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Methodenartikel

Im lebenden Organismus Konfokale Mikroskopie in der Diagnose und Behandlung des trockenen Auges: Ein Fokus auf bildgebende Protokolle und Interpretation

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DOI:

10.3791/69156

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11. November 2025

 ,  , 
1Hankou Aier Eye Hospital, 2Aier Eye Hospital of Wuhan University, 3School of Stomatology and Ophthalmology, Xianning Medical College, Hubei University of Science and Technology

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieser Artikel zeigt die Funktionsweise und Wirkung der in vivo konfokalen Mikroskopie bei der Diagnose und Behandlung des trockenen Auges und untersucht die Anwendung und Ergebnisse der in vivo konfokalen Mikroskopie, um eine Grundlage für zukünftige Forschungen zu schaffen.

Zusammenfassung

Die konfokale In-vivo-Mikroskopie (IVCM) hat aufgrund ihres nicht-invasiven Charakters und ihrer hohen Auflösung große Aufmerksamkeit erregt. Es ermöglicht die In-vivo-Beobachtung und objektive Quantifizierung zahlreicher okulärer Oberflächenstrukturen, die mit der Krankheit des trockenen Auges (DED) in Verbindung stehen, einschließlich der Hornhaut, der Bindehaut, des Augenlidrandes, der Meibom-Drüsen und von Parasiten wie Demodex, auf zellulärer Ebene. Diese Funktion unterstützt Augenärzte bei der Identifizierung spezifischer Ätiologien und Subtypen von DED und erleichtert so eine präzise Diagnose, eine gezielte Behandlung und eine prognostische Bewertung. Es fehlen jedoch nach wie vor standardisierte Protokolle für den IVCM-Betrieb und die Befundung. Kenntnisse sowohl in der Augenheilkunde als auch in der technischen Bedienung sind unerlässlich, um dieses Gerät effektiv zu nutzen und qualitativ hochwertige Berichte zu erstellen. Dieser Artikel beschreibt die Verfahrensschritte und Nuancen der IVCM-Untersuchung bei DED-Patienten. Dies ist das erste JoVE Schritt-für-Schritt-IVCM-Protokoll für DED. Es soll als Referenz für Kliniker dienen und ihnen helfen, betriebliche Ineffizienzen zu vermeiden und konsistent qualitativ hochwertige Bilder der Hornhaut- und Augenoberfläche zu erhalten, um das klinische Management zu leiten.

Einleitung

Aufgrund von Einschränkungen der lokalen medizinischen Ressourcen oder der finanziellen Belastung der Patienten konzentriert sich die klinische Diagnose der DED oft nur auf einen grundlegenden Aspekt (z. B. Beobachtung unter dem Spaltlampenmikroskop, Beschwerde über Trockenheit und Juckreiz der Augen) oder sogar auf einen einzigen Indikator (z. B. invasive Tränenfilmauflösung, Tränensekretionstest oder Demodex-Befall). Die IVCM-Anwendung ist nicht weit verbreitet, geschweige denn standardisierte Protokolle dafür. Für ophthalmologische Einrichtungen, die mit IVCM ausgestattet sind, empfiehlt der Autor jedoch, dass Erstpatienten einer umfassenden mikroskopischen Untersuchung unterzogen werden, um Auslassungen zu vermeiden, einschließlich der Hornhaut, der Bindehaut und des Lidrands. Bei mehrdeutigen DED-Fällen oder zur Detektion von Demodex eignet sich IVCM besonders für eine explizite Antwort.

