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Formulierung von Vitamin-A-Tracer-Dosen zur Verabreichung an menschliche Probanden mittels der Retinolisotop-Verdünnungstechnik

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DOI:

10.3791/69240

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31. März 2026

 , 
1Human Nutrition and Exercise Research Centre, Newcastle University, 2Fera Science Ltd

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Herstellung von stabilem, isotop-gekennzeichnetem Vitamin A, das für die Retinolisotopen-Verdünnungstechnik notwendig ist, muss den Lebensmittelsicherheitsstandards entsprechen. Das Protokoll zeigt die Zubereitung der Dosierung in Pflanzenöl in Konzentrationen, die für das gewählte Verabreichungssystem und die angewandte Analyseplattform geeignet sind.

Zusammenfassung

Die Retinolisotopen-Verdünnungstechnik (RID) basiert auf der Verabreichung isotopisch markierter Vitamin-A-Tracer an menschliche Proben. Hier stellen wir eine Methode vor, die Forscherteams anleitet, wie man stabile Vitamin-A-Isotopentracer sowohl für Forschungsstudien als auch für Populationsumfragen vorbereitet. Der Artikel bietet einen Überblick über die Vorbereitung, Beschaffung der Materialien, benötigte Ausrüstung und Verfahren, um sicherzustellen, dass die Tracer für den menschlichen Verzehr sicher sind. Vitamin-A-stabile Isotopen-Tracer können kommerziell gewonnen werden und sind üblicherweise entweder mit Deuterium [2H] oder Kohlenstoff-13 [13C] mit >95 % alltrans-isomerischer Reinheit und >99 % isotopischer Anreicherung gekennzeichnet. Die Herstellung der stabilen Vitamin-A-Isotop-Tracer beinhaltet die Auflösung des Tracers in essbarem Pflanzenöl durch Sonikation und Hitze. Tracer müssen in einer Konzentration hergestellt werden, die gut innerhalb der volumetrischen Grenzen des Abgabesystems liegt. Schließlich wird der Tracer in sterile Bernsteinglasphiolen aliquotiert, und die Konzentrationen der Tracer werden spektrophotometrisch bestätigt.

Einleitung

Um eine effektive Überwachung von Interventionsprogrammen zu ermöglichen, die darauf abzielen, einen Vitamin-A-Mangel zu reduzieren, wurde die Retinolisotopenverdünnungsmethode (RID) erfolgreich angewandt, um Informationen über die Gesamtkörperspeicher (TBS) in verschiedenen Bevölkerungsgruppenbereitzustellen: 1,2,3,4. Während Serumretinol5, Serumretinol-Bindungsprotein (RBP)6,7,8 und modifizierte relative Dosis-Antwort-Tests (MRDR)9 häufig zur Bestätigung eines Vitamin-A-Mangels verwendet werden, ist RID die einzige Methode, die die gesamten Vitamin-A-Vorräte im Körper über das gesamte Spektrum – von subklinischer Mangel bis zur Toxizität 3,10 – genau quantifiziert. Durch die Verabreichung einer bekannten Dosis markierten Vitamin A und Messung dessen Verdünnung im Plasma nach dem Gleichgewicht liefert die RID-Methode präzise Schätzungen von TBS und den Vitamin-A-Reservender Leber 11,12. Wichtig ist, dass die RID-Methode auch in Populationen mit Entzündung zuverlässig bleibt und daher unverzichtbar ist, um die Wirksamkeit von Interventionen zu bewerten und die Toxizitätsrisiken in sich überschneidenden Supplementierungs- und Verstärkungsprogrammenzu bewerten 13,14.

Um die RID-Methode durchzuführen, muss isotopisch markiertes Vitamin A als orale Dosis von Retinylester verabreicht werden, das in den meisten Fällen Retinylacetat in essbarem Pflanzenöl gelöst ist. Die meisten Labore beziehen Isotopen-gekennzeichnetes Vitamin A von kommerziellen Lieferanten 1,3,7,15,16,17,18,19,20,21,22. Fast alle kommerziell erhältlichen Vitamin-A-Isotopen-Tracer werden mit stabilen Isotopen von Kohlenstoff-13 [13C] oder Deuterium [2 H] markiert (Tabelle 1). Die Wahl der angebrachten Isotopendosis hängt vom analytischen Instrument ab, das zur Bestimmung der Serum- oder Plasmakonzentration von massenmarkiertem Retinol verwendet wird. Während Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) und Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) sowohl [13C] als auch [2H]22,23,24,25,26,27 analysieren können, kann Gaschromatographie-Verbrennungs-Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie (GC-C-IRMS) nur [13C] markierte Retinoltracer 4,25 analysieren,28. Die Nachweisgrenzen des gewählten Analyseinstruments, der Zielgruppe (Kinder oder Erwachsene) und die Länge der Untersuchung bestimmen die Größe der zu verabreichenden Dosis 3,25,29. Bis heute lagen die angewandten Isotopendosen zwischen 0,3 - 4,3 mg Retinol-Äquivalent (RE; entspricht 1 - 15 μmol RE) bei Kindern 3,4,30 und zwischen 0,6 - 10,0 mg RE (entspricht 2 - 35 μmol RE) bei Erwachsenen 2,3,3,31, wobei neuere Studien niedrigere Dosen zwischen 0,3 - 0,6 mg RE (1 - 3 μmol RE) bei Kindern und 0,6 - 2,0 mg RE (2 - 7 μmol RE) bei Erwachsenen anwenden. Obwohl Befürchtungen geäußert wurden, dass eine hohe Vitamin-A-Menge in der Dosis die zugrundeliegende Kinetik von Vitamin A beeinträchtigen könnte, bestätigte eine aktuelle Analyse mittels kompartimentaler Modellierung, dass Isotopendosen bis zu 7 μmol RE bei Kindern oder 14 μmol RE bei Erwachsenen die Genauigkeit der TBS-Vorhersagen nicht beeinflussen sollten29. Hier zeigen wir, wie man einen isotopenbeschrifteten Tracer für die orale Anwendung im Rahmen der RID-Methode vorbereitet, wobei Lebensmittelsicherheitsbedenken berücksichtigt und genaue Dosierungskonzentrationen erhalten werden. Die Isotopendosisvorbereitung ist für die RID-Methode entscheidend.

