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Forschungsartikel

Neuregulin1-ErbB4-Signalgebung beteiligt an der Akupunktur, die die Myelinregeneration bei Rückenmarksverletzungsratten fördert

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DOI:

10.3791/69166

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20. Februar 2026

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1Department of Emergency and Intensive Care Unit, Beijing Anzhen Nanchong Hospital of Capital Medical University & Nanchong Central Hospital, 2Department of Neurology, Beijing Anzhen Nanchong Hospital of Capital Medical University & Nanchong Central Hospital, 3Department of Emergency and Intensive Care Unit, First Affiliated Hospital, Kunming Medical University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Studie zielt darauf ab, die Auswirkungen der Elektroakupunktur auf die Myelinregeneration in einem Rattenmodell von SCI zu untersuchen und zu überprüfen, ob der Neuregulin1 (NRG1)-ErbB4-Signalweg in diesem Prozess eine Rolle spielt.

Zusammenfassung

Rückenmarksverletzungen (SCI) führen häufig zu schweren neurologischen Dysfunktionen, und die Myelinreparatur ist ein entscheidender Schritt für die Wiederherstellung der neurologischen Funktion. Die Elektroakupunktur (EA), eine therapeutische Methode, die traditionelle Akupunktur mit elektrischer Stimulation kombiniert, wird im Bereich der Nervenreparatur weit verbreitet eingesetzt. Die spezifischen Signalwege, die an EA beteiligt sind, sind jedoch noch nicht vollständig geklärt. Diese Studie zielt darauf ab, die Auswirkungen von EA auf die Myelinregeneration bei SCI-Ratten zu untersuchen und zu überprüfen, ob der Neuregulin1 (NRG1)-ErbB4-Signalweg in diesem Prozess eine Rolle spielt. SCI-Ratten wurden durch eine Aneurysma-Clip-Verletzung im T10-Spinalsegment induziert. Ein Polyethylenkatheter (PE) wurde in den Wirbelkanal zwischen den L5-6-Zwischenwirbelräumen implantiert und subkutan fixiert, um ein langfristiges Arzneimittelabgabesystem zu etablieren. Exogenes NRG1 und sein Antagonist wurden alle zwei Tage über den PE-Katheter verabreicht, mit einem Volumen von 20 μL pro Injektion. Die EA-Behandlung wurde an den Akupunkturpunkten Dazhui (GV14) und Mingmen (GV4) alle zwei Tage angewendet, jede Sitzung dauerte 30 Minuten über 4 aufeinanderfolgende Wochen. Die Ergebnisse zeigten, dass die EA-Behandlung die Expression des Myelin-Basisproteins (MBP) im Rückenmarkgewebe signifikant förderte und die motorische Funktion der Hintergliedmaßen bei den Ratten verbesserte. Darüber hinaus erzeugte exogenes NRG1 ähnliche Effekte wie EA. Zusammenfassend spielt der NRG1-ErbB4-Signalweg eine wichtige Rolle bei der durch EA induzierten Myelinregeneration bei SCI-Ratten.

Einleitung

SCI ist eine traumatische Erkrankung, die zu schweren neurologischen Defiziten führt und sich typischerweise durch motorische Beeinträchtigungen, sensorischen Verlust und autonome Dysfunktion äußert, mit einer jährlichen Inzidenzrate von etwa 40–80 Fällen pro Million Menschen weltweit 1,2. Nach einer Verletzung sind axonale Ruptur und Myelinverlust die primären pathologischen Merkmale, die die neuronale Signalleitungbehindern. Myelin wird von Oligodendrozyten im zentralen Nervensystem (ZNS) und von Schwannzellen im peripheren Nervensystem (PNS) gebildet, und seine Integrität ist entscheidend für die schnelle Leitung von Nervenimpulsen4. Allerdings hemmen die entzündliche Reaktion, oxidativer Stress und die Bildung von Gliennarben in der lokalen Mikroumgebung nach SCI die Myelinregeneration signifikant, was zu chronischer neurologischer Dysfunktionführt. Gleichzeitig führt der Tod der Oligodendrozyten (OLs) nach SCI zur Demyelinisierung von Axonen, einem Prozess, der chronisch und persistent entsteht. Studien haben gezeigt, dass die axonale Demyelinisierung sowohl im menschlichen als auch in tierischen Modellen durch Myelinregeneration6 wirksam repariert werden kann. Daher ist die Suche nach Strategien zur Förderung der Myelinreparatur eine der wichtigsten Richtungen in der Behandlung von SCI.

