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Methodenartikel

CLCF1 Belastungsinduziertes Myokinprotokoll zur Untersuchung von RANKL/OPG-Knochenschutzmechanismen bei postmenopausaler Osteoporose

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DOI:

10.3791/69172

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7. November 2025

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1Department of Trauma Center, Central Hospital Affiliated to Shandong First Medical University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In diesem Artikel wird ein umfassendes Protokoll zur Untersuchung des Cardiotrophin-ähnlichen Zytokinfaktors 1 (CLCF1) als belastungsinduzierter Mediator des Knochenschutzes durch RANKL/OPG-Achsenmodulation bei postmenopausaler Osteoporose vorgestellt.

Zusammenfassung

Jüngste Studien haben den Cardiotrophin-ähnlichen Zytokinfaktor 1 (CLCF1) als ein trainingsinduziertes "Jugendmolekül" identifiziert, das die Vorteile des Bewegungsapparates vermittelt, aber mit zunehmendem Alter abnimmt. Dieses Protokoll beschreibt einen systematischen Ansatz, um die regulatorische Rolle von CLCF1 beim trainingsvermittelten Knochenschutz über Immun-Knochen-Crosstalk-Mechanismen zu untersuchen. Die Methodik umfasst klinische Probenanalysen, molekulare Charakterisierungstechniken und funktionelle Assays, um den Einfluss von CLCF1 auf den Rezeptoraktivator der Signalachse des Kernfaktor-κB-Liganden (RANKL)/Osteoprotegerin (OPG) aufzuklären. Durch quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR), Western Blotting, CRISPR/Cas9-Geneditierung und Co-Kultursysteme demonstriert dieses Protokoll die duale knochenschützende Wirkung von CLCF1 über die STAT1-vermittelte Osteoklastenhemmung und die STAT3-vermittelte Osteoblastenförderung. Die beschriebenen Methoden ermöglichen die umfassende Bewertung von CLCF1-Expressionsmustern, Korrelationsanalysen mit Knochenmineraldichteparametern und die mechanistische Bewertung potenzieller trainingsmimetischer Behandlungsinterventionen. Im Gegensatz zu herkömmlichen antiresorptiven Therapien, die in erster Linie auf Osteoklasten abzielen, können CLCF1-basierte Interventionen den einzigartigen Vorteil bieten, dass sie gleichzeitig die Knochenbildung fördern und gleichzeitig die Resorption hemmen. Dieses Protokoll bietet Forschern standardisierte Verfahren zur Untersuchung der trainingsinduzierten Zytokin-vermittelten Regulation des Knochenstoffwechsels und erleichtert die Entwicklung gezielter therapeutischer Interventionen für altersbedingte Knochenerkrankungen.

Einleitung

Die postmenopausale Osteoporose (PMOP) stellt ein paradigmatisches Beispiel für den altersbedingten Muskel-Skelett-Verfall dar, bei dem eine Dysregulation des Immunsystems zu einem pathologischen Knochenverlust führt 1,2,3. Obwohl Bewegung weithin als die wirksamste nicht-pharmakologische Intervention zur Verhinderung des altersbedingten Knochenabbaus anerkannt ist, blieben die genauen molekularen Mechanismen, die dem trainingsinduzierten Knochenschutz zugrunde liegen, bis vor kurzem schwer fassbar4. Das zeitgenössische Verständnis des Knochenstoffwechsels hat sich über traditionelle endokrinologische Rahmenbedingungen hinaus entwickelt und umfasst komplexe osteoimmune Wechselwirkungen und belastungsinduzierte Myokine, die die Skeletthomöostase steuern5.

Die kürzliche Identifizierung des Cardiotrophin-ähnlichen Zytokinfaktors 1 (CLCF1) als trainingsinduzierter Faktor zur Bekämpfung des altersbedingten Muskel-Skelett-Verfalls stellt einen Paradigmenwechsel im Verständnis der Knochen-Muskel-Crosstalkdar 6. Diese bahnbrechende Entdeckung erklärt die gut etablierte knochenschützende Wirkung von Bewegung durch einen bisher unbekannten molekularen Mechanismus und positioniert CLCF1 als Schlüsselmediator des trainingsinduzierten Osteoanabolismus7. Transgene Mäuse, die CLCF1 überexprimierten, zeigten im Vergleich zu Wildtyp-Kontrollen eine verbesserte Knochenbildung, eine verbesserte Glukosetoleranz und eine überlegene körperliche Leistungsfähigkeit6, was darauf hindeutet, dass eine CLCF1-Supplementierung möglicherweise die Vorteile von Bewegung in sitzenden oder mobilitätseingeschränkten Populationen nachahmen könnte.

Die bewegungsmimetische Behandlung ist definiert als pharmakologische Interventionen, die die trainingsinduzierte CLCF1-Kinetik replizieren und über molekulare Signalwege einen ähnlichen therapeutischen Nutzen wie körperliche Aktivität bieten8. Der Cardiotrophin-ähnliche Zytokinfaktor 1 (CLCF1), alternativ als Neurotrophin-1 (NNT-1) oder B-Zell-Stimulationsfaktor-3 (BSF-3) bezeichnet, gehört zur Interleukin-6 (IL-6)-Zytokin-Superfamilie und weist pleiotrope biologische Funktionenauf 8. Ursprünglich für seine neurotrophen Eigenschaften beim Überleben und der Entwicklung spinaler Motoneuronen charakterisiert, hat sich die Rolle von CLCF1 als belastungsinduziertes Myokin zu einem bedeutenden Forschungsgebiet entwickelt. Jüngste klinische Studien haben CLCF1 als Biomarker für den Gesundheitszustand der Knochen validiert und gezeigt, dass die CLCF1-Proteinspiegel in mononukleären Zellen des peripheren Blutes bei postmenopausalen Frauen mit Osteoporose im Vergleich zu gesunden Kontrollen signifikant verringert sind9. Diese Studien zeigten positive Korrelationen zwischen der CLCF1-Expression und der Knochenmineraldichte an mehreren Skelettstellen und lieferten eine klinische Validierung, die das translationale Potenzial von CLCF1-gezielten therapeutischen Interventionen stärkt.

Die Zytokine wirken über heteromere Rezeptorkomplexe, einschließlich löslicher ziliärer neurotropher Faktorrezeptoren (sCNTFR) und Zytokinrezeptor-ähnlicher Faktor-1 (CRLF-1), um verschiedene zelluläre Reaktionen zu orchestrieren10,11. Neuere mechanistische Studien haben das duale Signalparadigma aufgeklärt, bei dem CLCF1 gleichzeitig die Knochenresorption hemmt und die Knochenbildung fördert 2,6,7,9. Diese doppelte Wirkung erfolgt durch die Aktivierung des differentiellen Signalwandlers und Aktivators der Transkription (STAT): Die STAT1-Phosphorylierung vermittelt die Osteoklastensuppression, indem sie den Rezeptoraktivator des Kernfaktor-κB-Liganden (RANKL)-induzierten Kernfaktor-κB (NF-κB)-Signalwegs stört, während die STAT3-Aktivierung in Osteoblasten die Expression von Knochenbildungsmarkern, einschließlich alkalischer Phosphatase und Osteocalcin, fördert.

