Gefäßrekonstruktionen bei Empfängern, einschließlich der suprahepatischen unteren Hohlvene (SHIVC), der Pfortader und der infrahepatischen unteren Hohlvene (IHIVC), sind die Schlüsselverfahren für eine erfolgreiche orthotope Lebertransplantation in der Maus. Im Folgenden stellen wir Ihnen Nahttechniken und Tipps für die SHIVC- und IHIVC-Rekonstruktion im Lebertransplantationsmodell der Maus zur Verfügung.
Methodenartikel
Nahttechniken für die Gefäßrekonstruktion bei der orthotopen Lebertransplantation der Maus
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Translationale Forschung mit Tiermodellen ist unerlässlich, um die klinischen Probleme bei Organtransplantationen zu lösen. Obwohl die orthotope Lebertransplantation (LT) der Maus ein nützliches Werkzeug ist, um die Mechanismen der Leberregeneration, der Ischämie-Reperfusionsschädigung und der Immunantwort nach LT zu untersuchen, schränken technische Herausforderungen bei diesem Verfahren seine Machbarkeit ein. Die Schlüsselaspekte für eine erfolgreiche orthotope LT in der Maus sind die Gefäßrekonstruktion bei Empfängern, einschließlich der suprahepatischen unteren Hohlvene (SHIVC), der Pfortader (PV) und der infrahepatischen unteren Hohlvene (IHIVC). Neben den technischen Schwierigkeiten bei der Rekonstruktion dieser Gefäße erschwert die zeitliche Begrenzung der anhepatischen Phase auf 20 Minuten dieses Verfahren. Obwohl für die PV-Rekonstruktion eine Manschettentechnik verwendet werden kann, ist eine sichere und schnelle Nahttechnik erforderlich, um das SHIVC während der anhepatischen Phase zu rekonstruieren. Bei der IHIVC-Rekonstruktion sind zwar sowohl Manschetten- als auch Nahttechniken anwendbar, aber die Nahttechnik führt zu einer kürzeren Operationszeit in der Spenderchirurgie und der Backtable-Vorbereitung und kann ein größeres Gefäßlumen erhalten als die Manschettentechnik. Wir stellen hier Richtlinien für die SHIVC- und IHIVC-Rekonstruktion unter Verwendung einer Nahttechnik zur Erleichterung der orthotopen LT der Maus zur Verfügung.
Einleitung
Mit Fortschritten in den Operationstechniken, Immunsuppressiva und der Intensivmedizin hat sich die Organtransplantation als Standardtherapie für Organerkrankungen im Endstadium etabliert. Die Lebertransplantation (LT) ist derzeit die einzige kurative Behandlung für Lebererkrankungen im Endstadium und bestimmte bösartige Lebererkrankungen. Translationale Forschung mit Tiermodellen ist unerlässlich, um klinische Probleme bei LT zu lösen. Da verschiedene genetisch veränderte Tiere in Mausmodellen verfügbar sind, ist die orthotope LT der Maus ein wichtiges Werkzeug, um mechanistische Einblicke in die Leberregeneration, Ischämie-Reperfusionsschäden und Immunantworten nach LT1 zu untersuchen. Da die technischen Herausforderungen in diesem Verfahren jedoch die Machbarkeit einschränken, sind die Forschungsgruppen, die an diesem Modell arbeiten, auf 2,3,4,5,6,7,8,9,10 beschränkt.
Die orthotope LT der Maus wurde erstmals 1991 von Qian et al. beschrieben2. Das chirurgische Verfahren, das durch die Anwendung orthotoper LT-Techniken bei Ratten entwickelt wurde, umfasst drei Schritte: die Spenderchirurgie, die Präparation des Lebertransplantats am hinteren Tisch und die Empfängeroperation6. Die technisch anspruchsvollen Teile der LT der Maus sind die Gallen- und Gefäßrekonstruktion bei Empfängern, einschließlich der suprahepatischen unteren Hohlvene (SHIVC), der Pfortader (PV) und der infrahepatischen unteren Hohlvene (IHIVC). Zusätzlich zu den chirurgischen Techniken sollte die anhepatische Phase vom Einklemmen bis zum Lösen des PV-Flusses innerhalb von 20 min liegen, um eine erfolgreiche orthotope LT 2,6,11 der Maus zu erreichen. Darüber hinaus sollte nach unserer Erfahrung die Gesamtreperfusionszeit von der PV-Klemmung bis zur IHIVC-Freisetzung innerhalb von 30 Minuten liegen, um ein langfristiges Überleben in der LT der Maus zu erreichen. Dies stimmt mit dem vorherigen Bericht für die LT der Ratte überein, in dem die bevorzugte Zeit des instabilen systemischen hämodynamischen Zustands mit etwa 30 min beschriebenwurde 12. Technische Schwierigkeiten und zeitliche Einschränkungen bei der Maus-LT erschweren daher dieses Verfahren.
