdem der Import abgeschlossen ist, öffne die neue .slx-Datei.
    5. Klicken Sie auf Datei, Importieren und wählen Sie die Funktionsliste aus der Dateioption aus. Importiere Glycome-Annotationen und erstelle Ionenbilder, indem du zum Feature-Listenfenster gehst, die richtige Liste auswählst und auf die Schaltfläche "Ionenbilder erstellen" klickst.
      HINWEIS: Für N-Glykane16, 18, 19 und Glykogen13 stehen umfangreiche Funktionslisten zur Verfügung.
    6. Normalisieren Sie die Daten, soweit es passt. Total Ion Count (TIC) ist die am häufigsten verwendete Normalisierung.
    7. Sobald die Ionenbilder geladen sind, gehen Sie die Feature-Liste durch und stellen Sie sicher, dass die Peak-Integration korrekt ist, indem Sie manuell jene Features anpassen, in denen der Peak nicht vollständig integriert ist. Zur Anpassung klicke mit der linken Maustaste auf den Peak und halte Shift gedrückt. Sobald der Peak integriert ist, drücke Control und Leertaste auf der Tastatur. Dies erzeugt ein neues Ionenbild für den angepassten Peak.
    8. Nachdem Sie das für den Rest der Feature-Liste wiederholt haben, wählen Sie im Ionenbild-Panel die Liste "Funktions speichern " aus, benennen Sie die Liste und klicken Sie auf Speichern.
    9. Gehe zur Datei, zur Feature-Tabelle und öffne die gerade gespeicherte Feature-Listen-Tabelle. Sortieren Sie nach M/Z. Die angepassten Merkmale erscheinen mit einer leeren Zelle in der Namensspalte. Benennen Sie die angepassten Gipfel um, indem Sie den Namen kopieren und einfügen und den ursprünglichen Gipfel entfernen, indem Sie die Schaltfläche "Auswählen der ausgewählten Zeile entfernen" in der Funktionsliste auswählen, die sich oben in der Mitte der Funktionstabelle befindet.
    10. Nach Anpassung aller Namen wird eine endgültige annotierte Gipfelliste erstellt. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Hinzufügen von Intensität" in der Nähe des Lösch-Buttons. Von hier aus wählen Sie die interessanten Proben aus, um die durchschnittliche Intensität der kommentierten Merkmale jeder abgebildeten Region zu exportieren.
    11. Stellen Sie sicher, dass Sie den Peak Area Interval Processing-Modus und die Gesamtionenzahl für die Normalisierung auswählen. Klicken Sie auf OK. Neue Spalten erscheinen mit den entsprechenden Daten. Um die Daten zu exportieren, wählen Sie den nach außen zeigenden Pfeil und speichern Sie als .csv.

Ergebnisse

Eine sorgfältige Bearbeitung einer Leber aus einer Wildtyp-Maus, einschließlich des Durchschneidens eines vollständigen Querschnitts (Abbildung 1A), ermöglichte die Definition des Glycomes durch MALDI-MSI, mit verschiedenen glykogenabgeleiteten Oligosacchariden und N-gebundenen Glykanen über einen Bereich von m/z (Abbildung 1B). Glykogen war weitgehend in den Leberhepatozyten lokalisiert und es fehlte wie erwartet an Gefäßen und Bindegewebe in den Portalbahnen (Abbildung 1C,D). Wichtig ist, dass die MALDI-MSI-Daten sowohl die räumliche Verteilung des Glykogens als auch die Kettenlängenverteilung messen konnten, ein zentrales Merkmal des Glykogen im normalen Stoffwechsel und in Krankheitszuständen (Abbildung 1D). Außerdem weisen verschiedene N-gebundene Glykane unterschiedliche Organisationen auf. Die beobachtete räumliche Verteilung reicht von weit verbreitet in Hepatozyten (Abbildung 1E) über regionale Foci, was mit der sinusförmigen Organisation der Leber übereinstimmt (Abbildung 1F), bis hin zur spezifischen Markierung der Portalbahnelemente (Abbildung 1G-I).