Die Krankheit des trockenen Auges (DED) ist definiert als eine chronische Erkrankung der Augenoberfläche, die durch Anomalien in der Qualität oder Quantität der Tränenflüssigkeit und eine verminderte Stabilität des Tränenfilms verursacht wird. Im Dry Eye Workshop II (DEWS II) wird die DED in fünf Typen eingeteilt: das wässrig-defiziente trockene Auge (ADE), das evaporative trockene Auge (EDE), das gemischte trockene Auge (MDE), die Veranlagung zum trockenen Auge und der präklinische Zustand des trockenen Auges1. Ralene et al. fassten die wichtige klinische Praxis der IVCM bei verschiedenen Arten des trockenen Auges zusammen, einschließlich der von 2017 bis 2022 veröffentlichten Literatur2. Neuere Forschungen haben gezeigt, dass Entzündungen eine Schlüsselrolle bei der Pathogenese von DEDspielen 3,4. Insbesondere die Dichte der dendritischen Zellen (DCs) kann ein guter Indikator für DED sein, die mit einem systemischen immunvermittelten Prozess assoziiert ist5.

Das IVCM verwendet die konfokale Lasertomographie-Technologie. Er bietet horizontale und vertikale Auflösungen von 1 μm. Detaillierte technische Spezifikationen des Geräts sind im Bericht von Jeremy et al.dokumentiert 6. Bei der Untersuchung der Augenoberfläche wird die IVCM zuerst auf die Hornhautaufgetragen 7, gefolgt von der Bindehaut und den Meibom-Drüsen8. Die Demodex-Blepharitis hat in den letzten Jahren zunehmend klinische Aufmerksamkeit erregt 9,10. IVCM liefert klare Bilder der Hornhaut, der Bindehaut und des Lidrands. Diese Bilder ermöglichen es Ärzten, den Krankheitsstatus zu beurteilen und erleichtern die Bildgebung und Quantifizierung von Entzündungs- und Immunzellen.

Bei der DED-Bewertung konzentrieren wir uns auf: Hornhautepithelzellen (CEC); subepitheliale Nervenfasern (SNF); interepitheliale und subepitheliale Entzündungs-/Immunzellen; Bindehautbecherzellen (CGCs); Bindehautentzündungs-/Immunzellen; Meibom-Drüsen-Acini und Öffnungen; Demodex folliculorum und Demodex brevis; und Entzündungszellen im umgebenden Gewebe. Diese Betonung ergibt sich aus der Pathophysiologie: Eine Funktionsstörung der Meibom-Drüse führt zu einer verminderten Sekretion oder einer veränderten Zusammensetzung der Lipidschicht des Tränenfilms, was zu einer beschleunigten Tränenverdunstung und einer Schädigung der Augenoberfläche führt. Ein Demodex-Befall trägt zu Juckreiz und Unwohlsein der Augen bei. CGCs sezernieren Mucin, eine kritische Tränenfilmkomponente; Ihre Erschöpfung kann zu Muzin-defizientem DED führen. Umgekehrt schädigt DED selbst die Oberflächenstrukturen der Augen, einschließlich CEC und SNF, und erhöht in der Folge die Dichte der Entzündungs-/Immunzellen im Hornhaut- und Bindehautgewebe. Nachdem wir die idealen Bilder erhalten haben, können wir die integrierten quantitativen Werkzeuge der Software effektiv nutzen, um die vielen erwähnten Zellen zu zählen (Abbildung 1). Aber für die morphologische Vielfalt von SNF müssen wir uns auf Analysesoftware verlassen, um bei der Quantifizierung zu helfen11,12.