Obwohl die Manschettentechnik für die PV-Rekonstruktion verwendet werden kann, ist eine Nahttechnik erforderlich, um das SHIVC während der anhepatischen Phase zu rekonstruieren. Daher ist eine sichere und schnelle Nahttechnik für die SHIVC-Anastomose unerlässlich. Während sowohl Manschetten- als auch Nahttechniken für die IHIVC-Rekonstruktion anwendbar sind, haben die meisten früheren Studien eine Manschettentechnik verwendet 5,6,7,11,13. Der Einsatz einer Manschettentechnik bei der IHIVC-Rekonstruktion führt jedoch zu einer längeren Operationszeit bei Spender- und Backtable-Operationen. Darüber hinaus kann das Einsetzen einer Manschette für Anfänger aufgrund des kurzen Randes der unteren Hohlvene des Empfängers (IVC) schwieriger sein als das Nähen13.
Im Folgenden stellen wir Richtlinien für eine erfolgreiche SHIVC- und IHIVC-Rekonstruktion mit einer Nahttechnik bei der orthotopen LT der Maus zur Verfügung.
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Protokoll
Alle Tierversuche wurden vom Tierversuchsausschuss der Universität Kyoto genehmigt und in Übereinstimmung mit den Tierschutzrichtlinien der Universität Kyoto durchgeführt. Operationen an Mäusen wurden unter Vollnarkose mit Isofluran-Inhalation durchgeführt. Der Verdampfer wurde auf 3% Isofluran mit 1 l/min Sauerstoff eingestellt, um eine Anästhesie einzuleiten. Nach der Laparotomie wurde das Isofluran auf 1% reduziert, um die Anästhesie aufrechtzuerhalten. Die in diesem Protokoll verwendeten mikrochirurgischen Instrumente, einschließlich derjenigen, die in unserem zuvor veröffentlichten Gefäßrekonstruktionsprotokoll13 verwendet wurden, sind in der Materialtabelle aufgeführt. Für die Durchführung der orthotopen LT13 der Maus war ein Mikroskop erforderlich. Ein Heizkissen wurde verwendet, um die Körpertemperatur der Mauszu halten 13.
1. Tiere
- Verwenden Sie eine Maus mit einem Gewicht von 25-30 g.
HINWEIS: Obwohl Mäuse mit einem Gewicht von 20-35 g verwendet werden können, sind ca. 25 g Mäuse sowohl für Spender als auch für Empfänger geeignet. Da das Alter und die Lebersteatose die LT-Ergebnisse beeinflussen, sollten für jeden Versuchszweck geeignete Mäuse ausgewählt werden.
2. Dissektion des IHIVC in der Spenderleber
- Isolieren Sie das IHIVC aus dem umgebenden Gewebe. Verschließen Sie die Lendenvenen bei Bedarf mit einem Elektrokauter.
- Entfernen Sie das Fett aus dem IHIVC, um die Gefäßwand freizulegen.
- Präparieren Sie den IHIVC oberhalb der rechten Nierenarterie und Vene (Abbildung 1).
HINWEIS: Wenn die Nahttechnik für die IHIVC-Rekonstruktion verwendet wird, ist eine Dissektion der rechten Nierenvene an der Spenderstelle nicht erforderlich. Eine Spenderoperation dauert in der Regel weniger als 30 Minuten, wenn die Nahttechnik für die IHIVC-Rekonstruktion angewendet wird.
3. Dissektion des SHIVC in der Spenderleber
- Schneiden Sie nach der Perfusion der Speicherlösung aus dem PV die vordere und hintere Wand des SHIVC ab (Abbildung 1).
HINWEIS: Die Isolierung der SHIVC-Hinterwand von den Zwerchfell-Crus ist entscheidend, um einen ausreichenden Spielraum für die Rekonstruktion zu erhalten.
4. Vorbereitung des Lebertransplantats auf dem Rückentisch
- Befestigen Sie eine Manschette an der PV, wie zuvor beschrieben13.
- Befestigen Sie einen Klemmclip am IHIVC.
- Drehen Sie die Leber auf den Kopf und legen Sie den Stumpf von SHIVC frei.
- Legen Sie eine Stütznaht mit 10-0 Nylon an beide Kanten des SHIVC und halten Sie sie mit Bulldog-Klammern fest.
HINWEIS: Die Vorbereitung des Rücktisches dauert ca. 10 Minuten, ohne dass eine Manschette an IHIVC befestigt wird.
5. Rekonstruktion des SHIVC beim Empfänger
- Umschließen Sie das SHIVC mit 4-0 Seide, um die Leber nach unten zurückzuziehen.