Das Verständnis, wie sich akute Bewegungsreaktionen auf chronische Knochenanpassungen auswirken, ist für die therapeutische Entwicklung nach wie vor von entscheidenderBedeutung 13. Während eine akute CLCF1-Erhöhung nach einzelnen Trainingseinheiten mechanistische Erkenntnisse liefert, können wiederholte akute Reaktionen über Wochen bis Monate zu anhaltenden knochenschützenden Effekten durch kumulative Signalübertragung und zelluläre Anpassungen führen14.

Die Begründung für die Untersuchung von CLCF1 in der osteoimmunen Pathophysiologie ergibt sich aus seiner etablierten Rolle bei der Regulation von B-Lymphozyten und der Erkenntnis, dass B-Zellen signifikante Produzenten sowohl von RANKL als auch von Osteoprotegerin (OPG) darstellen12,13. Der Rezeptoraktivator der Achse des nuklearen Faktor-κB-Liganden (RANKL)/Osteoprotegerin (OPG) dient als zentraler Regulationsmechanismus für die Osteoklastendifferenzierung und den Knochenabbau14,15. Im Gegensatz zu anderen Mitgliedern der IL-6-Familie, die eine regulatorische Kontrolle über die Skeletthomöostase durch Knochenumbaumodulation gezeigt haben, bietet der einzigartige duale knochenschützende Mechanismus von CLCF1 ein überlegenes therapeutisches Potenzial 16,17,18.

Zu den Vorteilen dieses Protokolls gegenüber bestehenden Methoden gehört der umfassende Ansatz zur Untersuchung des Osteoimmuntrainings, der sowohl klinische Korrelationsanalysen als auch mechanistische zelluläre Studien umfasst, um translationale Einblicke in die CLCF1-vermittelte Regulierung des Knochenstoffwechsels zu erhalten. Die klinische Relevanz dieses Protokolls wird durch neue Erkenntnisse darüber verstärkt, dass der CLCF1-Spiegel durch Lebensstilinterventionen moduliert werden kann, was ihn als umsetzbares therapeutisches Ziel für altersbedingte Knochenerkrankungen positioniert.

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Protokoll

Dieses Protokoll wurde von der Ethikkommission der institutionellen Forschung (Protokoll #2024-CHSD-0156) genehmigt und entspricht den Prinzipien der Deklaration von Helsinki. Alle Tierverfahren entsprachen den Richtlinien des institutionellen Ausschusses für Tierpflege und -verwendung (Protokoll #2024-037). Alle Teilnehmer gaben eine schriftliche Einverständniserklärung ab.

1. Klinische Probenentnahme und Bewertung der Bewegungsintervention

  1. Rekrutierung von Teilnehmern und Auswertung des Übungsverlaufs
    1. Rekrutieren Sie postmenopausale Frauen im Alter von 55 bis 75 Jahren mit einer postmenopausalen Dauer von mindestens 1 Jahr.
    2. Bewerten Sie die detaillierte Trainingsgeschichte, einschließlich Häufigkeit, Intensität, Art und Dauer der körperlichen Aktivität in den letzten 6 Monaten mithilfe standardisierter Fragebögen zur körperlichen Aktivität.
    3. Kategorisieren Sie die Teilnehmer in sitzende (< 150 Minuten/Woche), mäßig aktive (150-300 Minuten/Woche) und hochaktive (> 300 Minuten/Woche) Gruppen auf der Grundlage der WHO-Bewegungsrichtlinien.
    4. Führen Sie eine umfassende Anamneseuntersuchung und körperliche Untersuchung durch, einschließlich Medikationsüberprüfung und Komorbiditätsscreening.
    5. Erhalten Sie Dual-Energie-Röntgen-Absorptiometrie (DXA)-Messungen mit dem Hologic Discovery A Densitometer mit der APEX-Software v4.5. Führen Sie eine tägliche Kalibrierung mit dem Spine-Phantom durch. Positionieren Sie den Patienten in Rückenlage mit angehobenen Beinen auf einem Positionierungsblock gemäß den Richtlinien der International Society for Clinical Densitometry (ISCD).
    6. Klassifizierung der Teilnehmer nach Osteoporose-Kriterien der Weltgesundheitsorganisation (T-Score ≤ -2,5 SD).
    7. Wenden Sie Ausschlusskriterien an: Vorherige antiosteoporotische Therapie innerhalb von 12 Monaten, immunsuppressive Behandlungen, metabolische Knochenerkrankungen, sekundäre Osteoporose oder Kontraindikationen für Belastungstests.
  2. Beurteilung des belastungsinduzierten CLCF1-Ansprechens
    1. Entnehmen Sie zwischen 8:00 und 10:00 Uhr Blutproben zu Studienbeginn, nachdem Sie 12 Stunden nächtliches Fasten in EDTA-Röhrchen durchgeführt haben.
    2. Implementieren Sie ein standardisiertes akutes Trainingsprotokoll: 45 Minuten Gehen mit mäßiger Intensität bei 65-70 % maximaler Herzfrequenz. Berechnen Sie die maximale Herzfrequenz mit der Karvonen-Formel (220 Alter)19. Führen Sie Übungen auf einem motorisierten Laufband mit kontinuierlicher Herzfrequenzüberwachung über einen Brustgurtmonitor durch. Halten Sie die Gehgeschwindigkeit bei 3,5-4,5 km/h mit Steigungsanpassung, um die Zielherzfrequenz zu erreichen.
    3. Entnahme von Blutproben nach dem Training zu 1 h, 4 h und 24 h Zeitpunkt, um die CLCF1-Kinetik unter Beibehaltung konsistenter Entnahmebedingungen zu beurteilen.
    4. Serumaliquoten für die anschließende CLCF1-Quantifizierung bei -80 °C lagern. Verwenden Sie das humane CLCF1 ELISA-Kit mit einem Nachweisbereich von 31,2-2000 pg/ml. Die Proben werden im Verhältnis 1:2 in einem Verdünnungsmittel verdünnt. Bereiten Sie eine 7-Punkt-Standardkurve mit 2-fachen seriellen Verdünnungen vor. Führen Sie Beispiele in Duplikaten aus. Lesen Sie Platten bei 450 nm mit 540 nm Wellenlängenkorrektur. Akzeptieren Sie einen Variationskoeffizienten (CV) von < 20 % zwischen Duplikaten.
  3. Interventionsprotokoll für Längsschnittübungen
    1. Entwerfen Sie ein 12-wöchiges progressives Trainingsprogramm mit drei Sitzungen pro Woche.
    2. Entnahme von Blutproben zu Studienbeginn, 4, 8 und 12 Wochen für die CLCF1-Trajektorienanalyse.
    3. Bewerten Sie Fitnessverbesserungen mit VO2max-Tests zu Studienbeginn und am Endpunkt.
    4. Korrelieren Sie CLCF1-Veränderungen mit BMD-Verbesserungen, gemessen durch DXA nach 12 Wochen.
    5. Dokumentieren Sie Trainingsanpassungen, einschließlich Trainingstoleranz und Erholungsmuster.

