Methodenartikel

Ein neonatales Mausmodell der nekrotisierenden Enterokolitis und der Isolierung von Lamina propria für die Erstellung von Immunzellprofilen

DOI:

10.3791/69233

⸱

19. September 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Neonatal-Perinatal Medicine, Department of Pediatrics, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Division of Pediatric Gastroenterology, Department of Pediatrics, University of North Carolina at Chapel Hill

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll skizziert ein neonatales Mausmodell der nekrotisierenden Enterokolitis (NEC) und die anschließende Isolierung von Immunzellen der Lamina propria aus dem neonatalen Dünndarm der Maus.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die nekrotisierende Enterokolitis (NEC) ist eine schwere entzündliche Erkrankung des Neugeborenendarms, die vor allem Frühgeborene betrifft. NEC ist gekennzeichnet durch epitheliale Schädigung, mikrobielle Dysbiose und eine fehlregulierte Immunantwort, die häufig zu Darmnekrosen und systemischen Entzündungen führt. Experimentelle Mausmodelle, die die Schlüsselaspekte menschlicher Krankheiten rekapitulieren, waren von entscheidender Bedeutung, um unser Verständnis der Mechanismen, die die Krankheit antreiben, zu verbessern und die therapeutische Entwicklung zu informieren. Dieses Protokoll beschreibt ein gut etabliertes neonatales Mausmodell der nekrotisierenden Enterokolitis (NEC) unter Verwendung von Säuglingsnahrung, intermittierender Hypoxie, oraler Verabreichung von Lipopolysaccharid (LPS) und enterischen Bakterien, die von einem Säugling mit NEC kultiviert wurden. Diese Kombination induziert zuverlässig histologische, transkriptionelle und immunologische Merkmale, die mit NEC bei menschlichen Säuglingen übereinstimmen, und war grundlegend für mehrere wichtige Entdeckungen auf diesem Gebiet. Darüber hinaus beschreibt dieses Protokoll die Isolierung von Immunzellen aus der dünndarmen Lamina propria von neugeborenen Mäusen. Die Isolierung von Lamina-propria-Zellen ermöglicht eine detaillierte Erstellung von Immunzellprofilen mittels Durchflusszytometrie und erleichtert die Analyse sowohl der angeborenen als auch der adaptiven Zellpopulationen im Darm.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die nekrotisierende Enterokolitis (NEC) ist eine schwere entzündliche Erkrankung des Darms, die fast ausschließlich Frühgeborene betrifft. Etwa 7 % bis 8 % der Säuglinge mit sehr niedrigem Geburtsgewicht (<1500 g) sind von NEC betroffen, und die mit der Krankheit verbundene Sterblichkeitsrate kann bei Neugeborenen, die einen chirurgischen Eingriff erfordern, bei 50 % liegen1. Die Pathogenese der NEC ist noch nicht vollständig verstanden; Aktuelle Erkenntnisse deuten jedoch darauf hin, dass NEC aus dem Zusammentreffen mehrerer Faktoren entsteht, darunter eine unreife Darmbarriere, eine dysregulierte Immunsignalisierung und ein dysbiotisches Mikrobiom 2,3,4. Das Zusammentreffen dieser Faktoren kann Entzündungsreaktionen im Darm auslösen und verschlimmern, vor allem durch die Aktivierung des Toll-like-Rezeptors 4 (TLR4), was zu Epithelschäden und verschiedenen Arten von Zelltod, einschließlich Apoptose und Nekrose, führt 5,6. Ziel dieses Protokolls ist es, ein reproduzierbares und physiologisch relevantes Mausmodell von NEC vorzustellen, das die bei menschlichen Neugeborenen beobachteten Darmentzündungen und Pneumatosis intestinalis (Gas in der Darmwand) rekapituliert und eine mechanistische Untersuchung der Krankheitspathogenese ermöglicht. Darüber hinaus beschreibt dieses Protokoll die Isolierung von Immunzellen aus der Dünndarmlamina propria von neugeborenen Mäusen, was es den Forschern ermöglicht, Immunzellprofile mittels Durchflusszytometrie zu erstellen.