- Reduzieren Sie die Konzentration von Isofluran auf 0,3-0,5% vor der anhepatischen Phase.
- Klemmen Sie das IHIVC mit einem Mikroserraffin über die rechte Nierenvene.
- Klemmen Sie die PV mit einer Pean Pinzette13 fest.
- Klemmen Sie das SHIVC mit dem Zwerchfell mit einer Bulldoggenklemme ein, während Sie die Leber nach unten zurückziehen.
- Schneiden Sie die Vorderwand des SHIVC und dann die Hinterwand (Abbildung 1).
HINWEIS: Die Isolierung der SHIVC-Hinterwand von den Zwerchfell-Crus beim Empfänger und bei den Spendern ist entscheidend, um einen ausreichenden Spielraum für die Rekonstruktion zu erhalten. - Nachdem PV und IHIVC nahe an der Leber des Empfängers präpariert wurden, entfernen Sie die Leber des Empfängers (Abbildung 1).
- Legen Sie das vorbereitete Lebertransplantat in die Bauchhöhle des Empfängers und platzieren Sie die Leber entsprechend.
- Platzieren und ligieren Sie eine Haltenaht am rechten Ende des SHIVC und halten Sie sie mit einer Bulldog-Klemme fest, um die Naht in Richtung der ventralen Seite des Empfängers zu ziehen (Abbildung 2A).
HINWEIS: Die rechte Seite des SHIVC liegt tief in der Bauchhöhle. Ziehen Sie die rechte Seite des SHIVC heraus, so dass die hintere Wand nach vorne liegt. - Platzieren und ligieren Sie eine Stay-Naht am linken Ende des SHIVC.
- Beginnen Sie mit dem kontinuierlichen Nähen mit einer intraluminalen Methode an der hinteren Wand des SHIVC von der linken Seite (Abbildung 2A).
- Wenn Sie das rechte Ende der hinteren Wand des SHIVC erreicht haben, drehen Sie den Operationstisch um 90° gegen den Uhrzeigersinn.
HINWEIS: Drehen Sie den Operationstisch für Linkshänder um 90° im Uhrzeigersinn. Alternativ kann der Chirurg die Vorderwand ohne Rotation von vorne nach hinten vernähen. - Setzen Sie die Naht mit einer Über-und-Über-Naht an der Vorderwand des SHIVC von der rechten Seite fort (Abbildung 2A).
HINWEIS: Es sind etwa sechs bis acht Stiche für die hintere Wand und acht bis zehn Stiche für die vordere Wand erforderlich. Die Naht am linken Ende der Vorderwand ist wichtig, um Blutungen zu verhindern. - Nachdem Sie die Luft im SHIVC gespült haben, ligieren Sie die durchgehende Naht mit der Bleinaht auf der linken Seite des SHIVC.
- Drehen Sie den OP-Tisch um 90° im Uhrzeigersinn, um die Empfängerposition wieder in die ursprüngliche Position zu bringen.
- Lösen Sie nach der Rekonstruktion und Reperfusion des PV das SHIVC.
HINWEIS: Die SHIVC-Rekonstruktion dauert 10-15 Minuten. Da die PV-Klemmzeit die LT-Ergebnisse beeinflussen kann, sollte die anhepatische Zeit (von der PV-Klemmung bis zum PV-Lösen) je nach Geschick des Chirurgen auf bis zu 20 Minuten festgelegt werden. Nach der PV-Reperfusion wird Isofluran auf 1% zurückgesetzt, um die Anästhesie aufrechtzuerhalten.
6. Rekonstruktion der IHIVC beim Empfänger
- Platzieren und ligieren Sie die Nähte mit 10-0 Nylon an beiden Enden des IHIVC.
- Halten Sie die Haltenähte mit Bulldoggenklemmen fest, um sie zu beiden Seiten zu ziehen, so dass der IHIVC-Stumpf breit und gerade wird.
- Beginnen Sie die kontinuierliche Naht mit einer intraluminalen Methode auf der linken Seite der Hinterwand (Abbildung 2B).
- Nachdem Sie die rechte Seite erreicht haben, nähen Sie immer wieder an der Vorderwand von der rechten Seite des Empfängers aus (Abbildung 2B).
HINWEIS: Eine Drehung des Operationstisches ist für die IHIVC-Rekonstruktion nicht erforderlich. Etwa sechs bis acht Stiche pro Seiten- und Vorderwand sind ausreichend. - Spülen Sie die Luft im IHIVC.
- Lösen Sie die IHIVC-Clips von der Transplantatseite und dann von der Empfängerseite.
HINWEIS: Eine Ligatur der kontinuierlichen Naht mit der Bleinaht auf der linken Seite des IHIVC ist nicht erforderlich. Die IHIVC-Rekonstruktion dauert 8-10 Minuten. Die Gesamtreperfusionszeit von der PV-Klemmung bis zur IHIVC-Freigabe sollte innerhalb von 30 Minuten liegen.
