Methodenartikel

Verkalkte Arterienvorbereitung und -verarbeitung mit erhaltener Morphologie und RNA für digitale räumliche Profilierung

DOI:

10.3791/69159

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23. Januar 2026

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1Division of Vascular Surgery, Department of Surgery, University of Washington, 2Department of Laboratory Medicine and Pathology, University of Washington, 3Division of Vascular Surgery, VA Puget Sound Health Care System

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beinhaltet einen Schritt-für-Schritt-Workflow für verkalkte Gefäßproben: Gewebehandhabung, Entkalkung, RNA-Validierung, Detektion von Verkalkungsniveaus und Strategien zur Auswahl von Interessenregionen auf dem Nanostring GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP). Das Ziel ist es, eine umfassende Methode zur Erhaltung der Gefäßgewebemorphologie und RNA für eine zuverlässige räumliche transkriptomische Analyse zu präsentieren.

Zusammenfassung

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Die räumliche Transkriptomik bildet ganz-Transkriptom-Profile direkt auf Gewebeschnitte, korreliert zwischen zellulären Nachbarschaften und Genexpression sowie wie diese Aktivitäten Gesundheit und Krankheit beeinflussen. Obwohl der Ansatz die Onkologie, Neurowissenschaften, Immunologie, Entwicklungswissenschaften und viele Bereiche revolutioniert hat, wurde er in der Gefäßbiologie seltener eingesetzt, obwohl Gefäßerkrankungen weltweit eine der führenden Todesursachen sind. Zwei Hindernisse stechen hervor: Arterien und Venen bieten kaum eine flache Fläche zum Schneiden, und erkrankte Proben, oft atherosklerotisch, thrombosiert, plaquehaltig oder verkalkt, erfordern harte Behandlungen wie Entkalkung, die die Morphologie und die RNA-Integrität gefährden. Doch dieselben Gefäße mit ihren konzentrischen Intima-, Media- und Adventitia-Schichtstrukturen sind ideal für die räumliche Analyse, da jede Schicht unterschiedliche Zelltypen und Genprogramme beherbergt, die über die Wand hinweg interagieren.

Einige detaillierte Protokolle behandeln, wie Gefäßgewebe für die räumliche Transkriptomik vorbereitet werden können. Dieser Mangel schränkt die Fähigkeit der Forscher ein, das volle Potenzial der Technik auszuschöpfen. Um diese Lücke zu schließen, präsentieren wir einen Schritt-für-Schritt-Workflow, der für menschliche Tibiaarterien mit fortgeschrittenen Läsionen optimiert ist. Das Protokoll umfasst Gewebehandhabung, Fixierung und korrekte Entkalkung, die Struktur und RNA-Qualität erhalten, gefolgt von histologischer Färbung zur Bewertung der Verkalkungsschwere. Wir beschreiben außerdem den Aufbau von Gewebe-Mikroarrays (TMA), um Batch-Effekte und Strategien zur Auswahl von Interessensregionen (ROI) auf dem NanoString GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) einzudämmen.

Durch die Absenkung technischer Hürden ermöglicht dieses Protokoll Gefäßforschern, zuverlässige räumliche transkriptomische Daten zu erzeugen und schichtspezifische transkriptionsbezogene Aktivitäten in gesunden und kranken Gefäßen zu untersuchen. Wir erwarten, dass sie die Entdeckung der Mechanismen der Verkalkung, Entzündung, intimer Atherosklerose und anderer vaskulärer Pathologien beschleunigen und eine breitere Einführung räumlicher Transkriptomik in der Gefäßbiologie fördern wird.

