FLEX: Flugtrainingsprotokoll für die Fruchtfliege Drosophila

Zusammenfassung

Das Ziel dieses Protokolls ist es, der Fruchtfliege Drosophila Flugübungen zu ermöglichen. Repräsentative Ergebnisse zeigen, dass Flugtraining zu einer erhöhten aeroben Kapazität und Widerstandsfähigkeit gegenüber einer fettreichen Ernährung führt.

Zusammenfassung

Drosophila ist in letzter Zeit zu einem beliebten Modell für die Untersuchung von Fettleibigkeit und verwandten Erkrankungen geworden. Während es relativ einfach ist, Stoffwechselstörungen bei Drosophila mit bestimmten Diäten hervorzurufen, ist es schwieriger, ein Trainingsmodell für die Fliegen zu erstellen. Bestehende Methoden, wie der Power Tower und das Tretrad, verwenden schüttelnde oder rotierende Fläschchen, um die Fliegen zum Klettern zu bringen, wodurch ihre negative Geotaxis-Reaktion genutzt wird. Kontinuierliches Klettern über längere Zeiträume ist für die Fliegen jedoch unnatürlich und kann zu belastungsbedingten Verletzungen und Todesfällen führen. In diesem Artikel wird ein neues Übungsprotokoll vorgestellt, das die natürliche Fähigkeit der Fliege zu fliegen nutzt und einen natürlicheren, physiologischeren und verletzungsfreien Trainingsansatz bietet. Die Experimente zeigen, dass ein 5-tägiges Flugtrainingsprogramm die bioenergetische Kapazität der Fliege erhöht und den negativen Auswirkungen einer westlichen Ernährung (WD) entgegenwirkt, das Steigverhalten verbessert und die WD-assoziierte Mortalität reduziert. Dieses Protokoll ermöglicht das gleichzeitige Training einer großen Anzahl von Fliegen, um die Wechselwirkung zwischen Bewegung und verschiedenen Faktoren wie Ernährung, Medikamenten, Alterung und Genetik zu untersuchen. Zusammen kann diese Methode bestehende Methoden zur Untersuchung der Auswirkungen von Bewegung auf die Physiologie und das Verhalten von Fliegen ergänzen.

Einleitung

Körperliche Aktivität und Bewegung stehen im Mittelpunkt intensiver Forschung auf ihre unmittelbaren und langfristigen gesundheitlichen Vorteile¹. Aufgrund seiner starken systemischen Wirkung auf den Stoffwechsel wird Bewegung zunehmend zur Vorbeugung und Behandlung von Stoffwechsel-, Herz-Kreislauf- und neurologischen Störungen eingesetzt ^2,3,4. Trotz der zunehmenden Evidenz für die zahlreichen gesundheitlichen Vorteile, die mit regelmäßiger Bewegung verbunden sind, sind die genauen molekularen Mechanismen, die diesen Vorteilen zugrunde liegen, nach wie vor wenig verstanden⁵. Um diese Mechanismen zu verstehen, ist der Einsatz innovativer Tiermodelle mit hohem Durchsatz unerlässlich. Während Nagetiermodelle häufig verwendet werden, um die Auswirkungen von Bewegung auf Stoffwechselerkrankungen zu untersuchen, erfordern solche Studien erhebliche Kosten, behördliche Aufsicht und spezielle Ausrüstung ^6,7.

In jüngster Zeit hat sich Drosophila melanogaster als neues Modell für die Erforschung der Bewegungsbiologie herauskristallisiert (überprüft ^8,9,10). Ausgestattet mit einem breiten Spektrum an potenten genetischen Werkzeugen, einem kurzen Lebenszyklus, umfangreichen Nachkommen und wirtschaftlichem Pflegebedarf stellt die Fruchtfliege eine wertvolle Ressource für die Erforschung genetischer, epigenetischer und transgenerationaler Mechanismen dar. Bei der Modellierung von Übungen bei Fliegen stützen sich die aktuellen Methoden typischerweise auf negative Geotaxis, die Verhaltensreaktion, um nach oben zu klettern^11,12.

Eines der ersten automatisierten Übungsprotokolle verwendete ein spezielles Trainingsgerät namens Power Tower¹¹. Der Power Tower verwendet eine Motoreinheit, die Fläschchen mit Tieren wiederholt anhebt und dann fallen lässt, um die negative Geotaxis-Reaktion¹¹ zu induzieren. Längeres Training im Power Tower führt zu einer signifikanten Verringerung des altersbedingten Rückgangs der Beweglichkeit und der Herzleistung¹³. Darüber hinaus kann das Power Tower-Regime für Fliegen stressig sein, und es wurde berichtet, dass eine übermäßige Trainingsintensität zu Verletzungen oder Todesfällen führt¹¹.