Akupunktur, als uralte traditionelle medizinische Technik, wurde in der klinischen Praxis in mehreren Ländern weit verbreitet angewendet, darunter China, Korea und Japan 7,8. EA, das traditionelle Akupunktur mit elektrischer Stimulation kombiniert, wurde in klinischen Einrichtungen weit verbreitet eingesetzt. Zunehmende Belege zeigen, dass EA therapeutische Effekte auf verschiedene Krankheiten hat, insbesondere bei der Förderung der Myelinregeneration nach Rückenmarksverletzungen. Die Auswahl der Akupunkturpunkte ist während der EA-Behandlung wie GV14 und GV49 entscheidend. GV14 befindet sich unterhalb des Spinusfortsatzes des 7. Halswirbels, nahe der Mittellinie der Wirbelsäule, während GV4 zwischen den Spinusfortsätzen des 2. und 3. Lendenwirbels liegt. Frühere Studien haben gezeigt, dass entzündliche Signalwege, oxidativer Stress, neurotrophe Faktoren und Autophagie eine Rolle bei der EA-induzierten Myelinreparaturspielen. Darüber hinaus deuten zunehmende Evidenzen darauf hin, dass bestimmte Akupunkturpunkte wie GV14 und GV4 eine aktive Rolle bei der Förderung der Myelinregeneration während der EA-Behandlungspielen. Die molekularen Mechanismen, durch die EA die Myelinregeneration nach einer Rückenmarksverletzung reguliert, sind jedoch nicht vollständig aufgeklärt.

NRG1 gehört zur Familie der epidermalen Wachstumsfaktoren und kann basierend auf seiner aminoterminalen Region in sechs Typen (I-VI)16 eingeteilt werden. NRG1 und seine Rezeptorfamilie ErbB (ErbB1/2/3/4) spielen eine bedeutende Rolle bei der Entwicklung und Reparatur des Nervensystems, einschließlich Prozessen wie neuronaler Migration, Differenzierung, Remyelinisierung und Synaptogenese. Während der Entwicklung des PNS proliferieren und migrieren Schwann-Zellen (SCs) entlang der Axone von Neuronen, um Myelin zu bilden, und der NRG1-ErbB4-Signalweg spielt eine Schlüsselrolle bei der Reifung der PNS-Schwann-Vorläuferzellen17,18. Frühere Studien haben gezeigt, dass der NRG1-Signalweg an der Differenzierung neuronaler Stammzellen zu Schwann-Zellen beteiligt ist und die Myelinreparatur von neuronalen Zellen nach SCI19 fördert. Außerdem hat eine Studie gezeigt, dass nach einer Rückenmarksverletzung der NRG1-ErbB4-Signalweg die Umwandlung von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs) in Schwann-ähnliche Zellen mit Remyelinisierungspotential20 fördert. Alex et al. konstruierten ein Kokultursystem aus vom Menschen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten sensorischen Neuronen und Ratten-Schwann-Zellen und stellten fest, dass das Blockieren des NRG1-ErbB-Signalwegs mit Medikamenten die neuronale Myelinisierung signifikant hemmte, was direkte Hinweise auf die Rolle dieses Weges bei der Förderung der menschlichen sensorischen Axon-Myelinisierung21 lieferte. Eine weitere Studie hat ebenfalls gezeigt, dass die EA-Behandlung die Expression von NRG1 im Rückenmark erhöhen und entzündliche Schmerzenlindern kann.

Die Forschung zur Wirkung von EA auf den NRG1-ErbB4-Signalweg bei SCI ist begrenzt, und die zugrunde liegenden Mechanismen bleiben unklar. Diese Studie soll untersuchen, ob die EA-Stimulation an den Akupunkturpunkten von GV14 und GV4 die NRG1-ErbB4-Signaltransduktion regulieren kann, und deren potenzielle Rolle bei der Förderung der Myelinregeneration und der Wiederherstellung der neurologischen Funktion bei SCI-Ratten zu untersuchen. Dies ist die erste Studie, die die Beziehung zwischen dem NRG1-ErbB4-Signalweg und EA-induzierter Myelinregeneration bei SCI-Ratten untersucht und experimentelle Belege für die Entwicklung neuartiger und wirksamer Behandlungsstrategien für SCI liefert.