Im Vergleich zu größeren Tiermodellen, wie z. B. neugeborenen Ratten oder Ferkeln 7,8, bieten neonatale Mausmodelle mehrere deutliche Vorteile, darunter niedrigere Kosten, einen besseren Zugang zu transgenen Tieren und die Möglichkeit, Experimente an größeren Kohorten durchzuführen. Maus-NEC-Modelle verwenden hauptsächlich eine Kombination aus Säuglingsnahrung, Kältestress und Hypoxie, um die komplexe Pathophysiologie der NEC zu simulieren, die bei menschlichen Patienten beobachtet wurde 7,8,9. Viele murine Modelle von NEC sind jedoch durch ihre Abhängigkeit von breiten mikrobiellen Stressoren oder künstlichen Veränderungen der Mikrobiota eingeschränkt, was ihre klinische Relevanz beeinträchtigen kann. Im Gegensatz dazu überwindet das in diesem Protokoll beschriebene Modell diese Einschränkungen, indem es mehrere Schlüsselfaktoren integriert, die an der NEC-Pathogenese bei menschlichen Säuglingen beteiligt sind10,11. Insbesondere kombiniert dieses Modell hypoxischen Stress, der mit der Störung der Integrität der Darmbarriere in Verbindung gebracht wurde 3,12, mit der oralen Verabreichung von Säuglingsanfangsnahrung, die mit Lipopolysaccharid (LPS) ergänzt wird, einem gut charakterisierten TLR4-Liganden, der Darmentzündungen induziert, sowie klinisch relevantem dysbiotischem Mikrobiom mit enterischen Bakterien, die von einem Patienten mit NEC totalis kultiviert wurden. Die schwerste Form der Krankheit, die durch Pannekrose des Darms gekennzeichnetist 10,13. Durch die Integration dieser klinisch relevanten und krankheitsspezifischen Stressoren spiegelt unser Modell die klinischen und molekularen Merkmale von NEC genau wider. Um den Forschern einen Rahmen für die Untersuchung der immunvermittelten Mechanismen zu bieten, die der NEC-Pathogenese zugrunde liegen, beschreibt dieses Protokoll die Isolierung von Lamina propria-Zellen aus dem neonatalen Dünndarm von Mäusen für die Durchflusszytometrie-Analyse. Als Hauptort der Immunaktivität der Darmschleimhaut enthält die Lamina propria ein dynamisches Repertoire an residenten und infiltrierenden Immunzellen, die eine zentrale Rolle bei der NEC-assoziierten Entzündung spielen14. Die Durchflusszytometrie bietet eine robuste und skalierbare Plattform für die Charakterisierung dieser Immunzellpopulationen mit hoher Auflösung, die eine detaillierte Analyse zellulärer Phänotypen, die Quantifizierung von Immunantworten und die Identifizierung immunologischer Signaturen ermöglicht, die an der NEC-Pathogenese beteiligt sind15.

Das in diesem Protokoll skizzierte murine NEC-Modell ergänzt In-vitro-Modelle , indem es die Untersuchung von Wirt-Mikrobiom-Interaktionen, Immunantworten und Entzündungssignalen in der komplexen Umgebung des neonatalen Darms ermöglicht. Es reproduziert Schlüsselaspekte der NEC-Pathogenese, die in vitro nicht modelliert werden können, was es zu einem wertvollen Werkzeug für die Aufklärung von Krankheitsmechanismen und die Bewertung therapeutischer Strategien macht. Obwohl speziesspezifische Unterschiede nach wie vor eine Einschränkung darstellen, bietet dieses Modell eine robuste und zugängliche Plattform, um unser Verständnis von NEC zu verbessern und die Entwicklung gezielter Interventionen zu beschleunigen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit den ethischen Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der Chapel Hill School of Medicine der University of North Carolina durchgeführt. Die Mäuse wurden gemäß den im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren beschriebenen Verfahren im Rahmen eines Studienvorschlags gezüchtet, gepflegt und untergebracht, der von der IACUC (Protokoll Nr. 24-114) der University of North Carolina an der Chapel Hill School of Medicine genehmigt wurde. Für alle in dieser Studie beschriebenen Experimente wurden C57BL/6J-Mäuse verwendet. Die Jungtiere wurden im Modell am 4. postnatalen Tag mit einem Gewicht zwischen 1,8 und 2,3 g gestartet; Tiere außerhalb dieses Gewichtsbereichs wurden ausgeschlossen. Die Versuchskohorten wiesen eine ausgewogene Geschlechterverteilung auf, wobei Männchen und Weibchen jeweils etwa 50 % der behandelten Tiere ausmachten. Die verwendeten Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Modell Murine NEC

HINWEIS: Der enterische Bakterienbestand wird hergestellt, indem der magensaftresistente Inhalt von einem Säugling gewonnen wird, der die schwerste Form von NEC, NEC totalis13,16, hatte. Der magensaftresistente Inhalt wird über Nacht bei 1 x g für 16 h bei 37 °C kultiviert, bei 3000 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert und in 50 % Glycerin resuspendiert. 20-μl-Aliquote werden in Kryoröhrchen pipettiert und für die Langzeitlagerung bei -80 °C gelagert. Die in diesem Protokoll ausgewählten Kulturzeiten wurden aus Gründen der Effizienz des Arbeitsablaufs ausgewählt. Diese Zeitpunkte können nach Bedarf angepasst werden, um individuelle Laborpläne zu berücksichtigen, ohne das Gesamtmodell zu beeinträchtigen. Darüber hinaus wurde dieses Protokoll für eine maximale Kapazität von 40 Mäusen optimiert, kann aber bei Bedarf skaliert werden.