Protokoll

Studie 1 wurde vom National Research Ethics Service, North-East Sunderland Committee (REC 09/H0904/20), vor der Registrierung beim UK Clinical Research Network (UKCRN: 7413) genehmigt. Studie 2 wurde vom Research Ethics Board der University of the Philippines, Manila (IRB ID: UPMREB 2016-282-01), dem Institutional Review Board an der UC, Davis (IRB ID: 903681-2) genehmigt und bei ClinicalTrials.gov registriert (ID: NCT03030339). Studie 2 war Teil des GloVitAS-Projekts, das von der Bill and Melinda Gates Foundation finanziert wurde (OPP1115464: Bewertung des Risikos der Vitamin-A-Toxizität durch großflächige Lebensmittelanreicherung und andere Interventionen). Georg Lietz war leitender Forscher des GloVitAS-Projekts und überwachte die Durchführung der Feldstudie. Ein Überblick über das Studienprotokoll findet sich in Abbildung 1.

1. Einschluss- und Ausschlusskriterien

  1. Für Studie 1 waren die angegebenen Kriterien: Inklusionskriterien: Beziehen Sie gesunde männliche und weibliche Freiwillige im Alter von 18 bis 45 Jahren ein. Ausschlusskriterien: Ausschluss von Freiwilligen mit Schwangerschaft, Rauchen, Bluthochdruck, Diabetes, BMI >30, Leber-/Nieren-/Magen-Darm-Erkrankungen, Lipidstoffwechselstörungen und Einnahme von Multivitaminen (mit den Vitaminen A, C, E) oder β-Carotin-Präparaten 3 Monate vor Studienbeginn.
  2. Für Studie 2 waren die angegebenen Kriterien: Einschlusskriterien: Beziehen Sie 12- bis 18 Monate alte Kinder ein, die während der gesamten Studiendauer im Untersuchungsgebiet blieben. Ausschlusskriterien: Ausschließen, wenn Kinder keine hochdosierte Vitamin-A-Supplementierung erhalten haben und in Gebieten lebten, die nicht mit Vitamin A angereicherten Lebensmitteln auf lokalen Märkten in Kontakt waren.

2. Bestimmung der Gesamtmenge des stabilen Isotopentracers für RID

  1. Bestimmen Sie, wie viel stabiler Isotop-Tracer jeder Versuchsperson erhalten sollte, wobei die isomerische Reinheit berücksichtigt wird. Es wird empfohlen, Vitamin-A-stabile Isotope mit >95 % All-Trans-Reinheit zu verwenden, da biologische Aktivität und metabolische Signalwege zwischen geometrischen Isomern signifikant abweichen. Berechnen Sie die Dosis basierend auf Retinoläquivalenten (RE). Ein Beispiel dafür, wie dies berechnet wird, findet sich in Tabelle 2.
  2. Multiplizieren Sie den Dosiswert mit der Gesamtzahl der Proben. Basisanzahl der Probanden bei Leistungsberechnungen für die erforderliche Stichprobengröße, aber erhöht basierend auf erwartetem Verlust (siehe Tabelle 2 zum Beispiel). Erhöhen Sie die Gesamtmenge des benötigten Tracers, indem Pipettverluste von bis zu 20 % berücksichtigt werden.
    HINWEIS: In der Regel muss die Isotoppräparation einen Überschuss enthalten, da es nicht möglich ist, das gesamte Material aus dem Fläschchen zu gewinnen. Verluste entstehen zusätzlich durch die Viskosität des Öls, das außen an der Pipettenspitze verbleibt. Um während der Verabreichung genaue Mengen der Dosis zu erhalten, muss überschüssiges Öl an der Außenseite der Pipettenspitze abgewischt werden. Bediener können Pipettverluste minimieren, wenn die Pipettspitze nicht zu tief ins Öl getaucht wird.