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Protokoll

Alle ethischen Richtlinien wurden während des Experiments befolgt, um das Leiden der Tiere zu minimieren. Das experimentelle Protokoll und das Design wurden vom Tierversuchsausschuss der Medizinischen Universität Kunming genehmigt (Genehmigungsnummer KMMU2021051) und gemäß den Richtlinien der Universität für Tierforschung durchgeführt wird. Erwachsene männliche Sprague-Dawley-Ratten (8 Wochen alt, 250-270 g, n = 60) wurden von der Kunming Medical University (Yunnan, China) bezogen.

Tierzubereitung

Die Tiere wurden in einer kontrollierten Umgebung mit konstanter Luftfeuchtigkeit, moderater Temperatur und einem 12-Stunden-Licht-/Dunkelzyklus untergebracht. Die Tiere wurden zufällig in 11 Gruppen eingeteilt: Sham-Operationsgruppe (S, n = 6), SCI-Gruppe (M, n = 6), SCI mit EA-Behandlungsgruppe (M + EA, n = 6), SCI mit NRG-1β-Behandlungsgruppe (M + NRG-1β, n = 6), SCI mit 5 % DMSO-Lösungsmittelgruppe (M + D, n = 6), SCI mit PD158780 Inhibitor und NRG-1β-Behandlungsgruppe (M + PD+NRG-1β), n = 6), SCI mit PD158780 Inhibitor- und EA-Behandlungsgruppe (M + EA + PD, n = 6), SCI mit Lösungsmittel- und EA-Behandlungsgruppe (M + EA + D, n = 6), SCI mit shRNA- und EA-Behandlungsgruppe (M + EA + shRNA, n = 6), SCI mit Lentivirus-enthaltendem nicht-zielgerichtetem shRNA und EA-Behandlungsgruppe (M + EA + NC, n = 6), SCI mit shRNA-Behandlungsgruppe (M + shRNA, n = 6). Die aktuelle Stichprobengröße wurde auf Grundlage unserer bisherigen Erfahrungen mit ähnlichen Modellen und Interventionen bestimmt, die mit dieser Zahl durchgehend signifikante Effekte gezeigt haben. Darüber hinaus beobachteten wir trotz der Stichprobengröße statistisch robuste und signifikante Unterschiede in den wichtigsten Endpunkten, was das Vertrauen in die berichteten Ergebnisse stärkt.

SCI-Rattenmodell

Ein Yasargill-Aneurysmaclip (Titan, Standard-Schließkraft von 70 g) wurde verwendet, um ein Rattenmodell von SCI mit einer Klemmtechnik zu erstellen (Abbildung 1A). Die Ratten wurden mit 2 % Natriumpentobarbital (30 mg/kg, intraperitoneal) betäubt und auf einen Operationstisch gelegt. Es wurde ein 3–4 cm großer Schnitt in die Rückhaut gemacht, gefolgt von einer schichtweise Zerlegung des subkutanen Gewebes und des Muskels, um die T9-11 thorakalen Dornen und Wirbelbögen freizulegen. Ein Gefäßclip wurde verwendet, um den T10 thorakalen Spinalfortsatz und den Wirbelbogen zu entfernen und das Rückenmark vollständig freizulegen. Der Yasargill-Aneurysmaclip wurde vertikal über das gesamte T10-Segment positioniert und nach einer Verweilzeit von 60 Sekunden schnell freigegeben. Das Modell galt als erfolgreich, wenn zwei oder mehr der folgenden Anzeichen beobachtet wurden: (1) spasmodisches Zittern des Körpers, (2) Schwanzwedelreflex und (3) sichtbare schwarze Kneifspuren am Rückenmark. Nachdem eine ausreichende Hämostase gewährleistet war, wurde der Schnitt desinfiziert und genäht. In der Scheinoperationsgruppe wurde derselbe Eingriff durchgeführt, jedoch wurde das Rückenmark nicht abgeklemmt. Postoperativ erhielten die Ratten normale Kochsalzlösung (3 ml, intraperitoneal) zur Rehydrierung und Penicillin (100.000 Einheiten, intraperitoneal) einmal morgens und einmal abends für drei aufeinanderfolgende Tage, um eine Infektion zu verhindern. Manuelle Hilfe beim Wasserlassen wurde gewährt, bis das spontane Wasserlassen wiederhergestellt wurde (2x täglich).