IVCM ist unverzichtbar für die Echtzeit-Beurteilung von Hornhautschichten, Nervenfasern und Entzündungs-/Immunzellen im Gewebe der Augenoberfläche. Für die Beurteilung von CGCs dient die Abdruckzytologie als alternative Methode. Diese Technik zielt auf die Fornix-Bindehaut ab, wo die Dichte der Becherzellen ihren Höhepunkt erreicht, was zu Werten führt, die typischerweise über den IVCM-Messungen liegen13,14. Die Ergebnisse unterliegen jedoch der Variabilität der Färbung und der Expertise des Anwenders, während das zeitintensive Protokoll die routinemäßige klinische Umsetzung einschränkt. Die Obstruktion der Meibom-Drüsenöffnung ist mit der Spaltlampenmikroskopie direkt beobachtbar, aber diese Methode kann keine Demodex-brevis-induzierten Blockaden erkennen, die IVCM genau identifiziert. Für die Diagnose eines Demodex-Befalls stellt die Wimpernepilation mit lichtmikroskopischer Untersuchung eine kostengünstige Methode dar. Dieser Ansatz ist zwar technisch einfach, birgt aber erhebliche Einschränkungen: Das Unwohlsein des Patienten schränkt die Mehrfachprobenahme ein, Milben, die sich tief in den Wimpernfollikeln oder den Meibom-Drüsenöffnungen befinden, bleiben nicht nachweisbar15. Im Gegensatz dazu ermöglicht die IVCM eine umfassende Untersuchung mehrerer Lidrandstellen, einschließlich Wimpernfollikeln und Meibom-Drüsenöffnungen, mit minimalen Beschwerden für den Patienten. Dieser Ansatz erzielt wesentlich höhere diagnostische Positivitätsraten durch Echtzeit-In-vivo-Visualisierung von Parasiten in ihren Mikrohabitaten16,17.

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Protokoll

Das Untersuchungsverfahren wurde von der Ethikkommission des Augenkrankenhauses Hankou Aier genehmigt und die Einverständniserklärung aller Patienten wurde eingeholt.

HINWEIS: Zu den Einschlusskriterien für die Patientenauswahl gehören Patienten mit Beschwerden über trockene und juckende Augen sowie Personen, die routinemäßige Augenuntersuchungen durchführen müssen. Zu den Ausschlusskriterien für die Patientenauswahl gehören Patienten mit Hornhautperforation oder drohender Hornhautperforation, Patienten, die allergisch auf topische Augenanästhetika reagieren, Personen, die zu jung (z. B. unter 3 Jahre alt) oder zu alt sind, um zu kooperieren, Patienten mit engen Lidfissuren, die kein Augenlidspekulum aufnehmen können, schwangere Frauen und Personen, die aus anderen Gründen nicht kooperieren können. Ein kurzes Workflow-Diagramm ist in Abbildung 2 zu finden. Und die detaillierten Betriebsschritte sind wie folgt.

1. Vorprüfung

  1. Materialvorbereitung: IVCM-Gerät, Hornhautkontaktkappe, ophthalmisches topisches Anästhetikum, Haftvermittler, medizinische Wattestäbchen, Augenlidspekulum, Alkoholkugeln, Alkoholreservoir, entzündungshemmende Augentropfen (Abbildung 3).
  2. Verstehen Sie die Schlüsselkomponenten der IVCM-Geräte (Heidelberg Retinal Tomography Rostock Cornea Module (HRT-RCM)), Fokussierknopf, Überwachungskamera, Blickleitlicht, Kinnstütze, Stirnstütze, Taste zum Umschalten zwischen linkem/rechtem Auge, Drehknöpfe zum dreiachsigen Bewegen des HRT-RCM, Bilderfassungsknopf und Fußpedal, Computer mit spezieller IVCM-Software) und bereiten Sie das IVCM-Gerät mit Kopplungsgel vor.
  3. Untersuchervorbereitung: Tragen Sie eine Maske und desinfizieren Sie die Hände mit alkoholhaltigem Gel oder tragen Sie Einweghandschuhe.
  4. Gerätedesinfektion: Wischen Sie die Stirn- und Kinnstützen des Geräts mit Alkoholtupfern ab.
  5. Erklärung des Verfahrens: Erklären Sie dem Patienten kurz, dass die Untersuchung schmerzfrei ist, um die Angst zu lindern.