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Abbildung 1: MALDI-MSI-Glykomanalyse der Mausleber. (A) Schaltplan für kritische Methoden bei der Probenvorbereitung, Datenerfassung und -analyse. (B) Proben-Massenspektren, die aus dem Ansatz abgeleitet sind. Pfeile in Rot zeigen die regelmäßig verteilten Oligosaccharide, die aus Glykogen abgeleitet sind, und unterscheiden sich um ein Glukosemonosaccharid. Pfeile in Blau stehen für N-Glykane, die über das gesamte Spektrum verteilt sind. In der Leber sind die Glykogenspitzen im Allgemeinen ausgeprägter, besonders bei höheren m/z-Werten. (C) Räumliche Verteilung der Maltohexaose (DP6), die aus Glykogen in der Leber abgeleitet ist. (D) Verteilung der Glykogenkettenlängen in der Leber. (E-G) Räumliche Verteilung verschiedener N-gebundener Glykan-Arten in der Leber. (H) Hämatoxylin- und Eosin-(H&E)-Färbung für eine fokussierte zentrale Region sowie anatomische Annotationen. (I) Entsprechendes fokussiertes Inset, das die räumliche Lokalisierung zusätzlicher N-gebundener Glykane (Hex5dHex1HexNAc5) in Portalbahnelementen zeigt. Maßstabsbalken: 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Diskussion

MALDI-MSI ist ein aufkommendes Werkzeug für die Glykom-Raumbiologie. Wichtig ist, dass sich dieses Protokoll zwar auf die Datenerfassung mit spezifischer Hardware konzentriert, aber problemlos an MALDI-MSI-Plattformen mehrerer Anbieter angepasst werden kann13. Die Probenverarbeitung ist bis Methode 4 identisch, obwohl einige Anbieter die Verwendung spezieller Objektträger verlangen können. Modifikationen der Datenerfassung unter Verwendung spezifischer Parameter der MALDI-MSI-Plattform ermöglichen eine schnelle Anpassung dieses Protokolls. Herstellerspezifische Software für die Datenverarbeitung kann, wie in Schritt 5 beschrieben, verwendet werden, oder alternativ können Plattformen für rigorose und reproduzierbare MALDI-MSI-Datenverarbeitungeingesetzt werden.

MALDI-MSI ist ein besonders nützliches Werkzeug zum Verständnis der Biologie, da verschiedene Organe, Gewebe und Zellen unterschiedliche Muster für ihr Glycome aufweisen. Die Leber eignet sich gut für die Glykomanalyse, da sie hohe Glykogenwerte und verschiedene N-gebundene Glykane13 aufweist. Andere Organe weisen höhere Werte und Vielfalt an N-gebundenen Glykanen sowie niedrigereGlykogen-13-Werte auf. Wichtig ist, dass das Glykom in verschiedenen Organen je nach Stoffwechsel und Krankheitszustand des Organismus variiert, weshalb das Glykom eine reiche Quelle biologischerInformationen liefert. Die fortlaufende Entwicklung einzigartiger kohlenhydrataktiver Enzyme für die MALDI-MSI-Analyse verspricht, die Glykomanalyse auf weitere orthogonale Biomoleküle im Glycome auszuweiten.

Obwohl MALDI-MSI viele Vorteile bietet, ist es derzeit im Vergleich zu anderen in der räumlicher Biologie verwendeten Werkzeugen in ihrer Auflösung begrenzt. Dieses Protokoll nutzte Datenerfassung mit 50 μm Auflösung. Obwohl ausgezeichnet für physiologische Analysen, würden Daten mit Einzelzellauflösung das Feld21 erheblich voranbringen. Insbesondere kann Delokalisierung ein erhebliches Hindernis für eine erhöhte Auflösung in Methoden sein, die Enzymsprühen und anschließende Inkubation unter feuchten Bedingungen nutzen. Jüngste Fortschritte in der Probenverarbeitungshardware, Probenhandhabungsmethoden, Datenerfassungshardware, der Verwendung selektiver Kennzeichnung und Datenverarbeitung ermöglichen es der MALDI-MSI-Datenerhebung, die zelluläre Auflösung22,23 zu erreichen. Es gibt jedoch Abwägungen zwischen Auflösung und Signal-Rausch-Effekt sowie inhärente Einschränkungen basierend auf den aktuellen Probenvorbereitungsmethoden für MALDI, die berücksichtigt werden müssen. Sehr spezifische Anwendungen erreichen bereits das Ziel des einzelzelligen MALDI-MSI mit Innovationen sowohl in der SampleProcessing 24 als auch bei neuartigen Algorithmen, was darauf hindeutet, dass allgemeine Lösungen für diese Probleme in Reichweitesind 25,26,27.