Ratten-intrathekale Schläuche und Medikamentenabgabe

Nach der Methode von Storkson et al.23 wurde bei Ratten eine Woche vor der Induktion des SCI-Modells ein Katheter in den Subarachnoidalraum implantiert. Nach der Anästhesie wurden die Ratten auf dem Operationstisch fixiert und der Zwischenwirbelraum L5-6 freigelegt. Eine 19G-Nadel wurde verwendet, um vertikal in die Dura Mater und die Arachnoidalmembran einzudringen. Die Nadel wurde etwa 1–2 mm vorgeschoben, und nach dem Durchbruch der Arachnoidalmembran wurde ein Raumgefühl wahrgenommen, gefolgt von einem klaren Durchfluss von Gehirnspinalflüssigkeit, was auf eine erfolgreiche Punktion hindeutet. Ein PE-10-Katheter (Polyethylen, Innendurchmesser 0,38 mm, Außendurchmesser 1,09 mm) wurde entlang der Stichnadel in den Subarachnoidalraum eingeführt. Der Katheter wurde auf eine Länge von etwa 3 cm vorgeschoben, wobei die Katheterspitze in der Nähe des L3-Wirbelkörpers positioniert war. Während des Einsatzes wurden bei den Ratten Schwanzzucken und Zuckungen der Hintergliedmaßen beobachtet, und das Gehirnspinalwasser floss durch den Katheter, was die Position des Katheters im Subarachnoidalraum bestätigte.

Sowohl NRG-1β als auch PD158780 wurden in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst und anschließend mit künstlicher Gehirnspinalflüssigkeit (ACSF) verdünnt, sodass die endgültige DMSO-Konzentration unter 0,5 % fiel. Die endgültigen Arbeitskonzentrationen betrugen 20 nM für NRG-1β und 20 μM für PD15878024. Am zweiten Tag nach der SCI erhielten Ratten der M+NRG-1β-Gruppe alle zwei Tage intrathekale Injektionen von 20 μL NRG-1β. Ratten in der M + EA + PD-Gruppe erhielten 20 μL PD158780 intrathecal25 Stunden, 2 Stunden vor der EA-Behandlung.

EA-Behandlung

Am drittenTag nach der Operation wurden die Ratten auf dem Behandlungstisch zur Elektroakupunkturtherapie (EA) an den Akupunkturpunkten GV14 und GV4 fixiert (Abbildung 1B). Zwei Akupunkturnadeln (0,25 mm x 13 mm) wurden in diese Punkte mit einer Tiefe von 3–4 mm eingeführt. Die EA-Therapie erfolgte mit einem Elektroakupunkturgerät mit einem dünn-dichten Wellenmuster (Sparse Wave bei 2 Hz und dichte Welle bei 10 Hz, mit einem Frequenzverhältnis von 1:5). Die Ausgangsintensität wurde auf 5 (etwa 0,5 mA) für 30 Minuten eingestellt, alle zwei Tage.

Verhaltensbewertung

Die Lokomotorik wurde mit der Basso, Beattie, and Bresnahan (BBB) Skala27 bewertet, die Gliedmaßenbewegung, Gang, Koordination und Pfotenposition zu folgenden Zeitpunkten bewertet: 0, 3, 7, 14, 21 und 28 Tage nach der Operation ( Abbildung 2D). Die BBB-Skala reicht von 0 (steht für vollständige Lähmung) bis 21 (was den normalen Gang anzeigt). Alle Bewertungen wurden unabhängig voneinander von zwei Forschern durchgeführt, die für die experimentellen Gruppenzuweisungen blind waren.

Probenentnahme

Nach Abschluss des Experiments wurden anästhesierte Ratten auf einer Dissektionsplattform zur Gewebesammlung fixiert. Die Bauchhöhle wurde geöffnet, um das Zwerchfell vollständig freizulegen, das sorgfältig mit einer Irisschere eingeschnitten wurde, um Gefäßverletzungen zu vermeiden. Der Brustkorb wurde dann an beiden Rippenrändern aufgeschnitten, um das Herz freizulegen, woraufhin eine Nadel in den linken Ventrikel am Apex eingeführt und etwa 300–400 ml vorgekühltes PBS schnell perfundiert wurden, um systemisches Blut zu reinigen, bis klare Flüssigkeit aus dem rechten Vorhof floss. Für die molekulare Proteinanalyse wurde die Perfusion in diesem Stadium gestoppt und die Wirbelsäule seziert. Nachdem benachbarte Rippen und Muskeln entfernt wurden, um die Wirbel freizulegen, wurde das T10-Segment lokalisiert, und ein Rückenmarkssegment von etwa 1 cm Rostral und Caudal bis T10 wurde mit einer Irisschere gesammelt, dann in flüssigem Stickstoff gefroren und bei -80 °C gelagert. Zur morphologischen Untersuchung wurde die Perfusion nach PBS auf 4 % Paraformaldehyd umgestellt, wobei eine erfolgreiche Fixierung durch Muskelkontraktion und Steifheit des Rumpfes angezeigt wurde. Dasselbe Spinalsegment wurde dann sorgfältig seziert, um die Gewebearchitektur zu erhalten, und 48 Stunden lang in 4 % Paraformaldehyd bei 4 °C fixiert.