3. Bestimmung der Menge an Pflanzenöl, die zur Auflösung des stabilen Isotop-Tracers benötigt wird

  1. Entscheiden Sie, welches Pflanzenöl Sie verwenden und wie viel Dosierung pro Person ist (Tabelle 2). Bestimmen Sie die Menge des hinzugefügten Öls anhand des Verabreichungssystems, das bei der Dosierung der Probanden verwendet wird.
    HINWEIS: Wir verwenden Sonnenblumenöl aufgrund des hohen Vitamin-E-Gehalts, was die Stabilität der Vitamin-A-Zubereitung32,33 unterstützt. Andere Pflanzenöle wurden jedoch von anderen Gruppen verwendet, um lokale Ernährungsnormen zu erfüllen. Da das RID auf der genauen Abgabe stabiler, isotopenmarkierter Tracer basiert, wird empfohlen, für die Dosierung in Speiseöl eine Verdrängungspipette zu verwenden. Die meisten neueren Studien haben Mengen bis zu 250 μL verwendet, insbesondere wenn die DosisKindern 1,7,23 verabreicht wird.
  2. Berechnen Sie die Dosiskonzentration des stabilen Isotop-Tracers in [mg/mL] Pflanzenöl. Bestimmen Sie das Gesamtvolumen des benötigten Pflanzenöls. Berechnen Sie das Gewicht des benötigten Öls basierend auf dem berechneten Volumen und der relativen Dichte des Pflanzenöls (siehe Tabelle 2 für ein Beispiel).
    HINWEIS: Zur Genauigkeit wird empfohlen, das Öl für eine stabile Isotop-Tracer-Vorbereitung zu wiegen. Sobald das Gesamtvolumen des benötigten Öls berechnet wurde, kann der stabile, isotopenmarkierte Tracer bestellt werden. Es ist wichtig, den Isotopen-Tracer in einer Flasche mit ausreichendem Volumen zu verschiffen, die es dem Forschungsteam ermöglicht, das Pflanzenöl direkt in die Flasche mit dem isotop-gekennzeichneten Tracer zu wiegen.

4. Herstellung eines stabilen, isotop-markierten Tracers in speziellen Bereichen für die Lebensmittelzubereitung

  1. Öffnen Sie vorsichtig den Deckel der bernsteinfarbenen Flasche, die die vorgegebene Gesamtmenge des stabilen Isotop-Tracers enthält, und legen Sie sie auf eine Analysewaage, die dann auf null geteert wird.
  2. Fügen Sie das Öl tropfweise hinzu, bis das gewünschte Gewicht erreicht ist (mit einer Genauigkeit von ± 0,1 g) mit einer sterilen 10-ml-Spritze.
    HINWEIS: Da einige Retinylacetatkristalle im Verschluss der Bernsteinflasche eingeschlossen sein können, muss die Flasche sehr vorsichtig geöffnet werden. Nachdem das Pflanzenöl in die Bernsteinflasche gegeben wurde, wird der Deckel vorsichtig wieder auf die Flasche gesetzt, die dann von Hand geschüttelt wird, um eventuelle Retinylacetatkristalle, die im Deckel verbleiben, wieder aufzuhalten.
  3. Stellen Sie die Flasche in ein Schallwasserbad mit Ultraschallleistung: 14 W/L und Betriebsfrequenz: 44 kHz. Füllen Sie Wasser bis über den Ölstand der Flasche, aber unterhalb des Deckels, um zu verhindern, dass Wasser unbeabsichtigt in die Vorbereitung gelangt.
  4. Sonikieren Sie die Flasche 15 Minuten lang, bevor Sie sorgfältig von Hand mischen, gefolgt von weiteren 15 Minuten Sonicieren. Es muss darauf geachtet werden, dass die Temperatur des sonisierenden Wasserbades 50 °C nicht überschreitet.
    HINWEIS: Mit Sonnenblumenöl zur Zubereitung haben wir festgestellt, dass die Isomerisierung zu cis-Retinoiden nicht erfolgt, wenn die Dosis 30 Minuten bei 50 °C ausgesetzt ist (siehe Abbildung 2). Allerdings sollten Präparate vom HPLC analysiert werden, um das Ausmaß der thermischen Isomerisierung zu beurteilen.
  5. Stellen Sie die Flasche für 30 Minuten in ein erhitztes Wasserbad bei 50 °C, um die Mikrokristalle vollständig aufzulösen.
  6. Nehmen Sie eine 20-μL-Ölprobe, um unter einem Lichtmikroskop mit 200-facher Vergrößerung im Labor das Vorhandensein von Mikrokristallen zu überprüfen. Wenn Mikrokristalle vorhanden sind, wiederholen Sie das Sonikations- und Erhitzungsverfahren.
  7. Sobald die vollständige Auflösung erreicht ist, wird die gesamte Ölpräparation in 2 bis 4 ml sterile Bernsteinglasphiolen umgewandelt. Verwenden Sie für dieses Verfahren Verdrängungspipetten, um Kreuzkontamination zu vermeiden.
    HINWEIS: Das Volumen stabilen Isotop-Tracers, das den Glasamber-Fläschchen zugesetzt wird, kann durch die tägliche Rekrutierungsrate bestimmt werden, z. B. wenn täglich 5 Probanden rekrutiert werden und das Dosisvolumen 150 μL beträgt, muss das Fläschchen genug Volumen enthalten, um 5 Dosen plus Pipettverluste auszugleichen: 5 x 150 μL x 1,2 = 900 μL.
  8. Bestimmen Sie die stabile Isotopenkonzentration im dreifachen Exemplar. Reserven 200 μL reines Pflanzenöls (verwendet zur Herstellung eines spektrophotometrischen Rohlings) und 200 bis 350 μL der stabilen Isotop-Dosis in separaten 2-mL bernsteinfarbenen Fläschchen während der Herstellung des stabilen isotop-markierten Tracers.
    1. Wenn die Dosiskonzentration ≤ 0,5 mg RE beträgt, reservieren Sie 350 μL des stabilen Isotops in einem separaten 2-mL Bernsteinfläschchen. Für Dosierungskonzentrationen > 0,5 mg RE reservieren Sie 200 μL der stabilen Isotop-Dosis in einem separaten 2-ml-Bernsteinfläschchen.
  9. Bedecken Sie die Fläschchen mit einem Inertgas (Ar), um die Potenzialoxidation des isotopenmarkierten Tracers zu verzögern, schließen Sie sie fest und lagern Sie sie in einer Kryobox, die mit Isotopenkonzentration, Dosisvolumen (später bestimmt), Vorbereitungsdatum und Projektnamen gekennzeichnet ist. Bewahre die Kryobox bis zum Versand in einem -20 °C Gefrierschrank auf. Unter diesen Bedingungen ist die Tracer-Dosis mindestens 2 Jahre stabil.

