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Methodenartikel

Hemmung der Osteoklastogenese durch LY90009 durch Modulation des Notch-Signalwegs in osteolytischen Krankheitsmodellen

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DOI:

10.3791/69178

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7. Oktober 2025

 ,  , 
1Department of Rheumatology, Central Hospital Affiliated to Shandong First Medical University, 2Department of Geriatrics, Feicheng People's Hospital, 3Department of Trauma Center, Central Hospital Affiliated to Shandong First Medical University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll vor, um die inhibitorischen Wirkungen des γ-Sekretase-Inhibitors LY900009 auf die RANKL-induzierte Osteoklastogenese in Makrophagen aus dem Knochenmark zu bewerten. Das Protokoll umfasst die Bewertung der Zytotoxizität, funktionelle Assays, molekulare Analysen und die In-vivo-Validierung in einem osteolytischen Modell der Maus mit Anwendungen in der therapeutischen Entwicklung osteolytischer Erkrankungen.

Zusammenfassung

Eine dysregulierte Osteoklastenaktivität trägt wesentlich zum Fortschreiten der osteolytischen Erkrankung bei, doch das Ausmaß der therapeutischen Interventionsmodalitäten ist durch Nebenwirkungen begrenzt. In dieser Studie wurde LY900009, ein γ-Sekretase-Hemmer, und seine Fähigkeit untersucht, die RANKL-induzierte Osteoklastogenese durch Modulation des Notch-Signalwegs zu unterdrücken. Unter Verwendung von Makrophagen aus dem Knochenmark führten wir umfassende In-vitro-Bewertungen von Zytotoxizität, Differenzierung und funktionellen Assays durch. Gen- und Proteinexpressionsanalysen mittels qPCR und Western Blotting wurden eingesetzt, um die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen aufzuklären. Die in vivo Wirksamkeit wurde mit Hilfe eines murinen Lipopolysaccharid-induzierten Knochenresorptionsmodells bestätigt. LY900009 hemmte die RANKL-induzierte Osteoklastenbildung und -resorptive Funktion dosisabhängig ohne Zytotoxizität bei therapeutischen Konzentrationen. Diese Behandlung reduzierte signifikant die Anzahl der TRAP-positiven Osteoklasten, beeinträchtigte die Bildung des Aktingürtels und unterdrückte den Abbau der Knochenmatrix. Die Expression von Osteoklastenmarkern, einschließlich NFATc1, c-Fos, Cathepsin K und TRAP, war deutlich herunterreguliert. Mechanistisch störte LY900009 die Notch-Signalgebung und die nachgeschalteten MAPK/Akt-Signalwege. Die In-vivo-Verabreichung reduzierte die LPS-induzierte Knochenzerstörung erheblich, verbesserte die Knochenparameter und reduzierte das Vorhandensein von Osteoklasten. Diese Ergebnisse zeigen, dass LY900009 die Osteoklastogenese und den Knochenabbau wirksam hemmt, indem es die Notch/MAPK/Akt-Signalachse moduliert, was es zu einem vielversprechenden therapeutischen Kandidaten für osteolytische Erkrankungen macht.

Einleitung

Die Knochenhomöostase stellt ein exquisit orchestriertes physiologisches Paradigma bei Wirbeltieren dar, das durch das empfindliche Gleichgewicht zwischen Osteoblasten-vermittelter Knochenbildung und osteoklastengetriebener Knochenresorption harmonisiertwird 1. Dieses komplizierte Gleichgewicht erhält die Integrität des Skeletts, die biomechanische Belastbarkeit und die metabolische Treue während der gesamten Lebensspanne und reagiert dynamisch auf mechanische Anforderungen, endokrine Störungen und pathologische Herausforderungen2. Der Knochenumbauzyklus umfasst aufeinanderfolgende Phasen der Aktivierung, Resorption, des Übergangs, der Bildung und der Beendigung, die jeweils von komplizierten molekularen Kaskaden gesteuert werden, die die räumlich-zeitliche Synchronisation der zellulären Aktivitäten sicherstellen3.

Eine Störung dieses homöostatischen Mechanismus, insbesondere durch übermäßige Osteoklastenaktivität oder unzureichende Osteoblastenfunktion, führt zu einem pathologischen Knochenverlust, der für zahlreiche osteolytische Erkrankungen charakteristisch ist 4,5. Diese Erkrankungen umfassen ein breites Spektrum von Krankheiten, darunter postmenopausale und seneszente Osteoporose, rheumatoide Arthritis, entzündliche Arthritis, neoplastische Knochenbeteiligung, Morbus Paget und parodontale Erkrankungen6. Zu den klinischen Manifestationen eines übermäßigen Knochenabbaus gehören ein erhöhtes Frakturrisiko, Skelettdeformitäten, chronische Schmerzen, funktionelle Behinderungen und eine erhebliche Belastung des Gesundheitswesens 6,7. Gegenwärtige epidemiologische Metriken zeigen, dass allein Osteoporose über 200 Millionen Menschen weltweit betrifft, wobei die damit verbundenen Frakturen zu erheblichen Morbiditäten, Mortalität und wirtschaftlichen Kosten von mehr als Milliarden von Dollar pro Jahr führen 7,8.

Osteoklasten manifestieren sich als hochspezialisierte mehrkernige Riesenzellen, die von hämatopoetischen Vorläufern der mononukleären Phagozytenlinie abstammen, insbesondere von Makrophagen aus dem Knochenmark9. Ihre Bildung stellt einen komplexen mehrstufigen Prozess dar, der die präzise Koordination von extrazellulären Signalen, intrazellulären Signalkaskaden und Transkriptionsprogrammen erfordert10. Zu den essentiellen Zytokinen, die die Osteoklastogenese steuern, gehören der Rezeptoraktivator des Kernfaktor-κB-Liganden (RANKL) und der Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (M-CSF), die an ihre jeweiligen Rezeptoren RANK und c-Fms binden, um Differenzierungsprogramme zu initiieren11. Die RANKL-RANK-Interaktion löst die Aktivierung mehrerer nachgeschalteter Signalwege aus, darunter Mitogen-aktivierte Proteinkinasen (MAPKs), Kernfaktor κB (NF-κB), Phosphoinositid-3-Kinase/Proteinkinase B (PI3K/Akt) und Calcium/Calcineurin-Signalwege, die auf den Kernfaktor der aktivierten T-Zellen zytoplasmatisch 1 (NFATc1), den Haupttranskriptionsregulator der Osteoklastogenese 10,11,12, konvergieren.

