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Methodenartikel

Beurteilung der mitochondrialen Spaltungs-/Fusionsdynamik in proximalen tubulären Zellen der Niere

1.1K Ansichten

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DOI:

10.3791/69268

⸱

14. November 2025

 ,  ,  ,  , 
1Lewis Katz Medical School at Temple University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt die Verwendung von konfokaler Mikroskopie und ImageJ zur Beurteilung der mitochondrialen Spaltungs-/Fusionsdynamik mittels Dendra2-Photoswitching-Fluoreszenz.

Zusammenfassung

Mitochondrien sind vor allem für ihre Rolle bei der ATP-Synthese bekannt und dienen als wichtige Regulatoren des Zellstoffwechsels. Die mitochondriale Dynamik umfasst die intrazelluläre und interzelluläre Bewegung der Mitochondrien sowie die Prozesse der Spaltung/Fusion. Diese Ereignisse sind von grundlegender Bedeutung für die Aufrechterhaltung der mitochondrialen Funktion, indem sie die zelluläre Homöostase, Morphologie, Bioenergetik, Qualitätskontrolle und Stressreaktionen aufrechterhalten. Auf der anderen Seite wirkt sich eine Dysregulation der mitochondrialen Dynamik auf die zelluläre Morphologie und Funktion aus. Eine präzise Messung von Spaltungs-/Fusionsereignissen in Mitochondrien kann ein Hinweis auf die Zellgesundheit sein. Aktuelle Methoden zur Messung der Mitochondriendynamik verwenden fortschrittliche Bildgebung wie hochauflösende Mikroskopie, Fluoreszenztechniken (Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP)) für die Konnektivität und optogenetische Werkzeuge für die raumzeitliche Kontrolle. Bei der quantitativen Analyse werden Berechnungswerkzeuge verwendet, um Parameter wie Länge, Anzahl und Verzweigung zu messen, die das Gleichgewicht zwischen Spaltung und Fusion anzeigen. Diese Methoden erfordern jedoch Fähigkeiten und ausgefeilte Instrumente. In diesem Artikel beschreiben wir die Verwendung der konfokalen Mikroskopie in Kombination mit frei verwendbaren Werkzeugen in ImageJ (Fidschi) zur Untersuchung von Spaltungs-/Fusionsereignissen unter Verwendung der Photo-Switching-Eigenschaft des Dendra2-Proteins, das an mitochondriales Cytochrom c gebunden ist.

Einleitung

Mitochondrien sind ein dynamisches Organell, das eine wichtige Rolle bei der Energieproduktion, dem Zelltod und der Signaltransduktion spielt1. Die mitochondriale Morphologie bezieht sich auf die Größe und Form der mitochondrialen Kompartimente, die sehr gut auf intrazelluläre und extrazelluläre Bedingungen reagieren und für die Aufrechterhaltung der Zellgesundheit entscheidend sind2. Die Morphologie der Mitochondrien kann wichtige Erkenntnisse über ihre Funktion liefern, jedoch können Veränderungen in der mitochondrialen Form den Zellstoffwechsel und die allgemeine Gesundheit beeinträchtigen3. Störungen der mitochondrialen Morphologie sind mit verschiedenen Krankheiten verbunden, darunter neurodegenerative Erkrankungen, Krebs und Stoffwechselerkrankungen4. Die mitochondriale Morphologie wird dynamisch durch Fusions- und Spaltungs-/Fusionsereignisse reguliert, die für die Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase und die Reaktion auf verschiedene metabolische Anforderungen entscheidend sind 5,6.