5. Bestimmung der stabilen Isotopen-Tracerkonzentration im Labor

  1. Verdünnen Sie den stabilen Isotop-Tracer in drei Volumenkolben mit n-Hexan. Füllen Sie die Volumenkolben mit n-Hexan bis 1 cm unterhalb der Kalibrierungslinie, bevor Sie die Tracer-Dosis hinzufügen.
    1. Bestimmen Sie die Verdünnung des stabilen Isotop-Tracers durch die Konzentration der Tracer-Dosis. Wenn die Dosiskonzentration des stabilen Isotopen-Tracers ≤ 0,5 mg RE beträgt, verdünnen Sie 100 μL der stabilen Isotop-Dosis in einem 50 ml Volumenkolben mit n-Hexan. Wenn die Dosiskonzentration zwischen 0,5 - 2 mg RE liegt, dann 50 μL des stabilen Isotops in einem 50-mL Volumenkolben mit n-Hexan. Wenn die Dosiskonzentration >2 mg RE beträgt, dann gibt es 50 μL des stabilen Isotops in einem 100 ml Volumenkolben mit n-Hexan.
    2. Geben Sie 50 oder 100 μL Öl direkt in das Hexan, und die Kolbe wird mit einem Volumen von 50 oder 100 ml mit zusätzlichem Hexan mit einer Glas-Pasteur-Pipette hergestellt. Drehe den Kolben 10 Mal, um das Öl mit dem Hexan zu mischen.
      VORSICHT: Hexan sollte in einem Abgasschrank mit geeigneter PSA behandelt werden. Abfallhexan wird in einem speziellen Behälter für eine spezialisierte Entsorgung durch einen zugelassenen Auftragnehmer gesammelt.
  2. Bereiten Sie den spektrophotometrischen Blankkolben vor, indem Sie das gleiche Volumen Pflanzenöl wie den stabilen Isotop-Tracer (50 oder 100 μL) pipettieren und in Hexan dosieren. Stellen Sie sicher, dass die aufgetragene Verdünnung (50 oder 100 mL) der für den stabilen Isotoptracer entspricht. Drehe den Kolben 10 Mal, um das Öl mit dem Hexan zu mischen.
    HINWEIS: Für das Pipettieren eines stabilen Isotop-Tracers oder reines Öls wird eine 100 μL Verdrängungspipette verwendet. Um die genauen Volumina zu pipettieren, ist es entscheidend, die Spitze mit fusselfreiem Papier nach unten abzuwischen, um Spurspuren/Öl von außen zu entfernen. Beim Abwischen der direkten Ersatzpipettenspitze ist vorsichtig gewesen, damit das Papier nicht mit der Spitzenöffnung in Kontakt kommt, da Öl aus der Spitze gezogen wird.
  3. Missen Sie die stabilen Isotopen-Tracerkonzentrationen in einer Quarzkuvette mit einem Spektrophotometer auf eine Wellenlänge von 325 nm, wobei das Pflanzenöl in Hexan als spektrophotometrischer Rohling verwendet wird (siehe Tabelle 3 für ein Beispiel).
    1. Beginnen Sie mit den Messungen mit dem Pflanzenöl in Hexan als spektrophotometrischen Rohstoff. Reinigen Sie die Quarz-UV-Cuvette zwischen den Messungen, indem Sie sie dreimal mit N-Hexan abspülen. Nachdem alle Proben gemessen wurden, reinigen Sie die Cuvette sorgfältig mit reinem N-Hexan.
  4. Bestimmen Sie die Konzentration des stabilen Isotoptracers anhand der durchschnittlichen AU-Werte und wenden Sie den isotopenspezifischen molaren Extinktionskoeffizienten mit dem Beer-Lambert-Gesetz an. Daraus berechnet man das Volumen des pro Dosis benötigten vorbereiteten stabilen Isotop-Tracers (siehe Beispiel in den repräsentativen Ergebnissen unten und in Tabelle 3).