Einleitung

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Im vergangenen Jahrzehnt haben Next-Generation-Sequenzierung und hochauflösende Bildgebung sich zusammengearbeitet, um die räumliche Transkriptomik voranzubringen, eine Methode der vollständigen Transkriptom-Quantifizierung, während die genaue Position jedes Transkripts in Gewebeschnitten 1,2 erhalten bleibt. In Kombination mit dem schnell reifenden Single-Cell RNA-Sequencing (scRNA-seq)-Feld bieten räumliche Ansätze einen effizienten Weg, Gensignaturen mit bestimmten Zelltypen, Zuständen und Nischen innerhalb eines Gewebes oder Organs zu verknüpfen, was unser Verständnis der Krankheitsmechanismen erheblich bereichert 3,4,5,6,7 . Mehrere kommerzielle Plattformen werden entwickelt, wie 10X Visium, NanoString GeoMx und CosMx, Slide-seq und DBiT-seq, die jeweils von Protokollen unterstützt werden, die für weiche, hochzelluläre Gewebe wie Tumore und Gehirngewebe optimiert sind. Das Fachgebiet erlebt ein explosionsartiges Wachstum, wobei PubMed im Jahr 2023 etwa 150 Publikationen indexiert, im Jahr 2024 fast 300 und voraussichtlich 500 im Jahr 2025 überschreiten wird. Trotz dieses Anstiegs bleibt die Gefäßbiologie im Vergleich zu Krebs, Neurowissenschaften und Immunologie unterrepräsentiert.

Harte oder mineralisierte Gewebe wie Knochen, Knorpel, Zähne und plaquehaltige, verkalkte Arterien oder Venen haben sich als deutlich weniger förderlich erwiesen. Die technischen Hürden sind vielschichtig. Erstens erfordern die Gewebe mit dichten Mineralmatrizen eine Chelat- oder säurebasierte Entfernung, aggressive Behandlungen, die RNA fragmentieren und die Gewebemorphologie verzerren können. Zweitens enthalten kranke Gewebe, entweder verletzt oder fibrotisch, oft nur wenige lebende Zellen, die in einer umfangreichen extrazellulären Matrix (ECM) eingebettet sind, was die Transkriptausbeute reduziert und die Datennormalisierung erschwert. Darüber hinaus besitzen Gefäßgewebe eine dünne, konzentrische Architektur (Intima, Media, Adventitia), die um ein hohles Lumen gewickelt ist. Die begrenzte Wanddicke, insbesondere die einzellige Intima-Schicht, bedeutet, dass Aufnahmebereiche spärliches Gewebe enthalten können, und Abschnitte können während mehrstündiger Färbung und Hybridisierung reißen oder ablösen. Daher bleiben räumliche transkriptomische Untersuchungen von Gefäßgewebe selten, obwohl Herz-Kreislauf-Erkrankungen weltweit zu den häufigsten Todesursachen und schweren Morbiditäten gehören. Existierende Protokollpapiere legen überwiegend Wert auf Datenverarbeitung, Visualisierung oder andere Plattformen als NanoString GeoMx 8,9,10,11,12,13. Unter diesen Arbeiten beschreiben nur wenige Methoden auf Labortisch zur Behandlung erkrankter Tibiaarterien, einem klinisch relevanten Gefäß bei peripherer Herzkrankheit (PAD), insbesondere bei diabetischen Patienten, die einen zunehmenden Anteil der betroffenen Population ausmachen.

Um diese Lücke zu schließen, präsentieren wir einen umfassenden Arbeitsablauf für verkalkte menschliche Tibiaarterien, die von PAD-Patienten mit einer Amputation gewonnen wurden. Das Protokoll umfasst: (1) Gewebeschnitt und -dissektion unmittelbar nach der Entnahme im Operationssaal; (2) korrekte Gewebefixierung und Entkalkung, die die Integrität von Gewebemorphologie und RNA erhalten; (3) Bau kostensparender Gewebe-Mikroarrays (TMAs) zur Minimierung von Chargeneffekten; (4) RNAscope-in-situ-Hybridisierung und histologische Kalziumfärbung zur Qualitätskontrolle; und (5) eine speziell für verkalkte Tibialarterien (ROI) entwickelte Strategie für verkalkte Tibialarterien auf der GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP)-Plattform. Diese Schritte umfassen alle Verfahren vor der Probenentnahme auf dem DSP-Instrument, Bibliotheksvorbereitung, Sequenzierung und Datenanalyse.

