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Ein serologischer Multiplex-Assay zum Nachweis von Antikörperantworten auf Arboviren

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DOI:

10.3791/69259

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4. November 2025

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1Infectious Diseases Epidemiology and Analytics G5 Unit, Department of Global Health, Institut Pasteur, Université Paris-Cité, INSERM U1347, 2Laboratory for Urgent Response to Biological Threats (CIBU), Environment and Infectious Risks (ERI) Unit, Institut Pasteur, Université Paris Cité, 3Immunology of Infectious Diseases Unit, Institut Pasteur de Madagascar, 4MRC Centre for Infectious Disease Analysis and Modelling, School of Public Health, Imperial College London, 5Immunophysiopathology and Infectious Diseases Department, Institut Pasteur de Dakar, 6Pasteur Network, Institut Pasteur, 7Department of Immunology, Institut Pasteur

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Multiplex-Fluoreszenz-Immunoassays werden zu einer Referenz für serologische Tests. Ihre Anwendung ist jedoch durch die Komplexität und zeitaufwändigen Bead-Analyt-Kopplungsprozesse begrenzt. In diesem Bericht wird ein halbautomatisches, reproduzierbares Multiplex-Mikrosphären-Bead-Kopplungsprotokoll vorgestellt, das mit der Standardmethode vergleichbar ist und gleichzeitig die Zeit bis zum Ergebnis erheblich verkürzt.

Zusammenfassung

Von Arthropoden übertragene Viren (Arboviren) sind eine Gruppe von Krankheitserregern, die von Stechmücken übertragen werden und weltweit verbreitet sind. Seit dem Ausbruch des Zika-Virus (ZIKV) im Jahr 2016 in Nord- und Südamerika, der diese Infektionen ins öffentliche Bewusstsein rückte, stellen Arboviren nach wie vor eine erhebliche Belastung für die öffentliche Gesundheit dar. Ihr Auftreten in bisher nicht endemischen Regionen gibt Anlass zur Besorgnis über die öffentliche Gesundheit. Die Überwachung und Kontrolle arboviraler Infektionen ist eine aktuelle Priorität für die Weltgesundheitsorganisation (WHO), die im Jahr 2024 einen globalen Strategieplan zur Bekämpfung arboviraler Erkrankungen auf den Weg gebracht hat. Die Multiplex-Technologie® hat den Bereich der serologischen Überwachung revolutioniert, indem sie die gleichzeitige Messung mehrerer Antikörper bei minimalem Probenvolumen ermöglicht. Aufbauend auf der Expertise in der Entwicklung von serologischen Multiplex-Tests wurde ein bead-basierter Multiplex-Assay zum Nachweis von Antikörpern gegen Arbovirus-Antigene entwickelt. Der Assay umfasst mehrere Antigene, die spezifisch für gängige Arboviren sind, darunter Dengue-Viren (DENV), Gelbfieberviren (YFV), Zika- und Chikungunya-Viren (CHIKV). Eine halbautomatische Methode wurde verwendet, um Antigene kovalent an Mikrosphärenkügelchen zu binden. Dieses neue Protokoll ist hocheffektiv und ermöglicht die Kopplung von bis zu 96 Antigenen in einem einzigen Experiment bei gleichzeitiger Gewährleistung reproduzierbarer Ergebnisse. Die Daten zur Medianen Fluoreszenzintensität (MFI) wurden mit einem benutzerfreundlichen Fluoreszenzbildgebungssystem erfasst. Wenn er auf humane Serumproben aus endemischen Ländern angewendet wird, gehen wir davon aus, dass dieser Assay ein leistungsfähiges Instrument für die Seroüberwachung darstellen wird.

Einleitung

Arboviren sind zusammen für Tausende von Todesfällen pro Jahr verantwortlich. Diese Viren werden über infizierte Gliederfüßer, meist Stechmücken und Zecken, auf den Menschen übertragen. Der Schweregrad der arboviralen Infektionen ist vielfältig und reicht von einer asymptomatischen Infektion bis hin zu schweren Erkrankungen, die zum Tod führen können. Im Jahr 2024 verzeichnete die Weltgesundheitsorganisation (WHO) über 10.000 Todesfälle, die allein durch die vier Serotypen des Dengue-Virus (DENV) verursacht wurden1. Im selben Jahr infizierte das Virus über 14 Millionen Menschen, darunter 50.000 schwere Verläufe1. Während DENV das bekannteste Arbovirus ist, gehören zur Gruppe auch andere lebensbedrohliche Krankheitserreger, die für mehrere Ausbrüche weltweit verantwortlich waren. Eine kürzlich durchgeführte zusammenfassende Überprüfung der arboviralen Infektionen in Afrika ergab, dass diese Viren, darunter DENV, Gelbfiebervirus (YFV), Chikungunya-Virus (CHIKV), Krim-Kongo-Hämorrhagisches Fiebervirus (CCHFV), Rifttalfieber-Virus (RVFV), West-Nil-Virus (WNV) und Zika-Virus (ZIKV), im Jahr 2023 mindestens 29 Ausbrüche auf dem gesamten Kontinent verursachten2. Im Jahr 2022 hob ein vom WHO-Regionalbüro für Afrika veröffentlichter Bericht die derzeitigen Einschränkungen bei der Arbovirus-Überwachung in der gesamten Region hervor und betonte die dringende Notwendigkeit, Methoden zur Überwachung und Bekämpfung von Arboviren zu entwickeln3.

Die klinische Diagnose von arboviralen Infektionen ist aufgrund der Ähnlichkeiten in den Symptomen wie Fieber, Arthralgie und allgemeinem Unwohlsein, die bei anderen Krankheitserregern in endemischen Regionen üblich sind, schwierig4. Darüber hinaus ist aufgrund der Kozirkulation und potentiellen Koinfektion der Viren die Unterscheidung des ätiologischen Erregers schwierig5. Die Bestätigung im Labor ist für die Differentialdiagnose von entscheidender Bedeutung. Für den Nachweis von Arborviren in menschlichen Proben gibt es mehrere Methoden. Direkte Methoden, einschließlich molekulardiagnostischer Tests, Nachweis viraler Antigene und Virusisolierung, weisen das Vorhandensein des Erregers nach, während indirekte Methoden, wie z. B. die serologische Diagnose, die Immunantwort auf die Virusinfektion messen6.