Unter den verschiedenen Regulationsmechanismen, die die Osteoklastenbiologie steuern, hat sich der Notch-Signalweg als kritischer Modulator mit komplexen und kontextabhängigen Funktionen herausgestellt13. Der Notch-Signalweg ist ein evolutionär konserviertes Zell-Zell-Kommunikationssystem, das die Bestimmung des Zellschicksals, die Differenzierung, die Proliferation und die Apoptose über verschiedene Gewebe und Entwicklungsstadien hinweg steuert14. Bei Säugetieren interagieren vier Notch-Rezeptoren (Notch1-4) mit fünf kanonischen Liganden (Delta-like 1, 3 und 4 sowie Jagged 1 und 2), um die interzelluläre Signalübertragung zu vermitteln. Die Aktivierung des Signalwegs umfasst die Ligandenbindung, Konformationsänderungen und die sequentielle proteolytische Spaltung durch ADAM-Metalloproteasen und den γ-Sekretase-Komplex, der letztendlich die intrazelluläre Notch-Domäne (NICD) für die nukleäre Translokation und transkriptionelle Regulation von Zielgenen, einschließlich der Hes- und Hey-Familien, freisetzt14,15. Die Rolle des Notch-Signalwegs bei der Osteoklastogenese bleibt umstritten und scheint stark kontextabhängig zu sein, wobei Studien sowohl stimulierende als auch hemmende Wirkungen in Abhängigkeit von den spezifischen Rezeptor-Subtypen, der Verfügbarkeit von Liganden, der zellulären Mikroumgebung und den experimentellen Bedingungen berichten 16,17,18.

Vorherrschende Therapieansätze für osteolytische Erkrankungen konzentrieren sich hauptsächlich auf antiresorptive Strategien, darunter Bisphosphonate, Denosumab (RANKL-Inhibitor), selektive Östrogenrezeptormodulatoren und Calcitonin 7,8,19. Obwohl diese Behandlungen das Knochenresorptions- und Frakturrisiko wirksam reduzieren, sind sie mit erheblichen Einschränkungen verbunden, darunter gastrointestinale Toxizität, Osteonekrose des Kiefers, atypische Frakturen, erhöhtes Infektionsrisiko und Bedenken hinsichtlich der langfristigen Sicherheit. Darüber hinaus können diese Mittel den Knochenumsatz übermäßig unterdrücken, was möglicherweise die Knochenqualität und die Reparaturmechanismen beeinträchtigt. Folglich besteht ein dringender klinischer Bedarf an neuartigen Therapeutika, die die pathologische Osteoklastenaktivität selektiv hemmen und gleichzeitig Nebenwirkungen minimieren und die physiologische Knochenumbaukapazität erhalten können 8,14.

γ-Sekretase-Inhibitoren stellen eine vielversprechende Klasse von Verbindungen dar, die durch Modulation des Notch-Signalwegs bei osteolytischen Erkrankungen eingesetzt werdenkönnen 14,20. Diese Wirkstoffe wurden in der Onkologie und in der Forschung zu neurodegenerativen Erkrankungen ausgiebig untersucht, wobei mehrere Wirkstoffe in klinische Studien für die Alzheimer-Krankheit und verschiedene Krebsarten übergingen. LY900009, ein potenter und selektiver γ-Sekretase-Inhibitor, hat in Vorstudien günstige pharmakologische Eigenschaften gezeigt, einschließlich hoher Spezifität, Bioverfügbarkeit und eines überschaubaren Sicherheitsprofils21,22. Seine spezifischen Auswirkungen auf die RANKL-induzierte Osteoklastogenese und sein potenzieller therapeutischer Nutzen bei osteolytischen Erkrankungen sind jedoch noch unvollständig charakterisiert. In dieser Studie sollte untersucht werden, ob LY900009 die Osteoklastogenese durch die Störung des Notch-Signalwegs hemmen und möglicherweise einen neuen therapeutischen Ansatz für osteolytische Erkrankungen bieten könnte. Wir haben umfassende Protokolle entwickelt, um ihre Auswirkungen auf die Osteoklastenbildung, die Knochenresorptionsaktivität, die Signalwege und die In-vivo-Wirksamkeit in entzündlichen Knochenverlustmodellen zu bewerten.

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Protokoll

Alle Tierverfahren wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien durchgeführt und vom Tierpflege- und -nutzungsausschuss des Zentralkrankenhauses, das der Shandong First Medical University angegliedert ist, genehmigt (Zulassungsnummer IACUC-2024-015). Die Studie hielt sich an etablierte ethische Grundsätze für Tierversuche und die ANARRIVE-Richtlinien, einschließlich der Unterbringung von Tieren in Standardkäfigen (5 Mäuse/Käfig, 12-stündiger Hell-Dunkel-Zyklus, ad libitum Futter/Wasser) und der Randomisierung in Gruppen