Nach der Datenerhebung kann das Objektträger mittels H&E zur histologischen Annotation gefärbt werden. Zell- und Gewebeschäden sind jedoch mit der Datenerhebung von MALDI-MSI verbunden, sodass diese Strategie den Umfang der zellulären Annotation begrenzt. Alternativ können sequentielle Gewebeschnitte für H&E verwendet werden. Diese Strategie liefert hochwertige Daten, erfordert jedoch die Ausrichtung und Integration diskreter Stichprobenschnitte.

Bemerkenswert ist, dass formalinfixierte, paraffin-eingebettete (FFPE) Gewebe sehr gut für die Glykomanalyse mit MALDI-MSI geeignet sind, mit kleinen Änderungen im Protokoll zur Probenvorbereitung13. FFPE-Gewebe kann jedoch nicht effektiv für Metabolomik und ähnliche Analysen genutzt werden, daher werden frisch gefrorene Proben, wie hier beschrieben, für Multiomics-Ansätze28 bevorzugt. Die Probenvorbereitung ist ein entscheidender Bestandteil jeder MSI-Pipeline für labile Biomoleküle, die spezielle Ansätze zur Entnahme und Handhabung von Proben erfordert. 17,29,30.

Methoden zur Erweiterung der Verbreitung und breiten Nutzung von MALDI-MSI-basierten Ansätzen entwickeln sich rasant mit dramatischen Verbesserungen bei Hardware und Software19. Darüber hinaus sind aktuelle innovative multiomische28 - und multimodale21-Ansätze in Kombination mit maschinellem Lernen und künstlicher Intelligenz besonders vielversprechend für die Verarbeitung dieser hochkomplexen Datensätze31.

Offenlegungen

R.C.S., M.S.G. und C.W.V.K. sind Co-Direktoren des Center for Advanced Spatial Biomolecule Research (CASBR) an der University of Florida und Mitbegründer von Sugar3 LLC. R.C.S. hat Forschungsunterstützung und/oder Beratungsgebühren von Maze Therapeutics erhalten. M.S.G. hat Forschungsunterstützung, Forschungsverbindungen oder Beratungsgebühren von Maze Therapeutics, Valerion Therapeutics, Ionis Pharmaceuticals, PTC Therapeutics und Aro Biotherapeutics erhalten. M.S.G. ist Mitglied des wissenschaftlichen Beirats von Chelsea's Hope, der Glut1-Deficiency Syndrome Foundation und der Adult Polyglucosan Body Disease Foundation.

