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Methodenartikel

Einzelzellige menschliche Darmorganoide für die Organoidforschung

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DOI:

10.3791/69265

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6. Februar 2026

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1Department of Anatomy, Graduate School of Medical Science, Brain Korea 21 Project, Yonsei University College of Medicine, 2Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, NYU Grossman School of Medicine, 3Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, 4Department of Pathobiology, University of Pennsylvania Perelman School of Veterinary Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein Protokoll zur Erzeugung von einzelligen, patientenabgeleiteten Darmorganoiden und bieten standardisierte Kulturen, die die Heterogenität verringern und die Reproduzierbarkeit für nachgelagerte Assays und Anwendungen in der Präzisionsmedizin verbessern.

Zusammenfassung

Jüngste Entwicklungen in der Organoid-Technologie haben die Erzeugung von patientenabgeleiteten Darmorganoiden (PDIOs) ermöglicht, die die strukturellen, funktionellen, genetischen und epigenetischen Merkmale ihres ursprünglichen Gewebes rekapitulieren. Konventionelle passage-abgeleitete Organoide führen jedoch zwangsläufig zu heterogenen Populationen in Größe und Anzahl, was selbst unter identischen Bedingungen zu inkonsistenten Ergebnissen führt. Um dem entgegenzuwirken, wurde ein standardisierter Ansatz eingeführt, der hier als "Single Cell-Seeded PDIOs" bezeichnet wird. Bei dieser Methode wurden ausgereifte PDIOs enzymatisch in Einzelzellen dissoziiert und mit einer definierten Anzahl in einzelne Brunnen einer 96-Well-Platte eingesät. Diese kontrollierte Aussaatung normalisierte Größe und Anzahl der PDIOs. Im Vergleich zu Passage-abgeleiteten Organoiden zeigten einzelzellige PDIOs eine geringere Variabilität zwischen Brunnen in der Anzahl der Organoide und intra-Well-Variabilität der Organoidgrößen, was die Bestimmung der Erzeugungseffizienz ermöglicht und die Reproduzierbarkeit von Viabilitätstests verbessert. Darüber hinaus ist diese Plattform mit Downstream-Analysen kompatibel, einschließlich transkriptomischer Analyse und Proteinexpressionsprofilierung. Insgesamt kann dieser Ansatz die experimentelle Konsistenz verbessern und eine praktische Grundlage für reproduzierbare PDIO-basierte Studien schaffen.

Einleitung

Der menschliche Darm ist ein hochkomplexes Ökosystem, das durch fein abgestimmte Interaktionen zwischen Darmmikrobiota, Darmepithel und Immunsystem definiertist. Diese Komponenten erhalten die intestinale Homöostase durch streng regulierte Signalnetzwerke. Zum Beispiel interagiert die Darmmikrobiota, bestehend aus über zehn Billionen mikrobieller Organismen, mit Immunzellen, um die Aktivität des Immunsystems zu modulieren und ein ausgewogenes Darmumfeldaufrechtzuerhalten. Das intestinale Epithel ist maßgeblich an der Vermittlung dieses Mikrobiota-Immunsystem-Kreuzgesprächs 3,4 beteiligt. Intestinale Stammzellen (ISCs), der Haupttreiber der epithelialen Erneuerung, regenerieren und differenzieren kontinuierlich zu spezialisierten Zelltypen, darunter sekretorische Zelllinien (Panath-Zellen, Becherzellen, enteroendokrine Zellen und Tuft-Zellen), absorbierende Enterozyten und Mikrofaltzellen 5,6. Zusammen bilden diese Zellen eine lebenswichtige physische Barriere und eine funktionelle Schnittstelle, die den Wirt vor entzündlichen Reizen schützt.

In den letzten Jahren haben sich PDIOs zu einer mächtigen Plattform in der translationalenForschung entwickelt. Diese dreidimensionalen (3D) Kulturen werden aus ISCs hergestellt, die aus Patientengeweben isoliert und in einer extrazellulären Matrix wie der extrazellulären Matrix (ECM) erhalten sind, zusammen mit definierten Wachstumsfaktoren, die die ISC-Nische 8,9 rekapitulieren. Bemerkenswert ist, dass PDIOs die genetischen und epigenetischen Eigenschaften des Spendergewebes behalten, was eine nachhaltige Expansion und reproduzierbare Experimente ermöglicht. Seit Sato et al. erstmals PDIOs aus dem leucinreichen, wiederholt enthaltenden G-Protein-gekoppelten Rezeptor 5+ (Lgr5⁺) ISCs10 entwickelten, haben nachfolgende Studien wesentliche Wachstumsfaktoren für die Erzeugung und Differenzierung von PDIOs identifiziert, was zu weit verbreiteten Verfahren in Laboren führte 11,12,13. Die experimentellen Umgebungen, die zur Behandlung von PDIOs mit Kandidaten verwendet werden, variieren jedoch erheblich zwischen den Studien und werden oft unzureichend beschrieben: 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, 27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44, 45,46,47. Darüber hinaus werden PDIOs typischerweise durch mechanische Störung durchführt, was zu einer Heterogenität in der Organoidgröße, Morphologie und räumlicher Anordnung führt. Diese Variabilität erschwert die genaue Bewertung der Medikamentenreaktion und der zugrundeliegenden molekularen Mechanismen. Um diese Einschränkung zu beheben, haben neuere Studien PDIOs entwickelt, die aus Einzelzellsuspension oder sortierten Einzelzellen 45,48,49,50,51,52,53,54 abgeleitet sind.