Ergebnisse

Berechnung der Gesamtdosisgröße des Isotop-Tracers
Für eine Studie mit einer Stichprobengröße von 100 Probanden wurde die Gesamtmenge an [13C10] Retinylacetat berechnet, um die Menge des [13C10] Retinylacetats zu bestimmen, die syntetisiert werden musste (Tabelle 2). Die Menge basiert auf Leistungsberechnungen für die erforderliche Stichprobengröße (n = 100), erwartete Verschleiß (n=15; 15 % Verschleiß), Pipettierverluste (20 %) und [13C10] Retinylacetatkonzentration pro Dosis (0,4 mg RE; basierend auf der Empfindlichkeit des angewandten Massenspektrometers, der Länge des Experiments und der Altersgruppe der Probanden). Die insgesamt benötigte Menge RE (55,2 mg RE) wird dann in das erforderliche Gewicht für [13C10]Retinylacetat (63 mg) umgerechnet.

Um das Volumen Sonnenblumenöls zu berechnen, das zur Auflösung von [13C10] Retinylacetat in der gewünschten Konzentration benötigt wird, setzen wir zunächst das Dosenabgabevolumen auf 150 μL/Dosis (0,15 mL/Dosis). Anschließend wird die Konzentration von [13C10]Retinylacetat in 1 ml Sonnenblumenöl berechnet (Tabelle 2). Teilt man das erforderliche Gewicht von [13C10]Retinylacetat (63 mg) durch die erforderliche Dosiskonzentration, erhält man das Gesamtvolumen des benötigten Sonnenblumenöls. Schließlich wird das Gewicht von Sonnenblumenöl durch die relative Dichte des Sonnenblumenöls bestimmt.

Die genaue Zieldosiskonzentration von [13C10]Retinylacetat in Öl wurde durch Messung der stabilen Isotopen-Tracerkonzentrationen mit einem Spektrophotometer nach dem Beer-Lambert-Gesetz (Tabelle 3) bestätigt. Unter Berücksichtigung der Verdünnung des stabilen Isotoptracers während der Messung (Verdünnungsfaktor von 500) ergibt eine Konzentration von 2,58 μmol/μL [13C10]retinylacetat im Öl. Das endgültige Volumen des hergestellten stabilen Isotop-Tracers, das für eine 0,4 mg RE-Dosis benötigt wurde, wurde daher auf 155 μL bestimmt (Tabelle 3).

Überprüfung der möglichen Isomerisierung der Tracer-Dosis
Die isomerische Reinheit der erhaltenen Tracer-Dosis wurde durch Überprüfung der cis-Isomerisierung mittels High Performance Liquid Chromatography (HPLC; Abbildung 2). Dazu wurde eine Probe aus der verdünnten Tracer-Lösung aus Schritt 5.1.2 unter Stickstoffgas getrocknet und der Rückstand zu 100 % Ethanol zur Injektion gelöst. Die HPLC-Analyse von 3 Wiederholungsproben wurde mit der Methode von Liu et al.34 durchgeführt, um auf eine cis-Isomerisierung zu prüfen (siehe Abbildung 2). Die Reinheit der Tracer-Dosis sollte während der gesamten Studie überwacht werden, um sicherzustellen, dass die Dosis nicht abbaut.

Einfluss der Konzentrationen der Tracer-Dosis auf den Anteil der Dosis im Zeitverlauf
Die Anwendung unterschiedlicher Dosierungsniveaus führt im Laufe der Zeit zu unterschiedlichen Anteilen der aufgenommenen Dosis, was die Fähigkeit der analytischen Plattform beeinträchtigen könnte, [13C10] Retinol bei allen Probanden zu den erforderlichen Zeitpunkten nachzuweisen. Die Anwendung einer Dosis von entweder 1 mg oder 0,4 mg [13C10] Retinylacetat in Öl bei Erwachsenen (Abbildung 3A) oder Kindern (Abbildung 3B) zeigte einen höheren Anteil der Dosis nach der Verabreichung von 1 mg im Vergleich zu 0,4 mg [13C10] Retinylacetat und bestätigte die Fähigkeit des aufgetragenen LC-MS/MS, [13C10] zu erkennen]Retinol bei Probanden bis zu 28 Tage nach der Dosierung. Dies bestätigt, dass die Informationen über den Dosenanteil zu unterschiedlichen Zeitpunkten entscheidend sind, um zu entscheiden, ob der angewandte Dosiswert hoch genug ist, um ein Signal über dem Detektionsniveau der angelegten Analyseplattform zu erhalten, und dass diese Information idealerweise während einer Pilotstudie mit repräsentativen Proben gewonnen werden sollte.