Es wurde eine Vielzahl von Methoden zum Nachweis von Antikörperreaktionen auf Arboviren entwickelt. Dazu gehören Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISAs), Komplementfixierung, Hämagglutinationshemmung und Mikrosphären-Immunoassays 6,7. In diesem Bericht wird ein Multiplex-Fluoreszenz-Mikrosphären-basierter Immunoassay (FMIA) zum Nachweis von Antikörperantworten auf Arbovirus-Antigene vorgestellt. Mikrosphären-basierte Assays8 werden in der Serologie häufig eingesetzt und bieten mehrere Vorteile, vor allem die Möglichkeit, mehrere Analyten in einer einzigen Reaktion mit minimalem Probenvolumen nachzuweisen. Optisch kodierte Mikrosphären (magnetische Polystyrolkügelchen), die mit rekombinanten Antigenen von Interesse beschichtet sind, werden in einem indirekten serologischen Immunoassay verwendet. Die gekoppelten Kügelchen werden dann mit Proben inkubiert, und antigenspezifische Antikörper werden mit einem Anti-Human-IgG-Sekundärantikörper nachgewiesen, der an einen Phycoerythrin (PE)-Fluorophor-Reporter konjugiert ist. Für die Detektion der emittierten Fluoreszenz, die als MFI gemeldet wird, stehen mehrere Analysatoren zur Verfügung.

Das Prinzip des Assays wird in Angeloni et al.8 ausführlich beschrieben. Kurz gesagt, die interessierenden Antigene sind chemisch an farbcodierte Mikrosphären gebunden. Dazu werden die Kügelchen zunächst mit 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimid (EDC) und N-Hydroxysulfosuccinimid (Sulfo-NHS) behandelt, die die Carboxylgruppe auf der Oberfläche der Kügelchen aktivieren, wodurch eine aminreaktive Verbindung entsteht. Diese halbstabile Zwischenverbindung wird dann mit dem interessierenden Protein vermischt, wobei Amineinheiten des Proteins kovalent an die Kügelchen gebunden werden, wodurch stabile Mikrokügelchen erzeugt werden, die an der Oberfläche mit dem interessierenden Protein beschichtet sind. Die antigengebundenen Kügelchen werden mit Proben inkubiert, so dass Antikörper an spezifische Antigene binden können. Antigengebundene Antikörper werden mit Hilfe eines Antiimmunglobulin-Sekundärantikörpers nachgewiesen, der an einen Fluoreszenzfarbstoff konjugiert ist. Wir verwenden PE-markierte Sekundärantikörper. MFIs werden mit einem Licht-Imager gemessen (Details zum Gerät finden Sie in der Materialtabelle). Das Instrument verwendet zwei LED-Leuchten, eine rote LED und eine grüne LED, die separat die inneren Farbstoffe der Kügelchen und eine Reporterfluoreszenz auf der Oberfläche der Kügelchenanregen 9. Filter werden dann verwendet, um die Kügelchen anhand der Farbe zu klassifizieren und die von den Analyten emittierte Fluoreszenz zu quantifizieren.

Wir haben die Technologie bereits zum Nachweis von Antikörperreaktionen auf SARS-CoV-210 und durch Impfung vermeidbare Krankheiten11 eingesetzt und gezeigt, dass Multiplex-Assays ein unschätzbares Werkzeug für Seroprävalenz- und Überwachungsstudien darstellen. Das Ziel dieses Projekts ist es, die Verwendung der FMIA auf den Nachweis von Antikörperantworten auf mehrere Antigene von Arboviren auszuweiten, mit dem Ziel, den Assay auf Screening-Proben aus der afrikanischen Region anzuwenden.

Arbovirus-Multiplex-Assays mit Multiplex-Technologie wurden an anderer Stelle unter Verwendung verschiedener Antigenziele wie dem Nichtstrukturprotein 1 (NS1)12,13 oder der Hülldomäne III (EDIII)14 beschrieben. Es wird ein 50-Plex-Assay vorgestellt, der 26 Arbovirus-Antigene (einschließlich NS1, EDIII, viral-like particles (VLPs)) und mehrere andere Antigene zum Testen auf Krankheitserreger enthält, die in der Region mitzirkulieren. Der Assay wird eine Beurteilung der Übertragungsintensität für diese Erreger ermöglichen. Eine Zusammenfassung der rekombinanten Antigene, die für die Entwicklung des Assays verwendet wurden, ist in Tabelle 1 enthalten. Das in diesem Bericht vorgestellte Protokoll wurde in Ergänzung zu einer umfangreichen Methodenentwicklungsstudie entwickelt, die sich auf die Optimierung des Nachweises von Arboviren konzentrierte.

Üblicherweise erfolgt die Kopplung (oder Fixierung) von Antigenen an die Mikrosphärenkügelchen in Einzelröhrchen8 (manuelle Kopplung). Dieser Prozess ist zeitaufwändig, umständlich und anfällig für Reproduzierbarkeitsfehler. In diesem Artikel wird über ein Protokoll berichtet, das ein automatisiertes Instrument verwendet, um die aufeinanderfolgenden Schritte durchzuführen, die an der chemischen Bindung von Antigenen an die Beads beteiligt sind. In diesem Manuskript berichten wir über die Schritte, die zur Validierung des neuen Protokolls unternommen wurden. Die Validierung des neuen Protokolls erfolgte durch den Vergleich von IgG-Reaktionen, die mit einem 50-Plex-FMIA gemessen wurden, unter Verwendung von antigengekoppelten Kügelchen, die entweder mit der manuellen Methode oder dem automatisierten Protokoll hergestellt wurden. Eine weitere Validierung der Methode erfolgte durch die Analyse von humanen Serumproben aus afrikanischen und französischen Kohorten.

Das automatisierte Beads-Coupling-Protokoll ist schnell und ermöglicht die gleichzeitige Kopplung von bis zu 96 Analyten in einem einzigen Lauf. Noch wichtiger ist, dass die Ergebnisse mit denen vergleichbar sind, die mit dem etablierten manuellen Protokoll erzielt wurden, mit reduzierten Schwankungen von Charge zu Charge.