  1. Vorbereitung der Bakterienkultur
    1. Am Versuchstag 0 um 15:00 Uhr geben Sie ein 20-μl-Aliquot enterischer Bakterien, die von einem Säugling mit NEC totalis kultiviert wurden, in ein 15-ml-Kulturröhrchen mit 2 ml Luria-Bertani (LB)-Brühe. Inkubieren Sie die Bakterienkultur mit dem Röhrchendeckel in belüfteter Position in einem Orbitalschüttler bei 37 °C, 1 x g, über Nacht für 16 Stunden, und inkubieren Sie ein Kulturröhrchen mit nur 2 mL LB-Bouillon gleichzeitig als Kontrolle, um eine LB-Kontamination zu beurteilen.
      1. Bestätigen Sie die Übernachtkultur visuell, indem Sie die Trübung zwischen der Bakterienkultur und der klaren, reinen LB-Kontrolle vergleichen. Fahren Sie nur fort, wenn die Bakterienkultur trüb erscheint und die Kontrolle klar bleibt.
    2. Am Versuchstag 1 um 07:00 Uhr aliquotierte 125 μl der inokulierten Übernachtkultur in einen T75-Zellkulturkolben mit belüftetem Deckel mit 25 ml LB-Brühe. Bereiten Sie insgesamt vier T75-Kolben vor und inkubieren Sie sie in aufrechter Position in einem Orbitalschüttler bei 37°C, 1 x g, für 2 h, um die Bakterienkultur zu erweitern.
      HINWEIS: Übernachtkulturen werden an den Versuchstagen 0, 1 und 2 des NEC-Modells hergestellt.
  2. Einteilung der Welpen in Versuchsgruppen
    1. Wiegen Sie am experimentellen Tag 1 um 07:00 Uhr die Welpen nach der Geburt 4.
      HINWEIS: Der optimale Gewichtsbereich liegt zwischen 1,8 und 2,3 g, und Ausreißer sollten aus dem Experiment entfernt werden.
    2. Gruppieren Sie die Versuchsmäuse in mit Säuglingsnahrung und Muttermilch gefütterte Kohorten und berechnen Sie das Durchschnittsgewicht der mit Säuglingsnahrung gefütterten Mäuse. Trennen Sie die mit Säuglingsnahrung gefütterten Mäuse vom Muttertier und setzen Sie sie in einen neuen Käfig, der in einem auf 37 °C vorgeheizten Säuglingsbrutkasten untergebracht ist. Halten Sie die mit Muttertieren gefütterten Welpen im ursprünglichen Käfig mit der Mutter.
      HINWEIS: Neugeborene Mäuse reagieren besonders empfindlich auf Änderungen der Umgebungstemperatur. Um eine gleichbleibende Temperaturregulierung nach der Trennung vom Muttertier zu gewährleisten, werden mit Säuglingsnahrung gefütterte Jungtiere in einem temperaturgesteuerten Säuglingsinkubator gehalten, der auf 37 °C eingestellt ist. Dieser Ansatz steht im Einklang mit etablierten NEC-Protokollen, die die physiologische Temperatur ohne den Einsatz zusätzlicher thermischer Eingriffe erhalten 11,17,18,19.
    3. Wiederholen Sie dies an den Versuchstagen 2 und 3, wiegen Sie die mit Säuglingsnahrung gefütterten Mäuse und berechnen Sie das Durchschnittsgewicht täglich vor dem Fütterungszeitpunkt um 07:00 Uhr.
  3. Messung der optischen Dichte (OD) von Bakterienkulturen
    1. Nach 2 h Inkubation bei 37 °C und 1 x g werden die vier T75-Kolben mit expandierter Kultur an den Versuchstagen 1, 2 und 3 aus dem Orbitalschüttler genommen. Kombinieren Sie den Inhalt der vier T75-Kolben, mischen Sie gut und pipettieren Sie 1 ml der Bakterienkultur in eine Küvette.
      1. Bereiten Sie eine Blindlösung vor, indem Sie 1 ml sterile LB-Brühe in eine Küvette geben. Messen Sie die optische Dichte der Bakterienkultur bei 600 nm (OD600 nm) mit einem Spektralphotometer.
        HINWEIS: Der Ziel-OD600 nm beträgt 0,6 ± 0,02. Liegt der OD600 nm der Bakterienkultur unter dem Zielwert, wird die Inkubation wie in Schritt 1.3.1 beschrieben fortgesetzt. bis der Ziel-OD600nm von 0,6 ± 0,02 erreicht ist. Wenn der OD600 nm über 0,6 liegt, verdünnen Sie die Bakterienkultur mit steriler LB-Brühe.
    2. 80 mL der Bakterienkultur in zwei 50 mL Zentrifugenröhrchen überführen und bei 3000 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren. Bestätigen Sie die erfolgreiche Kultur, indem Sie am Boden jedes Röhrchens nach einem sichtbaren Pellet suchen.
  4. Vorbereitung der Formel
    1. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Formel um 09:00 Uhr an den experimentellen Tagen 1, 2 und 3. Kombinieren Sie 16 ml Säuglingsanfangsnahrung und 8 ml Welpenmilch im Verhältnis 2:1 in einem sterilen 50-ml-Zentrifugenröhrchen.