In diesem Artikel wird als eine der komplementären und praktischen Methoden "Single Cell-Seeded PDIOs" eingeführt, um standardisierte PDIOs aus einer Einzelzellsuspension unter Verwendung konventioneller ECM und Medien zu erzeugen und so präzise und reproduzierbare Assays zu ermöglichen. Kurz gesagt, einzelne Zellen, die aus den reifen PDIOs isoliert wurden, wurden bei definierten Zelldichten in ECM eingebettet, und die daraus resultierenden Kulturen wurden über zwei Wochen überwacht, während Anzahl, Größe und Morphologie quantifiziert wurden. Da jede ECM-Kuppel mit einem bekannten Zelleingang eingebettet ist, ist die Organoidzählung pro Bohrloch konsistent, sodass die Erzeugungseffizienz als Anzeige für die Regenerationskapazität in jederOrganoidlinie 49,54 berechnet werden kann. Obwohl die kuppelförmige Matrigel aufgrund des räumlichen Gradienten der Wnt3a-Konzentration aufgrund ihrer inhärenten Instabilität und begrenzten Diffusion55 eine Größendifferenz erzeugt, ist die Größenvariabilität zwischen Brunnen bei einzelzelligen PDIOs deutlich geringer als bei passage-abgeleiteten Organoiden 49,54. Dieser Ansatz hat jedoch weiterhin praktische Einschränkungen. Ohne fluoreszenzaktivierte Zellsortierung können einige Organoide aus Doublets oder Triplets erzeugt werden, was zu einer intrinsischen biologischen Heterogenität innerhalb von PDIOs führt. Außerdem muss die optimale Anzahl einzelner Zellen empirisch für jede Organoidlinie bestimmt werden, da die Erzeugungseffizienz unterschiedlich ist. Schließlich wurden vollständig differenzierte, einzelzellige PDIOs nachgelagerten Analysen unterzogen, darunter quantitative Reverse Transcription PCR (qRT-PCR), Western Blot und Immunhistochemie.

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Protokoll

Alle für das Experiment benötigten Materialien und Reagenzien sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Herstellung von Reagenzien und Materialien

  1. Erwärmen Sie die Kulturplatte der Organoide in einem 37 °C Inkubator für mehr als 90 Minuten vor.
    HINWEIS: Das Vorerwärmen der Kulturplatte hilft, das ECM zu verfestigen und die Form der Kuppel zu erhalten. 90 Minuten sind die Mindestzeit für die ECM-Polymerisation. Es wird dringend empfohlen, den Teller länger als 12 Stunden vorzuwärmen.
  2. Verwenden Sie ein organoides Wachstumsmedium (EXP), ergänzt mit 0,5 % Penicillin-Streptomycin (PS) als Organoidkulturmedium.
  3. Zur Differenzierung einzelzelliger PDIOs verwenden Sie ein Differenzierungsmedium (DIF), das aus einem Basalmedium besteht, das mit Wachstumsfaktoren ergänzt wird (Tabelle 1). Das Basalmedium besteht aus fortgeschrittenem DMEM/F12, ergänzt mit 0,5 % PS, 0,25 % Gentamicinsulfat und 1 % Glutamin, zusammen mit folgenden Wachstumsfaktoren: Noggin (100 ng/mL), R-Spondin-1 (1 μg/mL), Wnt3a (100 ng/mL), epidermaler Wachstumsfaktor (EGF; 50 ng/mL), N-Acetyl-L-Cystein (1 mM), [Leu15]-Gastrin I human (10 nM), A 83-01 (500 nM), Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor 1 (IGF-I; 200 ng/mL), Fibroblast-Wachstumsfaktor (FGF; 100 ng/mL) und B-27-Supplement (1x) (Tabelle 1).
    HINWEIS: PS und Gentamicin sind biologisch gefährlich und sollten mit Handschuhen und Augenschutz behandelt werden.
  4. Frisch die Zellrückgewinnungslösung (CRS), Waschpuffer (DMEM hoher Glukosespiegel mit 1 % BSA), 1 mM Y-27632, EXP und DIF vorbereiten und bis zur Anwendung auf Eis lassen.
    HINWEIS: Lassen Sie EXP und DIF mindestens 20 Minuten auf Raumtemperatur ausgleichen, bevor Sie die vorgewärmten Kulturplatten hinzufügen.
  5. Taue das ECM auf Eis auf und stelle sicher, dass es immer kalt bleibt.
    HINWEIS: ECM erfordert Auftauen auf Eis und sollte immer kalt aufbewahrt werden, um eine vorzeitige Polymerisation zu verhindern.
  6. Das enzymatische Dissoziationsreagenz auf Raumtemperatur ausgleichen. Erwärmen Sie das Reagenz vor der Anwendung in einem 37 °C Wasserbad.
    HINWEIS: Das enzymatische Dissoziationsreagenz ist ein Reizstoff und sollte mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung behandelt werden.