2. Verbesserte Isolierung und Verarbeitung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC)

  1. Optimierte PBMC-Isolierung für die CLCF1-Analyse
    1. Entnahme von 20 mL venöser Blutproben in EDTA-haltigen Röhrchen (5 mL EDTA pro Röhrchen) unter sterilen Bedingungen.
    2. Verarbeiten Sie die Proben innerhalb von 2 Stunden nach der Entnahme, um eine optimale Zellviabilität und die Erhaltung der CLCF1-Expression zu gewährleisten.
      1. Blutproben 1:1 mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei Raumtemperatur verdünnen. Mischen Sie 20 ml Blut mit 20 ml PBS.
      2. Verdünntes Blut über Dichtegradientenmedium in konischen 50-ml-Röhrchen schichten. Verwenden Sie 15 ml Dichtegradientenmedium pro 20 ml verdünntem Blut (Verhältnis 1:1,33).
    3. Bei 400 × g 30 min bei Raumtemperatur ohne Bremse zentrifugieren.
    4. Die PBMC-Schicht wird an der Plasma-Ficoll-Grenzfläche vorsichtig mit einer sterilen Pasteur-Pipette aspiriert.
    5. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS mit 2 % fötalem Rinderserum (FBS) durch Zentrifugation bei 300 × g für 10 Minuten.
  2. Bewertung der Zellviabilität und CLCF1-Baseline-Messung
    1. Bestimmen Sie die Zellviabilität mit der Trypanblau-Ausschlussmethode (Ziel > 95 % Viabilität)20.
    2. Die intrazelluläre CLCF1-Expression zu Studienbeginn ist unmittelbar nach der Isolierung zu beurteilen.
    3. Die Zellkonzentration auf 1 × 106 Zellen/ml in geeignetem Medium einstellen.
    4. Ordnen Sie Zellen für nachgelagerte Anwendungen zu oder lagern Sie sie in flüssigem Stickstoff. PBMC in Gefriermedium einfrieren, das 90 % FBS + 10 % DMSO enthält. Verwenden Sie einen Gefrierbehälter mit kontrollierter Geschwindigkeit bei -1 °C/min bis -80 °C. 1 ml Aliquots (5 × 106 Zellen/Fläschchen) in Kryoröhrchen aufbewahren.

3. Umfassende quantitative Genexpressionsanalyse

  1. RNA-Extraktion und -Aufreinigung mit CLCF1-spezifischen Überlegungen
    1. 1 × 106 PBMC in 1 ml RNA-Lysereagenz innerhalb von 1 h nach der Isolierung lysieren.
    2. 200 μl Chloroform zugeben, kräftig vortexen und 3 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
    3. Zentrifugieren Sie bei 12.000 × g für 15 min bei 4 °C, um eine Phasentrennung zu erreichen.
    4. Übertragen Sie die wässrige Phase in ein frisches Röhrchen, fügen Sie ein gleiches Volumen Isopropanol hinzu.
    5. RNA durch Zentrifugation bei 12.000 × g für 10 min bei 4 °C ausfällen.
    6. RNA-Pellet mit 75 % Ethanol waschen, an der Luft trocknen und in nukleasefreiem Wasser auflösen.
    7. Beurteilen Sie die RNA-Integrität mit Hilfe der Agarose-Gelelektrophorese oder des Bioanalysators (Ziel-RIN >7.0).
  2. Reverse Transkription und quantitative PCR mit aktualisierten Primer-Sets
    1. Quantifizierung der RNA-Konzentration mittels spektrophotometrischer Analyse (Ziel A260/A280 Verhältnis 1,8-2,2).
    2. Führen Sie eine reverse Transkription mit 1 μg Gesamt-RNA mit dem Reagenzkit für reverse Transkription durch.
    3. Vorbereitung von qPCR-Reaktionen: Bereiten Sie 20 μL-Reaktionen vor, die 10 μl Master Mix, 0,8 μl jedes Primers (10 μM Stamm, final 400 nM), 2 μl cDNA-Template (50 ng) und 6,4 μl nukleasefreies Wasser enthalten. Führen Sie Triplicate aus. Verwenden Sie ein real-time PCR-System.
    4. Verwenden Sie validierte Primersequenzen:
      1. CLCF1 vorne: 5'-CCTCCTGCTTCTTGCCTACC-3',
        Rückseite: 5'-TGCCACCATGTTTGTTTCCT-3'
      2. CRLF1 vorne: 5'-TGAAGCTCATCCTGCAGTTC-3',
        Rückseite: 5'-CAGCATCTCCTCCTTGATGC-3'
      3. STAT1 vorne: 5'-CAGCTTCAGCAGCTTGACTC-3',
        Rückseite: 5'-AAGGTCAGCGATGTCTTCAG-3'
      4. STAT3 nach vorne: 5'-CAGCAGCTTGACACACGGTA-3',
        Rückseite: 5'-AAACACCAAAGTGGCATGTGA-3'
    5. Führen Sie das qPCR-Protokoll durch: 95 °C für 10 Minuten, gefolgt von 40 Zyklen mit 95 °C für 15 s und 60 °C für 1 Minute.
    6. Analyse der Ergebnisse mit der 2(-ΔΔCt)- Methode mit β-Aktin-Normalisierung21.
  3. Analyse des Trainings-Response-Gen-Panels
    1. Enthält auf das Training reagierende Gene: IL-6, TNF-α, IL-1β, BDNF, IGF-1 und Myostatin.
    2. Verwenden Sie validierte Primersequenzen:
      1. IL-6 vorne: 5'-AGCCACTCACCTCTTCAGAAC-3',
        Rückseite: 5'-GCCTCTTTGCTGCTTTCAC-3';
      2. TNF-α vorne: 5'-CCCAGGGACCTCTCTCTAATC-3',
        Rückseite: 5'-ATGGGCTACAGGCTTGTCACT-3';
      3. IL-1β vorwärts: 5'-ACAGATGAAGTGCTCCTTCCA-3',
        Rückseite: 5'-GTCGGAGATTCGTAGCTGGAT-3';
      4. BDNF vorwärts: 5'-TAACATGGCTGCGCGTGT-3',
        Rückseite: 5'-CGAGTGGGTCACAGCGGCAG-3';
      5. IGF-1 vorne: 5'-GCTCTTCAGTTCGTGTGTGGA-3',
        Rückseite: 5'-GCCTCCTTAGATCACAGCTCC-3';
      6. Myostatin vorwärts: 5'-AGTGACGGGCTTTTTGGAAGA-3',
        Rückseite: 5'-GTTTCAGAGGCCGGTCAAGT-3'.
    3. Korrelieren Sie trainingsinduzierte Veränderungen von CLCF1 mit anderen Myokin-Expressionsmustern.
    4. Bewertung der Co-Expressionsverhältnisse von CLCF1/CRLF1 als Indikatoren für die Bildung funktioneller Zytokinkomplexe.