Protokoll

Für die Verwendung von Humanproben wurde eine entsprechende Ethikgenehmigung eingeholt. Bei den Proben handelte es sich um anonymisierte Residuen aus früheren Studien. Das Protokoll für die Verwendung von ORPAL-Proben aus dem "Standardpool" wurde von der Nationalen Ethikkommission von Suriname (CMWO (Commissie voor Mensgebonden Wetenschappelijk Onderzoek), Gutachtennummer VG 25-17) genehmigt. Die Verwendung von Proben aus Madagaskar wurde im Rahmen des PvSTATEM-Projekts von der Ethikkommission der London School of Hygiene & Tropical Medicine (28541) und dem Madagaskar Comité d'Éthique de la Recherche Biomédicale (135MSANP/SG/AMM/CERBM ) genehmigt, während die Verwendung senegalesischer Proben im Rahmen des laufenden Projekts Dielmo und Ndiop von der senegalesischen Nationalen Ethikkommission für Gesundheitsforschung (CNERS Sénégal) genehmigt wurde. Die Zulassung zur Messung von Antikörpern gegen NTDs in diesen Proben wurde vom CNERS Sénégal (N 00000007 MSAS/CNERS/Sec) erteilt. Nicht-endemische französische Proben wurden aus routinemäßigen medizinischen Tests in französischen Krankenhauslabors gewonnen und in Übereinstimmung mit den geltenden Vorschriften und Richtlinien der französischen Kommission für den Datenschutz (Commission Nationale de l'Informatique et des Libertés) verarbeitet. Humane Serumproben wurden von Probanden aus Regionen mit hoher Prävalenz von Arboviren und aus einer naiven französischen Bevölkerung gewonnen. Die Serumproben wurden vor der Verwendung durch Inkubation bei 56 °C für 30 Minuten heißinaktiviert. Wenn die Proben nicht inaktiviert sind, manipulieren Sie sie unter einer Sicherheitswerkbank. Die meisten rekombinanten Antigene wurden kommerziell hergestellt, mit Ausnahme der rekombinanten EDIII Proteine, die im eigenen Haus synthetisiert wurden. Für die Datenerfassung wurde ein bildgebendes Analysegerät9 verwendet. Die verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Bestimmen Sie die optimalen Antigenkonzentrationen für die Kopplung

HINWEIS: Um Photobleichung zu verhindern, minimieren Sie die Lichteinwirkung von Mikrosphärenkügelchen während des gesamten Verfahrens. Optimieren Sie vor der Bulk-Kopplung die Kupplungskonzentrationen für jedes Antigen mit einem manuellen Kopplungsprotokoll. Das Protokoll wurde von Angeloni et al.8 übernommen. Die Puffer und Lösungen sind in der ergänzenden Tabelle 1 aufgeführt.

  1. Wählen Sie die Wulstbereiche aus, die für die Kopplung verwendet werden sollen. 20 s lang gründlich vortexen. Beschallen Sie das Rohr mindestens 60 s lang.
  2. Übertragen Sie 200 μl (2,5 M Kügelchen) Kügelchen in ein 1,5 ml-Röhrchen.
  3. Waschen Sie die Kügelchen mit 200 μL 100 mM Monobasischem Natriumphosphat/0,125x Triton.
    1. Legen Sie das Rohr für 60 s auf einen magnetischen Rohrabscheider. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne die Perlen zu berühren.
    2. Monobasischen Natriumphosphatpuffer zugeben. 60 s auf dem Magnetgestell stehen lassen. Entfernen Sie den Überstand.
  4. Aktivieren Sie die Kügelchen mit einem Puffer, der 80 μl 100 mM monobasisches Natriumphosphat, 0,125x Triton, 10 μl Sulfo-NHS und 10 μl EDC enthält.
    1. Monobasisches Natriumphosphat -Sulfo-NHS-EDC in die Röhrchen geben. Im Dunkeln 20 min bei Raumtemperatur auf einer Walze inkubieren.
    2. Waschen Sie die Kügelchen in 250 μL PBS (1x) und 0,125x Triton. Wiederholen Sie das Waschen dreimal.
  5. Binden Sie die Antigene.
    1. Bereiten Sie die unterschiedlichen Konzentrationen (serielle Verdünnungen) von Antigenen in einem Gesamtvolumen von 1 ml, 1x PBS und 0,125x Triton vor. Testen Sie mindestens zwei Konzentrationen von Antigenen.
    2. Fügen Sie den aktivierten Kügelchen Antigenlösungen hinzu. Im Dunkeln 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C auf einer Walze inkubieren.
  6. Waschgekoppelte Kügelchen aus 500 μL PBS-TBN und 0,125x Triton. Wiederholen Sie den Waschgang dreimal.
  7. Resuspendieren Sie die gekoppelten Kügelchen in 1 ml PBS-TBN und 0,125x Triton.
    HINWEIS: Lagern Sie die gekoppelten Kügelchen vor Gebrauch mindestens 24 Stunden lang bei 4 °C. Gekoppelte Kügelchen zeigten eine Variabilität der MFIs, wenn sie unmittelbar nach der Kopplung getestet wurden, im Vergleich zu Tests nach 24 Stunden.
  8. Wählen Sie eine optimale Konzentration für die anschließende großflächige Kopplung. Verwenden Sie verschiedene gekoppelte Beads für den Immunoassay an einem Standardpool. Wählen Sie die niedrigste Konzentration aus, bei der eine lineare Standardkurve erhalten wurde.
    HINWEIS: Ein Beispiel für die Linearität der Antikörperreaktion auf einen Standardpool finden Sie im Abschnitt "Ergebnisse" in Abbildung 1.

