Methodenartikel

Dynamische Clamp-Methoden zur Untersuchung der gestörten neuronalen Erregbarkeit im Zusammenhang mit Autismus

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DOI:

10.3791/69155

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17. Oktober 2025

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1Department of Biology, Miami University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die dynamische Klemmelektrophysiologie kann kausale Zusammenhänge zwischen neuronalen Feuerungsdefiziten und Ionenkanaldysfunktionen herstellen. Wir beschreiben dynamische Clamp-Methoden und -Protokolle in zerebellären Purkinje-Neuronen der Maus und erwähnen nützliche Ressourcen und technische Überlegungen. In einer repräsentativen Studie fügen wir modellierte Natriumleitfähigkeit zu Tsc1-/- Purkinje-Neuronen hinzu, um wiederholtes Feuern zu verhindern.

Zusammenfassung

Die Autismus-Spektrum-Störung (ASS) entsteht durch eine Vielzahl von genetischen und umweltbedingten Faktoren. Während zahlreiche ASD-gebundene Mutationen die Synapsenentwicklung oder -plastizität stören, wurde gezeigt, dass eine zunehmende Anzahl die Expression und Funktion von spannungsgesteuerten Ionenkanälen verändert, was zu Defiziten in der neuronalen intrinsischen Erregbarkeit führt. Ganzzell-Voltage-Clamp-Aufzeichnungen können verwendet werden, um zu charakterisieren, wie ASD-bedingte Mutationen die Funktion von Ionenkanälen beeinflussen. Diese Experimente können jedoch nicht direkt beurteilen, wie sich eine veränderte Ionenleitfähigkeit auf das Feuern des neuronalen Aktionspotentials auswirkt. Die dynamische Clamp-Elektrophysiologie schließt diese Lücke, indem sie die Echtzeit-Injektion von benutzerdefinierten Ionenleitwerten in lebende Neuronen ermöglicht. Dies ermöglicht eine kausale Prüfung, wie sich Änderungen der Ionenkanaleigenschaften auf die elektrische Aktivität eines bestimmten Zelltyps auswirken. In diesem Methodenartikel beschreiben wir, wie die dynamische Klemmelektrophysiologie in adulten Purkinje-Neuronen von Mäusen implementiert werden kann, die unter physiologischen Bedingungen in akut präparierten Kleinhirnschnitten aufgezeichnet wurden. Purkinje-Neuronen sind ein besonders relevantes Modell für diese Arbeit, da sie eine intrinsische Fähigkeit haben, repetitive, hochfrequente (20-100 Hz) Aktionspotentiale abzufeuern, und konsistent an der ASD-bedingten Dysfunktion des Kleinhirnschaltkreises beteiligt sind. Wir konzentrieren uns auf Tsc1, ein Gen, dessen Funktionsverlust-Mutationen zu den häufigsten monogenen Ursachen von ASD gehören. In Purkinje-Neuronen der Maus wurde die Tsc1-Deletion auch mit einer reduzierten spannungsgesteuerten Natriumkanalexpression (Nav) in Verbindung gebracht. Wir verwenden Markov-kinetische Zustandsmodelle, um die Nav-Leitfähigkeitseigenschaften von Purkinje-Neuronen zu simulieren und zu reproduzieren, und verwenden dann dynamische Clamps, um direkt zu beurteilen, wie sich Änderungen der Nav-Leitfähigkeit auf das intrinsische Feuern intakter zerebellärer Purkinje-Neuronen auswirken. Wir stellen Anleitungen und Ressourcen zum Modifizieren und Optimieren von Modellen der Ionenleitfähigkeit zur Verfügung. Durch die Integration von ionischer Leitfähigkeitsmodellierung, dynamischem Clamp und konventionellen Patch-Clamp-Techniken bietet dieser Ansatz einen leistungsstarken und flexiblen Rahmen für die Verknüpfung genetischer Störungen mit physiologischen Ergebnissen in ASD-relevanten Neuronen.

Einleitung

Frühere Untersuchungen zu den molekularen und zellulären Treibern der Autismus-Spektrum-Störung (ASS) betonten oft die synaptische Dysfunktion als zentral für die Pathophysiologie der Störung 1,2. Zahlreiche Studien haben eine erhöhte exzitatorische Synapsendichte 2,3,4, eine beeinträchtigte synaptische Beschneidung5 und Veränderungen der postsynaptischen Dichteproteine 6,7 in ASD-Modellen gezeigt. Neuere Arbeiten haben jedoch gezeigt, dass Veränderungen der intrinsischen neuronalen Erregbarkeit auch Treiber der ASD-Pathologie sind. Zum Beispiel haben transgene ASD-Mausmodelle und von Patienten stammende Zelllinien eine beeinträchtigte Generierung von Aktionspotenzial in zerebellären Purkinje 8,9,10 und kortikalen Pyramidenneuronen11 sowie eine abgeschwächte dendritische Erregbarkeit und synaptische Integration in Unterklassen kortikaler Pyramidenneuronen12 gezeigt. Kanalopathien mit Funktionsverlust-Mutationen in SCN2A, die für den spannungsgesteuerten Natriumkanal (Nav) Nav1.2 kodieren, der die porenbildende α-Untereinheit Nav1.2 bildet, ist heute eine bekannte monogene Ursache von ASD13 und es wurde gezeigt, dass sie Defizite in der intrinsischen Erregbarkeit verschiedener Klassen von zentralen Neuronen verursachen 14,15,16,17. Im Zuge des Fortschreitens dieser Art von Untersuchungen ist es wichtig, kausale Zusammenhänge zwischen pathogenen Veränderungen der Ionenleitfähigkeit und den Auswirkungen dieser Veränderungen auf die Funktion von Neuronen und Schaltkreisen herzustellen. Die Elektrophysiologie der dynamischen Klemme bietet einen effektiven Ansatz für diese Aufgabe. Sharp et al. (1992 und 1993)18,19 beschrieben zusammen mit Robinson und Kawai (1993)20 zunächst dynamische Clamp-Methoden, bei denen eine simulierte nichtlineare Ionenleitfähigkeit mit oder ohne spannungsabhängige Eigenschaften in lebende Neuronen injiziert/hinzugefügt wird, was es den Forschern ermöglicht, in Echtzeit zu beurteilen, wie sich die Eigenschaften oder mutmaßlichen Änderungen einer spannungsgesteuerten Ionenleitfähigkeit auf das neuronale Feuernauswirken 21. 22. Urheberrecht

Die Durchführung von dynamischen Klemmexperimenten wurde durch mehrere frei verfügbare Softwaresysteme wie RTXI23, QuB 24,25 und StdpC26 erleichtert; Jüngste Fortschritte haben jedoch die Implementierung dynamischer Klemmen mit kommerziellen Plug-and-Play-Systemen vereinfacht, die es ermöglichen, Modellleitwerte auf einem einzigen Computer und innerhalb eines einzigen Softwarepakets zu entwickeln, zu modifizieren und anzuwenden. Hier stellen wir Protokolle zur Durchführung eines dynamischen Clamps unter Verwendung eines Sutter dPatch-Systems27 zur Verfügung und stellen eine Beispieluntersuchung zur Verfügung, in der wir testen, wie die gezielte Deletion der tuberösen Sklerose 1 (Tsc1)9, die ein vorherrschender Mutationsort für ASD28 ist, das intrinsische Feuern von zerebellären Purkinje-Neuronen als Folge von Änderungen in der Expression der spannungsgesteuerten Natriumleitfähigkeit8 beeinflusst.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Protokollen durchgeführt, die von den Richtlinien des Miami University Institutional Animal Care and Use Committee (Protokoll #1044) genehmigt wurden. In den Experimenten wurden männliche und weibliche Wildtyp-Mäuse aus C57BL/6J und transgene Linien mit einem C57BL/6J-Stammhintergrund verwendet. Für elektrophysiologische Experimente wurden die Tiere im Alter von 6-7 Wochen behandelt. Alle Aufzeichnungen wurden von Purkinje-Neuronen in den Läppchen 5, 6 oder 7 im Kleinhirnvermis gemacht.