Die mitochondriale Dynamik hilft der Organelle, auf unterschiedliche Stressoren und Stoffwechselanforderungen zu reagieren7. Es beinhaltet eine kontinuierliche Spaltung/Fusion und Bewegung von Mitochondrien innerhalb von Zellen oder zwischen Zellen. Mitochondrien passen sich durch Veränderungen der Morphologie durch Spaltungs-/Fusionsereignisse an den zellulären Energiebedarfan 8. Diese Prozesse bestimmen die mitochondriale Form und beeinflussen mitochondriale Funktionen wie Energieabgabe, Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und mitochondriale Qualitätskontrolle 7,9,10. Darüber hinaus sind mitochondriale Spaltung/Fusion ausgleichende Mechanismen, die ein funktionsfähiges mitochondriales Netzwerk aufrechterhalten11. Die Fusion ermöglicht den Austausch von mitochondrialen Inhalten, wodurch die Komplementation und Pufferung gegen lokale Schäden gefördert wird, während die Spaltung die Segregation und Entfernung geschädigter Mitochondrien durch Mitophagie ermöglicht 7,12. Darüber hinaus hilft die Spaltung, beschädigte Bestandteile der Mitochondrien zu trennen, die dann durch Mitophagie, einen selektiven Autophagieprozess, entfernt werden13. Die Fusion hingegen ermöglicht die Komplementierung des mitochondrialen Inhalts, wobei alle beschädigten Bestandteile verdünntwerden 14. Die Hauptakteure bei der mitochondrialen Spaltung/Fusion sind Mitofusine (MFN1/2), die für die Fusion der äußeren mitochondrialen Membranessentiell sind 15,16, (OPA1): Diese Dynamin-ähnliche GTPase ist für die Fusion der inneren mitochondrialen Membran verantwortlich16. Bei den Spaltproteinen handelt es sich um das Dynamin-verwandte Protein 1 (Drp1), das Pro-Spaltungsprotein13,17. Mitochondriales Spaltungsprotein 1 (Fis1), Mitochondrialer Spaltfaktor (Mff) und Mitochondrialer Spaltregulator1 wie (MTFR1L). Verschiedene Techniken, wie z. B. die superauflösende EM, wurden verwendet, um die mitochondriale Ultrastrukturzu untersuchen 18. Die Einzelmolekül-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (smFISH) in Kombination mit STED- und MINFLUX-Superauflösungsmikroskopie (Nanoskopie) wurde verwendet, um einzelne mitochondriale mRNA und assoziierte Proteine sichtbar zu machen18. Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie (SMLM) verfolgt Veränderungen des Membranabstands19. Die superauflösende Mikroskopie der stochastischen optischen Rekonstruktionsmikroskopie (STORM) ermöglicht die Untersuchung mitochondrialer innerer Membrankomplexe20. Der Einsatz dieser fortschrittlichen Geräte ist jedoch nicht leicht zugänglich. Die konfokale Mikroskopie ist zugänglich und erfordert weniger Fachwissen. Darüber hinaus hat die Entwicklung von mitochondrialen zielgerichteten fluoreszierenden Proteinen die Untersuchung der mitochondrialen Dynamik in lebenden Zellen erheblich vorangetrieben21, da wir photoaktivierbares grün fluoreszierendes Protein (GFP) verwenden, um die mitochondriale Fusion sichtbar zu machen und zu quantifizieren22.

Um die mitochondriale Spaltung und Fusion zu untersuchen, werden die Zellen gestresst oder Medikamenten wie Cisplatin ausgesetzt, das an die DNA bindet und DNA-Schäden hervorruft, die in einer mitochondrienvermittelten Apoptose gipfeln23. In dieser Studie haben wir photoschaltbare, markierte Dendra2-Mitochondrien von photoaktivierbaren Mitochondrienmäusen verwendet, um die Spaltungs- und Fusionsereignisse in mit Cisplatin behandelten Nierenröhrenzellen zu untersuchen, da sie reich an Mitochondrien sind und eine hohe Regenerationsfähigkeit aufweisen. Dieses Protokoll kann jedoch in jedem Zelltyp verwendet werden, der photoschaltbare markierte Dendra2-Mitochondrien aufweist (Abbildung 1A-C).

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Protokoll

Alle Tierarbeiten wurden in Übereinstimmung mit den Protokollen durchgeführt, die vom Temple University Institutional Animal Care and Use Committee der Temple University (Animal Protocol-5183) genehmigt wurden. Die Pham-Mäuse, deren Mitochondrien das Dendra2-Protein exprimieren, wurden gekauft.