Hämatoxylin- und Eosin-Färbung

Die Paraffinabschnitte des Rückenmarks wurden 30 Minuten in einen 60 °C Ofen zum Vorheizen gelegt. Entwachsen: Xylol I für 15 Minuten, gefolgt von Xylol II für 15 Minuten. Rehydrierung: Behandelt mit 100 % Ethanol für 2 Minuten, dann mit 95 % Ethanol für 2 Minuten, dann mit 80 % Ethanol für 2 Minuten, gefolgt von 70 % Ethanol für 2 Minuten. Und schließlich destilliertes Wasser für 5 Minuten. Die Hämatoxylin-Färbung erfolgte 7 Minuten, gefolgt von einem Abspülen mit destilliertem Wasser, um die Restfärbungslösung zu entfernen. Die Differenzierung mit 1 % Salzsäurealkohol erfolgte 3 Sekunden lang, gefolgt von einer Spülung mit destilliertem Wasser, um die Restfärbungslösung zu entfernen. Es wurde 2 Minuten lang mit 5% Ammoniakwasser geblünkt, gefolgt vom Abwaschen der restlichen Bläulösung. Es wurde 30 Sekunden lang eine Eosin-Färbung durchgeführt, gefolgt von einem Abspülen mit destilliertem Wasser, um die Restverfärbungslösung zu entfernen. Die Dehydrierung der Abschnitte erfolgte mit 70 % Ethanol für 10 Sekunden, dann 80 % Ethanol für 10 Sekunden und schließlich mit 100 % Ethanol für 30 Sekunden. Die Beseitigung erfolgte durch 5 Minuten Behandlung mit Xylen. Nach der Montage wurden die Objektträger an der Luft getrocknet, und nach dem Trocknen wurden Bilder aufgenommen.

Luxol schnelle blaue Färbung

Die Schnitte wurden jeweils zweimal mit Xylol für jeweils 10 Minuten entwachst, dann mit LFB-Myelin-Färbungslösung gefärbt und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Am folgenden Tag wurde überschüssige Färbungslösung mit 90 % Ethanol entfernt. Die Schnitte wurden in einer Luxol-Differenzierungslösung für 10 s (C0631S) differenziert, gefolgt von einer Immersion in 75 % Ethanol für 30 s, bis die graue Substanz klar erschien. Abschließend wurden die Schnitte 1 Minute lang mit einer Eosin-Färbungslösung gekonterfärbt.

Westliche Blotting

Die Proteinproben wurden 5 Minuten lang in Wasser gekocht. Insgesamt wurden zunächst 5 μL Proteinmarker in das Elektrophorese-Gel geladen, gefolgt von sequentiellem Laden der Testproteinproben. Die Elektrophorese wurde bei 80 V eingeleitet, bis die Markierbänder klar getrennt waren, danach wurde die Spannung auf 130 V erhöht und bis zum Abschluss der Elektrophorese aufrechterhalten. Vorgeschnittene PVDF-Membranen wurden 1 Minute lang in Methanol aktiviert, dann auf Filterpapier gelegt und mit dem vorbereiteten Gel überzogen. Der Proteintransfer erfolgte mit einem konstanten Strom von 300 mA, wobei die Übertragungszeit entsprechend dem Molekulargewicht angepasst wurde (± 10 min). Nach dem Transfer wurde die PVDF-Membran in eine Inkubationsbox gelegt, 5 Minuten lang mit TBST-Puffer abgespült und dann mit 5 % Magermilch bei Zimmertemperatur auf einem Shaker für 2 Stunden verstopft. Die Membran wurde anschließend dreimal mit einem TBST-Puffer jeweils 5 Minuten lang gewaschen, bevor sie mit primären Antikörpern inkubiert wurde, darunter GAPDH (1:2000), Tubulin (1:2000), NRG1 (1:1000), ErbB4 (1:1000) und MBP (1:1000), über Nacht bei 4 °C mit sanftem Schütteln. Am folgenden Tag wurde die Membran dreimal mit einem TBST-Puffer für jeweils 5 Minuten gewaschen und dann mit einem sekundären Antikörper, dem Ziegenantikaninchen (1:4000), bei Zimmertemperatur auf einem Shaker für 2 Stunden inkubiert. Nach dem Waschen mit TBST wurden die Proteinbänder mittels Chemilumineszenz visualisiert. Importiere das WB-Bild in die ImageJ-Software und führe eine Hintergrundsubtraktion mit einem rollenden Kugelradius von 50 Pixeln durch. Für geneigte Bänder verwenden Sie das Werkzeug Segmentierte Linie, um die Bänder zu begradigen. Verwenden Sie das Rechteck-Werkzeug, um die Zielbänder auszuwählen und ein Dichteprofil zu erstellen, indem Sie Spuren aufzeichnen , um die Graustufenwerte der Bänder zu visualisieren. Nutze das Magic Wand Werkzeug, um die Spitzen zu segmentieren und die Graustufenwerte zu extrahieren. Nach dem Speichern der Daten verwenden Sie die Software GraphPad Prism, um Balkendiagramme zu erstellen.

