Forschungsartikel

Mikroverletzung des Sehnen-Knochen-Übergangs durch akutes erschöpfendes Training bei Ratten: ultrastrukturelle Veränderungen und Mechanismus

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DOI:

10.3791/69184

14. November 2025

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Ziel dieser Studie war es, die ultrastrukturellen Veränderungen und Mechanismen an der Sehnen-Knochen-Verbindung durch akutes erschöpfendes Training zu untersuchen. Akutes erschöpfendes Training führt zu Mikroverletzungen an der Sehnen-Knochen-Verbindung, die den ER-Stress und seine vermittelten apoptotischen Signalwege vorübergehend aktivieren. Nichtsdestotrotz können diese Mikroverletzungen und der ER-Stress nach dem Training schrittweise wiederhergestellt werden.

Zusammenfassung

Belastungsinduzierte Mikroverletzungen am Sehnen-Knochen-Übergang (Enthese) können zu einer Tendinopathie führen. Die Untersuchung der ultrastrukturellen Veränderungen und Mechanismen innerhalb der Enthese nach akuter erschöpfender Übung kann unser Verständnis der Tendinopathie verbessern und klinische Behandlungen leiten. In dieser Studie wurden sechsunddreißig männliche Sprague-Dawley-Ratten nach dem Zufallsprinzip in zwei Gruppen eingeteilt: Kontrolle und erschöpfendes Training. Die erschöpfende Übungsgruppe wurde basierend auf der Zeit nach dem Training weiter in fünf Untergruppen unterteilt: 0 h, 6 h, 12 h, 24 h und 48 h. Hämatoxylin-Eosin-Färbung und Elektronenmikroskopie wurden eingesetzt, um Veränderungen in der Fersenbeinsehnen-Knochen-Verbindung zu untersuchen. Die Expression der mit endoplasmatischem Retikulumstress (ERS) verwandten Proteine GRP78, CHOP und Caspase-12 an der Sehnen-Knochen-Verbindung wurde mittels Immunhistochemie (IHC) quantifiziert. Nach akuter intensiver körperlicher Betätigung zeigten die Sehnen-Knochen-Verbindungen von Ratten, die sich einer erschöpfenden Betätigung unterzogen hatten, signifikante strukturelle Veränderungen. Chondrozyten und Kollagenfasern zeigten bemerkenswerte ultrastrukturelle Veränderungen, die auf ERS hinweisen. Der ERS-Proteinspiegel stieg unmittelbar nach dem Training an und erreichte nach 6 Stunden seinen Höhepunkt. Diese Proteinspiegel begannen 12 Stunden nach dem Training zu sinken und kehrten nach 48 Stunden zum Ausgangswert zurück. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass akutes erschöpfendes Training bei Ratten Mikroschäden und Stress des endoplasmatischen Retikulums an der Sehnen-Knochen-Verbindung hervorruft, aber keine irreversiblen Schäden entstehen. Die rechtzeitige Behandlung und Reparatur dieser Mikroverletzungen kann übermäßige Schäden und die Entwicklung einer Tendinopathie verhindern.

Einleitung

Die Achillessehnen-Tendinopathie ist eine häufige klinische Erkrankung, die durch häufige Überlastungsverletzungen des Knöchels verursacht wird. Diese Störung ist gekennzeichnet durch Sehnenschwellungen, Schmerzen und Funktionsstörungen. Es tritt häufiger bei älteren Menschen und Sportlern auf, insbesondere bei Läufern und Springern. Die Achillessehnen-Tendinopathie wird in nicht-insertionelle und insertionale Tendinopathie eingeteilt. Die nicht-insertionelle Tendinopathie betrifft die Sehne 2 bis 6 cm oberhalb des Knochenansatzes, während die insertionelle Tendinopathie den Sehnen-Knochen-Übergang1 betrifft. Darüber hinaus tritt die nicht-insertionelle Tendinopathie tendenziell bei übergewichtigen, älteren und weniger aktiven Personen auf, während die insertionelle Tendinopathie tendenziell bei aktiveren Personen auftritt1.

Der Sehnen-Knochen-Übergang, an dem die Sehne in den Knochen eingreift, beinhaltet einen allmählichen Übergang vom Sehnengewebe zum Knochengewebe, einschließlich unverkalktem Faserknorpel und verkalktem Faserknorpel2. Diese Veränderung ermöglicht den Übergang von einem weichen und flexiblen Sehnengewebe zu einem harten Knochen. Technisch gesehen dient diese Region als Ankerpunkt, der die Muskelkraft überträgt, um die Gelenkbewegung zu erleichtern 3,4. Daher ist diese Region ein Ort der Stresskonzentration und wird häufig durch Überlastung beim Sport verletzt.