    2. Entfernen Sie den Überstand aus den beiden 50-ml-Zentrifugenröhrchen mit der pelletierten Bakterienkultur (Schritt 1.3.2).
    3. Resuspendieren Sie jedes der beiden Pellets gründlich in 2 mL der Formelmischung und übertragen Sie die Resuspension auf die Formelmischung, um 24 ml der NEC-Formel herzustellen.
      HINWEIS: Die endgültige Bakterienkonzentration in der NEC-Formel sollte zwischen 4 und 5 x 109 KBE/ml liegen.
    4. Beschriften Sie sechs 50-ml-Zentrifugenröhrchen für jeden der sechs Fütterungszeitpunkte (10:00, 13:00, 16:00, 19:00, 22:00, 07:00).
    5. Pipettieren Sie 4 ml der NEC-Formel in jedes markierte Röhrchen.
    6. Bereiten Sie sechs Einweg-Aliquots mit LPS-Stamm (5 mg/ml) vor und lagern Sie sie in Mikroröhrchen mit geringer Bindung bei -20 °C. Geben Sie LPS (siehe HINWEIS zur Konzentration) unmittelbar vor der Fütterung zu jedem Zeitpunkt zur NEC-Formel.
      HINWEIS: Die Menge an LPS, die der NEC-Formel zugesetzt wird, basiert auf dem durchschnittlichen Körpergewicht der mit Säuglingsnahrung gefütterten Welpen, das jeden Tag um 07:00 Uhr berechnet wird, wobei eine Dosierung von 5 μg LPS pro Gramm des Körpergewichts der Jungtiere verwendet wird. Die endgültige LPS-Konzentration variiert mit dem Körpergewicht. Bei einem Fütterungsvolumen von 80 μl und einem durchschnittlichen Welpen-Kohortengewicht von 2 Gramm würde die LPS-Konzentration in der Formel beispielsweise 0,125 mg/ml betragen.
  5. Fütterung
    HINWEIS: Am Versuchstag 1 werden Mäuse, die in das NEC-Modell aufgenommen werden sollen, nach der Trennung von ihrem Muttertier 3 Stunden lang gefastet. Die erste Fütterung mit NEC-Säuglingsnahrung erfolgt um 10:00 Uhr und wird alle 3 Stunden bis 22:00 Uhr fortgesetzt. An den Versuchstagen 2 und 3 werden die Mäuse um 07:00, 10:00, 13:00, 16:00, 19:00 und 22:00 Uhr gefüttert. Mäuse werden am Versuchstag 4 nicht gefüttert.
    1. Unmittelbar vor der Fütterung von Mäusen ein aliquotes LPS auftauen und 15 s lang vortexen. Geben Sie die entsprechende Menge LPS basierend auf dem Durchschnittsgewicht der Mäuse in das vorbereitete 4-ml-Röhrchen der NEC-Formel (siehe Schritt 1.4.6 zur Berechnung) und mischen Sie es gründlich durch Pipettieren.
    2. Füllen Sie eine 1-ml-Spritze mit NEC-Formel und legen Sie einen peripher eingeführten Zentralkatheter (PICC) für Neugeborene an. Stellen Sie sicher, dass sich keine Blasen oder Luft in der Spritze oder der PICC-Leitung befinden.
    3. Verabreichen Sie den Welpen die NEC-Formel über eine orale Sonde mit der PICC-Leitung.
      1. Halten Sie jedes Jungtier vorsichtig an der losen Haut am Halsansatz fest und halten Sie die Maus in einer aufrechten Position. Führen Sie mit einer Pinzette das distale Ende der PICC-Linie in den Oropharynx und die Speiseröhre und positionieren Sie die Spitze der PICC-Linie im Magen.
        HINWEIS: Der Einführabstand der PICC-Leitung entspricht dem Abstand vom Mundwinkel bis zum oberen Rand des Milchflecks im Magen. Der optimale Einfügepunkt sollte dann mit einem Permanentmarker eindeutig auf der PICC-Linie markiert werden.
      2. Wenn während des Einführens der PICC-Leitung ein erheblicher Widerstand zu spüren ist, entfernen Sie die PICC-Leitung, positionieren Sie sie neu und versuchen Sie vorsichtig erneut, was Sie tun.
      3. Geben Sie 8 μl NEC-Formel langsam in den Magen und überwachen Sie den Welpen während der gesamten Fütterung genau auf Anzeichen einer Aspiration. Achten Sie auf das Auftreten eines weißen Milchflecks, um eine erfolgreiche Magenentbindung zu bestätigen.
      4. Entfernen Sie die PICC-Leitung. Beobachten Sie den Welpen auf Atembeschwerden oder Erbrechen. Wenn der Welpe Säuglingsnahrung erbricht, tupfen Sie Mund und Nase mit einem fusselarmen Labortuch ab.
    4. Wiederholen Sie diesen Vorgang zu jedem Zeitpunkt der Fütterung.
    5. Setzen Sie die Welpen zweimal täglich 10 Minuten lang unmittelbar nach den Fütterungszeiten um 13:00 und 19:00 Uhr einer Hypoxie aus.