1. Isolierung und Kultur von Makrophagen aus dem Knochenmark

  1. Euthanasieren Sie 5 Wochen alte männliche C57BL/6-Mäuse (n = 5 pro Isolierung), indem Sie sie 5 Minuten lang in eine CO2 -Kammer mit einer Flussrate von 30 % Kammervolumen pro Minute legen. Bestätigen Sie den Tod durch Gebärmutterhalsluxation.
  2. Besprühen Sie die Maus mit 70% Ethanol. Machen Sie mit einer sterilen Schere einen Schnitt in der Mittellinie vom Schambein bis zum Brustbein. Femure und Tibien aseptisch entfernen. Legen Sie die Knochen in sterilem PBS auf Eis.
  3. Reinigen Sie die Knochen von Weichgewebe mit steriler Gaze. Schneide beide Enden der Knochen mit einer sterilen Schere ab. Spülen Sie das Knochenmark mit einer 25G-Nadel mit 10 ml kaltem α-MEM pro Maus. Die Zellsuspension wird durch ein 70 μm Zellsieb geleitet.
  4. Zentrifugieren Sie bei 300 x g für 5 min bei 4 °C. Resuspendieren Sie das Pellet in α-MEM, das 10 % FBS und 33,3 ng/mL M-CSF enthält. Zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer mit Trypanblau-Ausschluss. Platte bei 2 x 106 Zellen/ml in T75-Kolben.
  5. Die Kulturen sind bei 37 °C in 5 % CO2 -Atmosphäre zu halten, wobei das Medium alle 48 Stunden gewechselt wird.
  6. Ernte 1x 106 Zellen. Mit PBS waschen, das 2% FBS enthält. Mit Anti-CD11b-FITC (1:100) und Anti-F4/80-PE (1:100) 30 min bei 4 °C im Dunkeln inkubieren. Analysieren Sie durch Durchflusszytometrie mit der folgenden Gating-Strategie: Zuerst werden Zellen basierend auf Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitenstreuung (SSC) gegatet, um Ablagerungen auszuschließen und lebensfähige Zellen auszuwählen. Zweitens gatet CD11b-positive Zellen aus der lebensfähigen Zellpopulation. Drittens wird aus CD11b-positiven Zellen F4/80-positive Zellen gegatet, um CD11b+/F4/80+ doppel-positive Makrophagen zu identifizieren. Legen Sie Gates basierend auf nicht gefärbten Steuerelementen und einfarbigen Steuerelementen fest. Fahren Sie nur fort, wenn >95 % der Zellen CD11b+/F4/80+ sind.

2. Bewertung der Zytotoxizität

  1. Aus Knochenmark gewonnene Makrophagen (BMMs) in einer Menge von 1 x 104 Zellen pro Well in 96-Well-Platten mit 100 μl Medium pro Well aussäen. Lassen Sie die Zellen 4 h bei 37 °C anhaften.
  2. Bereiten Sie LY900009 Verdünnungen im vollständigen Medium vor: 0, 0,1, 0,2, 0,4, 0,8, 1,6, 3,2, 6,4, 12,8, 25,6 μM. Altes Medium entfernen. Geben Sie 100 μl Behandlungsmedium pro Vertiefung hinzu. Bereiten Sie für jede Konzentration Dreifachpräparate vor.
  3. Inkubieren Sie für 24 Stunden, 48 Stunden oder 96 Stunden. Entfernen Sie das Nährmedium vollständig. 100 μl frisches Medium mit 10 % CCK-8-Reagenz (10 μl CCK-8 in 90 μl Medium) zugeben. Genau 2 h bei 37 °C inkubieren. Verwenden Sie ein Mikroplatten-Reader, um die Absorption bei 450 nm mit einer Referenz bei 650 nm zu messen.
  4. Berechnen Sie IC50 mit GraphPad Prism. Offene Software, Eingangskonzentration (X-Achse) und prozentuale Rentabilität (Y-Achse). Wählen Sie Analysieren > Nichtlineare Regression > Dosis-Wirkungs-Beziehung > Hemmung > log(Inhibitor) vs. Reaktion mit variabler Steigung. Festlegen von Einschränkungen: Unten=0, Oben=100. Zeichnen Sie IC50 mit einem Konfidenzintervall von 95 % auf.

3. Osteoklastendifferenzierung und TRAP-Färbung

  1. Aus Knochenmark gewonnene Makrophagen (BMMs) in einer Menge von 1 x 104 Zellen pro Well in 96-Well-Platten. Über Nacht in α-MEM mit 10% FBS und 33,3 ng/mL M-CSF kultiviert.
  2. Ersetzen Sie das Medium durch 100 μl Differenzierungsmedium: α-MEM mit 10 % FBS, 33,3 ng/mL M-CSF, 100 ng/mL RANKL und LY900009 (0, 100, 200, 400 nM). Bereiten Sie Quadruplikate für jede Bedingung vor.
  3. Ersetzen Sie das Medium alle 48 h durch frisches Differenzierungsmedium. Fahren Sie 6 Tage lang fort. Überwachen Sie täglich mit einem inversen Mikroskop bei 100x auf Osteoklastenbildung.
  4. Entfernen Sie das gesamte Medium durch Aspiration. Einmal mit 200 μl PBS waschen. Fügen Sie 100 μl 4% Paraformaldehyd in PBS hinzu. Genau 15 min bei Raumtemperatur inkubieren. Fixiermittel entfernen. 3x mit 200 μL PBS waschen.
  5. Bereiten Sie die TRAP-Färbelösung vor: Mischen Sie 50 ml 0,1 M Natriumacetatpuffer (pH 5,0), 10 ml 50 mM Natriumtartrat, 1 ml 5 mg/ml Naphthhol AS-MX-Phosphat in Dimethylformamid und 0,5 ml 11 mg/ml Fast Red Violet LB-Salz. Filtern Sie durch einen 0,22 μm Filter. 200 μl pro Vertiefung auftragen. Bei 37 °C 30 min im Dunkeln inkubieren. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 3x mit destilliertem Wasser waschen.
  6. Identifizieren Sie Osteoklasten als TRAP-positive Zellen (violett/rot), die drei oder mehr Zellkerne enthalten. Zählen Sie mit einem inversen Mikroskop bei 100-facher Vergrößerung. Fotografieren Sie fünf zufällige Felder pro Vertiefung.
  7. Quantifizieren Sie mit ImageJ. Klicken Sie auf das Bild > In 8-Bit konvertieren (Bild > Geben Sie > 8-Bit ein) > Schwellenwert festlegen (Bild > Schwellenwert >anpassen) > wählen Sie TRAP-positive Bereiche aus > Partikel analysieren (Analysieren > Analysieren von Partikeln: Größe 100-Unendlichμm 2, Zirkularität 0-1,0) > Exportieren Sie die Ergebnisse nach Excel 23.