Die klinische Forschung konzentrierte sich in erster Linie auf die nicht-insertionelle Tendinopathie, während der insertionellen Tendinopathie am Sehnen-Knochen-Übergang weniger Aufmerksamkeit geschenktwurde 2. Untersuchungen deuten darauf hin, dass eine Überlastung die Desorganisation und Fragmentierung des Kollagens, die Infiltration des Fettgewebes und die Neovaskularisation in der Sehne fördert. Es führt auch zu Fibrochondrozytenhyperplasie, endochondraler Ossifikation und Knochensporn sowohl in der unverkalkten als auch in der verkalkten Faserknorpelregion5. Neuere Studien deuten jedoch darauf hin, dass Muskelkontraktionsmuster bei der Insertionstendinopathie eine bedeutendere Rolle spielen können als die Menge an Bewegung 6,7. Daher sind weitere Untersuchungen erforderlich, um die Auswirkungen einer Überbeanspruchung auf die Sehnen-Knochen-Verbindungen zu verstehen. Frühere Studien haben die Auswirkungen von Überbeanspruchung, wie z. B. langfristiges Springen oder Laufen, auf diese Knotenpunkte untersucht. Nur wenige haben jedoch die Auswirkungen von akutem erschöpfendem Training untersucht. Eine kürzlich durchgeführte Studie deutet darauf hin, dass akutes Training Stress im endoplasmatischen Retikulum in den Nieren von Ratten induziert, was auf eine Hochregulierung der IL-6-Signalgebung und der Hitzeschockproteine (HSPs) und eine Abnahme der mRNA des mitochondrialen AtmungskomplexesmRNA 8 hinweist. Ob solche Veränderungen an Sehnen-Knochen-Übergängen auftreten, ist nicht bekannt. Diese Studie konzentriert sich auf den Sehnen-Knochen-Übergang (Enthese), um die Veränderungen und zugrundeliegenden Mechanismen aufzuklären, die durch akutes erschöpfendes Training induziert werden. Die Ergebnisse sollen einen Beitrag zur Entwicklung von Präventionsstrategien für die Insertionstendinopathie leisten.

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Protokoll

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den ethischen Standards für Versuchstiere durchgeführt, die von der Abteilung für Wissenschaft und Technologie des Sichuan Higher Institute of Traditional Chinese Medicine (Zulassungsnummer: 2023DS01) festgelegt wurden. Die verwendeten Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Versuchsaufbau und -ablauf

  1. Tiere
    Sechsunddreißig männliche, 12 Wochen alte CD-Sprague-Dawley-Ratten wurden untergebracht und während des gesamten Versuchszeitraums ad libitum gefüttert. Die Umgebung wurde bei einer Temperatur von 20-25 °C und einer Luftfeuchtigkeit von 50 % bis 60 % gehalten, mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus.
  2. Gruppendesign
    Nach einer Woche adaptiver Fütterung wurden die Ratten nach dem Zufallsprinzip entweder einer Kontrollgruppe (Con, n = 6) oder einer erschöpfenden Übungsgruppe (EE, n = 30) zugeteilt. Die Ratten der EE-Gruppe durchliefen ein Anpassungstraining, indem sie drei Tage lang mit einer Geschwindigkeit von 10 m/min auf einem bergauf führenden Laufband mit einer Steigung von 10 Grad liefen. Nach dem adaptiven Training wurde die EE-Gruppe weiter in fünf Zeit-Untergruppen eingeteilt: 0 h, 6 h, 12 h, 24 h und 48 h nach erschöpfendem Training.
  3. Ablauf der Intervention
    Die Ratten in der Kontrollgruppe trainierten nicht, während die Ratten in der EE-Gruppe ausgiebig auf einem bergauf führenden Laufband mit einer Steigung von 10 Grad liefen (Abbildung 1A). In Anlehnung an das Bedford-Protokoll9 wurde die Übungsbelastung in drei Stufen eingeteilt: Stufe 1 bei 10 m/min für 15 min, Stufe 2 bei 15 m/min für 15 min und Stufe 3 bei 20 m/min bis zur Erschöpfung (Abbildung 1B). Eine Erschöpfung wurde festgestellt, wenn eine Ratte nicht mehr laufen konnte und innerhalb eines Zeitraums von weniger als 1 min10 dreimal auf dem Gleis stecken blieb, trotz wiederholter schwacher elektrischer (150 V, 0,5 mA Wechselstrom) und Schallstimulation (70 dB).