Um dieses Problem anzugehen, wurde ein weiteres Übungsparadigma namens Treadwheel entwickelt¹⁴. Das Laufrad nutzt auch die negative Geotaxis-Reaktion von Drosophila, aber anstatt Fliegen wie im Power Tower zu heben und fallen zu lassen, dreht es Fläschchen mit Tieren um. Im Gegensatz zum Power Tower ist diese Methode schonender für Fliegen und beugt belastungsbedingten Verletzungen und Sterblichkeit vor⁹. Die Fliegen im Laufrad könnten sich jedoch an die Drehbewegung gewöhnen, was die Interpretation der Ergebnisse^{erschweren könnte 12}. Um dieses Problem zu lösen, wurde ein Locomotor Activity Monitor (LAM25H, Trikinetics) hinzugefügt, um die Aktivität während des Trainings zu messen, die Drosophila-Aktivität zu quantifizieren und die Gewöhnung zu berücksichtigen. Anschließend wurde der Name des Systems auf das Rotational Exercise Quantification System (REQS)¹² aktualisiert.

Interessanterweise nutzten nur sehr wenige Studien die natürlichen Flugfähigkeiten von Drosophila, um das Training zu modellieren. Der Schwerpunkt der Flugforschung lag auf den aerodynamischen und biomechanischen Aspekten des Schwebens und Manövrierens in der Luft 15,16,17,18. Mehrere Studien haben sich mit den physiologischen und zellulären Mechanismen im Zusammenhang mit dem Flug befasst^19,20. In diesen Studien wurde die Flugfähigkeit mit Hilfe des Flugassays^21,22 bewertet, bei dem einzelne Fliegen in eine durchsichtige Acrylbox entlassen und ihre Fähigkeit, eine gleichmäßige Höhe und einen gleichmäßigen Flug aufrechtzuerhalten, beobachtet wurde²³.

In einer speziellen Studie untersuchten Forscher die Auswirkungen von induzierten Flugübungen, indem sie Fliegen in Flaschen steckten, die an einem wirbelartigen Shaker befestigt waren. Der Shaker schüttelte die Flaschen sanft in zufälligen Abständen zwischen 5 min und 10 min, wobei ein programmierbarer Timer¹⁹ verwendet wurde. Diese Studie berichtete, dass das induzierte Flugverhalten die Seneszenz und den altersbedingten Verlust der antioxidativen Kapazität in der Flugmuskulatur beschleunigte¹⁹. Aufbauend auf den bisherigen Forschungen hat unser Labor ein neues Übungsprotokoll namens FLEX (Flight Exercise) entwickelt, indem es ein automatisiertes negatives Geotaxis-System mit der Unterbringung von Fliegen in großen Behältern^{integriert hat 24}. Für das FLEX-Training wurden die Fliegen in durchsichtige 1-Gallonen-Trommelfischschalen aus Kunststoff gelegt, die an einer horizontalen Plattform befestigt waren, die an einem Motor befestigt war. Der Motor wurde über eine Zeitschaltuhr gesteuert, die alle 5 min eine Motorumdrehung einleitete. Jede Umdrehung hob die Plattform an und ließ sie dann wieder fallen, wodurch die Fliegen in die Luft flogen. Die FLEX wurde täglich für 7 h für 5 Tage durchgeführt. Es wurden keine Todesfälle oder Verletzungen im Zusammenhang mit körperlicher Betätigung beobachtet²⁴. Darüber hinaus negierte ein 5-tägiges FLEX-Regime bei Fliegen mit der Western Diet (WD) die nachteiligen Auswirkungen der WD deutlich und verbesserte das Überleben, das Kletterverhalten und die mitochondriale Atmung²⁴. Insgesamt stellt diese Arbeit ein neuartiges Übungsparadigma vor, das auf natürlicher Flugaktivität basiert, die keine Verletzungen verursacht. Dabei handelt es sich um ein Hochdurchsatzverfahren, das es ermöglicht, eine große Anzahl von Fliegen gleichzeitig zu trainieren, um die Wechselwirkung zwischen Bewegung, Ernährung, Medikamenten, Alterung, Umwelt und/oder Genetik zu untersuchen. Das Protokoll kann als Ergänzung zu bestehenden Übungsmethoden verwendet werden, um die Auswirkungen körperlicher Aktivität auf die Physiologie und das Verhalten der Fliege zu untersuchen.