1. Aufbau und Gewebevorbereitung für Purkinje Neuron Patch-Clamp Experimente

  1. Bereiten Sie 1 l künstliche zerebrale Rückenmarksflüssigkeit (ACSF) vor, die Folgendes enthält: 125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 25 mM NaHCO3, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 und 25 mM Dextrose bei pH 7,4 (~300 mOsM/L). Bereiten Sie außerdem 250 mL "Schneidlösung" vor, die Folgendes enthält: 240 mM Saccharose, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 0,5 mM CaCl2 und 7 mM MgCl2. ACSF und Schneidlösungen mindestens 20 Minuten vor der Verwendung und kontinuierlich während aller Versuche mit Carbogengas (95 % O2 / 5 % CO2) besprühen.
  2. Bereiten Sie eine mit ACSF gefüllte Haltekammer für Gehirnschnitte für die spätere Verwendung vor. Stellen Sie sicher, dass die Kleinhirnschnitte (sobald sie in die Schnittkammer gegeben wurden) so untergetaucht werden, dass beide Seiten der Kleinhirnscheiben ACSF ausgesetzt sind. Erreichen Sie dies, indem Sie untergetauchte Scheiben auf ein straff gespanntes Nylonnetz legen, das ebenfalls untergetaucht ist.
  3. Bereiten Sie die OP-Station vor. Bereiten Sie vier Stücke Klebeband vor, mit denen das betäubte Tier festgesteckt wird. Legen Sie in einen mit Eis gefüllten Eimer oder eine Eispfanne die untere Hälfte einer Petrischale mit den Wänden nach unten und dem Boden der Petrischale nach oben in das Eis. Legen Sie ein Filterpapier (≥ 3 cm2) auf den Boden der Petrischale und tränken Sie es mit 2-3 mL Schneidlösung.
    HINWEIS: Für die beschriebenen Experimente wird ein Kompresstom-Vibratom verwendet, um 350 μM parasagittale Kleinhirnschnitte zu schneiden. Mit dem Kompresstom wird das Gewebe zum Schneiden auf ein Probenröhrchen aus Kunststoff geklebt, das durch ein umgebendes dünnes Metallrohr passt. Beim Schneiden wird das Probenrohr durch das Metallrohr geschoben, das fixiert bleibt. Nachdem das Gewebe mit dem Probenröhrchen verklebt wurde, wird das Gewebe in erwärmte 2%ige Agarose eingebettet. Die Klinge des Kompresstoms wird auf eine feste Halterung geklebt, die am Arm des Vibratoms befestigt ist. Andere Arten von Vibratomen erfordern keine Einbettung von Gewebe in erwärmte Agarose, sollten aber für die beschriebenen Experimente ähnlich gut funktionieren.
  4. Legen Sie außerdem eine einschneidige Rasierklinge und einen kleinen (10 ml) Becher, der mit Schneidlösung gefüllt ist, in das Eis. Bewahren Sie einen Kühlblock auf, mit dem die erwärmte Agarose schnell abgekühlt wird, sobald sie in das Probenröhrchen gegeben wird, sowie eine 30-ml-Spritze, die mit Schneidlösung gefüllt ist und auf dem Eis gekühlt wird. Stellen Sie sicher, dass die 30-ml-Spritze mit einem 30-60 cm langen intravenösen (IV) Schlauch (über einen Luer-Lock-Stecker) verbunden ist, der (am Abschlussende) mit einer Nadel (≥ 26 G) mit einer Luer-Lock-Buchse verbunden ist.
  5. Die restliche Schneidlösung in einen -80 °C heißen Gefrierschrank geben. Sobald diese Schneidlösung eine verschlammte Eiskonsistenz erreicht hat (20-25 min), aus dem -80 °C Gefrierschrank nehmen und auf Eis legen.
  6. Betäuben Sie eine 5-8 Wochen alte erwachsene Maus mit einer intraperitonealen Injektion von 1 ml/kg tierischem Gewicht Ketamin (10 mg/ml)/Xylazin (0,25 mg/ml) Cocktail.
  7. Stellen Sie eine 2%ige Agaroselösung her, indem Sie 0,5 g Agarose in 25 ml Schneidlösung auflösen. Nachdem das Tier betäubt wurde (reagiert nicht auf das Einklemmen der Zehen), erhitzen Sie die 2%ige Agaroselösung (~30 s in der Mikrowelle) und geben Sie die erwärmte Agaroselösung in ein 40 °C warmes Wasserbad.
    HINWEIS: Die Schritte mit den Nummern 1.8-1.18 müssen mit Dringlichkeit und vor dem Erstarren der erwärmten Agarose durchgeführt werden.
  8. Befestigen Sie die Gliedmaßen des Tieres mit Klebeband an der Operationsliege. Öffnen Sie mit einer Schere die Brusthöhle des Tieres und achten Sie darauf, dass die Lunge und die Bauchorgane nicht durchtrennt werden. Verwenden Sie eine Verriegelungszange oder einen Hämostaten, um den Brustkorb offen zu halten und das Herz freizulegen. Um dies zu erreichen, verriegeln Sie die Pinzette am Brustbein und legen Sie sie vorsichtig in Richtung des Vorderteils des Tieres (mit den Fingerlöchern des Werkzeugs neben dem Kopf des Tieres).
  9. Führen Sie die mit der 30-ml-Spritze verbundene Nadel in den linken Ventrikel ein und drücken Sie mit einer Pinzette das Gewebe um die Nadel herum zusammen, wobei Sie die Nadel in der linken intraventrikulären Kammer halten. Machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen kleinen Schnitt im rechten Vorhof und perfundieren Sie das Tier schnell mit den 25 ml gekühlter Schneidlösung.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Perfusat in den linken Ventrikel gelangt und aus dem rechten Vorhof austritt, wodurch das Blut aus dem Kreislaufsystem des Tieres entfernt wird.
  10. Wenn die Perfusion abgeschlossen ist, enthaupten Sie das Tier schnell und schneiden Sie die Kopfhaut entlang der Mittellinie des Kopfes in Richtung Bregma, um die Oberfläche des Schädels freizulegen.
  11. Entfernen Sie mit einer Schere das Bindegewebe aus dem hinteren Bereich des Schädels und entfernen Sie überschüssiges Rückenmarksgewebe, wobei Sie darauf achten, dass das Rückenmark nicht aus dem Foramen magnum herausragt.
  12. Platzieren Sie eine Scherenklinge in das Foramen magnum und schneiden Sie entlang des Schädelumfangs auf beiden Schläfenseiten in Richtung Bregma, wobei Sie etwas Schädelgewebe an Ort und Stelle an der Bregma belassen.
  13. Legen Sie eine Scherenklinge oder eine Hälfte einer feinen Pinzette in das Foramen magnum und heben Sie sie nach oben, um den Schädel vom Gehirn zu trennen. Achte darauf, dass du die Scherenklinge oder Pinzette nicht in das Gehirn schiebst, während du den Schädel anhebst.
  14. Verwenden Sie einen chirurgischen Spatel, um unter das Gehirn zu schaufeln (von vorne) und entfernen Sie das Gehirn vorsichtig in das 10-ml-Becherglas mit gekühlter Schneidlösung, wobei Sie darauf achten, das Kleinhirn zu schützen, während das Gehirn übertragen wird. Ziehen Sie zu diesem Zeitpunkt saubere Handschuhe an.
  15. Nehmen Sie das Gehirn vorsichtig aus dem Becherglas (mit dem Spachtelwerkzeug) und legen Sie es auf das Filterpapier (auf eine Petrischale). Schneiden Sie mit der einschneidigen Klinge entlang der parasagittalen Achse einige Millimeter von der Mittellinie entfernt. Entsorgen Sie das kleinere parasagittale Schnittgewebe. Machen Sie einen zweiten koronalen Schnitt in der Mitte des Vorderhirns (vor dem Kleinhirn). Entsorgen Sie das koronal geschnittene Gewebe, das sich vor dem Kleinhirn befindet.
  16. Schieben Sie die einschneidige Klinge unter den vorderen Teil des Vorderhirns und heben Sie sie an, um das restliche Gewebe so zu drehen, dass die Seite des anfänglichen parasagittalen Schnitts nach unten (auf dem Filterpapier) und die ungeschnittene Kleinhirnhalbkugel nach oben zeigt.
  17. Legen Sie das Probenröhrchen aufrecht in das Eis und tragen Sie eine dünne Schicht Sekundenkleber (Cyanacrylatkleber) auf die Röhrchenoberfläche auf. Übertragen Sie das Hirngewebe mit einem Spachtelwerkzeug mit einer 90°-Biegung vorsichtig vom Filterpapier auf die Oberfläche des Probenröhrchens, wobei die Ausrichtung des Gewebes beibehalten wird. Achten Sie darauf, dass die ungeschnittene Kleinhirnhälfte weiterhin nach oben zeigt. Sobald das Gewebe auf das Probenröhrchen gelegt/geklebt ist, schieben Sie das Metallrohr nach oben, so dass es das Hirngewebe umgibt.
  18. Füllen Sie das Probenröhrchen mit einer motorisierten 10-ml-Pipette mit der erwärmten Agarose (Einbettung des Hirngewebes). Kühlen Sie das Gewebe (jetzt in erwärmte Agarose eingebettet) schnell ab, indem Sie den Kühlblock für ~30 s um das Metallrohr klemmen.
  19. Legen Sie das Probenröhrchen in die Vibrationsbadkammer und füllen Sie das Bad mit der geschlummten Schneidlösung. Sprühen Sie die Schneidlösung während des Schneidens von Hirngewebe kontinuierlich an, aber setzen Sie die Kleinhirnscheiben nicht direkt Gasblasen aus.
  20. Schneiden Sie 300-350 μm parasagittale Scheiben und geben Sie jede Scheibe sofort in die Scheibenhaltekammer, die mit ACSF bei Raumtemperatur gefüllt ist. Sobald sich alle Scheiben in der Scheibenkammer befinden, inkubieren Sie die Scheibenkammer in einem 33 °C warmen Wasserbad für 25 Minuten.
  21. Nach 25 Minuten im Wasserbad stellen Sie die Schnittkammer (wieder) auf Raumtemperatur und warten Sie mindestens weitere 35 Minuten, bevor Sie versuchen, Patch-Aufnahmen von einem der Kleinhirnschnitte zu machen.