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Abbildung 1: Flussdiagramm zur Herstellung von Vitamin-A-Tracer-Dosierungen. Wichtige Schritte zur Vorbereitung der stabilen Isotopendosis umfassen die Bestimmung der erforderlichen Mengen, die Konzentration der gewonnenen Tracer-Dosis und die Bestätigung der Dosisreinheit. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 2: HPLC-Chromatogramm der Tracer-Dosis zur Untersuchung der Isomerisierung von Retinylacetat. Die potenzielle Isomerisierung von [13C10]Retinylacetat nach (A) Sonikation und (B) Erhitzen auf 50 °C für jeweils 30 Minuten wurde mittels HPLC-Analyse der Isotopendosis nach jedem Schritt bewertet. Die Analyse wurde an einem HPLC mit Diodenarray-Detektion nach der Methode von Liu et al.34 durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 3: Beobachtete Mittel des Plasma-Retinol-Fraktions der Dosis über die Zeit nach der Aufnahme von [13C10]Retinylacetat. Anteil der Dosis von (A) 45 Erwachsenen im Vereinigten Königreich(16 ) und (B) 112 philippinischen Kindern1 , die entweder eine Dosis von 1 mg bzw. 0,4 mg [13C10] Retinylacetat erhielten. Anteil der Dosis = {Plasma [13C]Retinolkonzentration (μmol/L) X geschätztes Plasmavolumen (L) / [13C]Dosis (μmol). Daten werden als geometrischer Mittelwert ± SEM angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Stabiles IsotopZulieferer/Hersteller
[D4]-RetinylacetatBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Cambridge Isotopenlabor
[D6]-RetinylacetatBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Cambridge Isotopenlabor
[D8]-RetinylacetatBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Cambridge Isotopenlabor
[13C3]-RetinylacetatBuchem BV/ReseaChem GmbH
[13C4]-RetinylacetatBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Cambridge Isotopenlabor
[13C8]-RetinylacetatBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Cambridge Isotopenlabor
[13C10]-RetinylacetatBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Cambridge Isotopenlabor

Tabelle 1: Handelsübliche stabile Vitamin-A-Isotopen-Tracer. Liste von 13C und 2H gekennzeichneten Retinylacetat-Tracern von verschiedenen Anbietern.

Parameter
Stichprobengröße [n]:100
Abnutzung [n] (%):15 (15%)
Pipettenverluste:20%
MW [13C10]Retinylacetat:338,5 μg/μmol
MW [13C10]Retinol:296,46 μg/μmol
Dosisgröße:0,4 mg RE [13C10] Retinylacetat pro Freiwilliger
Berechnung
Gesamtmenge an RE erforderlich:= Dosisgröße in mg RE x Stichprobengröße x Verschleiß x Pipettierverluste
= 0,4 mg RE x 100 x 1,15 x 1,2
= 55,2 mg RE
Gesamtmenge an [13C10] Retinylacetat erforderlich:= mg RE x MW [13C10]Retinylacetat / MW [13C10]Retinol
= 55,2 mg RE x 338,5 μg/μmol / 296,46 μg/μmol
= 63,0 mg [13C10]Retinylacetat
Dosiskonzentration von [13C10]Retinylacetat in Öl:[13C10]Retinylacetat [mg/ml] =
(mg RE x MW [13C10] Retinylacetat / MW [13C10] Retinol) / 0,15 ml
= (0,4 mg RE x 338,5 μg/μmol / 296,46 μg/μmol) / 0,15 ml
= 3,04 mg/ml
Gesamtvolumen des benötigten Sonnenblumenöls:= Gesamtgewicht / Dosierung vonRetinylacetat im Öl
= 63,0 mg / 3,04 mg/ml
= 20,7 ml Öl
Benötigtes Gewicht des Sonnenblumenöls:= Gesamtvolumen des Sonnenblumenöls x relative Dichte Sonnenblumenöl
= 20,7 ml x 0,92 g/ml
= 19,0 g Sonnenblumenöl

Tabelle 2: Beispiel für Berechnungen der stabilen Isotop-Tracer-Dosisgröße. Angabe von Parametern und Berechnungen zur Bestimmung der Spurstoffdosis und der Menge an Pflanzenöl.

Parameter
Molarer Extinktionskoeffizient (E1%1 cm) von [13C10] Retinylacetat im Hexan:52718 L mol-1 cm-1 x 1 cm
Verdünnungsfaktor:500 (100μL Ölvorbereitung in 50 ml Hexan)
Gemessene durchschnittliche Absorption:0.917
MW [13C10]Retinol:296,46 μg/μmol
Berechnung
Konzentration (mol/L) von [13C10] Retinylacetat im Hexan:Konzentration (mol/L) = Absorption / E1%1 cm x Länge der Cuvette (1 cm)
= 0,917 / 52718 L mol-1 cm-1 x 1 cm = 1,739 x 10-5 mol/L
Umwandlung der Konzentration in μmol/μL:Konzentration (mol/L) = Konzentration (μmol/μL)
1,739 x 10–5 mol/L entspricht 1,739 x 10–5 μmol/μL
Korrektur für Verdünnung:1,739 x 10–5 μmol/μL x 500 = 8,697 x 10–3 μmol/μL in Öl
Gewicht pro μL (μg/μL):= [13C10]Retinylacetat μmol/μL in Öl x MW [13C10]Retinol
= 8,697 x 10-3 μmol/μL x 296,45 μg/μmol = 2,58 μg/μL
Volumen pro Dosis:= Volumen (μL/ 400 μg Dosis) = 400μg / 2,58 μg/μL = 155 μL

Tabelle 3: Bestimmung der stabilen Isotop-Tracer-Dosiskonzentration. Erforderliche Parameter und Berechnungen zur Bestimmung der Nachweisstoff-Dosiskonzentrationen und erforderlicher Volumina für die orale Dosierung.