      1. Nach zwei Fütterungen pro Tag legen Sie die Jungtiere in eine Hypoxiekammer, die mit einem Gastank verbunden ist, der 95 % Stickstoff und 5 % Sauerstoff enthält. Öffnen Sie das Tankventil und überwachen Sie den Sauerstoffgehalt in der versiegelten Hypoxiekammer mit einem Handmonitor. Sobald die Hypoxiekammer 5 % ± 0,5 % Sauerstoff erreicht, halten Sie die Welpen 10 Minuten lang auf diesem Sauerstoffgehalt.
        HINWEIS: Die Durchflussrate sollte so optimiert werden, dass sie über einen Zeitraum von 2 Minuten mit einer gleichmäßigen, kontrollierten Rate von 20 % auf 5 % Sauerstoff abnimmt.
    6. Beobachten Sie die Mäusewelpen zwischen den Fütterungen auf Anzeichen von Atemnot, blasser Verfärbung oder Apnoe. Wenn diese Anzeichen vorhanden sind, nehmen Sie den betroffenen Welpen aus der Hypoxiekammer, beobachten Sie sorgfältig die Genesung und schläfern Sie die Welpen bei Bedarf gemäß den IACUC-Richtlinien ein.
    7. Setzen Sie die orale Sondenernährung und die Hypoxie-Exposition zu festgelegten Zeitpunkten für die gesamte Dauer von 72 Stunden des NEC-Modells fort.
      HINWEIS: Wenn experimenteller Tag 1 am Montag um 10:00 Uhr beginnt, tritt der 72-Stunden-Endpunkt am Donnerstag um 10:00 Uhr auf. Dies wird als Tag 4 des Modells bezeichnet. Die Mäuse werden an Tag 4 des Modells um 07:00 Uhr nicht gefüttert und zu diesem letzten Zeitpunkt um 10:00 Uhr zur Gewebeentnahme eingeschläfert.
  6. Tiere einschläfern und Gewebe sammeln
    1. Wiegen und notieren Sie am Morgen von Tag 4 des Modells das Geschlecht jedes Welpen und euthanasieren Sie es dann gemäß den IACUC-Richtlinien.
    2. Nach der Euthanasie sammeln Sie das Blut von jedem Welpen in ein Serum-Separatorröhrchen, das einen Gerinnselaktivator und ein Gel enthält.
    3. Zentrifugieren Sie bei 16.000 x g für 20 min bei 4 °C, um das Serum zu trennen. Pipettieren Sie das Serum in beschriftete 1,7-ml-Röhrchen und lagern Sie es bei -80 °C.
    4. Machen Sie einen 1-2 cm langen Schnitt in der Mittellinie durch die Bauchdecke und das Bauchfell, um den Magen-Darm-Trakt freizulegen. Untersuchen Sie den freiliegenden Darm auf charakteristische Merkmale von NEC, einschließlich Blähungen, Rötungen, Gasansammlungen in der Darmwand (Pneumatosis intestinalis) und sichtbare Luftblasen.
    5. Identifizieren und resezieren Sie den Zwölffingerdarm durch das distale Rektum. Lege das Gewebe in eine Petrischale auf Eis. Verwenden Sie eiskalte phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), um den Darm zu spülen.
    6. Identifizieren Sie den Blinddarm und schneiden Sie proximal, um den Blinddarm und den Dickdarm vom Dünndarm zu trennen. Stücke abtrennen, beginnend am distalen Ileum und in Richtung Jejunum. Legen Sie ein 1 cm großes Stück in ein Röhrchen mit RNA-Lysepuffer und 1,5 mm Zirkoniumoxidkügelchen auf Eis für die Transkriptionsanalyse.
      1. Spülen Sie ein 1,5 cm großes Stück mit einer Spritze mit PBS, die an einer 24-G-Nadel mit stumpfem Ende befestigt ist, und legen Sie es dann in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml 4 % Paraformaldehyd (PFA). Frieren Sie ein 1 cm großes Stück Darm ein und lagern Sie es bei -80 °C für die Proteinanalyse. Frieren Sie ein 1 cm großes Stück Darm ein und lagern Sie es bei -80 °C für weitere Untersuchungen.
    7. Verarbeiten Sie das in RNA-Lysepuffer gesammelte Gewebe in einem Bead-Beater (5,50 m/s, 1,0 min., Zyklus = 1,0, Pausenverweilzeit: 10 s, 4 °C), um das Gewebe zu homogenisieren, und lagern Sie es dann bei -80 °C.
  7. Fixierung des Gewebes
    1. Legen Sie die in 4 % PFA gesammelten Gewebestücke auf eine Wippe bei 4 °C und fixieren Sie sie 24 h lang. Entfernen Sie nach 24 Stunden 4 % PFA aus jedem Röhrchen und ersetzen Sie es durch 1 ml PBS, um das Gewebe zu waschen. Setzen Sie die Schläuche wieder für 15 min bei 4 °C in die Wippe ein. Wiederholen Sie die PBS-Wäsche einmal.
      1. Entfernen Sie das PBS und geben Sie 1 ml 50%iges Ethanol in jedes Röhrchen und stellen Sie die Röhrchen wieder für 15 Minuten bei 4 °C in die Wippe. Entfernen Sie das 50%ige Ethanol und fügen Sie 1 ml 70%iges Ethanol hinzu und lagern Sie es bei 4 °C, bis das Gewebe zu Paraffin-Histologieblöcken verarbeitet werden kann.
        HINWEIS: Bei Bedarf können zusätzliche Darmsegmente oder Stuhlproben für die weitere Analyse entnommen werden.