4. Verbesserte Proteinexpressionsanalyse mit Fokus auf den STAT-Signalweg

  1. Proteinextraktion und -quantifizierung für die STAT-Analyse
    1. Lysieren Sie PBMCs in Lysepuffer (150 mM NaCl, 1 % NP-40, 0,5 % Natriumdesoxycholat, 0,1 % SDS, 50 mM Tris-HCl pH 8,0), ergänzt mit Protease- und Phosphatasehemmer-Cocktails.
    2. Fügen Sie unmittelbar vor der Anwendung einige spezifische Phosphatasehemmer hinzu: Natriumorthovanadat (1 mM) und Natriumfluorid (50 mM).
    3. Inkubieren Sie die Lysate 30 Minuten lang auf Eis mit periodischem Vortexen bei mittlerer Geschwindigkeit alle 10 Minuten.
    4. Zentrifugieren Sie bei 12.000 × g für 15 min bei 4 °C, um Zelltrümmer zu entfernen.
    5. Quantifizieren Sie die Proteinkonzentration mit dem Bradford-Assay oder der BCA-Methode22.
    6. Die Proteinkonzentrationen in einem Probenpuffer auf 2 μg/μl einstellen und bis zur weiteren Analyse für Western-Blotting-Anwendungen bei -80 °C lagern.
  2. Umfassende Western-Blot-Analyse mit Fokus auf STAT-Signalisierung
    1. Bereiten Sie 10 ml 10% SDS-PAGE-Gele mit Standard-Acrylamid/Bisacrylamid-Lösungen vor.
    2. Laden Sie 20 μg Protein pro Spur zusammen mit vorgefärbten Molekulargewichtsmarkern und lösen Sie 90 Minuten lang bei 120 V auf.
    3. Übertragen Sie Proteine auf PVDF-Membranen bei 100 V für 2 h bei 4 °C unter Verwendung von Transferpuffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 20% Methanol).
    4. Blockmembranen mit 50 mL 5 % fettfreier Trockenmilch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,1 % Tween-20 (TBST).
    5. Inkubation mit Primärantikörpern über Nacht bei 4 °C: Anti-CLCF1 (1:1.000); Anti-CRLF1 (1:1.000); Anti-OPG (1:1.000); Anti-RANKL (1:1.000); Anti-JAK2 (1:1.000); Anti-Phospho-JAK2 (Tyr1007/1008, 1:1.000); Anti-STAT1 (1:1.000); Anti-Phospho-STAT1 (Tyr701, 1:1.000); Anti-STAT3 (1:1.000); Anti-Phospho-STAT3 (Tyr705, 1:1.000); Anti-β-Aktin (1:1.000)
    6. Waschen Sie die Membranen 3 Mal für 10 min mit 15 mL TBST. Mit geeigneten Sekundärantikörpern 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
    7. Nachweis von Proteinbanden mit verbessertem Chemilumineszenzsubstrat. Bild mit Chemilumineszenz-Bildgebungssystem mit automatischer Belichtungsoptimierung. Quantifizieren Sie mithilfe der densitometrischen Analyse mit dem Gelanalysetool ImageJ v1.53.
  3. STAT1/STAT3 Dual-Pathway-Analyse
    1. Berechnen Sie die Verhältnisse von Phospho-STAT1/Gesamt-STAT1 und Phospho-STAT3/Gesamt-STAT3 mit der ImageJ/Fiji-Softwareversion 1.54f.
    2. Bewerten Sie das Aktivierungsgleichgewicht von STAT1/STAT3 als Indikator für die funktionelle Aktivität von CLCF1.
    3. Korrelieren Sie STAT-Aktivierungsmuster mit den RANKL/OPG-Expressionsverhältnissen.
    4. Beurteilung der STAT1/STAT3-Phosphorylierung mittels Western Blot bei 0, 15, 30, 60, 120 und 240 Minuten nach der CLCF1-Behandlung. Normalisieren Sie das Phosphoprotein mithilfe der Densitometrie auf den Gesamtproteinspiegel.