Obwohl auf der referenzierten DSP-Plattform demonstriert, können die Prinzipien die Gewebevorbereitung für 10X Visium oder andere Plattformen leiten, und die Methodik lässt sich leicht an zusätzliche Gefäßbetten oder Tiermodelle anpassen. Dieses Protokoll kann für Biobank- und postmortales Gewebe angepasst werden, hängt jedoch wesentlich von Gewebeerhaltung, Fixierung und Speicherbedingungen ab. Das Gewebe sollte sofort nach der Ernte fixiert werden, um die ischämische Zeit zu minimieren (idealerweise innerhalb von 1 Stunde). Standardmäßiges 10 % neutralgepuffertes Formalin (NBF) wird für mindestens 16 Stunden bei Raumtemperatur (RT) empfohlen. Gewebe sollten umgehend nach der Fixierung eingebettet werden und nicht länger als 3 Tage in Ethanol gelagert werden. Formalinfixierte, paraffin-eingebettete (FFPE)-Blöcke, die unter empfohlenen Bedingungen verarbeitet und gelagert werden, bleiben etwa 3 Jahre lang für räumliche Profilierung geeignet, obwohl die RNA-Qualität mit dem Blockalter abnimmt. Dementsprechend wird eine RNA-Qualitätsbewertung für Proben mit niedriger Zellulärität, Blöcke, die über 6 Monate gelagert werden, Biobankproben und postmortale Gewebe empfohlen. Die minimal akzeptable RNA-Qualität hängt vom ausgewählten Assay, der ROI-Auswahl, der gewünschten Auflösung und den Empfehlungen der Kernanlage ab. In der Praxis werden für robuste Ergebnisse üblicherweise etwa 50–100 Kerne pro Segment empfohlen. Die DSP-Plattform unterstützt sowohl FFPE als auch frisch gefrorene Gewebe. In diesem Protokoll konzentrieren wir uns auf FFPE-Gewebe.

Während sich diese Studie auf räumliche Transkriptomik konzentriert, lässt sie sich leicht mit scRNA-seq integrieren. Mit veröffentlichten scRNA-seq-Datensätzen und rechnergestützter räumlicher Dekonvolution können Zelltypproportionen für jeden räumlichen Fleck geschätzt werden, und scRNA-seq-definierte Zellzustände können auf die Gewebearchitektur projiziert werden. Durch die Aufrechterhaltung sowohl der Struktur als auch der RNA-Integrität ermöglicht unser Protokoll eine nachgelagerte Validierung von Einzelzellen oder Einzelmoleküln, maximiert biologische Erkenntnisse aus wertvollen Gefäßproben und eine breitere Einführung räumlicher Transkriptomik in der vaskulärbiologischen Forschung.

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Protokoll

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Alle Verfahren zur Entnahme menschlicher arteriale Proben wurden vom Institutional Review Board (IRB) der University of Washington Human Subjects Division und dem IRB des VA Puget Sound Health Care System (Seattle, WA) genehmigt. Vor der Gewebeentnahme wurden schriftliche informierte Einwilligungen von den Patienten eingeholt. Die für diese Studie verwendeten Materialien und Ausrüstungen sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Gewebeschnitt und -fixierung