4. Funktioneller Knochenresorptionsassay

  1. Kultivieren Sie BMMs in Sechs-Well-Platten (2 x 10,5 Zellen/Well) mit M-CSF für 24 h. Fügen Sie RANKL (100 ng/ml) hinzu, um die Präosteoklastenbildung für 3 Tage zu induzieren.
  2. Ernten Sie Zellen mit 0,25 % Trypsin-EDTA für 5 min bei 37 °C. Mit Vollmedium neutralisieren. Zählen Sie lebensfähige Zellen mit Trypanblau.
  3. 1 x 104 Prä-Osteoklasten pro Vertiefung auf mit Hydroxylapatit beschichteten 96-Well-Platten aussäen. Befestigung für 4 Stunden zulassen.
  4. Behandeln Sie 4 Tage lang mit M-CSF (33,3 ng/ml), RANKL (100 ng/ml) und LY900009 (0, 100, 200, 400 nM). Wechseln Sie das Medium alle 2 Tage.
  5. Entfernen Sie die Zellen mit 10% Bleiche für 10 Minuten. 5x mit destilliertem Wasser waschen. Vollständig an der Luft trocknen.
  6. Visualisieren Sie Resorptionsgruben mit einem automatisierten bildgebenden Reader bei 4-facher Vergrößerung. Erfassen Sie den gesamten Well-Bereich. Quantifizieren Sie die resorbierte Fläche als Prozentsatz der Gesamtfläche mit ImageJ.

5. Immunfluoreszenzmikroskopie

  1. Kultivieren Sie Osteoklasten auf Glasdeckgläsern in 24-Well-Platten für 5-7 Tage, wie in Schritt 3 beschrieben.
  2. Mit 4% Paraformaldehyd für 15 min fixieren. Permeabilisieren Sie mit 0,1% Triton X-100 in PBS für 10 min. Mit 1% BSA in PBS für 1 h bei Raumtemperatur blockieren.
  3. Mit Rhodamin-Phalloidin (1:200) in Blockierungspuffer 45 min bei Raumtemperatur in Dunkelheit inkubieren. Gegenfärbung der Zellkerne mit DAPI (1 μg/mL) für 10 min.
  4. Montieren Sie Deckgläser mit einem lichtbeständigen Eindeckmedium auf Dias. Untersuchen Sie mit einem Fluoreszenzmikroskop bei 200-facher Vergrößerung. Messen Sie die Aktinringfläche mit ImageJ.

6. Quantitative real-time PCR-Analyse

  1. Extrahieren Sie die Gesamt-RNA von 2 x 106 Zellen mit einem RNA-Extraktionsreagenz. Durch Pipettieren homogenisieren. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  2. Fügen Sie 200 μl Chloroform hinzu. 15 s kräftig schütteln. 3 Min. inkubieren. Zentrifugieren Sie bei 12.000 x g für 15 min bei 4 °C.
  3. Die wässrige Phase in das neue Röhrchen überführen. 500 μl Isopropanol zugeben. Vorsichtig mischen. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren. Zentrifugieren bei 12.000 x g für 10 min bei 4 °C.
  4. Waschen Sie das Pellet mit 1 ml 75%igem Ethanol. 10 Min. an der Luft trocknen lassen. In 30 μl RNase-freiem Wasser auflösen. Messen Sie die Konzentration mit einem Spektralphotometer (erforderliches Verhältnis A260/A280 >1,8).
  5. Synthetisieren Sie cDNA mit 1 μg RNA mit dem reversen Transkriptionskit gemäß dem Protokoll des Herstellers.
  6. Bereiten Sie qPCR-Reaktionen vor: 10 μl Master Mix, 1 μl cDNA, 0,5 μl jedes Primers (10 μM), 8 μl Wasser. Betrieb auf einem real-time PCR-System: 95 °C für 10 Minuten, dann 40 Zyklen von 95 °C für 15 s und 60 °C für 60 s. Berechnen Sie die relative Expression mit der 2-ΔΔCt-Methode mit GAPDH als Referenzgen.

7. Westliche Blot-Analyse

  1. Lyse der Zellen in RIPA-Puffer, der Protease- und Phosphatasehemmer enthält, auf Eis für 30 Minuten. Zentrifugieren Sie bei 14.000 x g für 15 min bei 4 °C.
  2. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit dem BCA-Assay gemäß den Anweisungen des Herstellers. Bereiten Sie 30 μg Proteinproben im Ladepuffer vor. 5 Min. kochen lassen.
  3. Laden Sie die Proben auf 10% SDS-PAGE-Gele. 30 min lang mit 80 V und dann 90 min mit 120 V betrieben. Übertragung auf PVDF-Membranen bei 100 V für 90 min in Kalttransferpuffer.
  4. Blockmembranen mit 5 % Magermilch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,1 % Tween-20 (TBST) für 1 h bei Raumtemperatur unter leichtem Schaukeln.
  5. Inkubieren Sie mit Primärantikörpern, die in der Materialtabelle (1:1000) aufgeführt sind, über Nacht bei 4 °C unter leichtem Schaukeln. 3x mit TBST für je 10 min waschen.
  6. Mit HRP-konjugierten Sekundärantikörpern (1:5000) 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. 3x mit TBST waschen.
  7. Mit dem ECL-Reagenz gemäß den Anweisungen des Herstellers nachweisen. Erfassen Sie Bilder mit einem Infrarot-Bildgebungssystem. Quantifizieren Sie die Bandenintensität mit ImageJ.

8. In vivo LPS-induziertes Knochenresorptionsmodell

  1. Berechnen Sie die Stichprobengröße mit G*Power 3.1 (Effektstärke = 0,8, α = 0,05, Potenz = 0,80, ergibt n n = 5/Gruppe). Ordnen Sie 7-8 Wochen alte männliche C57BL/6-Mäuse mit Hilfe eines Zufallszahlengenerators zufällig Gruppen zu. Halten Sie 5 Mäuse pro Käfig mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus, Temperatur 22 ± 2 °C, Luftfeuchtigkeit 55 % ± 10 %, ad libitum Zugang zu Standardfutter und Wasser.
  2. Betäuben Sie Mäuse durch intraperitoneale Injektion von Pentobarbital-Natrium (50 mg/kg). Bestätigen Sie die Anästhesie durch den Zehenkneifreflex.
  3. Fahrzeugsteuerung vorbereiten: PBS mit 1 % DMSO. Bereiten Sie LY900009 vor: Niedrige Dosis (2,5 mg/kg) und hohe Dosis (5 mg/kg) im Vehikel. Injizieren Sie 14 Tage lang täglich 100 μl mit einer 27-G-Nadel über die Schädeldecke. Injizieren Sie LPS (10 mg/kg) an den Tagen 1 und 8.
  4. Überwachen Sie Mäuse 2x täglich auf Anzeichen von Stress. Definieren Sie humane Endpunkte: Gewichtsverlust >20%, Unfähigkeit zu gehen, gebeugte Haltung, verminderte Körperpflege. Sofort einschläfern, wenn die Endpunkte erreicht sind.
  5. Euthanasieren Sie an Tag 15 mit einer Pentobarbital-Überdosierung (100 mg/kg intraperitoneal). Kalvarienberge ernten. 4 % Paraformaldehyd für 48 h bei 4 °C fixieren.