Diskussion

Stabile Isotopen-Tracer, die in Humanstudien verwendet werden, gelten allgemein als sicher, mit keinen gemeldeten negativen biologischen oder physiologischen Effekten bei den angewandtenKonzentrationen von 25,35. Da der stabile Isotop-Tracer jedoch oral verabreicht werden muss, ist es unerlässlich, dass die Dosierung der Lebensmittelsicherheit entspricht. Dies kann erreicht werden, indem man von Lieferanten und Herstellern von stabilem, isotop-gekennzeichnetem Vitamin A verlangt, Lebensmittelsicherheitstests an den gelieferten Isotopen 7,20,24 durchzuführen. Ebenso ist es unerlässlich, dass die Herstellung und Lagerung von Isotopen nur in bestimmten Bereichen für die Lebensmittelzubereitung erfolgt. Darüber hinaus muss alle zur Herstellung stabile Isotope verwendete Ausrüstung ausschließlich der Isotopenzubereitung gewidmet sein und in Bereichen für die Lebensmittelzubereitung aufbewahrt werden.

Mit Retinylacetat gekennzeichnete Isotope wurden zuvor mit Ethanol gelöst, dann unter Stickstoffgas getrocknet, bevor sie in Pflanzenöl36 gelöst wurden. Hier stellen wir eine Methode vor, die die Auflösung des isotopenmarkierten Tracers in Pflanzenöl ermöglicht, indem eine Kombination aus Sonikation und Wärme verwendet wird. Obwohl diese Methode in einem Lebensmittelpräparationsbereich leichter durchzuführen ist, muss beim Erhitzen des Tracers im Pflanzenöl vorsichtig gewesen sein. All-Trans-Retinol wird während der Wärmebehandlung zu 13-cis-Retinol isomerisiert, das bei höherenTemperaturen 37 beschleunigt. Die Isomerisierung von Retinol erhöht sich weiter durch Lichtexposition32. Darüber hinaus wird die Stabilität von Retinol durch die Lipidoxidationseigenschaft des Pflanzenöls32,38 beeinflusst. Da α-Tocopherol-Gehalt in Pflanzenöl einen positiven Einfluss auf die Vitamin-A-Retention32 hat und Sonnenblumenöl einen der höchsten Mengen an α-Tocopherol33 aufweist, entschieden wir uns, Sonnenblumenöl zur Herstellung der Tracer-Dosen zu verwenden. Die Entscheidung, bis zu 50 °C Hitze anzuwenden, um den Tracer aufzulösen, basierte auf der Anwendung von Wärme zur Auflösung von Retinolkristallen in kosmetischen Produkten ohne nennenswertenVerlust von 39. Obwohl wir unter dem beschriebenen Protokoll keine signifikante Degradierung von Retinylacetat festgestellt haben, ist es wichtig, die cis-Isomerisierung der Tracer-Dosis unmittelbar nach der Wärmebehandlung zu überprüfen (Abbildung 2). Wir empfehlen außerdem, dass die Stabilität der Tracer-Dosis während der gesamten Studie überwacht wird, um die angewandte Konzentration der Tracer-Dosis zu bestätigen.

Der Tracer muss in einer Konzentration hergestellt werden, die weit innerhalb der volumetrischen Grenzen des Verabreichungssystems liegt, das zur Verabreichung der erforderlichen Dosis verwendet wird. Da das RID auf die genaue Abgabe stabiler, isotopenmarkierter Tracer angewiesen ist, wird empfohlen, für die Dosisanwendung eine Verdrängungspipette zu verwenden. Obwohl Dosierungen von bis zu 1 ml in der Vergangenheit bei Erwachsenen16, 20 und 40 mg angewendet wurden, ist es einfacher, Volumina zwischen 100 und 250 μL zu verabreichen, da gezeigt wurde, dass diese Volumina von Säuglingen und Kindern gut vertragenwerden. Alternativ können Dosen auch in Form17 verabreicht werden, wobei es wichtig ist, Kapseln auszuwählen, die speziell darauf ausgelegt sind, Öllecks zu verhindern und die Akzeptanz innerhalb der Studienpopulation sicherzustellen. Schließlich hängen die angewandten Dosierungsniveaus von der Altersgruppe der Zielpopulationvon 29 Jahren, der Fähigkeit der angewandten analytischen Plattform, niedrige Werte3 zu erkennen, und den gesamten Körpervorräten der Zielpopulation ab, mit einem geringeren Plasmaanteil der Dosis bei höheren Gesamtkörperspeichern1.