2. Isolierung von Immunzellen der Lamina propria

HINWEIS: Dieses Protokoll ist für die Isolierung von Lamina propria-Zellen aus neugeborenen Mäusen im Alter von etwa einer Woche optimiert. Wenn Referenzproben für die spektrale Durchflusszytometrie benötigt werden, können Entwöhnungen (postnatale Wochen 3-4) verwendet werden. Bei Entwöhnungsproben verdoppeln Sie alle im Protokoll angegebenen Reagenzvolumina.

  1. Vorbereitung von Reagenzien
    1. 1x Hank's ausgewogene Salzlösung ohne Ca2+ und Mg2+ (HBSS W/O) mit 10mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethensulfonsäure (HEPES) zubereiten und bei Raumtemperatur lagern.
    2. Bereiten Sie einen Puffer für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) vor, indem Sie 5 % Rinderserumalbumin (BSA) in PBS + 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) auflösen und bei 4 °C lagern.
    3. Bereiten Sie am Tag vor der Zellisolierung der Lamina propria eine Lösung vor dem Aufschluss vor, indem Sie 5 mM EDTA, 5 % fötales Rinderserum (FBS) und 1 mM Dithiothreitol (DTT) zu HBSS W/O hinzufügen.
    4. Bereiten Sie die Aufschlusslösung unmittelbar vor der Zellisolierung der Lamina propria vor, indem Sie Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI) mit 10 % FBS und mg/ml Kollagenase IV ergänzen.
      HINWEIS: HBSS ohne O kann im Voraus zubereitet und bei Raumtemperatur gelagert werden. FACS-Puffer sollte im Voraus hergestellt und bei 4 °C gelagert werden. Vorverdauung und Aufschlusslösungen müssen unmittelbar vor der Isolierung der Lamina propria frisch zubereitet und auf Eis aufbewahrt werden.
  2. Sammeln und Vorbereiten von Darmgewebe für die Verdauung
    1. Lokalisieren Sie den Blinddarm und transektieren Sie proximal, um den Blinddarm und den Dickdarm zu entfernen. 2-3 cm des distalen Dünndarms (Ileum) herausschneiden und auf eiskaltes HBSS W/O in eine Petrischale legen (Fortsetzung von Schritt 1.6.5).
    2. Spülen Sie das Darmlumen mit einer 24-G-Nadel mit stumpfen Enden, die an einer Spritze befestigt ist, vollständig mit eiskaltem HBSS W/O und stabilisieren Sie das Gewebe mit einer Pinzette. Bestätigen Sie visuell, dass das Darmlumen nach dem Spülen stuhlfrei ist.
    3. Entfernen Sie vorsichtig restliches Bindegewebe aus dem Darmsegment mit einer feinen Pinzette oder Schere.
    4. Den Darm in Längsrichtung aufschneiden, um ihn zu öffnen, dann quer in 1-1 cm große Segmente schneiden.
  3. Dissoziation der Lamina propria
    1. Übertragen Sie die Darmsegmente in ein 1-ml-Zentrifugenröhrchen mit 1 ml Vorverdauungslösung, die auf Eis abgekühlt wurde.
    2. Inkubieren Sie die Probe 20 Minuten lang bei 37 °C mit kontinuierlicher Rotation, um die Dissoziation des Gewebes zu erleichtern.
    3. Schwenken Sie das Röhrchen vorsichtig und gießen Sie dann den Inhalt durch ein 10-μm-Zellsieb, das über ein 5-ml-Zentrifugenröhrchen gelegt wird.
      HINWEIS: Das durch das 10-μm-Sieb gesammelte Filtrat enthält intraepitheliale Lymphozyten (IELs) und kann auf Wunsch für die nachgelagerte Analyse verwendet werden.
    4. Übertragen Sie die Gewebefragmente in ein neues 15-ml-Zentrifugenröhrchen, das 10 mL der auf 37 °C vorgewärmten Aufschlusslösung enthält. Anschließend wird die Probe 40 Minuten lang bei 37 °C mit kontinuierlicher Rotation inkubiert.
    5. Übertragen Sie die gesamte Probe in ein automatisiertes Dissoziationsröhrchen und führen Sie das Dissoziationsprogramm aus, das aus vier Rotationszyklen von jeweils 15 s besteht, die zwischen Uhrzeigersinn und gegen den Uhrzeigersinn wechseln.
      HINWEIS: Eine Alternative zu einem automatisierten Gewebedissoziator ist das manuelle Schleifen des Darmgewebes mit den mattierten Spitzen von zwei Objektträgern. Wenn Sie diese Methode anwenden, üben Sie sanften, gleichmäßigen Druck aus, um übermäßige mechanische Belastung zu vermeiden, da dies die Lebensfähigkeit der Zellen erheblich verringern kann.
    6. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension vorsichtig und zentrifugieren Sie dann die Proben im Dissoziationsröhrchen des Gewebes bei 300 × g für 5 min bei 4 °C.
    7. Saugen Sie den Überstand vorsichtig an, ohne das Pellet zu stören, und resuspendieren Sie die Zellen dann in ml eiskaltem FACS-Puffer.
    8. Legen Sie ein 10-μm-Zellsieb auf ein 5-ml-Zentrifugenröhrchen. Übertragen Sie die resuspendierte Zellsuspension durch den Filter und waschen Sie den Filter dann mit einem zusätzlichen ml eiskaltem FACS-Puffer.