9. Mikro-CT und histologische Analyse

  1. Scannen Sie feste Kalvarien mit einem Mikro-CT-Scanner mit folgenden Parametern: 70 kV, 114 μA, 0,5 mm Aluminiumfilter, 9 μm Auflösung, 180° Drehung in 0,4° Schritten.
  2. Rekonstruieren Sie Bilder mit der NRecon-Software. Analysieren Sie mit der CTAn-Software. Definieren Sie den interessierenden Bereich als einen 3 x 3 mm großen Bereich, der auf der sagittalen Naht zentriert ist. Berechnen Sie BMD, BV/TV, Tb.N, Tb.Th.
  3. Entkalken Sie die Proben 14 Tage lang in 10 % EDTA (pH 7,4) mit täglichem Wechsel. Prüfen Sie den Abschluss der Entkalkung mit dem Calciumoxalat-Test24.
  4. Verfahren zur Paraffineinbettung: Dehydrieren durch abgestuften Alkohol, klar in Xylol, Infiltrieren mit Paraffin. Schnitt bei 4 μm Dicke mit Mikrotom.
  5. Verblindung sicherstellen: Kodieren Sie alle Stichproben mit zufälligen dreistelligen Zahlen. Bitten Sie einen Kollegen, den Codeschlüssel zu verwalten. Führen Sie alle Analysen ohne Kenntnis der Behandlungsgruppen durch. Decodieren Sie erst, nachdem die Datenerfassung abgeschlossen ist.
  6. H&E-Färbung durchführen: Entparaffinisieren, Rehydrieren, 5 Minuten lang mit Hämatoxylin färben, in saurem Alkohol differenzieren, 2 Minuten lang mit Eosin färben, dehydrieren und einbetten.
  7. Führen Sie die TRAP-Färbung wie in Schritt 3.5 durch. Zählen Sie TRAP-positive mehrkernige Zellen entlang der Knochenoberfläche. Ausdrücken als Zahl pro mm Knochenumfang.

10. Statistische Auswertung

  1. Berechnen Sie die erforderliche Stichprobengröße mit G*Power 3.1: Eingabeeffektgröße f=0,8, α=0,05, Potenz=0,80, Anzahl der Gruppen. Notieren Sie das Minimum an n pro Gruppe.
  2. Testen Sie die Normalverteilung mit dem Shapiro-Wilk-Test in SPSS 28.0. Betrachten Sie p > 0,05 als normalverteilt. Testen Sie die Varianzhomogenität mit dem Levene-Test. Betrachten Sie p > 0,05 als gleiche Varianzen.
  3. Wenden Sie geeignete Tests basierend auf der Verteilung an: Verwenden Sie für Normaldaten mit gleichen Varianzen parametrische Tests. Wenden Sie für die beiden Gruppen den t-Test des nicht gekoppelten Teilnehmers an. Verwenden Sie für mehrere Gruppen die unidirektionale ANOVA.
  4. Führen Sie eine Post-hoc-Analyse durch: Für signifikante ANOVA (p<0,05) wenden Sie den Tukey-Test für ehrlich signifikante Differenzen auf alle paarweisen Vergleiche an.
  5. Verwenden Sie nicht-parametrische Alternativen für nicht normalverteilte Daten: Wenden Sie den Mann-Whitney-U-Test für zwei Gruppen und Kruskal-Wallis mit Dunns Post-hoc-Test für mehrere Gruppen an.
  6. Berechnen Sie die Effektstärken: Cohens d für t-Tests, partielle ETA zum Quadrat für die ANOVA.
  7. Melden Sie exakte p-Werte mit drei Dezimalstellen und 95 %-Konfidenzintervallen. Normaldaten als Mittelwert ± Standardabweichung, Nicht-Normaldaten als Median (Interquartilsabstand) darstellen.
  8. Betrachten Sie p < 0,05 als statistisch signifikant. Wenden Sie die Bonferroni-Korrektur an, wenn mehrere Vergleiche durchgeführt werden.

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Ergebnisse

Die erfolgreiche Implementierung dieses Protokolls zeigte, dass LY900009 durch mehrere miteinander verbundene Mechanismen starke hemmende Wirkungen auf die Bildung und Funktion von Osteoklasten ausübten. Die anfängliche Bewertung der Zytotoxizität bei Makrophagen aus dem Knochenmark zeigte einen zeitabhängigen Anstieg der Toxizität mit berechneten IC50-Werten von 4,44 μM, 3,66 μM und 2,93 μM nach 24 h, 48 h bzw. 96 h (Abbildung 1A,B). Wichtig ist, dass diese zytot...

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Diskussion

Die vorliegende Untersuchung liefert überzeugende Beweise dafür, dass LY900009 durch seine starke und selektive Hemmung der Osteoklastogenese ein vielversprechendes Therapeutikum für osteolytische Erkrankungen darstellt, was mit dem wachsenden Interesse an γ-Sekretase-Inhibitoren für knochenbedingte Erkrankungen übereinstimmt 14,20,21. Die Ergebnisse zeigen, dass dieser γ-Sekretase-Inhibitor die...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder Interessenkonflikte bestehen. Kein Autor steht in irgendeiner finanziellen Beziehung zu den in diesem Werk erwähnten kommerziellen Unternehmen. Alle Autoren haben die ICMJE-Offenlegungsformulare ausgefüllt.