Wie im obigen Beispiel gezeigt, liefert [13C10]-Retinylacetat bei einer Konzentration von 2,58 μg/μL in Sonnenblumenöl eine Dosis von 0,4 mg RE-Tracer in 155 μL Sonnenblumenöl, die mit einer 250 μL Verdrängungspipette genau abgegeben werden kann. Um Konzentrationen innerhalb der volumetrischen Grenzen des Abgabesystems zu erhalten, ist es entscheidend, dass das zur Löslichkeit des Tracers gewählte Pflanzenöl mit einer analytischen Waage (bis auf 0,1 g genau) genau in die Flasche mit dem stabilen Isotop-Tracer gewogen wird. Wenn beispielsweise insgesamt 63 mg [13C10] Retinylacetat bei einer Konzentration von 3,04 mg/mL in Sonnenblumenöl hergestellt werden sollen und das spezifische Gewicht von Sonnenblumenöl 0,92 g/mL bei 25 ◦C beträgt, dann müssen 19,0 g (20,7 mL x 0,92 g/mL) Öl in die Flasche mit dem Tracer gewogen werden. Obwohl die Endkonzentration des stabilen Isotopen-Tracers mittels eines Spektrophotometer-Messers bestätigt wird, garantiert eine genaue Abwägung des Isotop-Tracers und des aufgetragenen Öls, dass die ermittelten Konzentrationen nahe am gewählten Abgabevolumen für jede Dosis liegen.

Es ist ratsam, Ölpräparate entsprechend dem erwarteten täglichen Bedarf zu entfernen, um sicherzustellen, dass alle Dosen in einem Fläschchen innerhalb von 2 Wochen nach Öffnen verwendet werden. Es ist am besten, die Ölzubereitungen während der Nutzung auf Eispacks im Feld aufzubewahren und sie so schnell wie möglich nach Abschluss der Dosierung wieder einzufrieren. Obwohl die Ölpräparate nicht durch wiederholte Einfrier- und Auftauzyklen betroffen sind, müssen sie stets vor Licht geschützt und gefroren werden, wenn sie nicht verwendet werden.

Zusammenfassend beschreibt dieses Protokoll die präzise Vorbereitung und Qualitätskontrolle der Tracer-Dosen für die RID-Methode und gewährleistet eine genaue Dosierung, Stabilität und Sicherheit. Die Methode berechnet Tracer-Anforderungen, optimiert die Löslichkeit in Pflanzenöl und überprüft Reinheit und Konzentration mittels Spektrophotometrie und HPLC. Strenge Handhabungs- und Lagerrichtlinien garantieren eine zuverlässige Tracer-Integrität für genaue isotopenbasierte Bewertungen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu erklären.

Danksagungen

Unterstützung für diese Arbeit wurde von der Bill & Melinda Gates Foundation (Projektnummer: OPP1115464) und der Internationalen Atomenergie-Organisation (IAEA) in Wien (Projektnummer E4.30.30) bereitgestellt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2 ml bernsteinfarbene Glasphiolen zum Aliquotieren von DosenFisher11573690Je nach Stichprobengröße der Studie und der Anzahl der täglich dosierten Freiwilligen kann es effizienter sein, größere, z. B. 4 ml, bernsteinfarbene Fläschchen zu verwenden
100ml VolumenkolbenFisher11323644Pyrex-Borosilikatglas Klasse A zertifizierter Volumenkolben
50-ml-VolumetrikFisher11313644Pyrex-Borosilikatglas Klasse A zertifizierter Volumenkolben
Analytische Waage Fisher13592970
Kapillarkolben (Pipettenspitzen) CP100 10x96 TIPACKGilsonFD148314
Kapillarkolben CP1000ST 2x91GilsonF148180
Kapillarkolben CP250ST 6x96GilsonF148714
Papp-KryoboxStarlabA9623-8181
Hellma Cuvette UV-QuarzSLSCEL1600
Hexan 95 % n-Hexan für HPLC-zertifizierte HPLCFisherH/0406/17
Deckel für 2ml bernsteinfarbene GlasphiolenFisher11573542
Microman E M1000E Pipette (Verdrängung)GilsonFD10006
Microman E M100E Pipette (Verdrängung)GilsonFD10004
Microman E M250E Pipette (Verdrängung)GilsonFD10005
MikroskopNikonEclipse E400
Mikroskopglas-Objektträger  Sigma41122601
Sonikierendes WasserbadVWRUSC100T
SpektrophotometerThermo Fisher ScientificA51119600C
Stabiler isotop-markierter Retinylacetat-TracerBuchem BVN/AFür die RID-Methode kann eine Reihe stabiler Isotope verwendet werden. Eine Liste verschiedener kommerziell verfügbarer Isotope ist in Tabelle 1 aufgeführt. & nbsp;
Unbewegtes WasserbadSLSSLS1176
PflanzenölIn jedem SupermarktN/AEs ist wichtig, frisches Pflanzenöl mit ausreichender Haltbarkeit zur Herstellung von Isotopendosen zu verwenden.
Volac entsteckte Glas-Pasteur-Pipette 150 mmSLSPIP4150

Referenzen

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Stabile IsotopenmarkerIsotopenanreicherungTracer Pr parationspektrophotometrische Best tigungDeuterium MarkierungKohlenstoff 13 MarkierungAufl sung in Pflanzen l
Formulierung von Vitamin-A-Tracer-Dosen zur Verabreichung an menschliche Probanden mittels der Retinolisotop-Verdünnungstechnik
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