2. Konfigurieren eines Markov-basierten Leitwertmodells in der dynamischen Klemme

HINWEIS: Dynamic Clamp ist die Echtzeitanwendung eines modellierten Leitwerts auf eine lebende Zelle. Die Membranspannung wird über eine Sharp- oder Patch-Elektrode aufgezeichnet/abgetastet, und das digitalisierte Signal wird an die dynamische Clamp-Software gesendet, die unter Verwendung der angewendeten Ionenleitfähigkeitsmodelle die geeignete dynamische Clamp-Strominjektion für die abgetastete Spannung berechnet. Das berechnete dynamische Clamp-Strom-Injektionssignal wird an den Verstärker und den Kopftisch gesendet, um (über eine Elektrode) in die Zelle injiziert zu werden. Damit eine modellierte Leitfähigkeit angemessen zu einer Zelle hinzugefügt werden kann, die Aktionspotentiale abfeuert, die schnelle transiente Änderungen der Membranspannung antreiben, muss die Spannungsabtastfrequenz hoch genug sein, und die Verzögerung zwischen der Spannungsabtastung und der dynamischen Klemmstrominjektion (manchmal auch als Latenz bezeichnet) sollte minimal und invariantsein 29.

  1. Entwickeln oder beschaffen Sie vor jedem dynamischen Clamp-Experiment das mathematische Modell für die Ionenleitfähigkeit(en), die im dynamischen Clamp-Experiment verwendet werden sollen. Diese Modelle können in Form eines Markov-Modells des kinetischen Zustands, eines Hodgkin-Huxley-Modells (HH) oder eines passiven (linearen) Leitwerts vorliegen. Stellen Sie sicher, dass das ausgewählte Leitfähigkeitsmodell die kinetischen und spannungsabhängigen Eigenschaften der beabsichtigten Ionenleitfähigkeit genau reproduziert.
    HINWEIS: Experimentatoren können die Eigenschaften einer modellierten Ionenleitfähigkeit vor der Verwendung in dynamischen Clamp-Experimenten bestätigen, indem sie die modellierte Leitfähigkeit (in silico) in Voltage-Clamp-Simulationsstudien testen. Wichtige Eigenschaften und Überlegungen von Markov-Modellen für den kinetischen Zustand und die HH-Leitfähigkeit werden im Abschnitt Diskussion beschrieben. Die folgenden Schritte beschreiben das Einrichten eines Markov-Leitwertmodells in der Software für dynamische Klemmen.
  2. Erstellen oder Abrufen eines Markov-Zustandsübergangsdiagramms für das Leitwertmodell, das in dynamischen Klemmexperimenten verwendet werden soll. Verwenden Sie dieses Diagramm, um das Markov-Leitwertmodell in der Software für dynamische Klemmen (siehe unten) genau zusammenzustellen.
    HINWEIS: SutterPatch ist die Datenerfassungssoftware für dPatch-Verstärker. Innerhalb der Software können dynamische Clamp-Experimente durchgeführt werden, die die Assemblierung und Anwendung modellierter Leitwerte über Strominjektion während der Stromzangenprotokolle ermöglichen. Ein Markov-Zustandsübergangsdiagramm für eine modellierte spannungsgesteuerte Natriumleitfähigkeit, basierend auf Nav-Strommessungen von Purkinje-Neuronen der Maus, ist in Abbildung 1A dargestellt. Dieses Modell wurde von Ransdell et al., 202230 entwickelt und wurde verwendet, um die Rolle der persistenten und wiederauflebenden Natriumstromkomponenten beim Feuern von Purkinje-Neuronen zu untersuchen31. Die Gating-Zustände (C, IC, IF, IS und O) sind durch Übergangsratenkonstanten miteinander verbunden, die durch Variablen (d. h. S0, S3, S1, S4) gekennzeichnet sind. Dieses Modell wird in den repräsentativen dynamischen Klemmenexperimenten verwendet und steht auf GitHub zum Download zur Verfügung: https://github.com/morenomdphd/Resurgent_INa.
  3. Öffnen Sie in der Datenerfassungssoftware das Fenster Dynamic Clamp Editor über die Registerkarte SutterPatch > Dynamic Clamp Editor oder klicken Sie auf das entsprechende Symbol im Dashboard-Fenster . Teile des Fensters des dynamischen Klemmeneditors sind in Abbildung 1B dargestellt.
    HINWEIS: Das Fenster "Dynamischer Zangeneditor" enthält alle erforderlichen Einstellungen, um den modellierten Leitwert während eines Stromzangen-Aufzeichnungsprotokolls anzuwenden. Die Leitfähigkeitspool-Schnittstelle (Abbildung 1B, oben links) ermöglicht es Benutzern, Gruppen von Modellleitwerten zu organisieren und gleichzeitig zu laden.
  4. Erstellen Sie in der Benutzeroberfläche "Conductance Pool" (Abbildung 1B, oben links) einen Pool, indem Sie auf Neu klicken und ihn wie gewünscht benennen. Sobald ein Leitwertpool ausgewählt ist, wählen Sie auf der rechten Seite des Fensters in der Kopfstufen-Auswahloberfläche (Abbildung 1B, unten links) den Modelltyp für den jeweiligen Leitwertpool aus (Modell Markov, Hodgkin-Huxley, variable Leitfähigkeit usw.) und wann die Modellleitfähigkeit(en) angewendet werden sollen, z. B. während einer Routine/eines Protokolls (aktiver Modus). Über die Kopfstufen-Wahlschnittstelle können auch die Aktualisierungsrate der dynamischen Zangen (in kHz) und der Spannungssignalquelle ausgewählt werden (siehe Abbildung 1B, rechts). Wählen Sie für Spannungssignalquelle den Kopftisch aus, der das Spannungssignal aufzeichnet.
  5. Wählen Sie in der Auswahlleiste "Kopfstufe" für das Beispiel für das Markov-Modell "Navigationsleitwert" (Abbildung 1A) die Option "Markov-Modell für Modell", "Während Sweeps" für den aktiven Modus, "200 kHz" für "Aktualisierungsrate" und "Kopfstufe 1" für "Spannungssignalquelle" aus. Aktivieren Sie die Option Apply and Command Signal to AuxOUT1, um Modellberechnungen als Reaktion auf das Spannungssignal zu initiieren und allen Current-Clamp-Protokollen eine dynamische Clamp-Strominjektion hinzuzufügen (Abbildung 1B, unten links).
  6. Unterhalb der Hauptfelder des Dynamic Clamp Editors befindet sich die Zustandsmatrix (Abbildung 1C, unten). Bearbeiten Sie die Statusmatrix, indem Sie zuerst in der Kopfstufen-Auswahlschnittstelle auf Modellparameter bearbeiten klicken (Abbildung 1B, unten links). Neben dem Editor wird ein neues Fenster mit dem Namen Dynamic Clamp Markov-Modellparameter angezeigt. Geben Sie in diesem Bereich die Gleichungen der Zustandsmatrix ein, die die Leitfähigkeit des Markov-Modells darstellen.
  7. Wählen Sie im Bereich "Kanaleinstellungen " (Abbildung 1B, oben rechts) aus, welche gespeicherten Leitwertmodelle angewendet werden sollen (in der dynamischen Klemmung). Alternativ können Sie einen leeren Kanal auswählen und mit der Erstellung eines neuen Modell-Leitwerts beginnen. Geben Sie auf der rechten Seite dieses Fensters die V-Umkehr ein (modelliertes Leitfähigkeits-Ionen-Umkehrpotential). Für unsere Studie mit einem Natriumleitwert geben Sie 55,0 mV ein, um das Umkehrpotenzial von Natrium basierend auf dem ACSF und der internen Lösung der Patch-Elektrode widerzuspiegeln.