  1. Gewebeschnitt
    1. Bereiten Sie die Transporttasche mit mehrschichtiger Verpackung vor, die einen Innenschlauch, einen Sekundärbehälter, einen äußeren Versandbehälter und einen Biohazard-Probenbeutel enthält. Füllen Sie das innere 50-ml-Zentrifugenrohr mit 30 ml Speichermedium von Dulbeccos Modified Eagle's Medium (DMEM), das 1 % 4-[2-Hydroxyethyl]-1-Piperazineethansulfonsäure (HEPES) und 1% Penicillin-Streptomycin (P/S) enthält.
    2. Setzen Sie die entnommenen vorderen Tibia- (AT), Arterialen Hintertibialen (PT) und Peroneal-Tibialarterien (PR) (idealerweise > 5 cm Länge) getrennt in die 50-mL-Zentrifugenröhren. Übertragen Sie die Behälter auf Eis vom Operationssaal in den Gewebekulturraum.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, dass die entnommene Probenlänge mindestens 5 cm beträgt, um Replikationen zu ermöglichen und genügend Gewebe für weitere Bewertungen oder Validierungen zu kryospeichern.
    3. Übertragen Sie jede Arterie zusammen mit dem Medium in eine 100 mm große Petrischale. Entfernen Sie überschüssiges perivaskuläres Bindegewebe mit steriler Schere und Pinzette, sodass nur die Arterienwand (Adventitia nach innen) bleibt.
      HINWEIS: Handhabt und trimmt das Gewebe in einem Biosicherheitsschrank, der mit einer RNase-Inaktivierungslösung abgewischt wurde, um RNA-Kontamination zu verhindern. Verwenden Sie sterile Skalpelle und Pinzetten; Zwischen den Proben spülen Sie sie in sterilem und nukleasefreiem Wasser, um Rückstände zu entfernen, und wischen Sie gründlich mit 70 % Ethanol ab.
    4. Spülen Sie die abgeschnittene Arterie kurz mit Dulbeccos Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in einer neuen Petrischale. Legt ein steriles Schneidebrett in eine frische Schale und bewegt die Arterie darauf.
    5. Schneiden Sie die Arterie querschnittsweise mit einer chirurgischen Klinge in 1 cm große Segmente.
  2. Gewebefixierung und -lagerung
    1. Zwei Segmente in Kryoröhren mit Snap-Freeze zur Kryokonservierung in flüssigem Stickstoff (LN2) und speichern Sie sie für zukünftige Protein-/RNA-Arbeiten.
    2. Setzen Sie die restlichen Segmente in 15-ml-Röhren mit 10 % NBF und fixieren Sie sie bei 4 °C für 24–48 Stunden für 1 cm arterielle Segmente.
      HINWEIS: Die Verwendung von 10 % NBF wird empfohlen. Bei Verwendung von 4%-Paraformaldehyd (PFA) bereiten Sie es frisch vor oder überprüfen Sie vor der Anwendung einen neutralen pH-Wert, um RNA-Schäden zu minimieren.

2. Entkalkung, Gewebeverarbeitung und Schnitt

  1. Bereite die Entkalkungslösung vor: Löse feste Ethylen-Diamin-Tetraessigsäure (EDTA) auf 10 % (w/v) in RNA-Stabilisierungslösung (RSS). Eine Filtration ist nicht erforderlich. Stellen Sie den pH-Wert mit Natriumhydroxid-(NaOH)-Pellets auf 9,2 ein, um das EDTA vollständig aufzulösen, und senken Sie dann auf 5,2 mit 10 M HCl, was der typische Arbeits-pH-Wert von RSS ist und zur Erhaltung der RNA-Integrität beiträgt.
  2. Spülen Sie die fixierten Gewebe kurz manuell in PBS. Jede Probe wird in ein 15-ml-Rohr mit der Entkalkungslösung übertragen und 72 Stunden bei 4 °C bewegt.
  3. Wenn die Entkalkung abgeschlossen ist, waschen Sie die Proben mit PBS (2 × 5 Minuten). Legen Sie Gewebe in Kassetten und laden Sie sie mit einem 4-Stunden-Verarbeitungsprogramm in einen Gewebeprozessor.
  4. Mehrere Arteriensegmente pro Gewebeblock einbetten. Markieren Sie den begrenzten Gewebebereich auf den Rückseiten des Objektträgers und überprüfen Sie, dass alle Bereiche in diesen Bereich fallen.
  5. Schneide überschüssiges Paraffin ab. Schneiden Sie die Blöcke mit einem Mikrotom und niedrigprofiligen Klingen auf 5 μm und montieren Sie die Gewebeschnitte innerhalb des markierten Objektträgers.
    HINWEIS: Entsorgen Sie die ersten Schnitte nach dem Abdecken und sammeln Sie weitere Gewebeschnitte. Verwende RNase-freie Pinsel und reinige das Wasserbad zwischen den Probenchargen.
  6. Bereiten Sie mindestens vier serielle Schnitte pro Block für verschiedene Färbungen und das Digital Spatial Profiling (DSP)-Experiment vor. Lagere die Objektträger bei 4 °C bis zur Anwendung (idealerweise < 6 Monate).