1. Vorbereitung des Zellkulturmediums

  1. Isolieren Sie proximale tubuläre Nierenzellen gemäß dem Protokoll, nachdem sie mit Kügelchen24 von glomerulären Endothelzellen getrennt wurden (Abbildung 1A). Bouchareb et al. entwickelten eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von glomerulären Endothelzellen (GECs) aus den Nieren transgener Mäuse, die fluoreszierende Mitochondrien (Mito-Dendra2) exprimieren, mithilfe von magnetischen Kügelchen. Nach der Isolierung von GEC werden die im Pellet verbleibenden Tubuli isoliert und kultiviert.
  2. Kulturieren Sie proximale tubuläre Zellen der Niere in einer 10-cm-Schale mit 10 ml DMF-12, ergänzt mit 5 % FBS (hitzeinaktiviert), Penicillin (100 μg/ml) und Streptomycin (100 μg/ml). Züchten Sie die Tubuli 2-3 Tage lang, bis sie aus den Tubuli wandern.
  3. Röhrenzellen nach Morphologie auswählen, nachdem sie 2 Tage lang gehungert haben (mit DMF-12 ohne FBS).
    HINWEIS: Verwenden Sie für die Experimente eine Scheibe mit 50-70 % konfluenten Zellen. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer, bevor Sie sie aussäen.
  4. Aussaat von Zellen für Experimente: Aussaat der Zellen in Kulturplatten mit Glasboden in einer Dichte von 1-5 × 105 Zellen pro Well, je nach experimentellen Anforderungen. Lassen Sie die Zellen über Nacht anhaften und wachsen, bevor Sie Cisplatin hinzufügen.
    HINWEIS: Cisplatin ist ein gefährliches Chemotherapeutikum, es ist wichtig, Sicherheitsprotokolle zu befolgen, um das Personal und die Umwelt zu schützen. Befolgen Sie zu diesem Zweck die Anweisungen der biologischen Sicherheitswerkbank der Klasse II, der persönlichen Schutzausrüstung (PSA), der Dekontamination, der Verschüttungskontrolle und der Abfallentsorgung (gefährliche Arzneimittelabfälle-Chemotherapie): Tragen Sie doppelte Handschuhe, eine Brille, dekontaminieren Sie die Arbeitsfläche, bewahren Sie das Verschüttungsset in der Nähe des Arbeitsplatzes auf, beschriften Sie den Abfallbehälter deutlich. Tragen Sie bei DMSO PSA, arbeiten Sie in einem Abzug und befolgen Sie die Verfahren zur Dekontamination und Entsorgung von Verschüttungen.

2. Induktion von Stress mit Cisplatin

  1. Zubereitung von Cisplatin-Medium
    1. Bereiten Sie eine Stammlösung von 50 mM Cisplatin vor, indem Sie sie in DMSO auflösen.
    2. Platte 1-5 x 106 proximale röhrenförmige Zellen auf die Kulturplatte mit Glasboden auffüllen, 2 mL DMF-12-Medium zugeben.
      HINWEIS: Es kann eine beliebige Kulturscheibe mit Glasboden verwendet werden.
    3. Geben Sie Cisplatin in einer Endkonzentration von 2 μM auf die Versuchsplatte, um 0,004 % DMSO zu erhalten.
      HINWEIS: Bereiten Sie 2 μl 50 mM Cisplatin vor, verdünnt in 1.998 μl FBS-freiem DMF-12-Medium, und geben Sie 80 μl in die Versuchsplatte.
    4. Inkubieren Sie die Zellen für 24 Stunden.