2. Während der Prüfung

  1. Überprüfen und erstellen Sie eine neue Patientenakte mit der zugehörigen Software auf dem Computer.
  2. Verabreichen Sie ein topisches Anästhetikum: Verabreichen Sie zwei Tropfen davon in einem Abstand von 3 Minuten vor dem Eingriff in den unteren Fornix.
  3. Bereiten Sie das Rostock-Hornhautmodul (RCM) des IVCM-Geräts vor: Beschichten Sie den laseremittierenden Bereich von RCM mit Kopplungsgel (stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen gebildet werden) (Abbildung 4 und Abbildung 5), und nur eine ausreichende Menge des Haftvermittlers (in der Regel ein oder zwei Tropfen, nicht zu viel) kann einen vollständigen Kontakt mit der Hornhautkontaktkappe gewährleisten und letztendlich die ideale Nullstellungsgrenzfläche erreichen. Bringen Sie eine Einweg-Hornhautkontaktkappe an.
  4. Positionieren Sie das Gerät: Ziehen Sie den RCM vollständig ein. Befestigen Sie die Stirnstütze waagerecht. Passen Sie die Überwachungskamera an die Zeitseite des Motivs an. Ermitteln Sie die Position des Stopppunkts der Kamera, der senkrecht zur optischen Achse des RCM verläuft.
  5. Fokus kalibrieren: Drehen Sie den Fokusknopf, bis die Software eine maximierte weiße Blende mit einem Bildqualitätswert von genau 100 anzeigt. Setzen Sie den Tiefenwert auf Null zurück (Nullstellung).
  6. Scanmodus auswählen: Standardmäßig auf Schnittmodus eingestellt, sofern nicht anders angegeben. Um die Aktivität der Demodex-Milben zu beobachten, kann der Sequenzmodus für die kontinuierliche Aufzeichnung dynamischer Bilder verwendet werden.
  7. Positionieren Sie die Patienten: Legen Sie das Kinn fest auf die Kinnstütze. Drücken Sie die Stirn gegen die Stirnstütze. Stellen Sie die Untersuchungsliege und den Kinnhalter an die Körpergröße des Patienten ein.
  8. Augenlidspekulum einführen: Bitten Sie den Patienten, nach unten zu schauen, während er das obere Lid mit einem Wattestäbchen anhebt, und bitten Sie den Patienten, nach oben zu schauen, während er das untere Lid vorsichtig mit einem Wattestäbchen nach unten zieht, um es zu platzieren.
  9. Abschließende Anweisungen: Bestätigen Sie erneut die korrekte Positionierung des Kopfes. Erinnern Sie den Patienten daran, entspannt zu bleiben und Bewegungen zu vermeiden. Melden Sie Beschwerden sofort.
  10. Protokoll der Hornhautuntersuchung
    1. Beginnen Sie mit der makroskopischen Ausrichtung: Passen Sie den RCM visuell an, um sich der Hornhautspitze anzunähern (Abbildung 6). Wechseln Sie zur Überwachungskamera des Geräts, um eine Feinabstimmung vorzunehmen, wenn sich der RCM der Hornhaut nähert. Leiten Sie den Patienten an, seinen Blick auf läsionale Hornhäute zu richten, und zentrieren Sie die Läsion unter dem RCM. Halten Sie einen sanften Kontakt, um Hornhautschäden zu vermeiden.