  8. Geben Sie auch im Bedienfeld "Kanaleinstellungen " die Anzahl der kinetischen Zustände des ausgewählten Leitwerts an (siehe Abbildung 1B, oben rechts, rotes Feld). Geben Sie hier 9 ein, um die 9 kinetischen Zustände der modellierten Leitfähigkeit widerzuspiegeln (siehe Abbildung 1A).
  9. Unterhalb des Bedienfelds "Kanaleinstellungen" befindet sich das Bedienfeld "Zustandsgleichungen ". Platzieren Sie die Gleichungen für die Konstanten der Zustandsübergangsrate entsprechend in der Gating-Zustandsmatrix , um die topologische Anordnung des Markov-Modells widerzuspiegeln. Geben Sie die Gleichungen in das Feld "Zustandsgleichungen " ein und geben Sie eine ID ein, beginnend bei "S0" (Abbildung 1B, Mitte).
    HINWEIS: Die Reihenfolge, in der diese Gleichungen eingegeben werden, ist nicht wichtig, solange diese Variablen in der Gating-Zustandsmatrix entsprechend ausgefüllt sind, um die Topologie des Markov-Modells widerzuspiegeln.
  10. Um die Gating-Zustandsmatrix mit den jetzt definierten Geschwindigkeitskonstantenvariablen zu füllen, klicken Sie auf der rechten Seite des Zustandsgleichungen-Panels auf Edit State Matrix (Abbildung 1B, Mitte). Jedem kinetischen Zustand wird eine Zahl zugewiesen, die bei 0 beginnt. Für ein zweikinetisches Zustandsmodell, das die Zustände X und Y enthält, werden diese Zustände z. B. als "0" und "1" bezeichnet und enthalten zwei Übergangsratenkonstanten a1 und b1, wobei a1 von 0 zu 1 und b1 von 1 zu 0 übergeht.
  11. Um diese Gleichungen mit dem Zustandsmatrix-Editor (Abbildung 1B, unten) richtig zu verbinden, geben Sie die Geschwindigkeitskonstanten in eine Tabelle ein, die nummerierte Zeilen und Spalten enthält, die beide bei 0 beginnen (siehe Beispiel in Abbildung 1C).
    HINWEIS: Die Bewegung von einem Zustand in einen anderen wird durch ihre Position in dieser Tabelle in der Form "Zeile zu Spalte" bestimmt. Im Beispiel eines Zwei-Zustands-Modells in Schritt 2.1 basiert der Übergang von Zustand 0 zu Zustand 1 beispielsweise auf der Ratenkonstante "a1", die dann in Zeile 0, Spalte 1 platziert wird. Die Übergangsratenkonstante "b1" steuert Übergänge von Zustand 1 zu Zustand 0, daher sollte die Geschwindigkeitskonstante in Zeile 1, Spalte 0 platziert werden. In Abbildung 1C weist die Beispiel-Gating-Zustandsmatrix Ratenkonstanten auf, die die Topologie des in Abbildung 1A gezeigten Nav-Leitfähigkeitsmodells widerspiegeln. Zum Beispiel ist "S0" die Geschwindigkeitskonstante, die Übergänge vom kinetischen Zustand IC1 in den IC2 definiert. daher wird "S0" in Zeile 0, Spalte 1 der Gating-State-Matrix platziert (Abbildung 1C). Die Gleichungen für die Übergangsratenkonstante, die die Variablen der einzelnen Geschwindigkeitskonstanten definieren, füllen dann eine gefüllte Zustandsmatrix (Abbildung 1C, unten).
  12. Wenn die Gleichungen mit der Geschwindigkeitskonstante über den Bereich des Zustandsmatrix-Editors verbunden werden, werden die Verbindungen (die entsprechende Zeile und Spalte) in den Bereich Verbindungen neben der Gleichung eingefügt (Abbildung 1B, Mitte rechts). Beachten Sie den offenen/leitenden Zustand im repräsentativen Natriumleitwertmodell (Abbildung 1A), der in Zeile und Spalte 7 von Abbildung 1C (oben, rote Kästchen) hinzugefügt wurde und für den nächsten Schritt wichtig ist.
  13. Verwenden Sie in Abbildung 1B (unten rechts) das Feld Leitwertgleichungen (nS), um die Amplitude des Modellleitwerts zu definieren, der während der dynamischen Klemmung angewendet wird. Wählen Sie die offenen/leitenden Zustände im Markov-Modell aus, und geben Sie einen Leitwertwert an (Abbildung 1B, unten, roter Rahmen).
  14. Geben Sie für dieses Experiment "400 nS" in das Feld "G7" ein, wodurch Spitzenwerte für den Nav-Strom hinzugefügt werden, die den Spitzen-Nav-Strömen ähneln, die in Voltage-Clamp-Studien an Purkinje-Neuronen der Maus gemessen wurden.
  15. Wenn die obigen Schritte abgeschlossen sind, klicken Sie auf Laden , um das Modell für die dynamische Zangenanwendung vorzubereiten, sobald eine Stromzangenroutine initiiert wurde.
  16. Verwenden Sie einen ähnlichen Prozess, um HH-Modelle anzuordnen. Fügen Sie jedoch Gleichungen hinzu, um unabhängige Gating-Zustände (in Gate-Gleichungen) und den Leitwert unter G-Maximum zu definieren.
  17. Um den dynamischen Clamp-Leitwert anzuwenden, erstellen Sie zunächst eine Stromzangenroutine mit dem Routine-Editor (klicken Sie auf die Registerkarte SutterPatch > Routine Editor) (Abbildung 1D). Um eine Stromzangenroutine zu erstellen, wählen Sie den übergeordneten Ausgangskanal aus (in diesem Beispiel StimOut1). Dadurch wird ein Fenster geöffnet, in dem der Benutzer die Ausgabe des aktuellen Befehls während der Routine definieren kann. Stellen Sie sicher, dass der Aufzeichnungsmodus im Routineneditor auf CC_Mode eingestellt ist.
    HINWEIS: Da dieses Protokoll mit spontan feuernden Zellen arbeitet, wird in den repräsentativen Experimenten eine lückenlose Stromklemmen-Routine/Protokoll verwendet, die keine Strominjektion hat.
  18. Definieren Sie im Routine-Editor für Eingabekanäle (Abbildung 1D, oben rechts) Eingangssignale, die während der Experimente die Fenster für den aufgezeichneten Oszilloskop füllen. Diese Eingänge müssen ein Spannungssignal enthalten und umfassen auch die Befehlsstrominjektion der Routine sowie die dynamische Zangenstrominjektion, die als Current1 bzw. AuxIN1 bezeichnet werden (Abbildung 1D, unten links).
  19. Bei Stromzangen-Routinen, die positive und/oder negative Stromeinspeisungsbefehle beinhalten, wird das Befehlsstromeinspeisungssignal automatisch mit dem dynamischen Zangstromsignal kombiniert. Erstellen Sie ein virtuelles Oszilloskopfenster, um das Befehlsstromsignal zu subtrahieren, sodass eine Aufzeichnung der isolierten dynamischen Klemmstromeinspeisung vorhanden ist. Um das neue Fenster für den virtuellen Bereich zu erstellen, wählen Sie zunächst einen zusätzlichen Eingangskanal aus, indem Sie das Kontrollkästchen Virtual1 aktivieren.
  20. Wählen Sie im Routinen-Editor unter Mathematischer Typ die Option Gleichung aus, und wählen Sie (unter Quellkanal) das Befehlseingabesignal der Stromzangenroutine aus, das in diesem Beispiel Current1 ist. Geben Sie eine Gleichung in das offene Feld ein, um das Stromzangen-Befehlssignal vom dynamischen Zang-Strominjektionssignal zu subtrahieren.
    HINWEIS: Für dieses Beispielexperiment wird dies mit der Gleichung t[3]-t[2] durchgeführt. Im Oszilloskopfenster Virtual1 wird nun die dynamische Clamp-Strominjektion (isoliert vom Strombefehlssignal) angezeigt. Benutzer haben die Möglichkeit, die Beschriftungen von Eingabe- oder Ausgabekanälen anzupassen, indem sie unter Beschriftung doppelklicken.