2. Auftauen und Bergung kryokonservierter PDIOs

  1. Holen Sie das Kryovialrohr mit den Organoiden aus dem flüssigen Stickstofftank. Lockere den Schlauchdeckel leicht und taue ihn in einem 37 °C Wasserbad für 60–90 Sekunden auf.
    HINWEIS: Umsetzen Sie das Rohr sofort nach dem Auftauen auf Eis.
  2. Vorbefeuchten Sie eine breite Pipettenspitze mit Waschpuffer vorab und übertragen Sie die Organoide aus dem Kryovialrohr in ein 50-ml-Rohr.
  3. Spülen Sie das Cryovial mit 1 ml Waschpuffer ab und übertragen Sie den restlichen Inhalt in das 50-mL-Rohr. Wiederhole diesen Spülschritt zweimal.
  4. Zentrifugiere mit 290 × g für 7 Minuten bei 4 °C. Stellen Sie sicher, dass sich am Boden des Rohrs eine sichtbare Kugel bildet.
  5. Aspiriere das Supernatant.
  6. In ECM mit einer breiten, vorbenetzten Pipettenspitze resuspendieren.
  7. Punkte ECM auf eine vorgewärmte 24-Wellen-Platte und inkubieren Sie bei 37 °C für 10 Minuten.
    HINWEIS: Verwenden Sie 30 μL ECM pro Bohrloch.
  8. Fügen Sie EXP hinzu und umgeben Sie die Bohrlöcher mit sterilem 1x phosphatgepuffertem Kochsalzlösungslösungszustand (PBS) oder destilliertem Wasser.
    HINWEIS: Verwenden Sie 500 μL EXP pro Brunnen. Die Kultur in EXP wurde in den ersten 3 Tagen mit 10 μM Y-27632 ergänzt, dann wechselte sie zu EXP ohne Y-27632.

3. Weitergabe von PDIOs

  1. Aspiriere die verbrauchte EXP.
  2. Vorbefeuchten Sie eine Breitrohr-Pipettenspitze mit Waschpuffer, geben Sie 1 ml Zelldissoziationsreagenz zur Ablösung des ECM und übertragen Sie den Inhalt in ein 15-ml-Rohr.
  3. Inkubiere das Rohr 10 Minuten lang auf einer Wippe bei Zimmertemperatur.
  4. Zentrifugiere bei 300 × g für 7 Minuten bei 4 °C.
  5. Kippen Sie das Supernatant ab und geben Sie 1 ml Waschpuffer dazu. 20 Mal wieder suspendieren.
  6. Fügen Sie weitere 1 ml Waschpuffer hinzu, ziehen Sie 20 Mal wieder auf und geben Sie es in ein 50-ml-Rohr.
  7. Zentrifugiere bei 300 × g für 7 Minuten bei 4 °C.
  8. Aspiriere das Supernatant.
  9. In ECM mit einer breiten, vorbenetzten Pipettenspitze resuspendieren.
  10. Punkte ECM auf eine vorgewärmte 24-Wellen-Platte und inkubieren Sie bei 37 °C für 10 Minuten.
    HINWEIS: Verwenden Sie 30 μL ECM pro Bohrloch.
  11. Fügen Sie EXP hinzu und umgeben Sie die Brunnen mit sterilem 1x PBS oder destilliertem Wasser.
    HINWEIS: Verwenden Sie 500 μL EXP pro Brunnen. Die Kultur in EXP wurde in den ersten 3 Tagen mit 10 μM Y-27632 ergänzt, dann wechselte sie zu EXP ohne Y-27632.