Immunfluoreszenz

Paraffinabschnitte wurden jeweils zweimal mit Xylol für jeweils 10 Minuten entwachst und durch eine graduierte Ethanolserie rehydriert. Die Antigenentnahme erfolgte, indem die Schnitte 15 Minuten in 5 % Zitronensäurelösung gekocht und anschließend 2 Stunden lang mit 10 % Ziegenserum blockiert wurden. Die Schnitte wurden dann über Nacht bei 4 °C mit folgenden primären Antikörpern inkubiert: mausmonoklonales NRG-1 (1:200), monoklonales Kaninchen-ErbB4 (1:300) und humanes monoklonales MBP (1:300). Nach drei Waschgängen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 0,1 % Triton X-100 (PBST) für jeweils 10 Minuten wurden die Schnitte 1 Stunde im Dunkeln mit folgenden sekundären Antikörpern inkubiert: FITC-markiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG (1:500), FITC-markiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (1:500) und FITC-markiertes Ziegen-Anti-Mensch-IgG (1:500). Die Abschnitte wurden dreimal mit PBST für jeweils 10 Minuten gewaschen, dann fixiert und mit Antifade-Reagenz montiert, um die Fluoreszenzsignale zu erhalten. Die Objektträger wurden im Dunkeln bei 4 °C aufbewahrt. Nachdem Sie die Zielzellen unter einer 10-fachen Objektivlinse mit einem Fluoreszenzmikroskop lokalisiert haben, wechseln Sie zu einer 40-fachen Linse, um das Fluoreszenzbild aufzunehmen.

Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR)