Danksagungen

Wir danken den Mitgliedern der Vander Kooi-, Sun- und Gentry-Labore für fruchtbare Diskussionen. Diese Studie wurde durch Fördermittel des National Institutes of Health (NIH) für die Biospecimen Procurement & Translational Pathology Shared Resource Facility des University of Kentucky Markey Cancer Center unterstützt, P30CA177558 an D.B.A., R01AG066653, R01CA266004, R01AG078702, R01CA288696, RM1NS133593 an R.C.S., R35NS116824 an M.S.G., R01DC019054 an C.W.V.K. und an das University of Florida College of Medicine.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Saugfähiges UnterpolsterDenville ScientificB1623
Acetonitril (ACN)Sigma-Aldrich34851-4X4L
AlufolieFisher Scientific 15078292
Citrakonisches AnhydridSigma-Aldrich125318
Konische Röhre (15 ml)Alkali ScientificCW5600
Coplin JarsDWK Life Sciences900570
Cryostat LeicaCM1860
Kryostat-ChuckLeica14041926491
DesiccatorBel ArtF424004131
DialysebecherThermo Fisher88400
EthanolFisher Scientific 22032601
EssensdampferRival CKRVSTLM21   
Glaseinsatz (70 mm)Gel CompanyLGI50
GlykogenSigma-AldrichG8876Standard
Meerrettichperoxidase (HRP)Sigma-AldrichP8125Standard
HPLC-WasserSigma-Aldrich270733-4X4L
HTX-SprüherHTX TechnologiesM5
SalzsäureFisher Scientific A144-500
IsoamylaseMegazymeE-ISAMY
Knauer-PumpeKnauerP 4.1 S
Flachprofil-KlingeElektronenmikroskopiewissenschaften63059-01
M1-MontagemediumEpredia1310
MassenspektrometerBruker DaltonicstimsTOF fleX
Mikrofugerohr (1,5 mL)Alkali ScientificCN3016
NadelBD305109
Neutral gepuffertes Formalin NBFMillipore sigmaHT501128-4L
StickstoffgasLuftgasNIUHP300
PBSFisher Scientific SH30256. FS
PCR-RöhrchenMedSupply-Partner62-1091-1
PNGase F PRIME-LY ULTRA Bulldoggen-BiografieNZPULT10LY
SCiLS-LaborBruker Daltonics1889000
ShakerThermowissenschaftlich88882007
Slide   Elektronenmikroskopwissenschaften71873-02
Dia-MailerRPI-Produkte212620A
Sonikater (Bioruptor Pico)DiagenodeB01080010
Sterile ZangeDR-InstrumenteS08098
Steriles SkalpellWPIWPI-500240
Sterile SchereFeine wissenschaftliche Werkzeuge14084-08
Spritze   Grainger19G342
SpritzenpumpeNeue ÄraNE-300
BandFisher Scientific 15-901-R
Dünner PinselAnezus#00
TrifluoressigsäureSigma-AldrichT6508-1L
Tune Mix, ESI niedrige KonzentrationAgilentG1969-85000
GewichtsbooteSigma-AldrichHS120882
XylenSigma-Aldrich534056
α-cyano-4-hydroxycinnaminsäure (CHCA)Cayman Chemical Company15254

