Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den ethischen Standards für Versuchstiere durchgeführt, die von der Abteilung für Wissenschaft und Technologie des Sichuan Higher Institute of Traditional Chinese Medicine (Zulassungsnummer: 2023DS01) festgelegt wurden. Die verwendeten Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Versuchsaufbau und -ablauf
- Tiere
Sechsunddreißig männliche, 12 Wochen alte CD-Sprague-Dawley-Ratten wurden untergebracht und während des gesamten Versuchszeitraums ad libitum gefüttert. Die Umgebung wurde bei einer Temperatur von 20-25 °C und einer Luftfeuchtigkeit von 50 % bis 60 % gehalten, mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus.
- Gruppendesign
Nach einer Woche adaptiver Fütterung wurden die Ratten nach dem Zufallsprinzip entweder einer Kontrollgruppe (Con, n = 6) oder einer erschöpfenden Übungsgruppe (EE, n = 30) zugeteilt. Die Ratten der EE-Gruppe durchliefen ein Anpassungstraining, indem sie drei Tage lang mit einer Geschwindigkeit von 10 m/min auf einem bergauf führenden Laufband mit einer Steigung von 10 Grad liefen. Nach dem adaptiven Training wurde die EE-Gruppe weiter in fünf Zeit-Untergruppen eingeteilt: 0 h, 6 h, 12 h, 24 h und 48 h nach erschöpfendem Training.
- Ablauf der Intervention
Die Ratten in der Kontrollgruppe trainierten nicht, während die Ratten in der EE-Gruppe ausgiebig auf einem bergauf führenden Laufband mit einer Steigung von 10 Grad liefen (Abbildung 1A). In Anlehnung an das Bedford-Protokoll9 wurde die Übungsbelastung in drei Stufen eingeteilt: Stufe 1 bei 10 m/min für 15 min, Stufe 2 bei 15 m/min für 15 min und Stufe 3 bei 20 m/min bis zur Erschöpfung (Abbildung 1B). Eine Erschöpfung wurde festgestellt, wenn eine Ratte nicht mehr laufen konnte und innerhalb eines Zeitraums von weniger als 1 min10 dreimal auf dem Gleis stecken blieb, trotz wiederholter schwacher elektrischer (150 V, 0,5 mA Wechselstrom) und Schallstimulation (70 dB).
Die Ratten wurden durch übermäßige intraperitoneale Injektion von 3% Natrium-Pentobarbital (200 mg/kg) zu den angegebenen Zeiten (0 h, 6 h, 12 h, 24 h und 48 h nach erschöpfendem Training) getötet. Die Haut und das Unterhautgewebe des Fersenbeins wurden sorgfältig präpariert, und die Achillessehne wurde 2 cm über dem Fersenbein mit einer Augenschere durchtrennt. Der rechte Fersenbein (einschließlich der daran befestigten Achillessehne) wurde in 4%igem Paraformaldehyd für histopathologische Untersuchungen und immunhistochemische Untersuchungen konserviert. Zusätzlich wurden drei Stichproben von der linken Seite in 2%iger Paraformaldehyd-2,5%iger Glutaraldehydlösung für die Elektronenmikroskopie gelagert, um ultrastrukturelle Veränderungen zu untersuchen ( Abbildung 1C).
2. Histologie des Sehnen-Knochen-Übergangs
Die Proben wurden 48 h lang in 4 % Paraformaldehyd fixiert und 4 Wochen lang bei Raumtemperatur (20-25 °C) mit 15 % EDTA entkalkt, wobei die Lösung täglich gewechselt wurde. Der Entkalkungsprozess endete, wenn der Knochen ohne Kraftaufwand leicht mit einer Nadel durchstochen werden konnte. Nach der Entkalkung wurden die Proben durch einen automatisierten Prozess dehydriert, bei dem eine abgestufte Reihe von Ethanol und Xylol zum Einsatz kam, gefolgt von drei Waschgängen mit PBS. Die Proben wurden sagittal in Paraffin eingebettet und bei 5 μm geschnitten. Die Hämatoxylin-Eosin-Färbung wurde nach Standardverfahren durchgeführt, und die Bilder wurden mit einem digitalen triokularen Mikrokamerasystem von Panthera bei einer Vergrößerung von 20× und 40× aufgenommen.
3. Elektronenmikroskopie-Scan
Die verbleibenden Proben wurden 48 h lang mit 2 % Paraformaldehyd-2,5 % Glutaraldehyd präfixiert, dann in einer Reihe von Acetonlösungen dehydriert, in einen Epoxid-Härtungsanalysator infiltriert und sagittal eingebettet. Halbdünnschnitte wurden mit Methylenblau gefärbt, um die Sehnen-Knochen-Übergangsregion zu identifizieren. Ultradünne Schnitte mit einer Dicke von ca. 60-90 nm wurden mit einem Diamantmesser geschnitten. Diese Abschnitte wurden 10-15 min lang mit Uranylacetat gefärbt, gefolgt von 1-2 min mit Bleicitrat. Die Schnitte wurden unter einem Transmissionselektronenmikroskop bei Vergrößerungen von 6000×, 12000× und 25000× untersucht.
4. Immunhistochemischer Assay
Der Sehnen-Knochen-Übergang wurde routinemäßig entkalkt und wie zuvor beschrieben geschnitten. Nach 10-minütiger Inkubation mit einer Citratpuffer-Antigen-Retrievallösung wurden die Proben 10 Minuten lang mit 3 %H2O2 behandelt, um die endogene Peroxidaseaktivität zu blockieren, gefolgt von einer 20-minütigen Blockierung mit normalem Ziegenserum bei 25 °C. Die Schnitte wurden dann über Nacht bei 4 °C mit Primärantikörpern, einschließlich GRP78 (1:100), inkubiert. CHOP (1:100 ) und Caspase-12 (1:100). Anschließend wurden die Proben mit Sekundärantikörpern für 2 h bei 25 °C inkubiert. Die Farbentwicklung wurde mit DAB für 8 min bei 25 °C erreicht, was zu einem braun-gelben positiven Signal führte. Die Zellkerne wurden 3 Minuten lang mit Hämatoxylin nachgefärbt. Zur Analyse der mittleren Dichte wurde die Software Image-Pro Plus 6.0 verwendet. Drei interessante Regionen der Sehnen-Knochen-Übergangsregion (Sehne, Faserknorpel und mineralisierter Faserknorpel) wurden für die Analyse ausgewählt und der Durchschnittswert berechnet.
5. Statistische Analyse
Zur Analyse der Daten und zur Erstellung von Diagrammen wurde GraphPad Prism 8 verwendet. Alle Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. Vergleiche zwischen verschiedenen Gruppen wurden mit Hilfe der unidirektionalen ANOVA durchgeführt, und der LSD-Test (Least Significant Difference) wurde für paarweise Vergleiche verwendet. Ein p-Wert von < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.