3. Bildgebung

  1. Verwendung des konfokalen Mikroskops
    1. Konfigurieren Sie Laser auf 405 nm (Dendra2-Photokonvertierung), 488 nm (nicht umgewandelte Dendra2-Anregung) und 561 nm (photokonvertierte Dendra2, Alexa 594).
    2. Schalten Sie die Laser ein und lassen Sie Zeit für die Stabilisierung (~10 min)
  2. Untersuchung von Spaltungs- und Fusionsereignissen
    1. Konfigurieren Sie Laser auf 405 nm (Dendra2-Photokonvertierung), 488 nm (nicht umgewandelte Dendra2-Anregung) und 561 nm (photokonvertierte Dendra2, Alexa 594).
    2. Legen Sie die Kulturscheibe in die Inkubationskammer.
    3. Geben Sie Wasser um die Kammer herum und stellen Sie die Temperatur auf 37 °C ein. Die Versorgung mit CO2 sollte aufrechterhalten werden.
    4. Lassen Sie die Inkubationskammer äquilibrieren. Die Temperaturänderung wird die Zellen belasten.
    5. Visualisieren Sie die Zellen mit höherer Vergrößerung und Auflösung für die mitochondriale Bildgebung.
    6. Öffnen Sie das Dropdown-Menü in der oberen linken Ecke, und wählen Sie die FRAP-Optionen aus (Abbildung 2A-D).
    7. Definieren Sie mit der LAS X-Software den Bereich of Interest (ROI), in dem das Photobleaching durchgeführt wird.
      HINWEIS: Der interessierende Bereich kann in beliebiger Größe gezeichnet werden, was die Ergebnisse nicht beeinflusst, da einzelne Mitochondrien analysiert werden.
    8. Nehmen Sie eine Reihe von Pre-Bleach-Bildern mit niedriger Laserintensität auf, um die Fluoreszenzintensität der Grundlinie zu bestimmen. Setlasersto405 nmWellenlänge für Photoschaltung (0,00), 48 nm (0,20) und 56 nm (0,20), um sicherzustellen, dass die Zellen fokussiert sind.
      HINWEIS: Die Werte in Klammern nach den Laserwellenlängen geben Laserintensitäten an, die auf einen beliebigen Wert eingestellt werden können, da dies das Photobleaching nicht beeinflusst.
    9. Um die Zellen zu photobleichen, wenden Sie einen hochintensiven Laserpuls an, um das Bleichen im ROI zu erreichen. Stellen Sie die FRAP-Laser auf 405 nm (4,00), 488 nm (0,00) und 561 nm (0,00) ein. Stellen Sie das Vorbleichen für 59 Iterationen auf 5,140 s und das Nachbleichen auf das gewünschte Timing ein (Abbildung 2B) (Die Laserintensität vor dem Bleichen und nach dem Bleichen ist in Klammern angegeben).
    10. Für die Bildgebung nach dem Bleichen nehmen Sie weiterhin Bilder mit niedriger Laserintensität auf, um die Wiederherstellung der Fluoreszenz 10 Minuten lang zu beobachten. Halten Sie FRAP-Laser bei 405 nm (0,00), 488 nm (0,50) und 561 nm (0,50).
      HINWEIS: Die Bleichzeit kann je nach Zelltyp unterschiedlich sein, in unseren Händen wurden ähnliche Bleichzeiten für Mitochondrien in röhrenförmigen Zellen und Valve Interstitial Cells (VIC) verwendet. Sobald die FRAP abgeschlossen ist, können die Bilder oder die Bildgebung lebender Zellen (Abbildung 3 und ergänzendes Video 1) neben der Aufnahme der Bilder nach dem Bleaching durchgeführt werden.

4. Bildanalyse

HINWEIS: Da Mitochondrien mit dem Dendra2-Protein markiert sind, führt eine irreversible Konformationsänderung des Dendra2-Proteins nach dem Photobleaching zu einer Erhöhung der roten Fluoreszenz, die durch den 561-nm-Laser nachgewiesen wird. Wenn die roten Mitochondrien mit den ungebleichten grünen Mitochondrien verschmelzen, ergibt die Kombination eine gelbe Farbe. Unter Ausnutzung dieses Phänomens können die dynamischen Spaltungs-/Fusionsereignisse gemessen werden.