Danksagungen

Die Autoren danken den Mitarbeitern des Zentralkrankenhauses, das der Shandong First Medical University und dem Feicheng People's Hospital angegliedert ist, für ihre technische Unterstützung und Hilfe während der Durchführung dieser Studie. Wir schätzen auch die Beiträge unserer Laborkollegen für ihre wertvollen Diskussionen und die Unterstützung bei Tierversuchen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
24-Well-ZellkulturplattenCorning3524Immunfluoreszenzmikroskopie
6-Well-ZellkulturplattenCorning3516Zellkultur und Western Blot
70% EthanolSigma-AldrichNr. E7023Sterilisation und Desinfektion
75% EthanolSigma-AldrichNr. E7148RNA-Waschpuffer
96-Well-ZellkulturplattenCorning3596Zellkulturen und Assays
Aluminiumfilter (0,5 mm)BrukerN/AMikro-CT-Scan-Filter
Anti-CD11b-FITC AntikörperBioLegende101206Durchflusszytometrie - Makrophagen-Marker
Anti-gespaltener Notch1-Antikörper (monoklonal Kaninchen)Zell-Signaltechnik4147SWestern Blot - Notch-Signalisierung
Anti-F4/80-PE AntikörperBioLegende123108Durchflusszytometrie - Makrophagen-Marker
Anti-Fade-EindeckmediumVector LaboratorienH-1000Fluoreszenzmikroskopie-Halterung
Anti-Hes1-Antikörper (Kaninchen, monoklonal)Zell-Signaltechnik11988STWestern Blot - Kerbe stromabwärts Ziel
Anti-NFATc1-Antikörper (monoklonal der Maus)Santa Cruz BiotechnologieSC-7294Western Blot - Osteoklasten-Master-Regulator
Anti-Phospho-Akt (Ser473) AntikörperZell-Signaltechnik4060SWestern Blot - PI3K/Akt-Signalisierung
Anti-Phospho-ERK1/2 (Thr202/Tyr204) AntikörperZell-Signaltechnik4370SWestern Blot - MAPK-Signalisierung
Anti-Phospho-NF-κ B p65 (Ser536) AntikörperZell-Signaltechnik3033SWestern-Blot - NF-κ B-Signalisierung
Anti-Phospho-p38 MAPK (Thr180/Tyr182) AntikörperZell-Signaltechnik4511SWestern-Blot - p38 MAPK-Signalisierung
Anti-β-Aktin-Antikörper (Maus monoklonal)Zell-Signaltechnik4970ERWestern-Blot-Ladekontrolle
Automatisiertes Imaging-LesegerätMolekulare BauelementeImageXpress MicroQuantifizierung der Resorptionsgrube
BCA-Protein-Assay-KitPierce/Thermo Fisher23225Bestimmung der Proteinkonzentration
Bleiche (10% Natriumhypochlorit)Sigma-Aldrich425044Zellentnahme aus Resorptionsplatten
BSA (Rinderserumalbumin)Sigma-AldrichNr. A7906Blockierungspuffer für Immunfluoreszenz
C57BL/6 Mäuse (männlich, 5-8 Wochen alt)Charles River Laboratorien27In vitro BMM-Isolierung und in vivo Studien
Calciumoxalat-TestreagenzSigma-AldrichNr. C0350Prüfung des Abschlusses der Entkalkung
CCK-8 Reagenz (Zellzählkit-8)Dojindo Molecular TechnologiesCK04Bewertung der Zellviabilität
Zellsieb (70 μ m)BD Falke352350Filtration von Knochenmarkzellen
Zentrifuge (gekühlt)Eppendorf5424RZell- und Probenvorbereitung
ChloroformSigma-AldrichNr. C2432Trennung der RNA-Extraktionsphase
CO2 KammerEuthanex CorpEX-075Euthanasie von Tieren
CTAn-SoftwareBrukerVersion 1.20Mikro-CT-Bildanalyse
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindol)Sigma-AldrichNr. D9542Nukleare Gegenfärbung
Dimethylformamid (DMF)Sigma-AldrichNr. D4551TRAP Färbelösungsmittel
DMSO (Dimethylsulfoxid)Sigma-AldrichNr. D2650Vorbereitung der Fahrzeugsteuerung
ECL Western Blotting SubstratPierce/Thermo Fisher32106Proteinnachweis im Western Blot
EDTA (10%, pH 7,4)Sigma-AldrichNr. E6758Lösung zur Entkalkung
Eosin YSigma-AldrichNr. E4009H& E histologische Färbung
Fast Red Violet LB SalzSigma-AldrichNr. F3381TRAP färbendes Chromogen
Fötales Rinderserum (FBS)Gibco/Thermo Fisher16140-071Nahrungsergänzungsmittel für Zellkulturen
DurchflusszytometerBD BiowissenschaftenFACSCaliburBMM-Charakterisierung
Fluoreszenz-MikroskopOlympIX73Immunfluoreszenz-Bildgebung
G*Power SoftwareHeinrich-Heine-UniversitätVersion 3.1Statistische Power-Analyse
Glas-Deckgläser (22 & 22 mm)Fisher Scientific12-541-BImmunfluoreszenzmikroskopie
GraphPad PrismaGraphPad-SoftwareVersion 9.0IC50-Berechnung und -Grafik