2. Großflächige automatisierte Wulstkupplung

  1. Bereiten Sie Pro Magnetic COOH-Kügelchen vor.
    1. Erforderliche Kügelchen berechnen: Bei 500 Kügelchen/Probe reichen 2,5 Millionen Kügelchen für 5000 Proben aus.
    2. Bereiten Sie die Wulstbereiche vor, die wie zuvor beschrieben für die Kopplung verwendet werden sollen.
    3. Übertragen Sie das gewünschte Volumen an Kügelchen in die zugewiesenen Vertiefungen. Für 2,5 Millionen wurden 200 μl Kügelchen (die Standard-Luminex-Konzentration beträgt 1,25e7 Kügelchen/ml) verwendet.
  2. Bereiten Sie die Antigene vor. Dies ist ein entscheidender Schritt, um genaue Mengen an Antigenen zu gewährleisten.
    1. Berechnen Sie die Mengen des benötigten Antigens nach der Optimierung. Die für jedes Antigen verwendeten Konzentrationen sind in Tabelle 1 aufgeführt.
    2. Mischen Sie in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen gründlich ein ausreichendes Volumen an Antigenen von Interesse mit 1x PBS / 0,125x Triton zu insgesamt 1 ml.
  3. Bereiten Sie Platten mit Reagenzien vor. Bereiten Sie 96-Deep-Well-Platten wie folgt vor. Die Volumina gelten pro Bohrung und werden für eine Kopplung von 2,5 Millionen Perlen berechnet.
    1. Platte 1 (Spitzenkämme): Laden Sie Spitzenkämme.
    2. Platte 2 (Perlen): Fügen Sie 8 μl 0,125x Triton und 200 μl der interessierenden Kügelchenregionen hinzu.
    3. Platte 3 (Waschgang 1): Fügen Sie 200 μl 100 mM monobasisches Natriumphosphat / 0,125x Triton hinzu.
    4. Platte 4 (Aktivierung): Fügen Sie 80 μl 100 mM monobasisches Natriumphosphat / 0,125x Triton + 10 μl Sulfo-NHS + 10 μl EDC hinzu.
    5. Platte 5 (Wash2): Fügen Sie 250 μl 1x PBS /0,125x Triton hinzu.
    6. Platte 6 (Kopplung): Übertragen Sie 1 ml Antigenlösung in die zugewiesene Vertiefung.
    7. Platte 7 (Wash3): 500 μl PBS-TBN/0,125x Triton hinzufügen.
    8. Platte 8 (Endplatte, enthält gekoppelte Kügelchen): Fügen Sie 1 mL PBS-TBN + 0,125x Triton hinzu.
  4. Richten Sie die Ausführung des Kopplungszyklus im automatisierten Prozessor ein.
    1. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, um die Maschine einzuschalten und das Protokoll einzurichten. Die notwendige Software kann auf dem PC15 heruntergeladen werden. Laufspezifische Parameter sind in der ergänzenden Tabelle 2 aufgeführt.
    2. Laden Sie die Platten in den dafür vorgesehenen Schlitz an der Maschine. Wählen Sie das Protokoll aus. Starten Sie den Zyklus. Die geschätzte Zeit bis zum Abschluss des Programms beträgt 2:50 h.
  5. Ende des Zyklus
    1. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, um die Maschine auszuschalten. Entladen Sie die Platten wie angewiesen. Überprüfen Sie visuell, ob Platte 8 die Perlen (braunes Pellet) enthält. Zusätzlich wird ein Laufbericht aus den Instrumenten exportiert.
    2. Übertragen Sie gekoppelte Kügelchen von Platte 8 zur Lagerung auf einzelne 1,5-ml-Röhrchen. Lagern Sie gekoppelte Kügelchen bis zur Verwendung bei 4 °C.
  6. Zähle die Perlen.
    HINWEIS: Es wurde ein Zellzähler verwendet. Informationen zur manuellen Zählung mit einem Hämazytometer finden Sie im Luminex-KochbuchHandbuch 8.
    1. Gründlich wirbelgekoppelte Perlen. 10 μl in eine Zellzählkammer überführen. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, um die Bead-Anzahl pro ml abzulesen.
    2. Überprüfen Sie die Aggregation, indem Sie das Bild auf dem Zellzähler visualisieren. In der ergänzenden Abbildung 1 finden Sie ein repräsentatives Bild der nicht aggregierten Perlen.
    3. Wenn Zuschlagstoffe vorhanden sind, mindestens 5 Minuten lang gründlich vortexen und beschallen. Wiederholte Zählung
      HINWEIS: Nach der Zählung der Beads wurde die Kopplungseffizienz durch Durchführung eines Immunoassays von gekoppelten Beads an einem Standardpool bewertet, um die Linearität der Antikörperantwort zu beurteilen.

Tabelle 1: Panel der Antigene, die im 50-Plex enthalten sind. Der Assay umfasst mehrere Antigene zum Nachweis von arboviralen Infektionen und co-zirkulierenden Krankheitserregern. Es werden Mengen an Antigenen angegeben, die für die Kopplung von 1,25 Millionen Kügelchen verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

3. Multiplex-Immunoassay

HINWEIS: Detaillierte Schritte des Protokolls zur Messung des MFI sind im jeweiligen Handbuch9 enthalten. Um die Lichteinwirkung der Kügelchen und das Risiko des Photobleichens zu minimieren, werden alle Lösungen und Proben vorbereitet, bevor die Kügelchen aus dem Kühlschrank genommen werden.