3. Erfassung von Stromklemmen-Aufzeichnungen von Purkinje-Neuronen der Maus in parasagittalen Kleinhirnschnitten

  1. Statten Sie das Elektrophysiologie-Rig mit einer Gewebeschnittkammer aus, die (Schwerkraft) mit ACSF durchblutet ist, das auf eine physiologische Temperatur (34-36 °C) erwärmt wurde. Platzieren Sie vorsichtig eine parasagittale Kleinhirnscheibe in der Schnittkammer und halten Sie die Kleinhirnscheibe mit einer Scheibenharfe in einer untergetauchten und fixierten Position. Stellen Sie sicher, dass eine chloridisierte Erdungselektrode und eine Temperatursonde ebenfalls in die Kleinhirnschnittkammer eingetaucht und stabil sind.
  2. Lokalisieren Sie die Purkinje-Neuronenschicht mit einem 40-fachen Immersionsobjektiv. Purkinje-Neuronen sind groß und tropfenförmig. Die Plasmamembran gesunder Purkinje-Zellen erscheint typischerweise glatt, und der Zellkern ist nicht sichtbar.
  3. Sobald ein gesundes Purkinje-Neuron identifiziert und für die Patch-Clamp-Aufzeichnung vorgesehen ist, richten Sie die Objektivlinse des Mikroskops nach oben. Positionieren und fokussieren Sie auf die Spitze einer Glasmikroelektrode, die an einem Elektrodenhalter und einem Kopftisch befestigt ist. Steuern Sie den Kopftisch/die Mikroelektrode durch einen 3-Achsen-Roboter-Mikromanipulator.
    HINWEIS: Stellen Sie für diese Experimente sicher, dass die Mikroelektroden Widerstandswerte von 2-4 MΩ haben und mit einer geeigneten internen Lösung der Stromzange gefüllt sind. Die in repräsentativen Experimenten verwendete interne Lösung enthält: 144 mM K-Gluconat, 0,2 mM EGTA, 3 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 8 mM NaCl, 4 mM Mg-ATP und 0,5 mM Na-GTP.
  4. Bevor Sie sich dem Ziel-Purkinje-Neuron nähern, fügen Sie 2-3 ml positiven Luftdruck in den Druckanschluss des Elektrodenhalters hinzu.
  5. Wechseln Sie auf dem Bedienfeld des Verstärkers in den VC-Modus und wenden Sie die Elektrodenkompensations- und Elektrodenspannungsversatzfunktionen an. Klicken Sie dazu im Beispiel auf Auto neben den Optionen für Elektrodenkompensation und Spannungsversatz.
  6. Starten Sie ein kontinuierliches Prüfprotokoll für die Membrandichtung (klicken Sie auf Membrantest). Stellen Sie die Membrantestparameter auf (oder nahe) 5 ms Sweeps mit einem 5-mV- oder 10-mV-Schritt ein. Stellen Sie das Haltepotenzial (V-Halten) auf 0 mV ein.
  7. Bewegen Sie die Mikroelektrode in Richtung der Zielzelle, und stellen Sie die Fokusebene so ein, dass der Fokus auf oder leicht unter der Spitze der Elektrode gehalten wird. Positionieren Sie die Elektrode etwas über der Plasmamembran der Zielzelle. Verwenden Sie den Mikromanipulator und den positiven Druck von der Elektrodenspitze, um extrazelluläre Ablagerungen vom Zielzellsoma wegzudrücken und die Oberflächenmembran zu "reinigen".
  8. Nachdem die Zielzelle von extrazellulären Trümmern befreit ist, positionieren Sie die Elektrode langsam in der Nähe der Oberfläche der Membran am breiten Ende des Purkinje-Neuronen-Somas, von dem aus sich das Axon vom Zellkörper aus erstreckt. Wenn die Elektrodenspitze auf die Membran abgesenkt wird, wird wahrscheinlich ein Grübchen auf der Membranoberfläche sichtbar (aufgrund des Überdrucks der Elektrode). Lassen Sie an dieser Stelle den Überdruck ab und verwenden Sie den Mundsauger, um eine kleine Menge Unterdruck auszuüben.
  9. Ändern Sie in der Verstärkersteuerung das V-Haltepotenzial auf -80 mV (von 0 mV). Überwachen Sie den Membrandichtungstest, wenn der Pipettenwiderstand ≥ 1 GΩ erreicht, erhöhen Sie den Unterdruck und klicken Sie auf die Zap-Funktion auf dem Membrandichtungstestpanel, um die Membran zu brechen und eine Ganzzell-Patch-Clamp-Konfiguration zu erreichen.
  10. Verwenden Sie ein kurzes Voltage-Clamp-Protokoll, um die passiven Eigenschaften der Membran (Kapazitäts- und Eingangswiderstandswerte) zu messen, bevor Sie über das Bedienfeld des Verstärkers in den Stromzangenmodus wechseln.
  11. Nach dem Umschalten in den Stromzangenmodus wird eine Brückenausgleichskompensation von ≥ 70 % angewendet.
  12. Korrigieren Sie vor dem Anlegen einer dynamischen Klemmleitfähigkeit mit einer Patch-Elektrode den Sperrschichtpotentialfehler (der auf der Grundlage der Zusammensetzung der internen Elektrode und der ACSF-Lösungen berechnet wird). Für die Lösungen in den repräsentativen Experimenten wird eine Sperrschichtpotentialkorrektur von 17,5 mV angewendet. In dynamischen Clamp-Studien ist eine genaue Sperrschichtpotentialkorrektur von entscheidender Bedeutung, damit ein genaues Spannungssignal von Leitfähigkeitsmodellen zur Berechnung dynamischer Clamp-Strominjektionen verwendet wird.

4. Anwenden des dynamischen Klemmleitwerts

  1. Da Purkinje-Neuronen sich wiederholende Aktionspotentiale spontan abfeuern, zeichnen Sie die Feuereigenschaften auf, bevor Sie eine modellierte Ionenleitfähigkeit hinzufügen (oder subtrahieren), um die Zellgesundheit zu testen und die Basiseigenschaften der Membranerregbarkeit zu messen. Wenden Sie den modellierten Leitwert an, indem Sie im Einstellungsfenster für dynamische Klemme auf Laden klicken. Auf dem dPatch-Controller ist nun ein kleines DynC-Label sichtbar, das CC überlagert (siehe Abbildung 1D, rote Kästchen).
  2. Nach dem Einschalten/Laden der dynamischen Zangenzange wird der Leitwert der dynamischen Zange automatisch angewendet, während eine Stromzangenroutine/ein Protokoll aktiv ist. Zeigen Sie die dynamische Klemmstrominjektion im Oszilloskopfenster an, das dem ausgewählten Eingangssignal von AuxIN1 entspricht.
    HINWEIS: Abwechselnde Aufzeichnungen von spontanem Feuern mit und ohne Anwendung von dynamischen, klemmenvermittelten Leitwerten sind wichtig, um zu bestimmen, wie sich die angewendete Modellleitfähigkeit auf die Erregbarkeit auswirkt, und um festzustellen, ob die Ausgangswerte der Erregbarkeit während des gesamten Experiments stabil/konsistent sind.

Ergebnisse

In den vorgestellten Experimenten wenden wir mit Hilfe einer dynamischen Klemme eine modellierte spannungsgesteuerte Natriumleitfähigkeit (Nav) auf adulte (6-7 Wochen alte) zerebelläre Purkinje-Neuronen der Maus an, die in einer parasagittalen Kleinhirnschnittpräparation akut isoliert sind. Die Studien werden an Wildtyp-Mäusen (Kontrollmäusen) und transgenen Mäusen durchgeführt, bei denen die Cre-loxP-Rekombination verwendet wird, um die tuberöse Sklerose 1 (Tsc1) selektiv aus zerebellären Purkinje-Neuronen zu entfernen. Der tuberöse Sklerose-Komplex (TSC) ist eine Multisystemerkrankung, die durch Funktionsverlustmutationen in TSC1 oder TSC2 verursacht wird 32,28,33. Bei Personen mit TSC werden häufig Epilepsiestörungen, kognitive Beeinträchtigungen und Autismus-Spektrum-Störungen diagnostiziert 34,35. Mäuse mit Purkinje-Neuronen-spezifischer Tsc1-Deletion, die hier als Tsc1 mut/mut bezeichnet wird, zeigen mehrere ASD-bezogene Verhaltensphänotypen, einschließlich Beeinträchtigungen der Motorik, des sozialen Interaktionsverhaltens und der Lautäußerungen sowie übertriebener repetitiver Verhaltensweisen 9,36. Tsc1mut/mut Es wurde auch gezeigt, dass Purkinje-Neuronen ein abgeschwächtes Feuern des Aktionspotentials aufweisen (Abbildung 2A,B), was mit signifikant reduzierten Nav-Stromamplituden (Abbildung 2C) und Nav-Kanalexpression an den Axon-Anfangssegmenten der Tsc1mut/mut Purkinje-Neuronen zusammenhängt8. Nav-Ströme inTsc1mut/mut Purkinje-Neuronen haben ähnliche kinetische und spannungsabhängige Eigenschaften wie Wildtyp-Purkinje-Neuronen8. In diesem transgenen Tsc1-Mut/Mut-Mausmodell haben wir mit dynamischer Klemmung getestet, ob das Hinzufügen von Nav-Leitfähigkeit zu Tsc1-Mut/Mut-Purkinje-Neuronen wiederholtes Feuern verhindern kann. Wir testen weiterhin, ob die Subtraktion der Nav-Leitfähigkeit in Purkinje-Neuronen des Wildtyps eine ähnliche Abschwächung des Feuerns von Purkinje-Neuronen verursacht, wie sie in Tsc1-Mut/Mut-Purkinje-Neuronen gemessen wird (Abbildung 2B). Um den nativ ausgedrückten Nav-Leitwert zu subtrahieren, haben wir den Nav-Leitwert mit dynamischer Klemme angewendet. Die Polarität des Leitwerts ist jedoch umgekehrt.