5. Fortgeschrittener CRISPR/Cas9-vermittelter Gen-Knockout mit Validierung

  1. Verbesserte Konstruktion lentiviraler Vektoren
    1. Design einer Single-Guide-RNA (sgRNA), die auf die CLCF1-Gensequenz abzielt:
      TTGAAGTCTGGCTCGTTGAA-3'.
    2. Fügen Sie zusätzliche sgRNA-Sequenzen hinzu, um die Knockout-Effizienz zu verbessern:
      GCTTGAACGAGCCAGACTTC-3".
    3. Klonieren Sie sgRNAs in lentivirale Vektoren unter Verwendung von Standard-molekularen Klonierungstechniken.
    4. Überprüfen Sie die Integrität des Konstrukts durch DNA-Sequenzierungsanalyse.
    5. Beurteilen Sie die Effizienz des sgRNA-Schneidens mit dem T7-Endonuklease I-Assay23.
    6. Einschließlich der Validierung der Spezifität des Signalwegs mit den Inhibitoren AG490 (JAK2, 50 μM), Fludarabin (STAT1, 10 μM) und Stattic (STAT3, 5 μM).
    7. Durchführung von Rettungsexperimenten mit konstitutiv aktiven STAT-Konstrukten, um die Notwendigkeit des Signalwegs zu validieren.
  2. Optimiertes lentivirales Transduktionsprotokoll
    1. Kultur von Raji-Zellen in RPMI-1640 Medium (500 ml), ergänzt mit 10% FBS. Halten Sie alle Zellkulturen bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2. Nährmedien vor der Verwendung mindestens 30 Minuten lang voräquilibrieren.
    2. Die Zellen werden mit Polybren (8 μg/ml) vorbehandelt, um die Transduktionseffizienz zu verbessern.
    3. Herstellung von Lentiviren unter Verwendung von HEK293T Zellen mit Verpackung und Hüllplasmiden durch Calciumphosphat-Transfektion. Titer mittels p24 ELISA bestimmen (> 108 TU/mL erforderlich). Befolgen Sie die BSL-2-Eindämmungsverfahren23.
    4. Transduzieren Sie Zellen mit Lentiviren bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 100. Medienwechsel 24 h nach der Transduktion. Selektion transduzierter Zellen mit Puromycin (4 μg/ml) für 7 Tage und anschließende Amplifikation einer 500 bp-Region, die sich über die Zielstelle erstreckt, unter den folgenden PCR-Bedingungen: anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 3 Minuten, gefolgt von 35 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 30 s, Annealing bei 60 °C für 30 s und Verlängerung bei 72 °C für 30 s, mit einer abschließenden Verlängerung bei 72 °C für 5 min. Für den T7-Endonuklease-Assay denaturieren und reannealieren Sie die PCR-Produkte, verdauen Sie sie 30 Minuten lang bei 37 °C mit T7E1-Endonuklease und analysieren Sie dann die Produkte auf einem 2%igen Agarosegel.
    5. Validierung der Gen-Knockout-Effizienz durch Western Blotting und Sanger-Sequenzierung24,25.
    6. Durchführung von Off-Target-Analysen mit GUIDE-seq oder einer ähnlichen Methodik26.
      HINWEIS: Neuere Erkenntnisse zeigen, dass die Effizienz der CLCF1-Sekretion eine Co-Expression mit dem CRLF1-Chaperonprotein erfordert. Erwägen Sie duale Knockout-Ansätze für eine vollständige funktionelle Ablation27.

6. Umfassendes Co-Kultur-System mit Übungsmimetika

HINWEIS: Für die translationale Validierung ist die Anpassung an ovariektomierte Mausmodelle durch Verabreichung von rhCLCF1 in einer Dosis von 10 μg/kg i.p. täglich für 4 Wochen zu verabreichen und die BMD mittels Mikro-CT zu beurteilen.

  1. Erweitertes Raji-MG-63 Co-Kultur-Setup
    1. MG-63-Osteoblasten-ähnliche Zellen in 24-Well-Plattenunterkammern mit einer Dichte von 2 × 104 Zellen/Well in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit säen. Vor der Verwendung das Medium 30 Minuten lang im Inkubator voräquilibrieren. Für eine verbesserte Translation durch primäre humane Osteoblasten (Dichte 1 × 104/Well) aus kommerziellen Quellen ersetzen.
    2. Platzieren Sie Membraneinsätze mit einer Porengröße von 0,4 μm in Vertiefungen, die MG-63-Zellen enthalten.
    3. Raji-Zellen (Wildtyp, CLCF1-Knockout oder CLCF1-überexprimierend) in den oberen Kammern mit einer Dichte von 1 × 105 Zellen/Vertiefung säen.
    4. Halten Sie Co-Kulturen in vollständigem RPMI-1640-Medium (2 mL in der unteren Kammer, 1,5 mL in der oberen Kammer) für bestimmte Versuchszeiträume (7, 14, 21 Tage) bei 37 °C mit 5 % CO2.
    5. Schließen Sie rekombinante CLCF1-Behandlungsgruppen (5-10 ng/ml) ein, um die Dosis-Wirkungs-Beziehungen zu beurteilen.
  2. Trainingsmimetisches CLCF1-Behandlungsprotokoll
    1. Behandeln Sie Co-Kultursysteme mit physiologischen Konzentrationen von rekombinantem CLCF1 (5-10 ng/ml) basierend auf belastungsinduzierten Werten.
    2. Wenden Sie das pulsierende CLCF1-Behandlungsschema an: Tragen Sie CLCF1 für 2 Stunden Impulse bei 0, 8 und 16 Uhr an Tag 1 auf, gefolgt von einer kontinuierlichen Exposition für 24 Stunden, dann wiederholen Sie den Zyklus. Gesamtdauer der Behandlung: 7 Tage mit insgesamt 9 Impulsen.
    3. Beurteilen Sie die zeitabhängigen Effekte 1 h, 4 h, 24 h und 7 Tage nach der Behandlung.
    4. Überwachen Sie die Phosphorylierungskinetik von STAT1/STAT3 in beiden Zellpopulationen mittels Western Blot bei 0, 15, 30, 60 min. Lyse der Zellen in Puffer (500 μl) mit Inhibitoren, normalisiere auf Gesamt-STAT1/3 und β-Aktin.
  3. Verbesserte Bewertung der osteogenen Differenzierung
    1. Induzieren Sie eine osteogene Differenzierung mit einem osteogenen Standardmedium, das Ascorbinsäure (50 μg/ml), β-Glycerophosphat (10 mM) und Dexamethason (10 nM) enthält. Wechseln Sie das osteogene Medium alle 3 Tage (2 mL untere Kammer, 1,5 mL obere Kammer). Bereiten Sie für jede Änderung frische Ascorbinsäurelösung vor; β-Glycerophosphat und Dexamethason bleiben stabil.
    2. Beurteilen Sie die Aktivität der alkalischen Phosphatase (ALP) mit einem kolorimetrischen Enzymassay an den Tagen 7, 14 und 2128. Verwenden Sie 500 μl Extraktionsvolumen. Ablesen bei 405 nm. Normalisieren Sie sich auf den Gesamtproteingehalt. Erwarteter Farbbereich: hellgelb (niedrig) bis dunkelgelb (hoch).
    3. Bewerten Sie die Kalziumablagerung durch Alizarinrot S-Färbung und Quantifizierung an Tag 21. Extrakt mit 500 μl Cetylpyridiniumchlorid, abgelesen bei 540 nm, erwarteter Farbbereich: hellrosa (geringe Mineralisierung) bis dunkelrot (hohe Mineralisierung).
    4. Quantifizierung der Mineralisierung durch Messung der Absorption bei 540 nm nach der Extraktion von Cetylpyridiniumchlorid.
    5. Analysieren Sie die osteogene Genexpression: RUNX2, ALP, COL1A1, OCN und OPG unter Verwendung der in Schritt 3.2 beschriebenen qPCR-Protokolle.
    6. Bewertung von Osteoklasten-bezogenen Markern: TRAP, Cathepsin K und RANKL in MG-63-Zellen.