Referenzen

  1. Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: Localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS. Anal Chem. 69 (23), 4751-4760 (1997).
  2. Buchberger, A. R., Delaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass spectrometry imaging: A review of emerging advancements and future insights. Anal Chem. 90 (1), 240-265 (2018).
  3. Ouedraogo, R., Daumas, A., Capo, C., Mege, J. L., Textoris, J. Whole-cell MALDI-TOF mass spectrometry is an accurate and rapid method to analyze different modes of macrophage activation. J Vis Exp. 82, e50926(2013).
  4. Khalil, S. M., Cappuccio, G., Li, F., Maletic-Savatic, M. Molecular imaging of human brain organoids using mass spectrometry. J Vis Exp. 211, e66997(2024).
  5. Sun, R. C., et al. Brain glycogen serves as a critical glucosamine cache required for protein glycosylation. Cell Metab. 33 (7), 1404-1417 (2021).
  6. Aichler, M., Walch, A. Maldi imaging mass spectrometry: Current frontiers and perspectives in pathology research and practice. Lab Invest. 95 (4), 422-431 (2015).
  7. Conroy, L. R., et al. High-dimensionality reduction clustering of complex carbohydrates to study lung cancer metabolic heterogeneity. Adv Cancer Res. 154, 227-251 (2022).
  8. Seeley, E. H., Caprioli, R. M. Molecular imaging of proteins in tissues by mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18126-18131 (2008).
  9. Powers, T. W., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization imaging mass spectrometry workflow for spatial profiling analysis of N-linked glycan expression in tissues. Anal Chem. 85 (20), 9799-9806 (2013).
  10. Drake, R. R., Powers, T. W., Norris-Caneda, K., Mehta, A. S., Angel, P. M. In situ imaging of N-glycans by MALDI imaging mass spectrometry of fresh or formalin-fixed paraffin-embedded tissue. Curr Protoc Protein Sci. 94 (1), e68(2018).
  11. Stanback, A. E., et al. Regional n-glycan and lipid analysis from tissues using MALDI-MS imaging. STAR Protoc. 2 (1), 100304(2021).
  12. Hawkinson, T. R., Sun, R. C. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging of glycogen in situ. Methods Mol Biol. 2437, 215-228 (2022).
  13. Young, L. E. A., et al. In situ mass spectrometry imaging reveals heterogeneous glycogen stores in human normal and cancerous tissues. EMBO Mol Med. 14 (11), e16029(2022).
  14. Conroy, L. R., et al. Spatial metabolomics reveals glycogen as an actionable target for pulmonary fibrosis. Nat Commun. 14 (1), 2759(2023).
  15. Clarke, H. A., et al. Glycogen drives tumor initiation and progression in lung adenocarcinoma. Nat Metab. 7 (5), 952-965 (2025).
  16. Wallace, E. N., et al. An N-glycome tissue atlas of 15 human normal and cancer tissue types determined by MALDI imaging mass spectrometry. Sci Rep. 14 (1), 489(2024).
  17. Veerasammy, K., et al. Sample preparation for metabolic profiling using MALDI mass spectrometry imaging. J Vis Exp. 166, e62008(2020).
  18. Mcdowell, C. T., et al. Imaging mass spectrometry and lectin analysis of N-linked glycans in carbohydrate antigen-defined pancreatic cancer tissues. Mol Cell Proteomics. 20, 100012(2021).
  19. Palmer, A., et al. FDR-controlled metabolite annotation for high-resolution imaging mass spectrometry. Nat Methods. 14 (1), 57-60 (2017).
  20. Colpaert, M., et al. Neurological glycogen storage diseases and emerging therapeutics. Neurotherapeutics. 21 (5), e00446(2024).
  21. Taylor, M. J., Lukowski, J. K., Anderton, C. R. Spatially resolved mass spectrometry at the single cell: Recent innovations in proteomics and metabolomics. J Am Soc Mass Spectrom. 32 (4), 872-894 (2021).
  22. Chan, Y. H., et al. Gel-assisted mass spectrometry imaging enables sub-micrometer spatial lipidomics. Nat Commun. 15 (1), 5036(2024).
  23. Lim, M. J., et al. Maldi Hiplex-IC: Multiomic and multimodal imaging of targeted intact proteins in tissues. Front Chem. 11, 1182404(2023).
  24. Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging. J Am Soc Mass Spectrom. 18 (9), 1646-1652 (2007).
  25. Rappez, L., et al. Spacem reveals metabolic states of single cells. Nat Methods. 18 (7), 799-805 (2021).
  26. Grgic, A., Cuypers, E., Dubois, L. J., Ellis, S. R., Heeren, R. M. A. Maldi MSI protocol for spatial bottom-up proteomics at single-cell resolution. J Proteome Res. 23 (12), 5372-5379 (2024).
  27. Dressman, J. W., Bayram, M. F., Angel, P. M., Drake, R. R., Mehta, A. S. Single-cell multiomic MALDI-MSI analysis of lipids and N-glycans through affinity array capture. Anal Chem. 97 (24), 12493-12502 (2025).
  28. Clarke, H. A., et al. Spatial mapping of the brain metabolome, lipidome, and glycome. Nat Commun. 16 (1), 4373(2025).
  29. Juras, J. A., et al. In situ microwave fixation provides an instantaneous snapshot of the brain metabolome. Cell Rep Methods. 3 (4), 100455(2023).
  30. Cantrell, A. R., et al. Protocol for high-power, brain-focused microwave fixation to define rodent metabolism. STAR Protoc. 6 (2), 103794(2025).
  31. Ma, X., et al. An AI-driven framework to map the brain metabolome in three dimensions. Nat Metab. 7 (4), 842-853 (2025).

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