Das kinetische Markov-Zustandsmodell (Abbildung 1A), das zur Simulation der Nav-Leitfähigkeit des Purkinje-Neurons verwendet wird, enthält neun kinetische Zustände, von denen acht nicht leitend sind und als geschlossen (C1, C2 und C3), inaktiviert-geschlossen (IC1 und IC2), schnell inaktiviert (IF1 und IF2) und langsam inaktiviert (IS) gekennzeichnet sind. Es gibt einen offenen/leitenden (O) kinetischen Zustand30,31. Übergangsratenkonstanten, die zwischen den beschrifteten kinetischen Zuständen dargestellt sind (Abbildung 1A), bestimmen den Anteil der simulierten Kanäle/Leitfähigkeiten, die jeden kinetischen Zustand einnehmen. Die Membranspannung wirkt sich auf jede der Geschwindigkeitskonstanten des Modells aus. Simulierte Nav-Ströme, die von diesem Modell (in silico) in simulierten Voltage-Clamp-Experimenten erzeugt wurden, sind rechts von Nav-Strömen, die von akut isolierten Purkinje-Neuronen gemessen wurden, (in rot) dargestellt, die schwarz dargestellt sind (Abbildung 1A, unten). Der Spannungsbefehl, der diese simulierten (rot) und Purkinje-Neuronen- (schwarz) Nav-Ströme hervorruft, ist über den Stromspuren in Schwarz dargestellt. Beachten Sie, dass im voltage-Befehl ein anfänglicher Depolarisationsschritt (auf 0 mV) zu einem schnell transienten nach innen gerichteten Natriumstrom führt, der in der simulierten Kurve Kanäle reflektiert, die aus dem nichtleitenden geschlossenen Zustand in den offenen kinetischen Zustand übergehen, wodurch ein kurzer nach innen gerichteter Strom möglich ist, bevor sich Kanäle im offenen Zustand in den schnellen inaktivierten (IF1 und IF2) kinetischen Zuständen ansammeln. Dieser depolarisierende Spannungsschritt ist kurz (5 ms) und das Membranpotential wird anschließend auf eine repolarisierte Zwischenspannung von -45 mV abgestuft, bei der das Potential für 80 ms gehalten wird (Abbildung 1A, unten). Während dieses Repolarisationsspannungsschritts ist bemerkenswert, dass es zu einem Wiederaufleben des nach innen gerichteten Natriumstroms kommt, einer Stromkomponente, die als wiederauflebender Natriumstrom (INaR) bezeichnet wird. Während dieses 80-ms-Schritts auf -45 mV zeigt INaR einen langsamen (im Vergleich zu INaT) Abfall der Amplitude und erreicht schließlich einen stationären Zustand des nach innen gerichteten Stroms, der die persistente Nav-Stromkomponente (INaP) ist. Die Aktivierung des modellierten INaR (Abbildung 1A, unten, rot) während der Membranrepolarisation spiegelt simulierte Kanäle wider, die sich von den schnell inaktivierten (IF1 + IF2) kinetischen Zuständen in den offenen/leitenden Zustand erholen. Im Laufe der Zeit (bei -45mV) akkumuliert sich ein Teil der simulierten Kanäle, die den offenen Zustand einnehmen, zu einem absorbierenden, langsam inaktivierten (IS) kinetischen Zustand, der als I-NaR-Zerfall reflektiert wird, und ein Teil dieser Kanäle verbleibt im offenen/leitenden Zustand, reflektiert als stationäreI-NaP-Stromkomponente 30,31.

In den repräsentativen Experimenten/Ergebnissen wurde das Nav Markov-Leitfähigkeitsmodell (Abbildung 1A) zu adulten Purkinje-Neuronen in akut isolierten Kleinhirnschnitten hinzugefügt. Eine Cartoon-Darstellung dieses Versuchsaufbaus ist in Abbildung 3A dargestellt. Um die modellierte Nav-Leitfähigkeit über dynamische Clamp-Strominjektion anzuwenden, haben wir das dPatch-Verstärkersystem (siehe Abbildung 3B) verwendet, das über eine vollständig integrierte Analog-Digital- (A/D) und Digital-Analog-Wandlung (D/A) verfügt. Dieses System verarbeitet auch Signaltransformationen über integrierte ARM-Kernprozessoren (außerhalb des PCs) und verfügt über eine integrierte FPGA-Schaltung (Field-Programmable Array), die eine nahezu sofortige Verarbeitung von Eingangssignalen und eine Rückmeldung (Senden von Ausgangssignalen) an die stromeinspeisende Elektrode27 ermöglicht. Die Experimente hier beinhalteten die Anwendung (in dynamischer Klemmung) eines komplexen Markov-Leitfähigkeitsmodells, das wir mit aktuellen Injektionsaktualisierungsraten von bis zu 500 kHz anwenden konnten.

Die Zugabe der simulierten Nav-Leitfähigkeit (400 nS) zu Tsc1mut/mut Purkinje-Neuronen während lückenloser Stromklemmen-Aufzeichnungen führte zu einem deutlichen Anstieg der repetitiven Feuerfrequenzen der Zellen (Abbildung 3C1, D1), was darauf hindeutet, dass die Hinzufügung der Nav-Leitfähigkeit in diesen Zellen ausreichen könnte, um Defizite in der Erregbarkeit von Tsc1 mut/mut Purkinje-Neuronen zu beheben, obwohl wir nicht das gesamte Repertoire an Defiziten untersucht haben, die in Tsc1mut/mut berichtet wurden Erregbarkeit des Purkinje-Neurons8. Wie aus den repräsentativen Spuren in Abbildung 3C2 (oben) ersichtlich ist, haben Wildtyp-Purkinje-Neuronen eine intrinsische Fähigkeit, repetitive Aktionspotentiale bei hohen Frequenzen abzufeuern. Mit Hilfe der dynamischen Klemme subtrahierten wir die modellierte Nav-Leitfähigkeit von Wildtyp-Purkinje-Neuronen, indem wir die modellierte Nav-Leitfähigkeit mit einer umgekehrten (negativen) Polarität (-400 nS) anwendeten. Die Subtraktion der modellierten Nav-Leitfähigkeit führte zu einer sofortigen und offensichtlichen Verringerung des wiederholten Feuerns (Abbildung 3C2, unten), was auch mit der Hypothese übereinstimmt, dass reduzierte Nav-Ströme, die in Tsc1mut/mut Purkinje-Neuronen gemessen wurden, zu den in diesen Zellen gemessenen abgeschwächten Feuerungseigenschaften beitragen8. Bei mehreren Tsc1-Mut/Mut- oder Wildtyp-Purkinje-Neuronen führten diese dynamischen Clamp-Experimente, bei denen die Nav-Leitfähigkeit addiert bzw. subtrahiert wurde, zu konsistenten Effekten auf die Feuerfrequenz. Die Hinzufügung der Nav-Leitfähigkeit (P = 0,029) erhöhte die Tsc1 mut/mut Purkinje-Neuronen-Feuerfrequenz signifikant (Abbildung 3D1), und in Wildtyp-Purkinje-Neuronen reduzierte die Subtraktion der Nav-Leitfähigkeit signifikant (P = 0,031) die Feuerfrequenz (Abbildung 3D2) (gepaarter t-Test des Studenten).