7. Erweiterte statistische Analyse und Dateninterpretation

  1. Umfassende statistische Methodik
    1. Führen Sie einen Normalitätstest mit dem Shapiro-Wilk-Test für alle stetigen Variablen29 durch. Verwenden Sie nicht-parametrische Tests, wenn die Normalitätsannahmen verletzt werden (p < 0,05).
    2. Wenden Sie den Mann-Whitney-U-Test für nicht-parametrische Vergleiche zwischen den Gruppen30 an.
    3. Durchführung einer Spearman-Korrelationsanalyse für Assoziationsstudien zwischen CLCF1-Spiegeln und klinischen Parametern31.
    4. Führen Sie eine multiple Regressionsanalyse durch, um unabhängige Prädiktoren für BMD zu bewerten.
    5. Verwenden Sie die ANOVA mit wiederholten Messungen für die Zeit-Verlauf-Analyse der Bewegungsintervention32.
    6. Bonferroni-Korrektur für Mehrfachvergleicheanwenden 33.
    7. Legen Sie den Schwellenwert für die statistische Signifikanz für alle Analysen auf p < 0,05 fest.
  2. Verbesserte Datenpräsentation und -analyse
    1. Präsentieren Sie kontinuierliche Daten als Mittelwert ± Standardabweichung oder Median mit Interquartilsabstand.
    2. Erstellen Sie Korrelationsdiagramme für die CLCF1-Expression im Vergleich zur BMD, die Lymphozytenzahl und die Trainingsparameter mit GraphPad Prism v9 für Statistiken und ImageJ v1.53 für die Densitometrie. Es sind keine benutzerdefinierten Skripts erforderlich. Generieren Sie ROC über das integrierte Tool von Prism; Korrelationen über Spearman in Prism.
    3. Generierung von Zeitverlaufsdiagrammen für die trainingsinduzierte CLCF1-Reaktionskinetik.
    4. Entwicklung von ROC-Kurven (Receiver Operating Characteristic) für CLCF1 als Osteoporose-Biomarker.
      HINWEIS: Repräsentative Western-Blot-Bilder wurden mittels quantitativer densitometrischer Analyse erstellt.

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Ergebnisse

Die erfolgreiche Implementierung dieses Protokolls demonstriert die regulatorische Rolle von CLCF1 im immunvermittelten Knochenstoffwechsel unter Verwendung mehrerer experimenteller Ansätze. Die klinischen Validierungsstudien zeigen eine signifikante Herunterregulierung der CLCF1-Expression bei PMOP-Patienten im Vergleich zu gesunden Kontrollen, wie in Abbildung 1A gezeigt. Die quantitative PCR-Analyse von mononukleären Zelle...

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Diskussion

Das hierin beschriebene Protokoll bietet einen umfassenden methodischen Rahmen für die Untersuchung der Rolle von CLCF1 als trainingsinduzierter Mediator des Knochenschutzes durch eine systematische Analyse der RANKL/OPG-Achse. Jüngste bahnbrechende Forschungen haben CLCF1 als einen trainingsinduzierten Faktor identifiziert, der den altersbedingten Muskel-Skelett-Abbau bekämpft, und ihn als zentralen Mediator des trainingsinduzierten Knochenschutzes positioniert 34,35,36.