Primer für ErbB4 und das Referenzgen GAPDH wurden mit der NCBI-Website entwickelt. Die Reihenfolge der Primer waren wie folgt: ErbB4 vorderer Primer: ACAGCCCTCCTCCTGCCTAC; ErbB4 Rückwärtsprimer: ATCTCAGCCGTTGCACCCT; GAPDH-Primer vorwärts: CCCAGCTTAGGTTCATCATCAGGT; GAPDH Rückzünder: TACGCCAAATCCGTTCACACA. Etwa sobohnengroßes Rückenmarksgewebe wurde in ein 1,5 mL Zentrifugenrohr gelegt, und 600 μL Gesamt-RNA-Extraktionsreagenz wurden hinzugefügt. Das Gewebe wurde gründlich homogenisiert und 5 Minuten auf Eis inkubiert, gefolgt von einer Zentrifugation bei 12.000 x g für 5 Minuten bei 4 °C. Der Supernatant wurde auf ein neues 1,5-ml-Rohr übertragen, und 400 μL Chloroform wurden zugesetzt. Die Mischung wurde gründlich vermischt und bei 12.000 x g für 5 Minuten bei 4 °C zentrifugiert. Das Supernatant wurde erneut in ein neues Rohr übertragen, und 400 μL Isopropanol wurden zugesetzt. Die Lösung wurde 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von einer Zentrifugation mit 12.000 x g für 10 Minuten. Der Supernatant wurde entsorgt und das RNA-Pellet mit 400 μL 75 % Ethanol gewaschen. Nach der Zentrifugation bei 7.500 x g für 5 Minuten bei 4 °C wurde das Überlagerungsmittel entsorgt und das Rohr umgedreht, um auf einer sauberen Oberfläche an der Luft zu trocknen. Das RNA-Pellet wurde in 60 μL RNA-freiem Wasser gelöst, gründlich gemischt und die RNA-Konzentration gemessen. Die Reinheit und Konzentration der RNA wurden durch Messung der Absorption bei 260 nm und 280 nm erfasst, wobei das Verhältnis von 260/280 bei etwa 2,0 lag. Für die cDNA-Synthese wurden Reaktion 1 (mit gDNA-Radierer usw.) und Reaktion 2 (mit Reverse-Transkriptase usw.) gründlich vermischt, und die Mischung wurde bei 95 °C für 15 Minuten inkubiert. Das Fluoreszenz-PCR-Reaktionssystem wurde gemäß den Anweisungen des cDNA-Synthese-Kits vorbereitet. Eine 2-μL-Probe wurde zu 23 μL PCR-Reaktionsmischung hinzugefügt, und die Amplifikation erfolgte gemäß dem fluoreszenz-quantitativen PCR-Kit-Protokoll. Die Glühtemperatur wurde auf 60 °C eingestellt, und die Verstärkungsbedingungen waren wie folgt: Vordenaturierung: 95 °C für 30 Sekunden, 1 Zyklus; PCR-Reaktion: 95 °C für 3 Sekunden, 60 °C für 30 Sekunden, 40 Zyklen; Die Analyse der Dissoziationskurve wurde wie folgt durchgeführt: 95 °C für 5 S, 60 °C für 30 S, gefolgt von einem allmählichen Anstieg von 60 °C auf 95 °C mit kontinuierlicher Fluoreszenzsignalaufnahme. CT-Werte wurden mit der Bio-Rad-Computersoftware gemessen und berechnet, und die relativen mRNA-Werte wurden mit der 2-ΔΔCt-Methode bestimmt.

Sicherheits- und Handhabungsrichtlinien

Paraformaldehydfixierung: Verwenden Sie Paraformaldehyd ausschließlich in einer gut belüfteten Abzugshaube. Tragen Sie immer geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA), einschließlich Maske, Handschuhe, Laborkittel und Schutzbrillen. Bewahren Sie Paraformaldehydlösung in einem dicht verschlossenen Behälter auf, fern von direkter Sonneneinstrahlung und Wärmequellen. Entsorgen Sie Paraformaldehyd gemäß den Laborsicherheitsrichtlinien der Kunming Medical University, indem Sie es in einen gefährlichen Abfallbehälter legen.

DMSO-Lösung: DMSO kann über die Haut aufgenommen und in den Körper gelangen. Tragen Sie während der Handhabung geeignete PSA, einschließlich Handschuhe und Schutzbrillen. Bewahren Sie das DMSO in einem verschlossenen Behälter bei Raumtemperatur auf, fern von starken Oxidationsmitteln. Entsorge das Abfall-DMSO gemäß den Laborsicherheitsrichtlinien der Kunming Medical University, indem man ihn in einen Gefahrenbehälter legt.

Pentobarbitalanästhesie: Pentobarbital ist eine kontrollierte Substanz und sollte nur von autorisiertem Personal behandelt werden. Vermeiden Sie eine unbeabsichtigte Berührung während der Handhabung und sorgen Sie für eine ordnungsgemäße Belüftung während der Benutzung. Tragen Sie geeignete Schutzausrüstung. Lagern Sie Pentobarbital in einem verschlossenen Schrank bei Zimmertemperatur unter Aufsicht autorisierter Mitarbeiter. Entsorgung von Pentobarbital-Abfällen gemäß den Richtlinien der Kunming Medical University für kontrollierte Substanzen, wobei eine ordnungsgemäße Nutzungsgenehmigung und Abfallentsorgungsverfahren sichergestellt werden.

Allgemeine Abfallentsorgung: Alle gefährlichen Chemikalien und Reagenzien müssen gemäß den Labormanagementrichtlinien der Kunming Medical University entsorgt werden. Stellen Sie sicher, dass alle Abfallmaterialien ordnungsgemäß gekennzeichnet und in geeignete Behälter für eine sichere Entsorgung gelegt werden.