3. RNAscope In-situ Hybridisierung (ISH) und histologische Färbung

  1. RNAscope ISH
    1. Backe die Folien über Nacht in einem Trockenofen bei 60 °C, um die Gewebehaftung an den Objektträgern zu verbessern.
    2. Deparaffinisation: Untertauchen der Folien in Xylol (3 × 5 Min), gefolgt von 100 % Ethanol (2 × 3 Min). Trockene Rutsche bei 60 °C für 7 Minuten.
    3. Führen Sie den RNAscope 2.5 HD Red ISH-Test gemäß dem Protokoll des Herstellers durch. Blockieren Sie endogene Peroxidase mit 3 % H2O2 für 10 Minuten bei RT; Spülen Sie in destilliertem (DI) Wasser.
    4. Inkubieren Sie die Objektträger in vorgeheiztem, 100 °C Rückholpuffer (verdünnt 1:10 in DI-Wasser) für 15 Minuten (verwenden Sie 200 ml Rückholpuffer für ein Rack mit bis zu 24 Objektträgern in einem Dampfgerät), tauchen Sie 100 % Ethanol fünfmal in und trocknen die Objektträger bei 60 °C für 7 Minuten. Erzeugen Sie eine hydrophobe Barriere für Lösungen rund um das Gewebe mit einem hydrophoben PAP-Stift.
    5. Stellen Sie die Objektträger in ein Hybridisierungsofengitter, geben Sie 200 μL Verdauungsenzympräparat (vom Händler in Tropfflaschen vorverdünnt) zu jedem Objektträger und inkubieren Sie bei 40 °C für 15 Minuten. Spüle die Objektträger zweimal in DI-Wasser.
    6. Tragen Sie die Objektträger mit positiver Kontrollprobe Human PPIB an und inkubieren Sie 2 Stunden bei 40 °C. Wasche die Objektträger zweimal im Waschpuffer.
    7. Durchführung einer sequentiellen Verstärkung: AMP1 bei 40 °C für 30 Minuten; AMP2 bei 40 °C für 15 Minuten; AMP3 bei 40 °C für 30 Minuten; AMP4 bei 40 °C für 15 Minuten; AMP5 bei RT für 30 Minuten; und AMP6 bei RT für 15 Minuten. Waschen Sie zwischendurch 2 x 2 Minuten.
    8. Füge eine Fast Red funktionierende Lösung hinzu, inkubiere 10 Minuten im RT. Lassen Sie die Rutschen ab, tauchen Sie sie in DI-Wasser und tauchen Sie sie dann fünfmal in frisches DI-Wasser. Bestätigen Sie, dass die positiven Kontrollpunkte des PPIB als diskrete, punktierte rote Punkte erscheinen.
    9. Gegenfärbe mit Gills 1 Hämatoxylin, tauche 5 Mal in 2 Wechsel des DI-Wassers, Blau in 0,02 % Ammoniumhydroxid und tauche 5 Mal in 2 Wechsel DI-Wasser. Bestätigen Sie, dass die Kerne blau färben und die Gewebemorphologie erhalten bleibt. Lass die Folien über Nacht trocknen und bedecke sie mit Befestigungsmedium.
  2. Alizarin Red S-Flecken
    1. Für zusätzliche serielle Schnitte wiederholen Sie die Deparaffinisierung und Rehydration in den Schritten 3.1.2.
    2. Bestätigen Sie, dass der pH-Wert der Alizarin Red S-Lösung 4,1-4,3 ist.
    3. Tauchen Sie die Objektträger in Alizarin Red S für 30–60 Sekunden oder bis Kalziumablagerungen eine orange-rote Farbe entwickeln.
    4. Schüttle übermäßig färbende Farbe ab. Dehydriere mit 20 schnellen Dips in 100% Aceton, dann 20 Dips in Aceton:Xylen (1:1).
    5. Reinigen Sie die Folien in zwei frischen Xylenbädern, jeweils 3 Minuten. Deckdeckel mit Montagemedium.