Die Ratten wurden durch übermäßige intraperitoneale Injektion von 3% Natrium-Pentobarbital (200 mg/kg) zu den angegebenen Zeiten (0 h, 6 h, 12 h, 24 h und 48 h nach erschöpfendem Training) getötet. Die Haut und das Unterhautgewebe des Fersenbeins wurden sorgfältig präpariert, und die Achillessehne wurde 2 cm über dem Fersenbein mit einer Augenschere durchtrennt. Der rechte Fersenbein (einschließlich der daran befestigten Achillessehne) wurde in 4%igem Paraformaldehyd für histopathologische Untersuchungen und immunhistochemische Untersuchungen konserviert. Zusätzlich wurden drei Stichproben von der linken Seite in 2%iger Paraformaldehyd-2,5%iger Glutaraldehydlösung für die Elektronenmikroskopie gelagert, um ultrastrukturelle Veränderungen zu untersuchen ( Abbildung 1C).

2. Histologie des Sehnen-Knochen-Übergangs

Die Proben wurden 48 h lang in 4 % Paraformaldehyd fixiert und 4 Wochen lang bei Raumtemperatur (20-25 °C) mit 15 % EDTA entkalkt, wobei die Lösung täglich gewechselt wurde. Der Entkalkungsprozess endete, wenn der Knochen ohne Kraftaufwand leicht mit einer Nadel durchstochen werden konnte. Nach der Entkalkung wurden die Proben durch einen automatisierten Prozess dehydriert, bei dem eine abgestufte Reihe von Ethanol und Xylol zum Einsatz kam, gefolgt von drei Waschgängen mit PBS. Die Proben wurden sagittal in Paraffin eingebettet und bei 5 μm geschnitten. Die Hämatoxylin-Eosin-Färbung wurde nach Standardverfahren durchgeführt, und die Bilder wurden mit einem digitalen triokularen Mikrokamerasystem von Panthera bei einer Vergrößerung von 20× und 40× aufgenommen.

3. Elektronenmikroskopie-Scan

Die verbleibenden Proben wurden 48 h lang mit 2 % Paraformaldehyd-2,5 % Glutaraldehyd präfixiert, dann in einer Reihe von Acetonlösungen dehydriert, in einen Epoxid-Härtungsanalysator infiltriert und sagittal eingebettet. Halbdünnschnitte wurden mit Methylenblau gefärbt, um die Sehnen-Knochen-Übergangsregion zu identifizieren. Ultradünne Schnitte mit einer Dicke von ca. 60-90 nm wurden mit einem Diamantmesser geschnitten. Diese Abschnitte wurden 10-15 min lang mit Uranylacetat gefärbt, gefolgt von 1-2 min mit Bleicitrat. Die Schnitte wurden unter einem Transmissionselektronenmikroskop bei Vergrößerungen von 6000×, 12000× und 25000× untersucht.

4. Immunhistochemischer Assay

Der Sehnen-Knochen-Übergang wurde routinemäßig entkalkt und wie zuvor beschrieben geschnitten. Nach 10-minütiger Inkubation mit einer Citratpuffer-Antigen-Retrievallösung wurden die Proben 10 Minuten lang mit 3 %H2O2 behandelt, um die endogene Peroxidaseaktivität zu blockieren, gefolgt von einer 20-minütigen Blockierung mit normalem Ziegenserum bei 25 °C. Die Schnitte wurden dann über Nacht bei 4 °C mit Primärantikörpern, einschließlich GRP78 (1:100), inkubiert. CHOP (1:100 ) und Caspase-12 (1:100). Anschließend wurden die Proben mit Sekundärantikörpern für 2 h bei 25 °C inkubiert. Die Farbentwicklung wurde mit DAB für 8 min bei 25 °C erreicht, was zu einem braun-gelben positiven Signal führte. Die Zellkerne wurden 3 Minuten lang mit Hämatoxylin nachgefärbt. Zur Analyse der mittleren Dichte wurde die Software Image-Pro Plus 6.0 verwendet. Drei interessante Regionen der Sehnen-Knochen-Übergangsregion (Sehne, Faserknorpel und mineralisierter Faserknorpel) wurden für die Analyse ausgewählt und der Durchschnittswert berechnet.