Statistische Analyse

Alle Experimente wurden im dreifachen Exemplar oder mehr durchgeführt. Die Banddichtewerte der Zielproteine wurden auf die der Kontrollgruppe normalisiert, um Vergleiche zwischen den Gruppen zu erleichtern. Die Daten werden als Median (Interquartilbereich) oder Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt, wobei n die Anzahl der Ratten darstellt. Für normal verteilte Daten wurden signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen mittels Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) bewertet. Für nicht-normalverteilte Daten wurde der Kruskal-Wallis-H-Test angewandt, um Gruppen zu vergleichen. Die statistische Signifikanz wurde auf p < 0,05 gesetzt.

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Ergebnisse

H&E-Färbung und BBB-Bewertung zeigen die schützenden Effekte von EA auf SCI-Ratten

Die H&E-Färbung wurde verwendet, um die Morphologie und Struktur der hinteren Hornzellen des Rückenmarks zu untersuchen (Abbildung 2D). Die H&E-Ergebnisse zeigten, dass in Gruppe S die hinteren Hornzellen ordentlich angeordnet waren, mit klar definierten Zellkonturen und zentral gelegenen Zellkernen. Im Gegensatz dazu wurde die Anza...

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Diskussion

Diese Studie zeigt, dass die EA-Behandlung die Rückenmarkskavitation und Demyelinisierung nach SCI lindert, die Remyelinisierung durch Hochregulation der MBP-Proteinexpression fördert und folglich die Hintergliedmaßenmotorik bei Ratten verbessert. Darüber hinaus identifizierten wir den NRG-1/ErbB4-Signalweg als kritischen Mediator der neuronalen Remyelinisierung und als potenziellen therapeutischen Mechanismus, durch den EA die Remyelinisierung und die Wiederherstellung der Hintergliedma...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Wir danken den Autoren für ihre Beiträge zu dieser Studie. Diese Studie wurde finanziell von der Nationalen Naturwissenschaftlichen Stiftung Chinas (NSFC 81960817, 82260387) und dem Grundlagenforschungs-Sonderprogramm des Wissenschafts- und Technologieplans des Provinzministeriums für Wissenschaft und Technologie Yunnan (202301AS070020) unterstützt. Wissenschaftliches Forschungs- und Entwicklungsprojekt des North Sichuan Medical College (CBY22-QNA20)

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
BCA Protein-Detektionskit Beyotime BiotechnologieP0012SQuantitative Proteinanalyse
ElektroakupunkturgerätHuatuo Elektroakupunkturinstrument, SDZ-V, Suzhou—Therapeutische Geräte
FITC-gekennzeichnetes ziegenfeindliches IgGBeyotimeA0556Fluoreszierende sekundäre Antikörper
FITC-gekennzeichnetes Ziegen-Anti-Maus-IgGBeyotimeA0568Fluoreszierende sekundäre Antikörper
FITC-gekennzeichnetes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgGBeyotimeA0562Fluoreszierende sekundäre Antikörper
FluoreszenzmikroskopOlympus——
Menschliches monoklonales MBPAbcamab209328Spezifischer Antikörper
LFB-Myelin-FärbungslösungSolarbioG3240Myelin-Schichtfarbung
Millipore ECLMilliporeWBKLS0100Detektionsreagenzien
Mausmonoklonales NRG-1  Santa CruzSC-57384Spezifischer Antikörper
Nanodrop ND-1000LabTech—
NRG1-1 BetaNovoprotein Technology CoC753Rekombinantes humanes NRG1-1 Beta
PD158780GlpBio-TechnologieGC15925Der epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) Tyrosinkinase-Inhibitor
PE-10-RohrBecton, Dickinson und Co.427401intrathekale Injektion
Penicillinnatrium zur InjektionHarbin Zhongjing Biotechnology Co80451182Postoperative Antiinfektionstherapie
Kaninchenmonoklonales ErbB4Abcamab109273Spezifischer Antikörper
RNAiso Plus KitTakara9109RT-PCR-Reagenzien
RT-Reagenz-KitTakaraRR037ART-PCR-Reagenzien
Sekundärer AntikörperBeyotime Biotechnologie—Spezifischer Antikörper
NatriumpentobarbitalSigma-Aldrich69020100Tieranästhesie
Yasargil Aneurysma-ClipRebstock Instruments GmbH—Konstruktion eines Ratten-Rückenmarksverletzungsmodells

Referenzen

  1. McDonald, J. W., Sadowsky, C. Spinal-cord injury. Lancet. 359 (9304), 417-425 (2002).
  2. Mohammadi, E., Villeneuve, L. M., Smith, Z. A. Spinal Cord Injury: The Global Incidence, Prevalence, and Disability From the Global Burden of Disease Study 2019. Spine. 48 (24), 1767(2023).
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