4. Einzellige PDIO-Kultur

  1. Aspiriere die verbrauchte EXP.
    HINWEIS: Abfallstoffe mit Antibiotika (z. B. verbrauchtes Medium mit PS oder Gentamicin) sollten vor der Entsorgung autoklaviert werden.
  2. Waschen Sie mit 1 ml sterilem 1x PBS.
  3. Vorbefeuchten Sie eine breite Pipettenspitze mit Waschpuffer, fügen Sie 300 μL CRS hinzu, um ECM abzutrennen, und übertragen Sie den Inhalt in ein 50-mL-Rohr.
  4. Zentrifugiere mit 300 × g für 5 Minuten bei 4 °C (Abbildung 1A).
  5. Saugen Sie das Überlagermittel ab, fügen Sie 3 ml Waschpuffer hinzu und suspendieren Sie 20 Mal nach.
    HINWEIS: Dieser Schritt stört die Organoide mechanisch.
  6. Zentrifugiere bei 300 × g für 5 Minuten bei 4 °C (Abbildung 1B).
  7. Aspirieren Sie das Supernatant und fügen Sie 5 ml vorgewärmtes enzymatisches Dissoziationsreagenz mit 10 μM Y-27632 hinzu. Wirbel 2-3 Mal und brüte 20 Minuten in einem 37 °C Wasserbad, wobei du den Schlauch alle 5 Minuten schüttelst.
    HINWEIS: Trümmeraggregate erscheinen typischerweise innerhalb von 10 Minuten nach der Brutzeit. Begrenzen Sie die Gesamtbehandlung des enzymatischen Dissoziationsreagens auf unter 20 Minuten. Überschreiten Sie nicht 25 Minuten, da eine Überverdauung den Ertrag und die Lebensfähigkeit einzelner Zellen erheblich beeinträchtigt.
  8. Gib 10 ml DMEM mit hohem Glukoseniveau dazu.
  9. Zentrifugiere bei 300 × g für 5 Minuten bei 4 °C (Abbildung 1C).
  10. Aspirieren Sie das Überdachungsmittel und fügen Sie 1 ml Waschpuffer hinzu. 20 Mal wieder suspendieren.
    HINWEIS: Abfall, der enzymatische Dissoziationsreagenz enthält, sollte gemäß den institutionellen Biosicherheitsrichtlinien einzeln gesammelt und mit 0,5–1 % Bleichmittel mindestens 30 Minuten vor der Entsorgung inaktiviert werden.
  11. Filtern Sie durch ein 40-μm-Zellsieb in ein neues 50-mL-Rohr (Abbildung 1D).
    HINWEIS: Dieser Schritt ist entscheidend für die Isolierung einzelner Zellen aus den reifen Organoiden. Ein 40-μm-Zellsieb sollte verwendet werden, um einzelne Zellen zu isolieren.
  12. Zähle die Zellen mit Trypan-Blau. Übertragen Sie das berechnete Volumen auf eine 1,5-mL-Röhre.
    HINWEIS: Platte 3.000–4.000 Zellen pro Bohrloch in einer vorgewärmten Platte mit 96 Wellen.
  13. Zentrifugiere bei 300 × g für 5 Minuten bei 4 °C (Abbildung 1E).
  14. Entfernen Sie das Überlagermittel mit einer Pipette.
  15. Die Zellen werden in ECM (100–500 Zellen/μL) mit einer breit durchbohrten, vorbenetzten Pipettenspitze wieder suspendiert.
  16. Punkte ECM in eine vorgewärmte 96-Well-Platte und inkubieren Sie bei 37 °C für 10 Minuten.
    HINWEIS: Verwenden Sie 10 μL ECM pro Bohrloch.
  17. Füge DIF in die Brunnen hinzu. Umgeben Sie die Brunnen mit sterilem 1x PBS oder destilliertem Wasser.
    HINWEIS: Verwenden Sie 150 μL DIF pro Bohrloch. Die Kultur in DIF wurde 3 Tage lang mit 10 μM Y-27632 ergänzt, dann wechselte sie zu DIF ohne Y-27632. Wechsle das Medium alle 3 Tage und halte es insgesamt 10 Tage lang aufrecht.