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Danksagungen

Die Autoren danken den Teilnehmern, die sich freiwillig für diese Studie gemeldet haben, und dem klinischen Personal des Zentralkrankenhauses, das der Shandong First Medical University angegliedert ist, für ihre Unterstützung bei der Patientenrekrutierung und Probenentnahme. Wir danken den Labortechnikern für ihre Unterstützung bei Zellkultur- und molekularbiologischen Experimenten. H.Z. konzipierte und konzipierte die Studie, führte die Experimente durch, analysierte die Daten und schrieb das Manuskript. H.L. trug zum Versuchsdesign, zur Datenerfassung und zur Überarbeitung des Manuskripts bei. Y.S. betreute das Projekt, gab kritisches Feedback und überarbeitete das Manuskript. Alle Autorinnen und Autoren haben das endgültige Manuskript zur Einreichung geprüft und freigegeben.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Cell Culture Media & Reagenzien
Dimethylsulfoxid (DMSO)Sigma-AldrichD2650Purpose_Application:  Kryokonservierungsmedium-Komponente
Specifications_Comments: Molekularbiologische Qualität, steril gefiltert
DMEM-MediumThermo Fisher Scientific11965092Purpose_Application:  MG-63 Osteoblastenkulturmedium
Specifications_Comments: Hochglukose-Formulierung mit L-Glutamin
Fetales Rinderserum (FBS)Thermo Fisher Scientific16000044Purpose_Application:  Zellkulturpräparat (hitzeinaktiviert)
Specifications_Comments: Wärmeinaktiviert bei 56 Â ° C für 30 Minuten
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122Purpose_Application:  Antibiotikapräparat für sterile Kultur
Specifications_Comments: 100-fache Aktie, Endkonzentration 1 %
Polybren (Hexadimethrinbromid)Santa Cruz BiotechnologieSC-134220Purpose_Application:  Lentivirale Transduktions-Enhancer
Specifications_Comments: 8 Î ¼ g/mL Arbeitskonzentration
Puromycin-DihydrochloridInvivoGenANT-PR-1Purpose_Application:  Selektionsantibiotikum für transduzierte Zellen
Specifications_Comments: 4 Î ¼ g/mL-Selektionskonzentration für 7 Tage
RPMI-1640 MediumThermo Fisher Scientific11875093Purpose_Application:  Raji B-Lymphozytenkulturmedium
Specifications_Comments: Mit L-Glutamin, ohne rotes Phenol bevorzugt
Trypan-Blau-LösungThermo Fisher Scientific15250061Purpose_Application:  Zellviabilitätsbewertung
Specifications_Comments: 0,4%-Lösung für den Ausschlusstest
Gefrierbehälter mit kontrollierter RateThermo Fisher Scientific5100-0001Purpose_Application:  Kontrolliertes Zellgefrieren (-1Â ° C/min)
Specifications_Comments: Mr. Frosty oder äquivalent für -1 & Acirc; ° C/min-Kühlung
EDTA-BlutabnahmeröhrchenBD Biosciences366643Purpose_Application:  Venöse Blutentnahme mit Antikoagulans
Specifications_Comments: 10–20 ml Kapazität, violette obere Röhren
Ficoll-Paque PLUS DichtegradientCytiva (GE Healthcare)17144003Purpose_Application:  PBMC-Isolierung mittels Dichtezentrifugation
Specifications_Comments: Steril, endotoxingetestet auf Zelltrennung.
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Thermo Fisher Scientific14190144Purpose_Application:  Zellreinigung und Verdünnungspuffer
Specifications_Comments: Steril, zellkulturfähig
RNA-Extraktion & qPCR
Chloroform (ACS-Qualität)Sigma-AldrichC2432Purpose_Application:  Phasentrennung bei RNA-Extraktion
Specifications_Comments: ACS-Reagenzqualität â ‰ & Yen; 99 % Reinheit
Ethanol (75 %, Molekularqualität)Sigma-AldrichE7023Purpose_Application:  RNA-Pelletwäsche
Specifications_Comments: Molekularbiologie-Qualität, frisch vorbereitet
Isopropanol (Molekularqualität)Sigma-AldrichI9516Purpose_Application:  RNA-Präzipitation
Specifications_Comments: Molekularbiologie-Qualität, â ‰ & Yen; 99,5 % Reinheit
Nukleasefreies WasserThermo Fisher ScientificAM9930Purpose_Application:  PCR-Reaktionsvorbereitung
Specifications_Comments: Frei von DNase/RNase, getestet für PCR-Anwendungen
Optischer KlebefilmThermo Fisher Scientific4311971Purpose_Application:  Optische Abdichtung für qPCR-Platten
Specifications_Comments: Optische Qualität für qPCR-Anwendungen
PCR-Platten (96-Well)Thermo Fisher ScientificN8010560Purpose_Application:  96-Well-Format für Hochdurchsatz qPCR
Specifications_Comments: Weiß, klarer Boden für optische Detektion
PCR-RöhrenstreifenThermo Fisher ScientificAB0451Purpose_Application:  PCR-Reaktionen mit kleinem Volumen
Specifications_Comments: 8-Röhrenstreifen mit einzelnen Kappen
PrimeScript RT Reagenz-KitTakara-BiografieRR037APurpose_Application:  Reverse-Transkription von RNA zu cDNA
Specifications_Comments: Mit gDNA-Eraser zur genomischen DNA-Entfernung
SYBR Green Master MixAngewandte Biosysteme4309155Purpose_Application:  Echtzeit-PCR-Verstärkung und -Erkennung
Specifications_Comments: Mit ROX-Referenzfarbe zur Normalisierung
TRIzol-Reagenz (RNA-Lyse)Thermo Fisher Scientific15596026Purpose_Application:  Zelllyse und RNA-Extraktion
Specifications_Comments: Lagern bei 4Â ° C, innerhalb von 6 Monaten verwenden
Proteinanalyse – Western Blot
Acrylamid/Bis-Acrylamid (29:1)Bio-Rad1610146Purpose_Application:  SDS-PAGE Gel-Polymerisation
Specifications_Comments: 30% Acrylamid-Stocklösung
BCA-Protein-Assay-KitThermo Fisher Scientific23225Purpose_Application:  Quantifizierung der Proteinkonzentration
Specifications_Comments: Reduzierungskompatibel für eine genaue Quantifizierung
Verbessertes Chemilumineszenz-(ECL)-SubstratThermo Fisher Scientific32106Purpose_Application:  Chemilumineszente Proteindetektion
Specifications_Comments: Femtogramm-Sensitivitätsdetektion
Fettfreie TrockenmilchLaborwissenschaft170-6404Purpose_Application:  Westlicher Blot-Blockiermittel
Specifications_Comments: Blockwert, niedriger Hintergrund
Phosphatase-Inhibitor-CocktailRoche Angewandte Wissenschaft4906845001Purpose_Application:  Proteindephosphorylierung verhindern
Specifications_Comments: Enthält Okadainsäure und Calyculin A
Vorgefärbte ProteinleiterBio-Rad1610394Purpose_Application:  Molekulargewichts-Referenzstandards
Specifications_Comments: 10-250 kDa Bereich mit 11 Bändern
Protease-Inhibitor-CocktailRoche Angewandte Wissenschaft11697498001Purpose_Application:  Proteinabbau während der Lyse verhindern
Specifications_Comments: EDTA-frei für metallabhängige Phosphatasen
PVDF-Membranen (0,45 & Icirc; ¼ m)Millipore SigmaIPVH00010Purpose_Application:  Proteintransfermembran (0,45 & Icirc; ¼ m-Pore)
Specifications_Comments: Niedriger Fluoreszenzhintergrund
RIPA Lysis-PufferZell-Signaltechnik9806SPurpose_Application:  Ganzzell-Proteinextraktion
Specifications_Comments: Fertiger Lysepuffer mit Reinigungsmitteln
Sample-Ladepuffer (4X)Bio-Rad1610747Purpose_Application:  Proteinprobenvorbereitung für SDS-PAGE
Specifications_Comments: Farbstoff mit Î laden; ²-mercaptoethanol
SDS-PAGE LaufpufferBio-Rad1610732Purpose_Application:  Proteinelektrophorese
Specifications_Comments: Tris-Glycin-SDS-Puffersystem
NatriumfluoridSigma-Aldrich201154Purpose_Application:  Zusätzliche Phosphatase-Hemmung
Specifications_Comments: 50 mM Arbeitskonzentration