    2. Schlüsseltechnik: Die Hornhautkontaktkappe hat eine große physikalische Größe, aber eine extrem kleine optische Zone (beschränkt auf den laseremittierenden zentralen Bereich). Kritische Anforderung: Erreichen Sie einen hochpräzisen Kontakt zwischen der Kappe und dem Zielgewebe, da eine schlechte Adhäsion bildgebende Artefakte (z. B. Blasen, Ölinterferenzen oder vollständiger Signalverlust) verursacht.
      HINWEIS: Für eine kontinuierliche Bildgebung drücken Sie das Fußpedal für einen längeren Scanvorgang, um sequenzielle Tiefenbilder aufzunehmen und zu vermeiden, dass wichtige Daten übersehen werden.
  11. Schichtige Hornhautbeurteilung: Scannen Sie von oberflächlichen zu tiefen Schichten in dieser Reihenfolge: CEC, SNF, subepitheliale Entzündungszellen.
    1. Konzentrieren Sie sich auf den unteren Wirtel, der der empfohlene Orientierungspunkt ist, und die angrenzenden oberen/unteren Regionen18.
  12. Nasale Bindehautuntersuchung
    1. Setzen Sie die Fokusebene auf den Tiefenwert von Null zurück. Kupplungsgel auf die Kappe auftragen. Weisen Sie den Patienten an, zeitlich oder inferotemporal zu blicken. Schieben Sie den RCM sanft auf die Bindehautfläche. Gleichzeitige Manöver: Passen Sie die RCM-Position für ein optimales Sichtfeld mit der rechten Hand an. Drehen Sie mit der linken Hand den Fokusknopf, um Becherzellen in der äußersten Bindehautschicht zu identifizieren.
  13. Entfernung des Augenlidspekulums: Weisen Sie den Patienten an, nach unten zu schauen und das Oberlid mit einem Wattestäbchen anzuheben, um es zu entfernen. Weisen Sie den Patienten an, nach oben zu schauen und das Unterlid vorsichtig mit einem Tupfer zu drücken, um es zu entfernen.
  14. Gerät zurücksetzen: Lassen Sie die Stirnstütze los und heben Sie sie an. Stellen Sie den Fokusknopf auf Null. Tragen Sie das Kupplungsgel erneut auf die RCM-Oberfläche auf.
  15. Bewertung der Meibom-Drüse und der Wimpernfollikel
    1. Patientenpositionierung: Weisen Sie den Blick nach unten an. Manöver des Untersuchers: Heben Sie die Haut des oberen Augenlids sanft an und drücken Sie sie nach innen, um den Lidrand parallel zur Hornhautkappe auszurichten. Verschieben Sie den RCM horizontal, um mehr Bilder derselben Typstruktur anzuzeigen. Bewegen Sie den RCM vertikal (von unten nach oben), um von der Untersuchung der Meibom-Drüsenöffnungen zu den Acini der Drüse und dann zu den Wimpernwurzeln zu wechseln.
      HINWEIS: Anfänger können das Augenlid für eine bessere Belichtung bei der Untersuchung der Meibom-Drüsenöffnungen überziehen. Wir empfehlen für diesen Teil den Ort der Inspektion in der Mitte von 1/3 des oberen Augenlids.
    2. Quantitative Standards (institutionelles Protokoll): Beurteilen Sie 8 aufeinanderfolgende Follikel mit benachbarten Acini15 und untersuchen Sie 4-8 aufeinanderfolgende Drüsenöffnungen. Tiefenkalibrierung: Um klare Bilder von Follikeln aufzunehmen, fokussieren Sie, bis Demodex-Milben scharfe Ränder zeigen (falls vorhanden). Für die Aufnahme klarer Bilder von Acinis liegt der empfohlene Wert bei etwa 30-50 μm Tiefe. Und für die Öffnungen liegt sie bei etwa 30 μm (bei Befall an die Sichtbarkeit von Demodex brevis anpassen)19.