Protokoll

1. Einrichtung und Bedienung des Trainingsgeräts

1. Bauen Sie eine Maschine in der Maschinenwerkstatt der Universität. Verwenden Sie einen rechteckigen Aluminiumsockel von 35 mm x 35 mm x 1,4 mm mit einem AC/DC-Motor und einer horizontalen Aluminiumplattform von 35 mm x 35 mm x 0,5 mm (Abbildung 1A).
2. Für die Umwandlung von Drehbewegungen in lineare Bewegungen bauen Sie einen speziell angefertigten rotierenden Rundnocken mit einem Durchmesser von 15 cm, der auf dem Motor montiert ist (Abbildung 1B). Befestigen Sie einen Mitnehmer mit einer 2 cm langen Rolle an der Unterseite der horizontalen Plattform, so dass die Plattform vom Mitnehmer angehoben und dann wieder in ihre ursprüngliche Position zurückgeworfen wird, sobald die Mitnehmerrolle den Nocken freigibt.
3. Stellen Sie die Drehzahl des Motors mit einem Drehpotentiometer so ein, dass eine volle Drehzahl von ca. 5.360 ms lang ist.
   HINWEIS: Genaue Motorspezifikationen, Abmessungen von Stößel und Rolle sowie die Nockengeometrie sind nicht entscheidend. Jede motorisierte Konfiguration, die die Plattform zuverlässig anhebt und absenkt, um die Fliegen zu entfernen, und dem Benutzer die Kontrolle über die Fallfrequenz ermöglicht, ist akzeptabel.
4. Befestigen Sie 1-Gallonen-Trommelfischnäpfe aus durchsichtigem Kunststoff mit Bungee-Seilen, die an Schraubösen eingehakt sind, an der Plattform (Abbildung 1C).

2. FLEX-Protokoll

1. Halten Sie die Fliegen in einem 24 °C heißen Inkubator oder Raum mit 60 % Luftfeuchtigkeit und einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus.
2. Sammeln Sie altersgerechte Fliegen innerhalb von 3-4 Tagen nach dem Schlüpfen. Ordnen Sie die Fliegen nach dem Zufallsprinzip Bewegungs- und Bewegungsgruppen zu. Verwenden Sie die gleiche Anzahl von Fliegen sowohl für die Übungs- als auch für die sitzende Gruppe.
   HINWEIS: Fliegen können in einer Dichte von 30 bis 400 pro Schale untergebracht werden, da dies das Flugtraining nicht beeinträchtigt. Versuchs- und Kontrollgruppen sollten jedoch immer hinsichtlich Anzahl, Geschlecht und Alter abgeglichen werden, um eine Vergleichbarkeit zu gewährleisten.
3. Versorgen Sie sitzende und kontrollierte Fliegen mit 7 ml Formulierungsfutter. Sichern Sie die Lebensmittelfläschchen in den Schalen mit Klebeband.
4. Übertragen Sie die Fliegen mit einer leichten und kurzen CO₂ -Anästhesie einen Tag vor Beginn des Trainingsprogramms in die Schalen. Decken Sie die Öffnungen der Schüsseln mit einem Netz ab, das mit Gummibändern gesichert ist.
   HINWEIS: Fliegen sollten kurz unter leichtem CO₂ auf einem Pad betäubt werden. Die Exposition muss kurz bleiben, um dauerhafte Verhaltenseffekte zu vermeiden. Daher sollte die Anästhesie 1 Tag vor dem Übungsexperiment durchgeführt werden.
5. Befestigen Sie die Schalen mit Bungee-Seilen an der Plattform. Führen Sie das Bewegungstraining in einem Raum mit einer Temperatur von 24 °C und einer Luftfeuchtigkeit von 60% durch. Wenn die Luftfeuchtigkeit im Raum nicht kontrolliert wird, ermöglichen Sie den Fliegen den Zugang zu Wasser, indem Sie Fläschchen mit nasser Watte in die Fischgläser legen und die Fläschchen mit Klebeband an der Wand der Schüssel befestigen.
6. Für Kontrollexperimente (Scheinübung) legen Sie die gleiche Anzahl von Fliegen in eine Schüssel, die neben dem Trainingsgerät positioniert, aber nicht an der Plattform befestigt ist.
7. Das Training fliegt an 5 aufeinanderfolgenden Tagen.
   1. Steuern Sie den Motor mit zwei Zeitschaltuhren (Abbildung 1D). Der erste Timer schaltet die Maschine zu einer bestimmten Tageszeit ein und aus. Beginnen Sie das Training um 8 Uhr morgens und beenden Sie es um 15 Uhr.
   2. Verwenden Sie den zweiten Timer, um eine Reihe von drei Motorumdrehungen zu starten, wobei jede Sequenz alle 5 Minuten erfolgt. Bei jeder Umdrehung wird die Plattform angehoben und dann wieder nach unten gesenkt, wodurch die Fliegen in die Luft geschleudert werden.
   3. Sobald die Trainingsbehandlung für einen bestimmten Tag abgeschlossen ist, stellen Sie die Schalen wieder in ihre Brutkästen. Dieses Protokoll kann leicht an ein bestimmtes Experiment angepasst werden.
      HINWEIS: Eine Luftfeuchtigkeit unter 60 % kann zu einem Anstieg der Sterblichkeit führen. Eine kleine Anzahl von Fliegen beginnt möglicherweise nicht nach dem ersten Abwurf mit dem Flug, beginnt aber in der Regel nach dem zweiten oder dritten Abwurf zu fliegen. Obwohl es nicht möglich ist, das Fliegen bei jedem Individuum zu verfolgen, fliegt die Mehrheit der Fliegen, und es wird davon ausgegangen, dass alle Fliegen schließlich an Bewegung teilnehmen. Zusätzlich bietet der große Behälter Platz für freiwillige Flucht zwischen den Drops.
8. Am Ende der FLEX-Kur können Sie die Fliegen ruhigstellen, indem Sie die Schalen für 5 Minuten in den Kühlraum stellen. Dann werden die Fliegen für weitere Analysen der phänotypischen Merkmale in neue Lebensmittelfläschchen oder für molekulare und/oder biochemische Assays von Interesse in Mikrozentrifugenröhrchen umgefüllt.
   HINWEIS: Beispiele für weitere Analysen sind verhaltensbezogene und biochemische Assays und/oder Genexpression. Assays mit lebenden Fliegen müssen in Übereinstimmung mit den spezifischen Zielen des phänotypischen Assays umgehend durchgeführt werden. Das Protokoll kann hier pausiert werden, indem Proben für die Biochemie/Molekularbiologie eingefroren und entsprechend gelagert werden, abhängig von den durchzuführenden Beurteilungen. Eine Zusammenfassung des Protokolls ist in Tabelle 1 enthalten.