4. GeoMx DSP-Folienvorbereitung und ROI-Auswahl

  1. Reinigen Sie vor Beginn alle Geräte und Behälter mit RNAse-inaktivierender Lösung und trocknen oder spülen Sie sie mit DEPC-behandeltem Wasser, um RNA-Kontaminationen zu vermeiden. Befolgen Sie die Anweisungen für den räumlichen RNA-Profiling-Assay.
  2. Backe die Folien über Nacht in einem Trockenofen bei 60 °C, um die Gewebehaftung an den Objektträgern zu verbessern.
  3. Deparaffinisierung und Rehydrierung: Untertauchen von Objektträgern in Xylol (3 × 5 Min), gefolgt von 100 % Ethanol (2 × 5 Minuten und 95 % Ethanol, verdünnt in DEPC-behandeltem Wasser, für 5 Minuten. Übertragen Sie die Objektträger auf 1× PBS für 1 Minute.
  4. Inkubiere die Objektträger in vorgeheiztem, 100 °C Tris/EDTA-pH 9,0 Antigen-Rücknahmepuffer für 20 Minuten und übertrage die Objektträger auf 1× PBS für 5 Minuten bei RT.
  5. Inkubiere die Objektträger in vorgewärmter 1,0 μg/ml Proteinase K für 15 Minuten und spüle in 1× PBS für 5 Minuten bei RT.
  6. Postfixiere die Objektträger mit 10 % NBF (200 μL pro Objektträger) für 5 Minuten bei RT und wasche 5 Minuten in PBS.
  7. Entferne die Objektträger aus PBS, klopfe auf ein Küchenpapier, wische überschüssige Flüssigkeit um das Gewebe mit einem Kimwipe ab und stelle sie in das Hybridisierungsfärbungsgestell.
  8. Fügen Sie jedem Schlitten 200 μL Hybridisierungslösung (verdünnt 1:10 in Puffer W) hinzu und wenden Sie einen Hybridisierungsschluf an. Schließen Sie die Hybridisierungskammer, setzen Sie sie in den Ofen und bebrüten Sie sie über Nacht bei 37 °C.
  9. Dip-Slides werden im Kochsalz-Natriumcitrat-Puffer (SSC, 2×) eingesetzt und ermöglichen es, dass die Hybridisationsglitze innerhalb von 5 Minuten von selbst abgleiten.
  10. Waschen Sie die Objektträger in einem strengen Waschpuffer, der zu gleichen Teilen 4× SSC und deionisiertem Formamid bei 37 °C besteht, 25 Minuten pro Wasch. Wasche die Folien in 2× SSC-Puffer, 2 Minuten pro Wasch.
  11. Blockiere die Slides mit Buffer W auf RT für 30 Minuten.
  12. Das Gewebe 1 Stunde lang mit einer Primärantikörperlösung (Rabbit Anti-CD45) in der Feuchtigkeitskammer-Schachtel bei RT abdecken, 3x mit 2× SSC-Puffer waschen.
  13. Sekundäre Antikörperlösung (Goat Anti-Rabbit IgG-AF647) für 1 Stunde auftragen und in 2× SSC-Puffer waschen.
  14. Gewebe 1 Stunde lang in der Feuchtigkeitskammer-Schachtel in der Feuchtigkeitskammer bei RT abdecken. Waschen Sie in 2× SSC-Puffer.
  15. Färben Sie die Objektträger 10 Minuten lang in einem 2 μM Syto83-Kernmarker, verdünnt in Puffer W, für 10 Minuten.
  16. Scannen Sie die Objektträger mit einem RNA-Profilierungsinstrument, um die morphologische Markerfärbung zu visualisieren. Wählen Sie ROIs proximal und distal zu verkalkten Läsionen jedes Arteriengewebes aus und anmerken die schichtspezifische Lage jeder ROI.
    HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, um die Bildung von Luftblasen zu verhindern, wenn Sie den Hybridisierungsschlitz auf die Gewebeschnitte anbringen.

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Ergebnisse

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Das hier beschriebene Protokoll leitet die Forscher vom Empfang der Tibiaarterien bis zur Erstellung von TMA-Objektträgern, die sowohl die Morphologie als auch die RNA-Integrität für die räumliche Transkriptomik-Analyse bewahren. Es beschreibt außerdem histologische Methoden zur Visualisierung von Calciumablagerungen in Arterien, morphologische Markerfärbungen und ROI-Auswahlstrategien.

In Abbildung 1 sind die Arterien bei 10 % NB...