    9. Zählen Sie Zellen und beurteilen Sie die Lebensfähigkeit mit Trypanblau oder einem Viabilitätsfarbstoff. Das für die Durchflusszytometrie erforderliche Volumen wird bei 30 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Verwenden Sie Zellen sofort für nachgelagerte Anwendungen, um die Lebensfähigkeit und die Markerexpression zu erhalten.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das neonatale Mausmodell der NEC, das in diesem Protokoll beschrieben wird, repliziert die wichtigsten Merkmale der Krankheit. Die Kaplan-Meier-Überlebensanalyse (Abbildung 1A) zeigte eine signifikante Verkürzung des Überlebens in der NEC-Behandlungsgruppe im Vergleich zu den mit Muttertieren gefütterten Kontrollen (9/21 vs. 8/8; p = 0,0063). Eine grobe Untersuchung des Darms der Mäuse, die dem Modell unterzogen wurden (Abbildun...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll integriert ein physiologisch relevantes neonatales Mausmodell von NEC mit der Isolierung von Immunzellen der Lamina propria und bietet damit eine umfassende Plattform zur Untersuchung der Immunreaktionen der Schleimhäute während einer Darmentzündung. Durch die Kombination klinisch relevanter Expositionen, wie z. B. enterisches Mikrobiom aus menschlichen NEC-Fällen, hypoxischem Stress und Säuglingsnahrung, rekapituliert dieses Modell die komplexe und multifaktorielle Path...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt im Zusammenhang mit diesem Manuskript besteht.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Manuskript wurde unterstützt von R01DK124614, R01HD105301, DP1DK140012, dem Chan Zuckerberg Initiative Grant Nummer 2022-316749, dem Yang Biomedical Scholar Award und der University of North Carolina at Chapel Hill Department of Pediatrics.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1 mL Syringe-Tuberculin Slip TipBecton Dickinson309659Spritzen für die Ernährung mit der Formel
1.5 mL semi-micro EinwegküvettenBRAND GMBH + CO KG759085D
1.7 ml Microtubes ClearAxygen - Corning Inc.MCT-175-CNonpryogenic & Rnase-/Dnase-frei
5% Sauerstoff, Balance Stickstoff Zertifiziertes Referenzmaterial, Größe 200 Hochdruckstahlzylinder, CGA 580AirgasX02NI95C2003186
Anti-Mo CD16/CD32 Gereinigt Klon: 93eBioscience Inc. 14-0161-85
Anti-Mouse CD16/CD32 Gereinigt Klon: 93eBioscience Inc. 14-0161-86
APC anti-mouse Ly-6C Klon: HK1.4 Isotyp: Rat IgGcBioLegend128015
autoMACS SpüllösungMiltenyi Biotec130-091-222
BB515 Rat Anti-CD11b Klon: M1/70BD Biosciences564455
BB700 Rat Anti-Mouse CD4 Klon: RM4-5BD Biosciences566408
BD Microtainer SSTBecton Dickinson365867Serum Tube
BIOTIX Rainin LTS Kompatible Racked Filterspitzen, p1200Fisher Scientific12-111-365
BIOTIX Rainin LTS Kompatible Racked Filterspitzen, p20Fisher Scientific12-111-366
BIOTIX Rainin LTS Kompatible Racked Filterspitzen, p200Fisher Scientific12-111-362
Brilliant Stain BufferBD Biosciences563795
BUV615 Rat Anti-Mouse Ly-6G Klon: 1A8BD Biosciences751263
BV650 Rat Anti-Mouse I-A/I-E Klon: M5/114.15.2BD Biosciences563415
C57BL/6J Neonatal MäuseThe Jackson Laboratory000664
CD45-VioGreen MausMiltenyi Biotec 130-102-412
CD64 Antikörper, anti-Maus, PE-Vio 770, REAfinity Klon REA286Miltenyi Biotec 130-119-659
CFX Opus Echtzeit-PC-Systeme Bio-Rad12011319
Kollagenase Typ 4Worthington Biochemical Corporation LS004188
DL-Dithiothreitol SigmaD9779-5g
eBioscience FOXP3/Transkriptionsfaktor FärbesetLife Technologies Corp. 00-5523-00
EDTA (0,5M), pH 8,0Quality Biological Inc351-027-721
Esbilac WelpenmilchersatzPet-Ag, Inc.99502-1Welpenmilch
Fisherbrand EinwegküvettenFisher Scientific14-955-127
Fisherbrand Sterile Polystyrol Einweg Serologische Pipetten mit Vergrößerungsstreifen (Papier/Kunststoffummantelung), 10mLFisher Scientific13-678-11E
Fisherbrand Sterile Polystyrol Einweg Serologische Pipetten mit Vergrößerungsstreifen (Papier/Kunststoffummantelung), 25mLFisher Scientific13-678-11
Fisherbrand Sterile Polystyrol Einweg Serologische Pipetten mit Vergrößerungsstreifen (Papier/Kunststoffummantelung), 50mLFisher Scientific13-678-11F
Fisherbrand Sterile Polystyrol Einweg Serologische Pipetten mit Vergrößerungsstreifen (Papier/Kunststoffummantelung), 5mLFisher Scientific13-678-11D
Genie Temp-Shaker 300USA Scientific, Inc.SI-G1600
gentleMACS Dissociator (Protokoll; m_intestine-01)Miltenyi Biotec 130-093-235
gentleMACS  C TubesMiltenyi Biotec 130096334
Ghost Dye Red 780 LebensfähigkeitsfärbungTonbo Biosciences13-0865-T100
Glycerol ReagentPlusSigma-AldrichG7757-500ML
GraphPad Prims Software, Version 10.0GraphPadN/A
Greiner Bio-One Rundboden Polypropylen Kulturrohr mit Zwei-Positionen-VentilverschlussFisher Scientific07-000-212
Handi+ SauerstoffanalysatorMaxtecN/A
Hanks' Balanced Salt SolutionGibco141650-095
HEPES-PufferMediatech, Inc. 25-060-CI
HypoxiekammerBillups-Rothenburg, Inc.N/A
ImageJSchneider et al., 2012N/A
Integra Miltex MeisterHand Iris-Schere, 10,2cmFisher Scientific12-460-655
Integra Miltex MeisterHand Iris-Schere, 9cmFisher Scientific12-460-598
Integra Miltex™ Swiss Jeweler-Style PinzetteFisher Scientific12-460-110
Isolette SäuglingsinkubatorAir-Shields VickersC100-200-2 Series 02Inkubator für Mäuse
Kimtech Science Kimwipes Delicate Task WipesKimberly-Clark34120
LPSSigma-AldrichL3129-10mg
Luria Broth Broth, Miller Molecular Genetics PulverFisher ScientificBP1426-500
MACS BSA LagerlösungMiltenyi Biotec 130-091-376
MACSmix Tube RotatorMiltenyi Biotec 130-090-753
MikrozentrifugenrohreThermo Scientific34511,5 ml, klar, graduiert, steril
Nano