  1. Richten Sie das Plattenlayout ein. Es wurden 96-Well-Platten verwendet, die serielle Verdünnungen eines Standardpools sowie einen Blindwert (nur Puffer) in der ersten Reihe enthielten.
  2. Proben und Standard in PBT-Puffer in einer separaten, nicht bindenden Platte verdünnen. Für die Proben wurde eine Verdünnung von 1:200 (Endkonzentration von 1:400) verwendet. Für die Standardkurve wurden eine 1:50-Verdünnung des Standard-Serumpools (was zu einer Endkonzentration von 1:100 führt) und zehn 2-fache Serienverdünnungen verwendet.
  3. Bestimmen Sie die Menge der gekoppelten Kügelchen, die in einem Gesamtvolumen von 50 μl/Vertiefung verwendet werden sollen. 500 Kügelchen jeder Perle pro Well wurden verwendet und mit PBT-Puffer an das Volumen angepasst.
  4. Die gekoppelten Kügelchen 30 s lang gründlich durchwirbeln. Mindestens 60 s lang beschallen.
  5. Berechnen Sie das Volumen jeder gekoppelten Kügelchen, die der Multiplex-Vormischung hinzugefügt werden soll, um sicherzustellen, dass für jeden Analyten die gleichen Kügelchen vorhanden sind. Das Volumen der Kügelchen wurde wie folgt berechnet: Volumen der Kügelchen pro Vertiefung = Anzahl der Kügelchen pro Vertiefung/Kügelchenanzahl.
    HINWEIS: Ein Beispiel für die Berechnung der für die Vormischung erforderlichen Kügelchen und Puffervolumina ist in der ergänzenden Tabelle 3 dargestellt.
  6. Übertragen Sie ausreichende Bead-Antigen-Volumina in ein Zentrifugenröhrchen.
  7. Passen Sie die Lautstärke mit PBT an.
  8. Mischen Sie die Vormischung gründlich.
  9. Verteilen Sie 50 μl der Vormischung auf die bildgebende Mikroplatte (z. B. ps, f-Bodenplatten).
  10. Geben Sie 50 μl der verdünnten Proben zu den Kügelchen.
  11. Auf einem Plattenschüttler 30 Minuten bei Raumtemperatur und 700 U/min mixen.
  12. Waschen Sie die Teller dreimal wie folgt (manuelle Wäsche).
    1. Legen Sie die Platte für 60 s bei Raumtemperatur auf ein Magnetgestell. Halten Sie die Platte fest auf dem Rost fest und entsorgen Sie den Überstand.
    2. Fügen Sie 100 μl PBT-Puffer hinzu. 60 s auf dem Magnetgestell stehen lassen. Wiederholen Sie die Wäschen
      HINWEIS: Alternativ kann eine Unterlegscheibe16 verwendet werden. Die Waschmaschine wurde wie folgt eingestellt: 1 Zyklus Einweichen, gefolgt von 3 Zyklen (Aspiration, Dispense und Soak) und einem abschließenden Aspiratzyklus.
  13. Der Überstand wird verworfen und 50 μl verdünnter Sekundärantikörper hinzugefügt.
    1. Befolgen Sie die Anweisungen des Lieferanten, um eine Stammlösung des Sekundärantikörpers herzustellen. Es wurde eine 1/120 Verdünnungslösung des Sekundärantikörpers verwendet. Die Volumina des Sekundärantikörpers wurden wie folgt berechnet: Volumen des Sekundärantikörpers = Gesamtvolumen/Verdünnungsfaktor.
    2. Mischen Sie den Sekundärantikörper mit einem ausreichenden Volumen PBT-Puffer. Gründlich mischen. Geben Sie 50 μl verdünnten Sekundärantikörper zu den gewaschenen Kügelchen.
  14. Auf einem Schüttler 15 Minuten bei Raumtemperatur und 700 U/min inkubieren.
  15. Führen Sie drei Wäschen wie zuvor beschrieben durch.
  16. Resuspendieren Sie die Kügelchen in 150 μl PBT-Puffer.
  17. Auf einem Schüttler 5 Minuten bei Raumtemperatur und 700 U/min inkubieren. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, um die Instrumente einzurichten9.
    HINWEIS: Es wurde die mit dem Imager-Instrument gelieferte xPONENT-Software17 verwendet. Die Einstellungen für den Fluoreszenzmesswert wurden wie folgt eingestellt: Das Sammelvolumen wurde auf 50 μl eingestellt, mit einem Mindestmaß von 50 Kügelchen, ohne XY-Heizung und der Analysetyp als keiner.

4. Datenanalyse

  1. Ausführen der Validierung
    1. Überprüfen Sie, ob die minimale Bead-Anzahl erreicht wurde. Empfohlen werden mindestens 35 Kügelchen pro Well, um einen statistisch validen MFI8 zu erhalten.
    2. Die MFI-Werte der Prüf- und Negativkontrollstichprobe sind minimal.
    3. Überprüfen Sie die MFI-Werte für Standards, indem Sie eine Standardkurve zeichnen. Diese sind höher als die Blindprobe und/oder Negativkontrollprobe.
  2. Analyse von Beispieldaten
    1. Exportieren Sie die Daten als CSV-Dateien und analysieren Sie sie extern mit der R-Software.

Ergebnisse

Um den Prozess zur Validierung des Protokolls zu veranschaulichen, haben wir drei Antigene ausgewählt, die drei Familien von Arboviren repräsentieren: Flaviviren (DENV1 NS1 Protein), Alphaviren (CHIKV VLP Protein) und Bunyaviren (RVFV NP). Die Antigene wurden an einem Standardpool aus einer präexponierten Population (ORPAL), französischen (nicht exponierten) Populationseren und zwei Kohorten aus Afrika (Senegal und Madagaskar) getestet.

Verdünnungslinearität der Antikörperantwort
Die Konzentration der Antigene, die für die Bead-Kopplung verwendet werden sollen, wurde unter Verwendung von seriellen Verdünnungen des ORPAL-Pools bestimmt. Die optimale Konzentration wurde als die niedrigste Konzentration gewählt, bei der eine lineare Standardkurve erhalten wurde (Daten nicht gezeigt). Abbildung 1 zeigt die Linearität ausgewählter Arbovirus-Antigene bei optimaler Konzentration für jedes Antigen. Zur Qualitätskontrolle der Kopplung wurde jede Charge der gekoppelten Kügelchen auf dem ORPAL-Standardpool unter Verwendung der vorgewählten Konzentration auf ihre Verdünnungslinearität getestet.

Vergleichbarkeit zum Standard-Assay mit manueller Kopplung
Um die Vergleichbarkeit von Daten, die mit dem neuen automatisierten Protokoll gewonnen wurden, mit der etablierten manuellen Kopplung zu bewerten, verglichen wir Standardkurven, die aus Ergebnissen der manuellen und automatisierten Kopplung generiert wurden. Abbildung 2 zeigt die parallele Linearität für beide Assays. Die MFI-Werte variieren je nach Antigen.