HämatoxylinSigma-AldrichNr. H3136H& E histologische Färbung
HämozytometerHausser Scientific3200Zellzählung
Reverse-Transkriptionskit für cDNA mit hoher KapazitätAngewandte Biosysteme4368814cDNA-Synthese aus RNA
HRP-konjugiertes Anti-Maus-IgGZell-Signaltechnik7076SWestern-Blot-Sekundärantikörper
HRP-konjugiertes Anti-Kaninchen-IgGZell-Signaltechnik7074SWestern-Blot-Sekundärantikörper
Hydroxylapatit-beschichtete 96-Well-PlattenCorning BioCoat354651Funktionstest für Knochenresorption
BildJNIHVersion 1.53eBildanalyse und Quantifizierung
Inkubator (CO2)Thermo Fischer51033058Wartung von Zellkulturen
Infrarot-BildgebungssystemBio-RadChemiDoc MPWestern-Blot-Nachweis
Inverses MikroskopOlympCKX41Überwachung von Zellkulturen, TRAP-Zählung
IsopropanolSigma-AldrichNr. I9516RNA-Präzipitation
LPS (Lipopolysaccharid aus E. coli)Sigma-AldrichNr. L4391In vivo entzündliche Knochenresorption
LY900009 (γ-Sekretase-Hemmer)Selleck ChemikalienNr. S7999Testverbindung - Osteoklastenhemmer
M-CSF (Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor)Forschung & Forschung D-SystemeArtikel-Nr.: 416-ML-010Überleben von Makrophagen und Osteoklastendifferenzierung
Mikro-CT-ScannerBrukerSkyScan 1272Analyse der Mikroarchitektur von Knochen
Mikroplatten-ReaderBioTekSynergie H1Absorptionsmessungen (CCK-8)
MikrotomLeicaRM2255Histologische Schnitte
Naphthol AS-MX PhosphatSigma-AldrichN5000TRAP Färbesubstrat
Nadeln (25G, 27G)BD305122, 305109Knochenmarkspülung, Injektionen
NRecon SoftwareBrukerVersion 1.7Mikro-CT-Bildrekonstruktion
ParaffinSigma-AldrichNr. P3683Einbettung von Gewebe
Paraformaldehyd (4%)Sigma-AldrichNr. P6148Fixierung von Zellen und Gewebe
PBS (Phosphatgepufferte Kochsalzlösung)Gibco/Thermo Fisher14190-144Zellwäsche und Puffervorbereitung
Pentobarbital-NatriumSigma-AldrichNr. P3761Tieranästhesie und Euthanasie
Phosphatase-Hemmer-CocktailRoche4906837001Konservierung der Phosphorylierung
PowerUp SYBR Grün MastermixAngewandte BiosystemeNr. A25742Quantitative real-time PCR
Proteasehemmer-CocktailRoche11697498001Verhinderung des Proteinabbaus
PVDF-Membran (0,45 μ m)Bio-Rad1620177Transfer von Western-Blot-Proteinen
RANKL (Rezeptoraktivator von NF-& kappa; B-Ligand)Forschung & Forschung D-SystemeArtikel-Nr.: 462-TEC-010Induktion der Osteoklastendifferenzierung
Real-Time-PCR-SystemAngewandte Biosysteme7500 SchnellQuantitative Genexpressionsanalyse
Rhodamin-PhalloidinInvitrogen/Thermo FisherNr. R415F-Aktin-Visualisierung
RIPA-PufferZell-Signaltechnik9806SProtein-Extraktion
RNase-freies WasserAmbion/Thermo FisherAM9937RNA-Auflösung und PCR
SDS-PAGE Gele (10%)Bio-Rad4561036Trennung von Western-Blot-Proteinen
MagermilchpulverBio-Rad1706404Western-Blot-Blockierung
Natriumacetat-Puffer (0,1 M, pH 5,0)Sigma-AldrichNr. S2889TRAP Färbepuffer
Natriumtartrat (50 mM)Sigma-AldrichNr. S4297Spezifität der TRAP-Färbung
SpektralphotometerThermo FischerNanoDrop 2000Messung der RNA-/Proteinkonzentration
SPSSIBM CorporationVersion 28.0Statistische Analyse
Spritzen (1 mL, 10 mL)BD309659, 309604Knochenmarkspülung, Injektionen
T75 ZellkulturflaschenCorning430641Primäre BMM-Kultur
TBST (Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit 0,1% Tween-20)Bio-Rad1706531Puffer für die Western-Blot-Reinigung
Puffer übertragenBio-Rad1704270Transfer von Western-Blot-Proteinen
Triton X-100Sigma-AldrichNr. T8787Zellpermeabilisierung
TRIzol-ReagenzInvitrogen/Thermo Fisher15596026Extraktion der Gesamt-RNA
Trypanblau (0,4 %)Sigma-AldrichNr. T8154Bewertung der Zellviabilität
Trypsin-EDTA (0,25 %)Gibco/Thermo Fisher25200-056Zellernte und -ablösung
Western-Blot-TransfersystemBio-RadTrans-Blot TurboProteintransfer zur Membran
XylolSigma-AldrichX3750Gewebeaufbereitung und -reinigung
α-MEM (Alpha Minimum Essential Medium)Gibco/Thermo Fisher12561-056Zellkulturmedium