Natrium-OrthovanadatSigma-AldrichS6508Purpose_Application:  JAK2/STAT Phosphorylierungskonservierung
Specifications_Comments: 1 mM Arbeitskonzentration, frisch vorbereiten
Pufferkonzentrat übertragenBio-Rad1704156Purpose_Application:  Halbtrockener Proteintransfer
Specifications_Comments: 10-fach konzentriert, vor der Anwendung verdünnen
Tris-Puffer-Kochsalzlösung mit Tween-20 (TBST)Zell-Signaltechnik9997SPurpose_Application:  Membranwäsche und Antikörperverdünnung
Specifications_Comments: 0,1 % Tween-20, pH 7,6
CRISPR/Gene Editing
Calciumphosphat-Transfektions-KitPromegaE1200Purpose_Application:  DNA-Transfektion in Verpackungszellen
Specifications_Comments: Hohe Transfektionseffizienz bei der Lentivirusproduktion
DNA-Gel-ExtraktionssetQiagen28706Purpose_Application:  PCR-Produktreinigung für Sequenzierung
Specifications_Comments: Säulenbasiertes Reinigungssystem
GV371 LentiviralvektorGeneChem Co., LtdGV371Purpose_Application:  CRISPR/Cas9-Expression für Gen-Knockout
Specifications_Comments: Praxisbereites CRISPR/Cas9-Lentiviralsystem
HEK293T ZelllinieATCCCRL-3216Purpose_Application:  Lentivirale Verpackungszelllinie
Specifications_Comments: Hochtransfektierbare Verpackungszelllinie
Sanger SequenzierungsdienstMacrogen Inc.GewohnheitPurpose_Application:  Knockout-Validierung und Off-Target-Analyse
Specifications_Comments: Standardsequenzierung mit individuellen Primern
T7-Endonuklease INew England BiolabsM0302SPurpose_Application:  CRISPR-Schnitteffizienz-Validierung
Specifications_Comments: Mismatch-spezifische Endonuklease für CRISPR-Validierung
ELISA & Immunoassays
ELISA-Platten (96-Brunnen, flacher Boden)Corning3590Purpose_Application:  ELISA-Substratreaktion
Specifications_Comments: Hochbindend, flacher Boden für ELISA
Human CLCF1 DuoSet ELISAR& D-SystemeDY1234Purpose_Application:  CLCF1-Proteinquantifizierung (31,2–2000 pg/mL)
Specifications_Comments: Nachweisbereich: 31,2–2000 pg/mL, CV & 10%
p24 ELISA Kit (lentiviraler Titer)ZeptoMetrix Corporation801111Purpose_Application:  Bestimmung lentiviraler Titer
Specifications_Comments: Zur Bestimmung des lentiviralen Titers (>10â ¸ TU/mL)
funktionale Assays
Alizarin Red S FärbungssetSigma-AldrichA5533Purpose_Application:  Calciumabscheidungsvisualisierung
Specifications_Comments: 2 % Lösung in destilliertem Wasser, pH 4,1–4,3
Alkalines Phosphatase-AktivitätskitAbcamab83369Purpose_Application:  ALP-Enzymaktivitätsmessung
Specifications_Comments: Kolorimetrischer Test, bei 405 nm gemessen
Ascorbinsäure (L-Ascorbinsäure)Sigma-AldrichA4544Purpose_Application:  Osteogene Mediumkomponente
Specifications_Comments: 50 & Icirc; ¼ g/mL Endkonzentration
CetylpyridiniumchloridSigma-AldrichC9002Purpose_Application:  Alizarin Red S-Extraktion zur Quantifizierung
Specifications_Comments: 10%-Lösung für Farbstoffextraktion
DexamethasonSigma-AldrichD4902Purpose_Application:  Osteogene Mediumkomponente
Specifications_Comments: 10 nM Endkonzentration
Î ²-GlycerophosphatSigma-AldrichG9422Purpose_Application:  Osteogene Mediumkomponente
Specifications_Comments: 10 mM Endkonzentration
Osteogenes DifferenzierungsmediumPromoCellC-28010Purpose_Application:  Osteoblasten-Differenzierungsinduktion
Specifications_Comments: Fertiges vollständiges osteogenes Medium
Transwell-Zellkultur-Einsätze (0,4 & Icirc; ¼ m)Corning3470Purpose_Application:  Kokultur-System mit 0,4 & Icirc; ¼ m-Trennung
Specifications_Comments: Polyethylenterephthalatmembran, steril
Ausrüstung – Hauptinstrumente
Zentrifuge (Hochgeschwindigkeit, gekühlt)Eppendorf5430RPurpose_Application:  Probenverarbeitung und Zelltrennung
Specifications_Comments: Gekühlt, maximal 30.000 x g
ChemilumineszenzbildgebungssystemBio-Rad Labore12003154Purpose_Application:  Western-Blot-Bildgebung und Quantifizierung
Specifications_Comments: Gel-Dokumentation und Westlich-Blot-Bildgebung
CO2-Inkubator (befeuchtet)Thermo Fisher Scientific51030287Purpose_Application:  Zellkulturpflege (37Â ° C, 5 % CO2)
Specifications_Comments: Dreifachgas (CO2/O2/N2), Feuchtigkeitskontrolle
Herzfrequenzmesser (Brustgurt)PolarelektroH10Purpose_Application:  Kontinuierliche Herzfrequenzmessung
Specifications_Comments: Bluetooth-Konnektivität & Acirc; &Plusmn; 1 bpm Genauigkeit
Hologic Discovery Ein DXA-ScannerHologic Inc.Entdeckung APurpose_Application:  Messung der Knochenmineraldichte
Specifications_Comments: Mit APEX-Software v4.5 tägliche Qualitätskontrolle erforderlich
Mikroplattenleser (Multimode)BioTek-InstrumenteSynergie H1Purpose_Application:  ELISA-Plattenmessung und Absorptionsmessung
Specifications_Comments: UV-Vis, Fluoreszenz, Lumineszenzdetektion
Motorisiertes LaufbandLebensfitness95TiPurpose_Application:  Standardisierte Trainingsintervention
Specifications_Comments: Variable Geschwindigkeit 0–16 km/h, Gefälle 0–15 %
Echtzeit-PCR-System (CFX96 oder äquivalent)Bio-Rad Labore1855195Purpose_Application:  Echtzeit-PCR-Verstärkung und -Erkennung
Specifications_Comments: 96-Well-Block, Gradientenfähig
Software & Analysetools
APEX Software v4.5 (DXA-Analyse)Hologic Inc.v4.5Purpose_Application:  DXA-Scananalyse und BMD-Berechnung
Specifications_Comments: BMD-Analyse mit Referenzdatenbank
Bio-Rad CFX MaestroBio-Rad LaboreCFX MaestroPurpose_Application:  qPCR-Datenanalyse und CT-Determination
Specifications_Comments: Echtzeit-PCR-Analyse und Datenexport
GraphPad Prism v9.0GraphPad-Softwarev9.0Purpose_Application:  Statistische Analyse und Grapherstellung
Specifications_Comments: Statistische Software mit Graphgenerierung
ImageJ/Fiji v1.53Nationale Gesundheitsinstitutev1.53Purpose_Application:  Westliche Blot-Densitometrie und Bildanalyse
Specifications_Comments: Bildanalyse mit Messwerkzeugen
Microsoft Excel 365Microsoft Corporation365Purpose_Application:  Datenorganisation und grundlegende Berechnungen
Specifications_Comments: Datenorganisation und grundlegende statistische Funktionen
Verbrauchsgüter & Plastikwaren
1,5 mL MikrozentrifugenröhrenEppendorf22363204Purpose_Application:  Kleinvolumige Probenlagerung und -verarbeitung
Specifications_Comments: DNase/RNase-frei, wenig bindend
15-mL konische RöhrenCorning430766Purpose_Application:  Mittelvolumen-Probenverarbeitung
Specifications_Comments: Polypropylen, graduiert, mit Kappen
24-Well-ZellkulturplattenCorning3524Purpose_Application:  Kokultur und funktioneller Assay-Aufbau
Specifications_Comments: Gewebekultur behandelt, flacher Boden
50 mL konische RöhrenCorning430829Purpose_Application:  Großvolumige Probenentnahme und -verarbeitung
Specifications_Comments: Polypropylen, graduiert, mit Kappen
Kryoviale (1 ml)Thermo Fisher Scientific375418Purpose_Application:  Langzeitlagerung von Zellen und Proben bei -80 & Acirc; ° C
Specifications_Comments: Außengewinde, O-Ringdichtung, -196Â ° C-Klassifizierung
Pasteur-Pipetten (steril)Fisher Scientific13-678-20APurpose_Application:  Sterile Probenentnahme und Transfer
Specifications_Comments: Einzel verpackt, steril

Referenzen

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