Chargenvariation der Wulstkupplung
Die Variation der Kupplungscharge, d. h. die Reproduzierbarkeit von Versuchen aus derselben Kupplungscharge beurteilt wurde, wurde anhand des Levey-Jennings-Diagramms18 bewertet. Die repräsentativen Antigene und BSA-gekoppelten Kontrollkügelchen wurden verwendet und am ORPAL-Standardpool getestet. Abbildung 3 zeigt MFIs von 19 verschiedenen Platten, die an unterschiedlichen Tagen für jedes Antigen getestet wurden. Die resultierenden MFIs liegen im Bereich des Mittelwerts ± 3 SD für die drei Antigene und die Kontrolle.

Auswirkungen des Multiplexings auf MFI
Um die Leistung des Assays weiter zu bewerten, wurde getestet, ob das Multiplexing mehrerer Antigene die gemessene Antikörperantwort beeinflusst. Das Ansprechen wurde mit einem einzelnen Antigen (oder Single-Plex-Bead) unter Verwendung des ORPAL-Standardpools verglichen. Abbildung 4 zeigt eine starke Korrelation (R = 0,99, p < 2,2e-16) zwischen Ergebnissen, die erzielt wurden, wenn MFIs an einzelnen Antigenen oder an einer Vormischung mit 50 Antigenen gemessen wurden.

Antikörperreaktionen aus humanen Serumproben in afrikanischen Populationen
Um die Anwendbarkeit des Assays auf Proben aus verschiedenen Kohorten zu bewerten, verglichen wir die Antikörperantworten in humanen Serumproben aus afrikanischen Populationen, die eine hohe Wahrscheinlichkeit einer Exposition gegenüber Arboviren haben, mit denen einer französischen Kohorte, die vermutlich eine geringere Exposition gegenüber diesen Viren aufweist. Insgesamt wurden 1.596 Proben für Madagaskar, 1.428 für Senegal und 84 Proben aus der französischen Kohorte getestet. Abbildung 5 zeigt Dichtediagramme für die verschiedenen Kohorten. Für die Senegal-Kohorte wird eine klare bimodale Verteilung der Daten für die Reaktionen auf CHIKV VLP beobachtet, was auf zwei unterschiedliche Reaktionen auf CHIKV in der Bevölkerung hindeutet. Ein subtiler bimodaler Schwanz wird auch für DENV1 NS1 und RVFV NP in der Senegal-Kohorte beobachtet, während es keinen Unterschied zwischen der französischen und der Madagaskar-Kohorte gibt.

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Abbildung 1: Linearität der Antikörperantwort getestet am ORPAL-Standardpool. Als Beispiel werden ausgewählte Arbovirus-Antigene gezeigt. Die medianen Fluoreszenzintensitäten (MFI) sind auf der y-Achse (logarithmisch skala) und die serielle Verdünnung des Standardpools auf der x-Achse dargestellt. Alle Antigene im Gremium wurden vor den Massentests an Proben im Standardpool vorgetestet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Parallele Linearität der Antikörperantwort durch Kopplungsmethoden. Logarithmus des MFI (y-Achse) repräsentativer Antigene (Facette), getestet an seriellen Verdünnungen des ORPAL-Standardpools (x-Achse). Die Farben stehen für unterschiedliche Kopplungsmethoden: Automatisierung (rot, grün, blau) und manuell (violett). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Variation von Platte zu Platte. Levey_Jennings Diagramme für BSA-gekoppelte Kügelchen (Kontrolle), DENV1 NS1, CHIKV VLP und RVFV sind für den ORPAL-Standardpool bei einer Konzentration von 1:400 dargestellt. Die Ergebnisse repräsentieren 19 Platten, die an verschiedenen Tagen gefahren wurden. MFIs werden auf der y-Achse dargestellt, die Anzahl der Tests auf der x-Achse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Korrelation der Antikörperantwort auf Mono- und Multiplex-Assays. Der Standardpool wurde auf eine Endkonzentration von 1:400 verdünnt und an einer Vormischung getestet, die die 50-Plex-Antigene parallel zu einzelnen antigenbeschichteten Kügelchen enthielt. Für die Analyse wurde die Pearson-Korrelation verwendet. Als Beispiel werden drei repräsentative Antigene gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: Anwendung des Assays auf die endemische und nicht-endemische Probenkohorte. Der Untersuchungsbericht wurde an Proben aus Madagaskar (grün), Senegal (blau) und Frankreich (rot) getestet. Die Proben wurden auf eine Endkonzentration von 1:400 verdünnt. Die X-Achse stellt die normalisierten MFIs (nMFI) dar, die als Verhältnis von Proben-MFI zu Standardpool-MFI bei gleicher Konzentration (1:400) berechnet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: Beispiel für ein repräsentatives Bild der Raupenaggregation. Feld (A) zeigt nicht aggregierte Sicken und Feld (B) zeigt Wulstaggregate. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 1: Tabelle der Puffer. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 2: Einstellungen für das KingFisher Apex-Beads-Kopplungsprotokoll. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 3: Beispiel für die Berechnung der Raupenvolumina für die Vormischung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Der Einsatz von FMIA hat die Landschaft der serologischen Tests verändert. Die Stärke der Assays liegt in der Fähigkeit, Antikörperreaktionen auf mehrere Antigene in einer Reaktion zu bewerten, wodurch die Zeit bis zum Vorliegen von Ergebnissen verkürzt und die Testkosten gesenkt werden. Dies ist besonders wichtig in der serologischen Überwachung. Der routinemäßige Einsatz von FMIA-Assays wird jedoch durch den arbeits- und zeitaufwändigen manuellen Bead-Kopplungsschritt behindert, bei dem einzelne Antigene pro Reaktion gehandhabt werden müssen. In diesem Bericht wird eine automatisierte Methode zur chemischen Kopplung von Antigenen an Kügelchen vorgestellt. Die Automatisierung ermöglicht die gleichzeitige Kopplung von bis zu 96 Antigenen in einem einzigen Lauf, wodurch der Zeitaufwand für die Antigenkopplung mit hohem Durchsatz erheblich reduziert wird.