5. Statistische Analyse

Zur Analyse der Daten und zur Erstellung von Diagrammen wurde GraphPad Prism 8 verwendet. Alle Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. Vergleiche zwischen verschiedenen Gruppen wurden mit Hilfe der unidirektionalen ANOVA durchgeführt, und der LSD-Test (Least Significant Difference) wurde für paarweise Vergleiche verwendet. Ein p-Wert von < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

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Ergebnisse

Wie in Abbildung 2A gezeigt, sind in der Kontrollgruppe die Chondrozyten und Kollagenfibrozyten in der Sehnen-Knochen-Verbindung regelmäßig angeordnet, und es gibt eine glatte blaue Linie zwischen dem Faserknorpel und dem mineralisierten Faserknorpel, die als Gezeitenmarke bekannt ist (gelbe Pfeile). In den erschöpfenden Übungsgruppen traten ultrastrukturelle Veränderungen an der Sehnen-Knochen-Verbindung auf. Bei den Verände...

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Diskussion

Die Sehnen-Knochen-Verbindung, auch Enthesen oder Ansatzstellen genannt, ermöglicht das Einsetzen von Sehnen in den Knochen und ist eine Stelle der Stresskonzentration, an der Bänder und Sehnen am Knochenansetzen 4. Als Ankerpunkt erleichtert es die Bewegung des Knöchels, überträgt die Kraft der Kontraktion der Wadenmuskulatur auf die Bänder und Sehnen des Fußes und beteiligt sich an der Bewegung des Knöchels und des Fußes2. Der Sehnen-Knoc...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Die Autorinnen und Autoren bedanken sich herzlich für die Unterstützung durch die Natural Science Foundation (Förderkennzeichen 23ZRYB03), das Projekt des Forschungs- und Innovationsteams (TD-2022-04), die Clinical Medicine Science and Education Innovation Group und das Sichuan College of Traditional Chinese Medicine sowie für das Forschungsprojekt 2025 (25MSZX329), das von der Provinzverwaltung für Traditionelle Chinesische Medizin in Sichuan finanziert wurde.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2% Paraformaldehyd-2,5% GlutaraldehydlösungMKBio, ChinaMM1515, Elektronenmikroskopie-Scan
Anti-Caspase12AntikörperHangzhou Huaan Biotechnology Co., Ltd.HA500144Immunhistochemischer Test
Anti-CHOP-AntikörperHangzhou Huaan Biotechnology Co., Ltd.ET1703-05Immunhistochemischer Test
Anti-GRP78-AntikörperHangzhou Huaan Biotechnology Co., Ltd.ER1706-50Immunhistochemischer Test
BiomikroskopieMotic Industrial Group Co., Ltd.CHINABA210DigitalBiomikroskopie für Sehnen-Knochen-Junction-Histologie Immunhistochemischer Assay
CD-Sprague-Dawley-RattenBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.SCXK2021-0007 CD
Antigenrückgewinnungslösung für CitratpufferZSGB-Bio, ChinaZLI-9065, Immunhistochemischer Test
DAB   ZSGB-Bio, ChinaZLI-9018 Immunhistochemischer Test
EDTASinopharm Chimical Reagant Co., Ltd.10009717Hämatoxylin-Eosin-Färbung 
Epox 812Sinopharm Chimical Reagant Co., Ltd.XW00000020Elektronenmikroskopie-Scan
Ethanol Sinopharm Chimical Reagant Co., Ltd.10009218Hämatoxylin-Eosin-Färbung 
GraphPad Prism 8 GraphPad Software, Inc.  GraphPad Prism 8 Statistische Analyse
H2O2 Sinopharm Chimical Reagant Co., Ltd.011092708Immunhistochemischer Test
Image-Pro Plus 6.0Media Cybernetics Co., Ltd. USAImage-Pro Plus 6.0Immunhistochemischer Test
Paraformaldehyd Sinopharm Chimical Reagant Co., Ltd.20230408Hämatoxylin-Eosin-Färbung  Immunhistochemischer Test
PBSZSGB-Bio, ChinaZLI-9062Elektronenmikroskopie-Scan
TransmissionselektronenmikroskopJAPAN ELECTRON OPTICS LABORATORY CO., LTDJEM-1400Flash, JapanElektronenmikroskopie-Scan
Laufband für Rat & MausBioMed Easy Technologies Co., Ltd  CHINASA101Ausführliche Übungen auf dem Laufband durchgeführt
XylolSinopharm Chimical Reagant Co., Ltd.10023418Hämatoxylin-Eosin-Färbung 

Referenzen

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Schlagwörter

Endoplasmatischer RetikulumstressRattenmodellH matoxylin Eosin F rbungElektronenmikroskopieImmunhistochemieChondrozyten UltrastrukturVer nderungen der Kollagenfasern

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