Ergebnisse

Das FLEX-Protokoll wurde zuvor in einer veröffentlichten Arbeit aus unserem Labor validiert. In einer veröffentlichten Studie haben wir gezeigt, dass Flugübungen die negativen metabolischen Auswirkungen einer westlichen Ernährung (WD) ^{abschwächen24}. Diese Diät wurde auf der Grundlage der Standarddiät von Nutri-Fly Bloomington mit den folgenden Zusätzen von 15 % Nutiva USDA-zertifiziertem Bio-Futter, gentechnikfrei, rotem Palmöl, 15 % Saccharose und 0,1 M NaCl herg...

Diskussion

Das FLEX-Protokoll bietet eine neuartige und physiologisch relevante Methode zur Induktion von aerobem Training bei Drosophila melanogaster durch den Flug. Im Gegensatz zu traditionellen Paradigmen wie dem Power Tower und dem TreadWheel, die auf negativer Geotaxis und mechanischer Bewegung beruhen, macht sich FLEX das angeborene Flugverhalten der Fliege zunutze. Dieser Ansatz minimiert trainingsinduzierte Verletzungen und Stressreaktionen und ist damit ein sichereres und biologi...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
17 x 100 mm 14 mL Polypropylen-Kulturröhre	VWR	60818-689
1-Gallone klare Plastik-Fassfischschalen	Petco	N/A	Erhältlich bei Petco
8-Steckdosen-Überspannungsschutz mit 7-Tage-Digitaltimer	BN-LINK	EGPH020028	Erhältlich bei Amazon
AC/DC-Motor	Dayton	Modell 12W368 mit Drehmoment 80 IN-LBS
Bloomington Formulation Diät	Nutri-Fly	66-112	Erhältlich bei Genesee Scientific Inc., San Diego, CA
Kim-Wipes	Fisher Scientific	06-666	Kimberly-Clark Professional 34120
Multifunktionaler programmierbarer Timer für den Ausgang mit Countdown und unendlichem kurzen Zyklus	NEARPOW	SPM10188153502	Erhältlich bei Amazon