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Ergebnisse
Eine Mausempfängerin erholte sich innerhalb von 30 Minuten von der Anästhesie, nachdem eine erfolgreiche Gefäßrekonstruktion mit einem normalen Lebertransplantat ohne verlängerte kalte ischämische Zeit durchgeführt wurde. Eine Erfolgsquote von >90 % kann als geschickt für dieses Verfahren angesehen werden. Wir untersuchten die Lernkurven bei einem Chirurgen für die Erholungsraten nach der LT (Erholung von der Anästhesie), die anhepatische Zeit (vom Einklemmen bis zum Freigeben des PV-Flusses) und die gesamte Reperfusi...
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Diskussion
In diesem Artikel wurden die detaillierten Techniken zur Rekonstruktion des SHIVC und IHIVC mit einer Nahttechnik bei der orthotopen LT der Maus dokumentiert. Die Gefäßrekonstruktion, insbesondere die SHIVC-Anastomose, die eine Nahttechnik während der anhepatischen Phase erfordert, ist eine entscheidende Fähigkeit für eine erfolgreiche LT der Maus. Zusätzlich zu der sicheren Nahttechnik ist eine schnelle Naht erforderlich, um die anhepatische Phase innerhalb von 20 Minuten zu halten, um ...
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von der Japan Society for the Promotion of Science (Fördernummer: 24K19356) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 10-0 Mikro-Naht | AROSurgical Instruments GmbH | T4A10N07 | |
| 16 G intravenöser Katheter | TERUMO | Nr. SR-FF2032 | IHIVC-Manschette |
| 20 G intravenöser Katheter | TERUMO | Nr. SR-FF1651 | PV-Manschette |
| 8-0 Geflochtene Seide | Natsume Seisakusho | CR9-80B2 | 8-0 Seide |
| Belzer UW Kühlhauslösung | Astellas | Flüssigkeit zur Organkonservierung | |
| Bulldoggen-Klemme | B BRAUN | FB329R | Bulldoggen-Klemme |
| Bulldog-Klemmen | Natsume Seisakusho | C-42-S-2 | Für SHIVC-Spannung |
| C57BL/6 Mäuse | Orientalischer Bio-Service | ||
| Zange | Werkzeuge für die Feinwissenschaft | 11231-30 | |
| Isofluran-Inhalationslösung | Viatris | Anästhesie | |
| Micro Blunted Tips 0,1 mm x 0,06 mm | Werkzeuge für die Feinwissenschaft | 11253-20 | Gerade Mikrozange |
| Mikro-Schere | Muranaka Medizinische Instrumente | 451-609-13 | |
| Mikro-Serraffin | Werkzeuge für die Feinwissenschaft | 18055-03 | Für IHIVC-Spannung |
| Mikro-Serraffin | Werkzeuge für die Feinwissenschaft | 18055-04 | Für PV-Klemmung |
| Micro Serrefine Clamp Applikator mit Verriegelung | Werkzeuge für die Feinwissenschaft | 18056-14 | Applikator für Gefäß-Clips |
| Mikro-Serraffinerien | Werkzeuge für die Feinwissenschaft | 18055-4 | Gefäß-Clip |
| Mikronaht-Stuhl | Äskulap | FD281R | |
| Mikro-Serrefine-Klemmapplikator | Werkzeuge für die Feinwissenschaft | 18056-14 | |
| Nadelhalter | Äskulap | FD231R | |
| Nr.11 Ersatzklingen | FEATHER Rasierhobel | 11 | Klingen |
| Augenschere, runder Griff | B BRAUN | FD103R | Mikroschere |
| Rechteckiger Kunststoffbehälter | Daiso | 10 cm lang, 15 cm breit und 6 cm hoch | |
| SuperGrip-Spitzen | Werkzeuge für die Feinwissenschaft | 00649-11 | Gebogene Mikrozange |
| SZX7 | Olymp | SZX7 | Mikroskop |
| Vannas Schere | Welt Präzisionsinstrumente | 501232 | |
| Gefäß-Clip | BEAR Medic Corporation | TKF-1-30 | Für die IHIVC-Klemmung am Lebertransplantat |
Referenzen
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- Qian, S. G., Fung, J. J., Demetris, A. V., Ildstad, S. T., Starzl, T. E. Orthotopic liver transplantation in the mouse. Transplantation. 52 (3), 562-564 (1991).
- Tian, Y., Rudiger, H. A., Jochum, W., Clavien, P. A. Comparison of arterialized and nonarterialized orthotopic liver transplantation in mice: Prowess or relevant model. Transplantation. 74 (9), 1242-1246 (2002).
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