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Diskussion

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Dieses Protokoll beschreibt die Schritte, die erforderlich sind, um verkalkte menschliche Tibiaarterien für das räumliche transkriptomische Profiling auf dem NanoString GeoMx DSP vorzubereiten. Die Tibiaarterien besitzen, wie alle Gefäße, konzentrische Intima-, Media- und Adventitienschichten, die jeweils unterschiedliche Zellpopulationen beherbergen, die Verletzungen und Reparaturen orchestrieren. Die Aufrechterhaltung der Architektur dieser Schichten ist für schichtaufgelöste transkrip...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde durch einen Startzuschuss des VA Puget Sound, den VA Merit Award I01 BX004975-02 sowie Ressourcen und die Nutzung der Einrichtungen im VA Puget Sound Health Care Center unterstützt.  Das Werk stammt von den Autoren und spiegelt nicht notwendigerweise die Position oder Politik des Department of Veteran Affairs oder der US-Regierung wider.  Wir möchten den Bildgebenden Service des Histology and Imaging Core (HIC) an der University of Washington würdigen.  Wir möchten Dr. Shreeram Akilesh für seine Anleitung zu DSP-Experimenten an der University of Washington und seiner Gruppe bei MANTIS Labs: UW Spatial Biology Core danken.  Wir möchten auch Nishi Ivanov vom Diabetes Research Center der University of Washington für die histologische Färbung würdigen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Dulbeccos modifiziertes Adlermedium (DMEM), hoher Glukosespiegel, Pyruvat Thermo Fisher Scientific11995065
4-(2-Hydroxyethyl)-1-Piperazineethanesulfonsäure (HEPES) Pufferlösung, 1 MThermo Fisher Scientific15630080
Penicillin-Streptomycin (P/S), 10.000 U/mLThermo Fisher Scientific15140122
10 % neutrales Formalin (NBF)Millipore Sigma65346-M
Ethylen-Diamin-Tetraessigsäure (EDTA)Millipore Sigma3620
RNAlater-StabilisierungslösungThermo Fisher ScientificAM7024RNA-Stabilisierungslösung (RSS)
Wasserstoffperoxid (H2O2)Advanced Cell Diagnostics, Inc322335
ZielabruflösungAdvanced Cell Diagnostics, Inc322001
Protease PlusAdvanced Cell Diagnostics, Inc322331Nahrungsergänzungsmittel für Verdauungsenzyme
DapB (Negativkontrolle)Advanced Cell Diagnostics, Inc310043
RNAscope-Waschpuffer (RNAscope 2.5 HD Red ISH Assay-Kit)Advanced Cell Diagnostics, Inc320058
AMP1Advanced Cell Diagnostics, Inc324511
AMP2Advanced Cell Diagnostics, Inc324512
AMP3Advanced Cell Diagnostics, Inc324513
AMP4Advanced Cell Diagnostics, Inc324514
AMP5 RotAdvanced Cell Diagnostics, Inc324515
AMP6 RotAdvanced Cell Diagnostics, Inc324516
Fast Red AAdvanced Cell Diagnostics, Inc324517
Menschliches PPIBAdvanced Cell Diagnostics, Inc313901
Gill' s HämatoxylinMillipore SigmaGHS132
Antigenentnahme, Tris/EDTA pH 9Thermo Fisher Scientific00-4956-58
Proteinase KThermo Fisher ScientificAM2546
Hybridisierungslösung – Hs WTANanostring121401102
HybrislipHybridisierungsverschiebung
Hybridisierungslösung – Puffer RNanostring121300313
Kaninchen anti-CD45 Zellsignalübertragung1317
Puffer WNanostring121300313
Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-AF647Jackson Immunforschung111-605-144
Maus anti-SMA-AF488 Thermo Fisher Scientific53-9760
Syto83 Thermo Fisher ScientificS11364
Chirurgische KlingeBD Biosciences371110
Superfrost  Plus Mikroskop-ObjektträgerThermo Fisher Scientific1255015
ImmEdge-Stift
Mikrotome-KlingenThermo Fisher Scientific22-500-125
RNase WEGRNase-Inaktivierungslösung
Ausrüstung
HybEZ Hybridisierungsofen Advanced Cell Diagnostics, Inc321710
GeoMx Digitaler RäumlichkeitsprofilerNanostring Modell: GeoMx DSP
Datenzugriffsplattform: GeoMx DSP Control Center (Version 3.1.2.12)		Kanalscan-Einstellung: Für FITC beträgt die Explosurezeit 300 ms, und die Fluorophore ist AlexaFluro 488; für Kanal Cy3 beträgt die Belichtungszeit 50 ms, und das Fluorophor ist Syto83; und für Kanal Cy5 beträgt die Belichtungszeit 300 ms, und das Fluorophor ist AlexaFluor 647.

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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