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alsaied, A., Islam, N., Thalib, L. Global incidence of necrotizing enterocolitis: A systematic review and meta-analysis. BMC Pediatr. 20 (1), 344(2020).
  2. Warner, B. B., Tarr, P. I. Necrotizing enterocolitis and preterm infant gut bacteria. Semin Fetal Neonatal Med. 21 (6), 394-399 (2016).
  3. Rose, A. T., Patel, R. M. A critical analysis of risk factors for necrotizing enterocolitis. Semin Fetal Neonatal Med. 23 (6), 374-379 (2018).
  4. Tanner, S. M., et al. Pathogenesis of necrotizing enterocolitis: Modeling the innate immune response. Am J Pathol. 185 (1), 4-16 (2015).
  5. Leaphart, C. L., et al. A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair1. J Immunol. 179 (7), 4808-4820 (2007).
  6. Hackam, D. J., Sodhi, C. P. Toll-like receptor-mediated intestinal inflammatory imbalance in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 6 (2), 229-238.e1 (2018).
  7. Sulistyo, A., Rahman, A., Biouss, G., Antounians, L., Zani, A. Animal models of necrotizing enterocolitis: Review of the literature and state of the art. Innov Surg Sci. 3 (2), 87-92 (2018).
  8. Lopez, C. M., et al. Models of necrotizing enterocolitis. Semin Perinatol. 47 (1), 151695(2023).
  9. Jilling, T., et al. The roles of bacteria and TLR4 in rat and murine models of necrotizing enterocolitis. J Immunol. 177 (5), 3273-3282 (2006).
  10. Mihi, B., Lanik, W. E., Gong, Q., Good, M. A mouse model of necrotizing enterocolitis. Methods Mol Biol. 2321, 101-110 (2021).
  11. Nolan, L. S., Gong, Q., Hofmeister, H. N., Good, M. A protocol for the induction of experimental necrotizing enterocolitis in neonatal mice. STAR Protoc. 2 (4), 100951(2021).
  12. Kaplina, A., et al. Necrotizing enterocolitis: The role of hypoxia, gut microbiome, and microbial metabolites. Int J Mol Sci. 24 (3), 2471(2023).
  13. Good, M., et al. Lactobacillus rhamnosus hn001 decreases the severity of necrotizing enterocolitis in neonatal mice and preterm piglets: Evidence in mice for a role of TLR9. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 306 (11), G1021-G1032 (2014).
  14. Denning, T. L., Bhatia, A. M., Kane, A. F., Patel, R. M., Denning, P. W. Pathogenesis of nec: Role of the innate and adaptive immune response. Semin Perinatol. 41 (1), 15-28 (2017).
  15. Yu, Y. -R. A., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLOS ONE. 11 (3), e0150606(2016).
  16. Mihi, B., et al. Interleukin-22 signaling attenuates necrotizing enterocolitis by promoting epithelial cell regeneration. Cell Rep Med. 2 (6), 100320(2021).
  17. Bautista, G. M., Cera, A. J., Chaaban, H., Mcelroy, S. J. State-of-the-art review and update of in vivo models of necrotizing enterocolitis. Front Pediatr. 11, 1161342(2023).
  18. Sodhi, C. P., et al. The human milk oligosaccharides 2'-fucosyllactose and 6'-sialyllactose protect against the development of necrotizing enterocolitis by inhibiting toll-like receptor 4 signaling. Pediatr Res. 89 (1), 91-101 (2021).
  19. Blum, L., Vincent, D., Boettcher, M., Knopf, J. Immunological aspects of necrotizing enterocolitis models: A review. Front Immunol. 15, 1434281(2024).
  20. Nolan, L. S., et al. Indole-3-carbinol-dependent aryl hydrocarbon receptor signaling attenuates the inflammatory response in experimental necrotizing enterocolitis. Immunohorizons. 5 (4), 193-209 (2021).
  21. Valle-Noguera, A., Gómez-Sánchez, M. J., Girard-Madoux, M. J. H., Cruz-Adalia, A. Optimized protocol for characterization of mouse gut innate lymphoid cells. Front Immunol. 11, 563414(2020).
  22. Booth, J. S., et al. Characterization and functional properties of gastric tissue-resident memory T cells from children, adults, and the elderly. Front Immunol. 5, 294(2014).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Darmentz ndungDurchflusszytometrieIsolation von Immunzellenepitheliale Sch digungmikrobielle Dysbioseadaptive Immunzellen

Verwandte Artikel