figure-results-1
Abbildung 1: Einrichten eines Markov-Modells in einer Software für dynamische Klemmen. (A) Ein Markov-Zustandsübergangsdiagramm wird für ein Modell gezeigt, das die in zerebellären Purkinje-Neuronen der Maus gemessenen Nav-Leitfähigkeitseigenschaften30 reproduziert. Dieses Modell umfasst neun kinetische Zustände. Davon sind 8 nichtleitende Zustände: drei geschlossen (C), zwei inaktiviert-geschlossen (IC), zwei schnell inaktiviert (IF) und ein langsam inaktivierter (IS). Das Modell enthält einen offenen (O) kinetischen Zustand, der leitend ist. Zwischen benachbarten kinetischen Zuständen wird der Übergang von Verbindungen/Zustandsbelegung im Laufe der Zeit durch Übergangsratenkonstanten definiert, die als S0-S15 dargestellt werden. Beachten Sie, dass jedem kinetischen Zustand auch ein numerischer Wert (rot) zugewiesen wird, der es dem Benutzer ermöglicht, das Markov-Modell und seine kinetische Zustandstopologie in einer Gating-Zustandsmatrix zu definieren (siehe Feld C, siehe unten). (B) Panels/grafische Oberflächen, mit denen Benutzer im SutterPatch Dynamic Clamp Editor arbeiten, werden vorgestellt. Beachten Sie, dass die Anordnung dieser Bedienfelder des Dynamic Clamp Editors nicht mit der Anordnung übereinstimmt, wie sie in der Dynamic Clamp-Software angezeigt wird. Darüber hinaus werden nicht alle Paneele angezeigt, die mit dem Editor für dynamische Klemmen verknüpft sind. (C) (oberes Feld) Es wird ein Beispiel für eine Gating-Zustandsmatrix mit eingegebenen Variablen gezeigt, die der Topologie des in Panel A gezeigten Zustandsübergangsdiagramms entsprechen. Rote Kästchen in der Gating-State-Matrix markieren Zeile und Spalte 7, die dem offenen (O) kinetischen Zustand des Modells entsprechen. In Spalte 7 werden alle Geschwindigkeitskonstanten aufgelistet, die Übergänge in den offenen (O) kinetischen Zustand definieren, und in Zeile 7 werden alle Ratenkonstanten aufgelistet, die Übergänge definieren, die den offenen (O) kinetischen Zustand verlassen. Mit dieser Organisation beschreibt die Gating-State-Matrix die Anzahl der kinetischen Zustände, die Variablen der Geschwindigkeitskonstanten und die Topologie (Verbindungen zwischen kinetischen Zuständen) des Modells. In (D) sind die SutterPatch-Panels/Benutzeroberflächen dargestellt, die mit dem Laden dynamischer Zangenleitfähigkeitsmodelle verbunden sind, zusammen mit den Schnittstellen, die an der Erstellung von Stromzangenroutinen beteiligt sind. Benutzerinteraktionen mit diesen Modellen werden in den Protokollschritten 2.17-2.20 beschrieben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-2
Abbildung 2: Tsc1mut/mut Purkinje-Neuronen haben im Vergleich zu Wildtyp-Kontrollen eine abgeschwächte Membranerregbarkeit. (A) Ganzzell-Stromklemmen-Aufzeichnungen von Wildtyp- (oben, schwarz) und Tsc1mut/mut (unter, blau) Purkinje-Neuronen zeigen ein abgeschwächtes Feuern in der Tsc1-Mutantenzelle. (B) Die reduzierten Feuerfrequenzen in Tsc1mut/mut Purkinje-Neuronen sind im Vergleich zu Wildtyp-Kontrollen in allen Zellen konsistent. Die mittlere (±± SEM) spontane Feuerungshäufigkeit von Tsc1mut/mutPurkinje-Neuronen ist signifikant (P < 0,0001) niedriger als bei Wildtyp-Zellen (Welchs ungepaarter t-Test; Kontrolle N = 13, n = 32; Tsc1mut/mut N = 6, n = 21). (C) Voltage-Clamp-Messungen von Nav-Strömen in adulten Purkinje-Neuronen zeigen, dass die mittlere (±± SEM) schnelltransiente Nav-Stromspitze (INaT) in Tsc1-Mut/Mut-Zellen im Vergleich zu Wildtyp-Kontrollen signifikant reduziert ist. (P = 0,007, RM bidirektionale ANOVA; Wildtyp-Steuerung: N = 6, n = 22, schwarz; Tsc1mut/mut: N = 6, n = 16, blaue Quadrate). Beispiel INaT-Datensätze, die durch einen Depolarisationsschritt von -35 mV hervorgerufen werden, werden als eingefügtes Feld rechts von Feld C dargestellt. Daten, die zuvor in Brown et al.8 veröffentlicht wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-3
Abbildung 3: Verwendung einer dynamischen Klemme zur Bestimmung der Auswirkungen einer ionischen Leitfähigkeit auf die Erregbarkeit des Purkinje-Neurons. Bei der dynamischen Klemme wird die Membranspannung (über eine Aufzeichnungselektrode) abgetastet und auf der Grundlage der abgetasteten Spannung der Stromausgang eines Modellleitwerts berechnet. Der berechnete Strom wird dann mit Hilfe einer strominjizierenden Elektrode an eine biologische Zelle angelegt. Tafel (A) zeigt diese Versuchsanordnung. Wenn die Spannungsabtastung bei einer ausreichenden Frequenz durchgeführt wird und es eine minimale Verzögerung (Latenz) zwischen der Spannungsabtastung und dem Anlegen des berechneten Stroms gibt, kann diese Technik verwendet werden, um zu beurteilen, wie sich das Addieren oder Subtrahieren einer modellierten Leitfähigkeit auf das neuronale Feuern und die Membranerregbarkeit auswirkt. (B) In repräsentativen Experimenten wurden dynamische Clamp-Aufnahmen mit der SutterPatch-Software und dem dPatch-Verstärkersystem aufgenommen. dPatch ist ein Patch-Clamp-Verstärker mit externen Signalprozessoren und einem voll integrierten Digitizer, wodurch er sich gut für dynamische Clamp-Aufnahmen eignet (siehe Diskussion). (C) Repräsentative Stromklemmenaufzeichnungen des spontanen Feuerns von Purkinje-Neuronen vor und nach der Verwendung der dynamischen Klemme zur Addition oder Subtraktion von 400 nS der modellierten Nav-Leitfähigkeit (dargestellt in Abbildung 1A). In C1 (links) stammen die Datensätze von einem Tsc1 mut/mut Purkinje-Neuron mit abgeschwächtem Feuern. Die Zugabe eines Nav-Leitwerts von 400 nS führt zu einer deutlichen Erhöhung der Zündfrequenz dieser Zelle. Alternativ stammen die Datensätze in C2 von einem Purkinje-Wildtyp-Neuron. In diesem Experiment wird die modellierte Nav-Leitfähigkeit mit einer umgekehrten Polarität (-400 nS) angewendet, was zu einer Subtraktion der Nav-Leitfähigkeit und einer deutlichen Verringerung der Häufigkeit wiederholter Zündungen führt. Die grau dargestellten Aufzeichnungen der dynamischen Zangenstromeinspeisung werden unter den schwarz dargestellten Aufzeichnungen über die Zündung des Aktionspotentials (Spannung) angezeigt. (D) Die Ergebnisse dieser dynamischen Clamp-Experimente, dargestellt als die Änderungen der spontanen Feuerfrequenz nach dem Hinzufügen der Nav-Leitfähigkeit zu Tsc1 mut/mut Purkinje-Neuronen (D1, n = 3) oder der Subtraktion der Nav-Leitfähigkeit von Wildtyp-Purkinje-Neuronen (D2, n = 3), zeigen konsistente und signifikante Effekte der Addition oder Subtraktion dieser Leitfähigkeit über Tsc1mut/mut (P = 0,029) und Wildtyp (P = 0,031) bzw. Zellen (gepaarter Student's t-Test). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Kleinhirnschaltkreise spielen eine Rolle bei der Propriozeption und motorischen Kontrolle37,38, sind aber auch entscheidend für komplexe Verhaltensweisen wie soziale Interaktionen und emotionale Verarbeitung 39,40,41. Die Pathologie der Kleinhirnstruktur und -funktion wird oft mit ASD in Verbindung gebracht 42,43,44,45,46. Die einfache Architektur der Kleinhirnschaltkreise47 und die klare Rolle des Kleinhirns in der ASD-Pathologie machen es zu einer attraktiven Gehirnregion, um die molekularen und zellulären Treiber von ASD-Verhaltensdefiziten sowie mögliche Therapeutika zu untersuchen. Die dynamische Clamp-Elektrophysiologie bietet ein wichtiges Werkzeug für diese Untersuchungen, das es den Forschern ermöglicht, die kausalen Zusammenhänge zwischen ASD-bedingten Veränderungen der Ionenkanaleigenschaften/Ionenleitwerte und dem Feuern von Kleinhirnneuronen direkt zu testen. Während dynamische Clamp-Methoden besonders geeignet sind, um ASD-bedingte Veränderungen der neuronalen Erregbarkeit zu untersuchen, ist diese Technik relevant für die Untersuchung einer Reihe von pathologischen Mechanismen, die Zellen mit erregbaren Membranen beeinflussen. Darüber hinaus ist die dynamische Klemme nach wie vor ein hervorragendes Werkzeug, um die komplexen Prozesse zu analysieren, durch die Neuronen und Muskelzellen das Auslösen eines angemessenen Aktionspotentials regulieren und aufrechterhalten.

Die genaue Durchführung von dynamischen Klemmversuchen erfordert eine sorgfältige Kontrolle der technischen Parameter. Insbesondere sollten die Experimentatoren die Folgen der potentiellen Variabilität in der Verzögerung zwischen Spannungsabtastung und Strominjektion, die oft als Jitter29 bezeichnet wird, sowie die passiven Eigenschaften der Elektroden, die Einschränkungen der Raumklemme und die physiologische Genauigkeit der zu untersuchenden Versuchsvorbereitung kennen und verstehen. Bettencourt et al. (2008)48 und Butera et al. (2001)29 zeigten zuvor, dass das Erreichen hoher Abtastraten von mindestens 50 kHz entscheidend für die genaue Erfassung schneller ionischer Leitwerte ist, wobei die Rückkopplungslatenzen idealerweise unter 25 % (≤ 5 μs) des Abtastintervalls gehalten werden. Nominale Abtastraten, die von kommerziellen Systemen, insbesondere Windows-basierten Plattformen, gemeldet werden, können irreführend sein. Daher ist oft eine unabhängige Leistungsüberprüfung erforderlich, die von Milescu et al. (2008)25 und Clausen et al. (2012)49 näher diskutiert wird. Space-Clamp-Einschränkungen müssen ebenfalls berücksichtigt werden, insbesondere bei der Arbeit mit intakten Neuronen mit komplexen Morphologien und nicht-isopotentiellen Membraneigenschaften. Zum Beispiel führt der Versuch, einen Leitwert mit einer Elektrode anzulegen (oder zu subtrahieren), die distal der integrierenden Stelle ist, wie z. B. das AIS, zu einer ungenauen Darstellung der Auswirkungen des angelegten Leitwerts. Ein schlechter (hoher) Elektrodenwiderstand, eine unzureichende Kapazitätskompensation und/oder das Versäumnis, den Sperrschichtpotentialfehler zu korrigieren, können ebenfalls zu einer falschen Darstellung der Spannungsmessungen (Eingangssignal) und folglich zu einer falschen Anwendung der modellierten Ionenleitwerteführen 50,51.