Abbildung 1 zeigt, dass die Antigene erfolgreich an die Kügelchen gebunden wurden. Die Ergebnisse zeigen auch eine starke Parallelität zwischen dem neuen automatisierten Protokoll und dem etablierten manuellen Protokoll (Abbildung 2), was auf eine nicht minderwertige Genauigkeit beim Nachweis von IgG-Antworten auf die bewerteten Antigene hinweist. Die Ergebnisse der Chargenvariation von Platte zu Platte (Abbildung 3) und der Raupenkupplung (Abbildung 2) zeigen die Vergleichbarkeit der Daten bei Verwendung der automatisierten Methode zur Kopplung. Die hohe Korrelation zwischen Multiplex- und Singleplex-MFIs (Abbildung 4) zeigt, dass das Multiplexen einer hohen Anzahl von Antigenen die Antikörperantwort auf die in diesem Assay verwendeten individuellen Antigene nicht beeinflusst.

Zur Validierung des Assays wurden Proben sowohl aus endemischen als auch aus nicht-endemischen Kohorten getestet (Abbildung 5). Während Seroprävalenzstudien von Arboviren in Afrika noch rar gesät sind, deuten die verfügbaren Daten 19,20,21,22 auf ein differenziertes Bild mit unterschiedlichen IgG-Seroprävalenzen zwischen und innerhalb der einzelnen Länder hin. Bemerkenswert ist, dass die vorhandenen Daten auf eine höhere Prävalenz der drei Viren (Chikungunya, Dengue und Rift Valley) im Senegal im Vergleich zu Madagaskar hindeuten, zum Beispiel19. Diese Prävalenzen stimmen mit den Beobachtungen in diesem Bericht überein, die im Vergleich zu den anderen Kohorten eine klare, unterschiedliche Reaktion auf die verschiedenen Antigene im Senegal zeigten. Dies unterstützt die Fähigkeit des Assays, Antikörperprofile im Kontext einer relativ hohen Seroprävalenz zu unterscheiden. Die beobachteten Daten für die Madagaskar-Kohorte können durch die gemeldete geringe Prävalenz der Viren in der Probenentnahmestelle22 erklärt werden, während die Vergleichbarkeit der Daten mit der nicht-endemischen Kohorte teilweise durch die geringe Stichprobengröße der französischen Kohorte erklärt werden kann. Darüber hinaus könnte die berichtete Variabilität zwischen den Regionen die in den Datensätzen beobachteten Unterschiede erklären. Eine umfangreiche Studie zur Bewertung der IgG-Seroprävalenz ist notwendig; Die in diesem Bericht vorgestellten Daten zeigen jedoch, dass der entwickelte Assay spezifisch für den Nachweis von IgG-Antworten auf die bewerteten Arbovirus-Antigene ist, wobei Daten aus endemischen Regionen sowie nuancierte, unterschiedliche Reaktionen innerhalb derselben Population unterschieden werden.

Zu den wichtigsten technischen Herausforderungen gehörten die Erzielung homogener Antigenlösungen trotz ihrer Verwendung in sehr kleinen Mengen, die Sicherstellung der äquimolaren Darstellung von Bead-Regionen in der Premischung und die Minimierung der Bead-Aggregation. Um die Schwierigkeit zu überwinden, eine homogene Lösung in der 96-Well-Platte zu erhalten, wurde ein Schritt implementiert, bei dem alle antigenen Lösungen in einem 1,5-ml-Röhrchen gründlich vorgemischt wurden, bevor sie in die Platte verteilt wurden. Zusätzlich wurde ein Schritt hinzugefügt, um die gekoppelten Kügelchen zu zählen und die Volumina anzupassen, um sicherzustellen, dass die gleiche Anzahl von Perlenregionen zum Premix hinzugefügt wird. Ein Beschallungsschritt war ebenfalls enthalten, um das Mischen der Beads zu erleichtern und die Aggregation in der Vormischung zu minimieren.

In dieser begrenzten Studie wurden die Stabilität der gekoppelten Kügelchen und ihr Einfluss auf die Assay-Leistung nicht untersucht, da alle Proben innerhalb eines Monats nach der Kopplung der Beads getestet wurden. Diese Bewertung ging über den Rahmen dieses Berichts hinaus und wird in künftigen Studien bewertet werden. Trotz dieser Einschränkungen stellt dieser Bericht eine schnelle und zuverlässige Methode zum Nachweis von Antikörperreaktionen auf eine Vielzahl von Krankheitserregern, einschließlich Arboviren, dar. Die serologische Überwachung arboviraler Infektionen ist entscheidend für die Kontrolle der Krankheiten, und die Verfügbarkeit einer reproduzierbaren, schnellen Methode zum Nachweis von Antikörperreaktionen auf diese Viren stellt einen bedeutenden Fortschritt in den globalen Bemühungen dar, Heterogenitäten in der Übertragung zu bewerten und gezielte Interventionen zur Milderung der Belastung durch diese Infektionen zu entwickeln. Obwohl der Schwerpunkt dieses Berichts auf Arboviren liegt, ist dieses Protokoll auf eine breite Palette von Antigenen anwendbar und stellt einen bedeutenden Fortschritt auf diesem Gebiet dar.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.