3. Nachprüfung

  1. Pflege nach dem Eingriff: Führen Sie eine Händehygiene durch und desinfizieren Sie die Hände gründlich. Wischen Sie mit einem Wattestäbchen vorsichtig Rückstände von Kopplungsgel, Tränen oder Ablagerungen von der Augenoberfläche ab. Verabreichen Sie antibiotische Augentropfen, um Infektionen vorzubeugen.
  2. Anweisungen für den Patienten: Weisen Sie den Patienten an, sich am Tag der Untersuchung nicht die Augen zu reiben.
  3. Berichterstellung: Analysieren Sie alle erfassten Bilder umfassend und erstellen Sie einen Diagnosebericht. Anforderungen an die Befundung: Fügen Sie mindestens ein Bild pro Gewebestruktur hinzu und fügen Sie bei Bedarf weitere für abnormale Befunde hinzu. Alle ausgewählten Bilder sind nach Untersuchungssequenz und Tiefenwert zu ordnen, gefolgt von genauen Beschreibungen und Messungen.
  4. Hinweise zur Abfallentsorgung: Einwegmaterialien (Kontaktkappen, Tupfer, Narkosebehälter) werfen Sie bitte zur fachgerechten Entsorgung in den medizinischen Abfallbehälter.

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Ergebnisse

Alle IVCM-mikroskopischen Bilder wurden mit einer Auflösung von 384 Pixeln × 384 Pixeln, einem Beobachtungsfeld von 400 μm × 400 μm aufgenommen. Wenn diese Untersuchung richtig "auf Null" gesetzt wird, zeigt sie nur drei mögliche Ergebnisse im Bildrahmen: i) Überhaupt kein Bild (erfolgloses Experiment): Die zentrale optische Zone hatte keinen Kontakt mit dem Zielgewebe. ii) Nur ein Teilbild (Abbildung 7) oder andere abnormale Situationen (

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Diskussion

Eine PubMed-Literaturrecherche mit den Schlüsselwörtern "in vivo konfokale Mikroskopie" und "Krankheit des trockenen Auges" (abgerufen im Juni 2025) ergab > 300 Publikationen. Bemerkenswert ist, dass sich die jährlichen Publikationsraten seit 2021 bei etwa 40 Artikeln pro Jahr stabilisiert haben. Breitere Anwendungen von IVCM bei Erkrankungen der Augenoberfläche haben in den letzten zwei Jahrzehnten (2004-2024) > 2.000 Studien hervorgebracht. Klinisch hat das IVCM die Beurteilun...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Danksagungen

Die Autoren danken Lina Jin vom Hankou Aier Eye Hospital und Min Chen von der Augenklinik des Wuhan Asia Heart Hospital für die Unterstützung bei einigen Bildern sowie allen Teilnehmern und Mitarbeitern, die für den chirurgischen Eingriff gearbeitet haben. Diese Forschung wurde durch einen Zuschuss aus wissenschaftlichen Forschungsprojekten der Wuhan Municipal Health Commission (WX23A20) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Saugfähige WattebäuscheJIAN QI, Chinahttp://www.hnjianqi.comFür das Herstellen von Alkoholbällchen, klein
Alkoholhaltiges GelLi Kang, Shanghai, China31107904Hand-antiseptisches spülfreies Gel, 500 ml
Kohlenhydrat-AugentropfenVidisic, Deutschland8187195Steriles ophthalmisches Gel für Kopplungsmittel, 10g
Hornhautkontaktkappe (TomoCap)Heidelberg, Deutschland18829Optisches Medium und aseptisches Kontakt mit der Hornhaut
AugenlidspekulumAsicon, China6102AUm die Augen zu öffnen
Heidelberg Eye Explorer SoftwareHeidelberg, DeutschlandVersion 1.5.2.0Die Software, die mit dem IVCM-Gerät geliefert wird
IVCM-GerätHeidelberg, DeutschlandHRT-?,08398Die Hauptausrüstung der Prüfung
Medizinische WattestäbchenEsound Med, Chinawww.e-soundmed.comZur Reinigung der Patienten und zur Unterstützung beim Öffnen der Augen, 10 cm
75 % medizinischer AlkoholHUICHANG, Chinawww.huichang888.cnFür die Herstellung von Alkoholbällchen, 75 % und plusmn; 5% 500 ml
0,4 % Oxybuprocain-Hydrochlorid-AugentropfenSanten, Japanhttp://www.santen.co.jpOphthalmische topische Anästhesie, 0,4 % (0,5 ml: 2 mg)
Tobramycin-AugentropfenTOBREX, Belgien8453824Entzündungshemmende Augentropfen, 0,3 % (5 ml: 15 mg)

Referenzen

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