Tausende von Markov- und HH-Modellen sind für Forscher in Online-Datenbanken wie ModelDB52 und Channelpedia53 frei verfügbar, die vom Human Brain Project bzw. dem Laboratory of Neural Microcircuitry unterstützt werden. Diese Datenbanken umfassen Modelle für synaptische Leitfähigkeiten, Ionenkanalleitwerte und leitfähigkeitsbasierte Neuronenmodelle, die hauptsächlich in NEURON, MATLAB oder Python geschrieben sind. Datenbankdateien enthalten in der Regel die notwendigen Modellgleichungen sowie alle verschiedenen Informationen über den/die Zelltyp(en) und Experimente, die das Modell beeinflusst haben.

Sowohl Markov- als auch HH-Leitfähigkeitsmodelle enthalten leitende (Simulation von Kanälen - offen/aktiviert) und nichtleitende (simulierte Kanäle - geschlossen) Gating-Zustände/Variablen. Diese Modelltypen unterscheiden sich jedoch in der Art und Weise, wie der Leitwert bei jeder abgetasteten Spannung berechnet wird, wobei Markov-Modelle mehr Rechenleistung erfordern, aber mehr Details in den Gating-Eigenschaften der simulierten Kanäle liefern. Zum Beispiel sind in HH-Modellen der leitende und der nichtleitende Zustand unabhängige Variablen, die jeweils durch die Spannungseingangs- und Gating-Kinetik des jeweiligen Zustandsbestimmt sind 54, 55. Im Gegensatz zu Markov-Modellen simulieren oder beschränken HH-Modelle nicht die Übergänge zwischen Gating-Zuständen, wie z. B. den Transit simulierter Kanäle vom aktivierten/offenen kinetischen Zustand direkt in den schnell inaktivierten kinetischen Zustand in einem spannungsgesteuerten Natriumleitfähigkeitsmodell25. Dies macht HH-Modelle weniger rechenkomplex54,55 und ermöglicht es den Forschern, mehrere HH-Modelle mit schneller Leitfähigkeit gleichzeitig hinzuzufügen, während gleichzeitig hohe Abtast- und Aktualisierungsraten beibehalten werden.

Markov-kinetische Zustandsmodelle bestehen aus diskreten kinetischen Zuständen, die leitend oder nicht leitend sein können, und diese Zustände sind in einer festen Topologie miteinander verbunden. In Markov-Modellsimulationen wird die Leitfähigkeit bei jeder abgetasteten Spannung durch den Anteil der simulierten Kanäle berechnet, die den oder die leitenden kinetischen Zustände einnehmen. Der Anteil der simulierten Kanäle, die jeden kinetischen Zustand (über die Zeit) einnehmen, wird durch Ratenkonstanten bestimmt, bei denen es sich um Parameter handelt, die die Geschwindigkeit steuern, mit der die Zustandsbelegung von einem kinetischen Zustand in einen anderen übergeht. Geschwindigkeitskonstanten haben Einheiten von inversen Sekunden (s-1), die eine Übergangswahrscheinlichkeit pro Zeiteinheit darstellen. Je nach Modell können die Werte der Ratenkonstante von dynamischen Faktoren wie Spannung oder Temperatur abhängen.

In Markov-Modellen werden gewöhnliche Differentialgleichungen verwendet, um die zeitabhängige Belegung jedes kinetischen Zustands zu beschreiben. Diese Gleichungen bestimmen, wie sich die Wahrscheinlichkeit, sich in jedem Zustand zu befinden, im Laufe der Zeit entwickelt, basierend auf den Übergangsratenkonstanten. Dies wird durch eine Zinsmatrix Q: figure-discussion-156 dargestellt. Wie oben diskutiert, können die Übergangsratenkonstanten (r), die die Bewegung zwischen den Zuständen bestimmen, durch die Eingangsspannung (V) und die Parameter α und β beeinflusst werden, die die Kinetik der Leitfähigkeit über Spannungen widerspiegeln. Diese Gleichungen können wie folgt figure-discussion-2beschrieben werden und können visuell in Form von Diagrammen dargestellt werden, die Verbindungen (Übergangsratenkonstanten) in und aus jedem kinetischen Zustand des Modells 56,57,58 enthalten. Eine hilfreiche Diskussion über die Entwicklung von Markov-Modellen und deren Topologie findet sich in Schoening und Silva (2024)56.

Seit der Einführung der dynamischen Klemme in ihrer derzeitigen Form, bei der nichtlineare Ionenleitwerte modelliert und (über eine stromeinspeisende Elektrode) in Echtzeit auf lebende Zellen angewendet werden19,59, haben sich die Methoden und Ressourcen für diese Technik weiterentwickelt und sind aufgrund von Innovationen wie Mikrocontroller-basierten, kostengünstigen Systemen60 und kostenloser Open-Source-Software23 zunehmend zugänglich und kostengünstiger. 25,26. Kommerzielle Systeme wie dPatch von Sutter Instrument oder Cybercyte von Cytocybernetics erleichtern die schnelle Durchführung dynamischer Clamp-Experimente durch integrierte Hardware- und Softwarelösungen27,61.

Die Vielseitigkeit der dynamischen Klemme ermöglicht vielfältige Anwendungen, einschließlich der Erzeugung virtueller chemischer und elektrischer Synapsen, der Einbettung realer Neuronen in künstliche Netze (oder umgekehrt) und des Hinzufügens virtueller Ionenkanäle62. Wichtig ist, dass die Spannungsabhängigkeit, die kinetischen Eigenschaften und die Amplituden einer angelegten Leitfähigkeit schnell angepasst werden können, was es den Forschern ermöglicht, direkt zu testen, wie die Skalierung eines oder mehrerer Parameter das Feuern des Aktionspotentials und die Membranerregbarkeit beeinflusst31. Heutige Systeme bieten hohe Abtastraten, die die genaue Anwendung von schnell transienten Leitwerten ermöglichen und können leicht in herkömmliche elektrophysiologische Geräte60,63 integriert werden, was die dynamische Klemme als ideale Methode zur Verbesserung unseres Verständnisses der neuronalen Funktion und Dysfunktion festigt.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Danksagungen

Wir danken Telly Galiatsatos und Josh Stanford von Sutter Instrument für ihre Unterstützung bei technischen Anfragen. Wir danken auch Jan Dolzer für seine Hilfe bei der Initiierung von dynamischen dPatch-Clamp-Studien.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
CaCl2Fisher ChemicalC79-500 Reagenz
Kapillarglasröhren, Boroscilikat, Standardwand, OD 1,5 mm, Innendurchmesser 0,86 mm, Länge 10 cm.Warner Instruments64-0793Ausrüstung
CleanBenchTMC63-9090EAusrüstung
Compresstome VF-500-Z Vibratome Vorausschauende Instrumentehttps://precisionary.com/product-category/compresstome-parts/parts-by-model/vf-500-0z/Ausrüstung
Dell OptiPlex 7080Talhttps://www.dell.com/en-us/shop/desktop-computers/optiplex-7080-tower-and-small-form-factor/spd/optiplex-7080-desktop/s005o7080sffusAusrüstung
DextroseFisher ChemicalD16-500 Reagenz
dPatch-VerstärkersystemSutter-InstrumentFG-DPATCHAusrüstung
EGTAEMD Millipore324626-25GMReagenz
HEPESFisher Chemical7365-45-9Reagenz
Inline-HeizgerätWarner Instruments64-0102Ausrüstung
KclFisher ChemicalP330-500 Reagenz
KetaminDechra Veterinärprodukte193.40620.3 Reagenz
K-GlukonatTCI ChemicalsG0040Reagenz
LinLab-SoftwareScientificahttps://www.scientifica.uk.com/products/scientifica-linlab-2Ausrüstung
LSE 6L WasserbadCorning6783Ausrüstung
Mg-ATPSigma-Aldrich74804-12-9Reagenz
MgCl2Fisher Chemical012288.A9Reagenz
Modell P-1000 PipettenzieherSutter-InstrumentFG-P1000Ausrüstung
NaClFisher ChemicalS271-500 Reagenz
Na-GTPMP Biomedizin56001-37-7Reagenz
NaH2PO4J.T. Baker02-004-220 Reagenz
NaHCO3Fisher ChemicalS233-500 Reagenz
Okuläre SoftwareDigital Optics Limitedhttps://www.scientifica.uk.com/products/qimaging-ocular-softwareAusrüstung
RasierklingePersonna60-0139-CTNAusrüstung
Slice-HarfeWarner Instruments64-0255Ausrüstung
SliceScope Pro 3000Scientificahttps://www.scientifica.uk.com/products/slicescope-pro-3000Ausrüstung
SekundenkleberLoctite8040-00-142-9193Ausrüstung
SutterPatch-SoftwareSutter-Instrumenthttps://www.sutter.com/amplifiers/sutterpatchAusrüstung
TemperaturreglerWarner Instruments64-2400Ausrüstung
XylazinMP Biomedizin158307Reagenz

Referenzen

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