Referenzen

  1. Langdahl, B., Ferrari, S., Dempster, D. W. Bone modeling and remodeling: potential as therapeutic targets for the treatment of osteoporosis. Ther Adv Musculoskeletal Dis. 8 (6), 225-235 (2016).
  2. Shah, M. A. A., et al. Functional morphology of trabecular system in human proximal femur: a perspective from P45 sectional plastination and 3D reconstruction finite element analysis. J Ortho Surg Res. 20 (1), (2025).
  3. Shah, M. A. A., et al. Microvasculature and trabecular bone in beagle proximal femur: Microstructural insights. Ann Anatomy. 258, 152368(2025).
  4. Mukherjee, K., Chattopadhyay, N. Pharmacological inhibition of cathepsin K: A promising novel approach for postmenopausal osteoporosis therapy. Biochem Pharmacol. 117, 10-19 (2016).
  5. Bertuglia, A., et al. Osteoclasts are recruited to the subchondral bone in naturally occurring post-traumatic equine carpal osteoarthritis and may contribute to cartilage degradation. Osteoarth Cartilage. 24 (3), 555-566 (2016).
  6. Alami, S., Hervouet, L., Poiraudeau, S., Briot, K., Roux, C. Barriers to Effective Postmenopausal Osteoporosis Treatment: A Qualitative Study of Patients' and Practitioners' Views. PLoS One. 11 (6), e0158365(2016).
  7. Hiligsmann, M., et al. A Systematic Review of Cost-Effectiveness Analyses of Drugs for Postmenopausal Osteoporosis. PharmacoEconomics. 33 (3), 205-224 (2014).
  8. Hadji, P., et al. Persistence, adherence, and medication-taking behavior in women with postmenopausal osteoporosis receiving denosumab in routine practice in Germany, Austria, Greece, and Belgium: 12-month results from a European non-interventional study. Osteoporosis Int. 26 (10), 2479-2489 (2015).
  9. Udagawa, N., et al. Osteoblasts/stromal cells stimulate osteoclast activation through expression of osteoclast differentiation factor/RANKL but not macrophage colony-stimulating factor. Bone. 25 (5), 517-523 (1999).
  10. Lee, K., et al. Selective Regulation of MAPK Signaling Mediates RANKL-dependent Osteoclast Differentiation. Int J Biol Sci. 12 (2), 235-245 (2016).
  11. Huang, H., et al. Osteoclast differentiation requires TAK1 and MKK6 for NFATc1 induction and NF-κB transactivation by RANKL. Cell Death Diff. 13 (11), 1879-1891 (2006).
  12. Matsumoto, Y., et al. RANKL coordinates multiple osteoclastogenic pathways by regulating expression of ubiquitin ligase RNF146. J Clin Investigat. 127 (4), 1303-1315 (2017).
  13. Lai, E. C. Notch signaling: control of cell communication and cell fate. Development. 131 (5), 965-973 (2004).
  14. Chen, X., et al. LY411575, a potent γ-secretase inhibitor, suppresses osteoclastogenesis in vitro and LPS-induced calvarial osteolysis in vivo. J Cellular Physiol. 234 (11), 20944-20956 (2019).
  15. Chen, S., Lee, B. H., Bae, Y. Notch Signaling in Skeletal Stem Cells. Calcified Tiss Int. 94 (1), 68-77 (2013).
  16. Sekine, C., et al. Differential regulation of osteoclastogenesis by Notch2/Delta-like 1 and Notch1/Jagged1 axes. Arthritis Res Ther. 14 (2), (2012).
  17. Duan, L. Notch is activated in RANKL-induced osteoclast differentiation and resorption. Front Biosci. (13), 7064(2008).
  18. Ashley, J. W., Ahn, J., Hankenson, K. D. Notch Signaling Promotes Osteoclast Maturation and Resorptive Activity. J Cell Biochem. 116 (11), 2598-2609 (2015).
  19. Hough, F. S., et al. The safety of osteoporosis medication. South African Med J. 104 (4), 279(2013).
  20. Espinosa, L. S., Inglés-Esteve, J., Robert-Moreno, A., Bigas, A. IκBα and p65 Regulate the Cytoplasmic Shuttling of Nuclear Corepressors: Cross-talk between Notch and NFκB Pathways. Mol Biol Cell. 14 (2), 491-502 (2003).
  21. Wang, Z., Li, Y., Sarkar, F. Notch Signaling Proteins: Legitimate Targets for Cancer Therapy. Curr Prot Peptide Sci. 11 (6), 398-408 (2010).
  22. Zhou, Z., et al. PP121 suppresses RANKL-Induced osteoclast formation in vitro and LPS-Induced bone resorption in vivo. Exp Cell Res. 388 (2), 111857(2020).
  23. Shah, M. A. A., et al. Regional distribution of microvasculature within the canine femoral head: a study of plastinated tissue histology and 3D reconstruction. J Ortho Surg Res. 20 (1), (2025).
  24. Clayden, E. C. Practical Section Cutting and Staining. , Churchill. (1955).
  25. McHorney, C. A., Schousboe, J. T., Cline, R. R., Weiss, T. W. The impact of osteoporosis medication beliefs and side-effect experiences on non-adherence to oral bisphosphonates ates. Curr Med Res Opin. 24 (3), 707-708 (2008).
  26. Canalis, E. Notch in skeletal physiology and disease. Osteoporosis Int. 29 (12), 2611-2621 (2018).
  27. Zanotti, S., Canalis, E. Notch Signaling and the Skeleton. Endocrine Rev. 37 (3), 223-253 (2016).
  28. Grevers, L. C., et al. Immune complex-induced inhibition of osteoclastogenesis is mediated via activating but not inhibitory Fcγ receptors on myeloid precursor cells. Ann Rheumatic Dis. 72 (2), 278-285 (2013).
  29. Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
  30. Weber, J. M., Calvi, L. M. Notch signaling and the bone marrow hematopoietic stem cell niche. Bone. 46 (2), 281-285 (2010).
  31. Kovtonyuk, L. V., Fritsch, K., Feng, X., Manz, M. G., Takizawa, H. Inflamm-Aging of Hematopoiesis, Hematopoietic Stem Cells, and the Bone Marrow Microenvironment. Front Immunol. 7, (2016).
  32. Khosla, S., Hofbauer, L. C. Osteoporosis treatment: recent developments and ongoing challenges. Lancet Diabet Endocrinol. 5 (11), 898-907 (2017).
  33. Reid, I. R. Efficacy, effectiveness and side effects of medications used to prevent fractures. J Inter Med. 277 (6), 690-706 (2015).
  34. Cosman, F., et al. Clinician's Guide to Prevention and Treatment of Osteoporosis. Osteoporosis Int. 25 (10), 2359-2381 (2014).
  35. Chen, Y. H., et al. Melatonin protects against lipopolysaccharide-induced intra-uterine fetal death and growth retardation in mice. J Pineal Res. 40 (1), 40-47 (2005).
  36. Abu-Amer, Y., Ross, F. P., Edwards, J., Teitelbaum, S. L. Lipopolysaccharide-stimulated osteoclastogenesis is mediated by tumor necrosis factor via its P55 receptor. J Clin Investigat. 100 (6), 1557-1565 (1997).
  37. Black, D. M., Rosen, C. J. Postmenopausal Osteoporosis. New Engl J Med. 374 (3), 254-262 (2016).
  38. Eastell, R., et al. Pharmacological Management of Osteoporosis in Postmenopausal Women: An Endocrine Society Clinical Practice Guideline. J Clin Endocrinol Metabol. 104 (5), 1595-1622 (2019).
  39. Leder, B. Z. Optimizing Sequential and Combined Anabolic and Antiresorptive Osteoporosis Therapy. JBMR Plus. 2 (2), 62-66 (2018).
  40. Grey, A., Bolland, M., Cundy, T. Maintaining Order in Osteoporosis Treatments. Journal of Bone Miner Res. 32 (5), 1147-1147 (2017).
  41. McClung, M. R. Role of bone-forming agents in the management of osteoporosis. Aging Clin Exp Re. 33 (4), 775-791 (2021).

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