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Ergebnisse

Zur Erzeugung einzelzelliger PDIOs wurden während der Überwachungskoloskopie mit 2,8 mm Standardbiopsien von gesunden Probanden von einwilligenden Probanden entnommen, während der Überwachungskoloskopie mit 2,8 mm Standardbiopsiepinzetten im Rahmen des Institutional Review Board der NYU Grossman School of Medicine (Mucosal Immune Profiling in Patients with Inflammatory Bowel Disease; S12-01137). Anschließend wurden einzelzellige PDIOs erzeugt, indem 6.000 Zellen, die aus reifen PDIOs iso...

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Diskussion

PDIOs bieten enormes Potenzial für präzise Krankheitsmodellierung, Medikamentenscreening und regenerative Medizin, da sie die genetische und epigenetische Landschaft einzelner Patienten getreu bewahren. Ihre praktische Anwendung wird jedoch oft durch Schwierigkeiten bei der Standardisierung der Organoid-Erzeugung und -Charakterisierung behindert. Um diese Herausforderungen zu meistern, wurde in aktuellen Studien ein Ansatz mit PDIOs eingeführt, die aus Einzelzellsuspension oder Einzelzel...

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Offenlegungen

Jordan E. Axelrad hat Forschungsstipendien von BioFire Diagnostics, Genentech, Janssen und Takeda erhalten; Beratungsgebühren, Honorare oder Beiratsgebühren von AbbVie, Abivax, Adiso, Biomerieux, Bristol-Myers Squibb, Celltrion, Ferring, Fresenius, Janssen, Merck, Pfizer, Sanofi, Takeda und Vedanta. K.C. ist Erfinder des US-Patents 10.722.600 sowie der vorläufigen Patente 62/935.035 und 63/157.225.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde teilweise durch einen Zuschuss der National Research Foundation of Korea (NRF) unterstützt, der von der koreanischen Regierung (MSIT) gefördert wurde (RS-2025-00557588, RS-2024-00411768, RS-2025-18362970 und RS-2025-02214844, Kyung Ku Jang); ein Zuschuss des Korea Health Technology R&D Project durch das Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), finanziert vom Ministerium für Gesundheit und Wohlfahrt der Republik Korea (RS-2024-00406488, Kyung Ku Jang); National Institutes of Health (NIH) Fördermittel DK093668 (Ken Cadwell); K23DK124570 (Jordan E. Axelrad); Crohn's & Colitis Stiftung (Jordan E. Axelrad). Die Geldgeber hatten keine Rolle bei der Studienplanung, Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Erstellung des Manuskripts.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
[Leu15]-Gastrin Ich MenschSigma-AldrichG91450-0,1 mg
15 mL konische RöhreSPL50015
20x PBS, pH 7,4BiosesangP2007-7.4
50 mL konische RöhreSPL50050
A 83-01Tocris2939-10 mg
Fortgeschrittene DMEM/F-12Gibco12634010
Axygen 1000 & Mikro; L-Pipetspitzen, Breitrohr, klar, nicht sterilAxygenT-1005-WB-C
Axygen 200 & Mikro; L-Pipetspitzen, Breitrohr, klar, nicht sterilAxygenT-205-WB-C
B-27-Supplement (50X) serumfreiGibco17504044
RinderserumalbuminRoche10735078001
Corning von 96-Well-klaren Polystyrol-MikroplattenCorning3599
Corning-Zell-RückgewinnungslösungCorning354253
Corning ECM-Matrix (Corning Matrigel) Corning356231
Costar 24-Well-klare TC-behandelte MehrfachbohrlochplattenCorning3526
DMEM hoher Glukose mit stabilem Glutamin und NatriumpyruvatBiowestL0103-500
GentamicinGibco15750060
Sanftes ZelldissoziationsreagenzStemcell100-0485
Humanes FGF-basisches (FGF-2/bFGF) (154 aa) rekombinantes ProteinGibco100-18B-100UG
Humanes IGF-I, tierfreies rekombinantes ProteinGibcoAF-100-11-500UG
Humanes Noggin-ProteinAkrobiosystemNICHT-H5219-1mg
Humanes R-Spondin 1 / RSPO1 (21-146) ProteinAkrobiosystemRS6-H4220-1 mg
IntestiCult Organoid Wachstumsmedium (Mensch)Stemcell6010
L-Glutamin 100XBiowestX0550-100
Maus-EGF-rekombinantes ProteinGibco315-09-100UG
N-Acetyl-L-CysteinSigma-AldrichA9165-5 g
Penicillin-Streptomycin-Lösung 100XBiowestl0022-100
Rekombinanter menschlicher Wnt3a-SurrogatAkrobiosystemWNE-W5253-50ug
TrypLE (enzymatische Dissoziationsreagenz) exprimiert Enzyme (1X), kein rotes Phenol;Gibco12604013
Y-27632 DihydrochloridTocris1254-10MG

Referenzen

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