Danksagungen

Die Autoren danken den Studienteilnehmern und den Gesundheitshelfern in den einzelnen Studienzentren herzlich. Wir danken auch allen Labor- und Außendienstmitarbeitern für ihren engagierten Einsatz bei der Probenentnahme, der Datenerfassung und den Laboranalysen. Diese Arbeit wurde durch den Zuschuss "Reconstructing the transmission intensity of arboviruses across Africa and the impact of interventions in a changing climate" (xSTAR) des Wellcome Trust [228185/Z/23/Z] unterstützt. Zum Zwecke des Open Access haben die Autoren eine CC BY-Lizenz für das öffentliche Urheberrecht auf jede vom Autor akzeptierte Manuskriptversion angewendet, die sich aus dieser Einreichung ergibt. Wir danken auch Rob Van Der Pluijm (Epidemiologie und Analytik von Infektionskrankheiten, Institut Pasteur, Paris) und Maylis Douine und Alice Sanna (Centre d'Investigation Clinique Antilles-Guyane, Centre Hospitalier de Cayenne, Cayenne).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,5 mL Mikrozentrifugenröhren -Allgemeine Labor-Konsumgüter
1000 mL Filtereinheiten 0,2 μmThermofischer Wissenschaftlich567-0020
25 mL Stauseen  Thermowissenschaftlich95128095
50 mLFalcon-Röhren-Allgemeine Labor-Konsumgüter
96 tiefe Brunnenplatten – KingFisher DWThermowissenschaftlich10373480
Automatischer Plattenscheibenwäscher (optional)TECANHydroFlex Plus Mikroplatten-Unterleger
B pertussis FHANatives Antigen BP-FHA-50
Gleichgewicht-Allgemeine Laborausrüstung
Bench Zentrifuge  - Allgemeine Laborausrüstung
BioPlex Pro Magnetic COOH Beads LuminexMC10xxx  (x=Perlenregion)
Rinderserum-Albumin, BSASigmaA7906
Branson Ultraschall Bransonic Ultraschallreiniger Modell B200Fisher Scientific15-337-22
BSASigma AldrichA7906
CCHF GPNatives AntigenREC31639-100
Zellzähler/HämatozomometerBiorad/MerckTC20 /Z359629
CHIKV E2Natives AntigenREC31617-100
CHIKV VLPNatives AntigenCHIKV-VLP-100
Klare, flachboden immun-nichtsterile 96-Well-PlattenThermowissenschaftlich3455
CMV-PartikelNatives AntigenCMV-HP-100
Zähl-Objektträger, Doppelkammer für Zellzähler & nbsp;BioradL003662 A
cp23Natives AntigenProduktionsprot
CT694Natives AntigenProduktionsprot
CtxB
DENV1 EDIII + SNAPEigenproduktionen-
DENV1 NS1Natives AntigenDENV1-NS1-100
DENV1 VLPNatives AntigenDENVX4-VLP-100
DENV2 EDIII + SNAPEigenproduktionen-
DENV2 NS1Natives AntigenDENV2-NS1-100
DENV2 VLPNatives AntigenDENVX4-VLP-100
DENV3 EDIII + SNAPEigenproduktionen-
DENV3 NS1Natives AntigenDENV3-NS1-100
DENV3 VLPNatives AntigenDENVX4-VLP-100
DENV4 EDIII + SNAPEigenproduktionen-
DENV4 NS1Natives AntigenDENV4-NS1-100
DENV4 VLPNatives AntigenDENVX4-VLP-100
Diphterie-ToxNatives Antigen DIP-TNL-100
EBV-GP125Natives AntigenREC31601-100
EDC Sigma03449
Ethanol zu 100 % -Allgemeines Labor 
Folien-Aluminium-Versiegelung, nicht steril -Allgemeines
Fluoreszenzbildgebungsinstrument – MAGPIX-SystemLuminex MAGPIX-XPON4.1-CEIVD
Handmagnet für Platten – Magnetischer 96-Well-SeparatorLuminexCN-0269-01
hev-ORF2Natives Antigen REC31653-100
Inaba OSPBoston_MGH -
Kingfisher DeepWell 96-Brunnen-SpitzenkammThermowissenschaftlich17170069
Leishmania K28ClinisciencesMBS3040095
Luminex MAGPIX KalibrierungskitLuminexMPX-CAL-K25
Luminex MAGPIX VerifizierungskitLuminexMPX-PVER-K25
MagnetröhrentrennerInvitrogenDynaMag
MAGPIX Drive Fluid PlusLuminex40-50030
MASERN NPNatives AntigenREC31796
Mikroplatten-Shaker Randox
MIKROPLATTEN, 96-BRUNNEN, PS, F-BODEN (SCHORNSTEIN)Greiner-Bio eins655096
MiliQ H20 -Allgemeines Labor 
Mehrkanal-Pipetten 10, 300SARTORIUS
NIENatives AntigenProduktionsprot
Ogawa OSPBoston_MGH -
ONNV E2ClinisciencesIT-022-006Ep
Partikules ProzessorinstrumentThermowissenschaftlichThermowissenschaftlicher KingFisher Flex
PBS 10x PH~7,0EUROMEDEXET330
PE-konjugierter antihumaner IgG Fc-SekundärantikörperJackson-Immunforschung709-116-098
PfAMA1Eigenproduktionen-
PfMSP1Natives AntigenREC32013-100
pgp3Natives AntigenProduktionsprot
Pipettenspitzen (Lieferant) 10 & Micro; L, 200 & Mikro; L, 1000 & Mikro; L -Allgemeine Labor-Konsumgüter
Pm MSP1ClinisciencesCUST-PRT-31102024-1B
Po MSP1ClinisciencesCUST-PRT-31102024-1A
PvMSP1Natives AntigenREC31724-100
R-Software R4.4.1--
RVFV NPNatives AntigenREC31640-100
Einkanal-Pipetten 10p, 20p, 200p, 1000pEppendorf
KNACKEigenproduktionen-
S-NHS Sigma56485
NatriumazidSigmaS2002
Natriumhypochloritlösung (Bleichmittel) -Allgemeines Haushaltsbleichmittel
Tetanus-ToxinNatives AntigenREC31801-100
Thermo Scientific BindIx Software Version 1.1ThermoFisher Scientific-
TRITONThermowissenschaftlichA16046
Röhrenroller IKARoller 6D -100219627
Tween-20SigmaP7949
USUV EDIII + SNAPEigenproduktionen-
USUV NS1Natives AntigenUSUV-NS1-100
Vortex  -Allgemeine Laborausrüstung
VSP3Natives AntigenProduktionsprot
VSP5Natives AntigenProduktionsprot
WNV EDIII + SNAPEigenproduktionen-
WNV NS1Natives AntigenWNV-NS1-100
xPONENT-SoftwareLuminex89-30000-00-759 Rev A Mai-19
YFV EDIII + SNAPEigenproduktionen-
YFV NS1Natives AntigenYFV-NS1-100
ZIKV EDIII + SNAPEigenproduktionen-
ZIKV NS1Natives AntigenZIKV-NS1-100
ZIKV VLPNatives AntigenZIKV-VLP-100

Referenzen

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Schlagwörter

Nachweis von Arbovirus Antik rpernBead basiertes MultiplexverfahrenFluoreszenzbildgebungAntigenkopplungmediane Fluoreszenzintensit tdurch M cken bertragene VirenHumanserumprobenMessung der Antik rperantwortSero berwachung

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