  1. Profilierung der verschmolzenen roten und grünen Mitochondrien
    1. Installieren Sie das RGB-Profiler-Plug-in, um das rote und grüne Signal in der gesamten Auswahl zu profilieren.
      HINWEIS: Befolgen Sie die Anweisungen auf der Website, um das Plugin zum Abschnitt "Fidschi" hinzuzufügen.
    2. Öffnen Sie ImageJ (Abbildung 4A).
    3. Suchen Sie im Menü Datei die zu analysierende Datei, und öffnen Sie sie (Abbildung 4B).
    4. Wählen Sie den Farbmodus Composite aus, aktivieren Sie die Option "Auto Scale " und öffnen Sie das zu analysierende Video (Abbildung 4C).
    5. Wählen Sie einen rechteckigen Bereich aus, der analysiert werden soll (Abbildung 4D).
    6. Zeigen Sie mit der Maus auf den ausgewählten Rechteckbereich, klicken Sie mit der rechten Maustaste, und wählen Sie Duplizieren aus (Abbildung 4E).
    7. Wählen Sie die Option Hyperstapel duplizieren aus, mit der alle Bildstapel dupliziert werden (Abbildung 4F).
    8. Um den duplizierten Stapel in das RGB-Format zu konvertieren, wählen Sie das Bild aus und wählen Sie die Option RGB in der Dropdown-Liste des Bildes (Abbildung 4G-H).
    9. Das RGB-Bild wird dupliziert, wobei nur ein Frame ausgewählt wird (Abbildung 4I).
    10. Wenn die Mitochondrien im Bild gekrümmt sind, zeichne eine Linie entlang ihrer Länge. Gehen Sie dann zum Menü Bearbeiten , wählen Sie Auswahl und klicken Sie auf Begradigen (Abbildung 5A).
    11. Wählen Sie einen Titel für das Bild und stellen Sie die Linienstärke auf 20 Pixel ein (Abbildung 5B).
    12. Ziehen Sie nach dem Begradigen der Mitochondrien eine Linie entlang der interessierenden Mitochondrien, um sicherzustellen, dass sie mit einer geraden Linie übereinstimmt (Abbildung 5C).
    13. Öffnen Sie das RGB Profiler-Plug-In (Abbildung 5D).
    14. Nach der Aktivierung generiert das Plugin ein Diagramm, das die roten und grünen Fluoreszenzintensitäten entlang der gezeichneten Linie anzeigt. Die Höhe jedes Peaks ist direkt proportional zur Fluoreszenzintensität (Abbildung 5E).
      HINWEIS: Die mitochondriale Morphologie kann auch mit dem Mitochondrien-Analysator-Plugin25 berechnet werden. Wählen Sie die für die Belichtung verwendeten Regionen aus, analysieren Sie den Schwellenwert in den ausgewählten Regionen, und messen Sie dann die Morphologie der Mitochondrien und die 2D-Analyse. Der Flächenumfang und weitere Parameter können ausgewählt werden.

5. Analysieren von Fusionsereignissen

  1. Legen Sie die Ausgangsbasis vor der Fusion fest: Bestätigen Sie vor der mitochondrialen Fusion, dass die rote Fluoreszenz (561 nm) an einem Mitochondrium und die grüne Fluoreszenz (488 nm) an ein benachbartes Mitochondrium lokalisiert ist. Das entsprechende Intensitätsdiagramm sollte zwei unterschiedliche Peaks anzeigen, einen roten und einen grünen, mit minimaler Überlappung.
  2. Bestätigen Sie das Ereignis nach der Fusion: Nach der Fusion sollte sich das rote Signal (das den Inhalt der Dendra2-Matrix darstellt) in das benachbarte grüne Mitochondrium ausbreiten, was auf eine Vermischung des Inhalts hinweist. Das Intensitätsdiagramm zeigt nun überlappende rote und grüne Spitzen an, was ein Fusionsereignis bestätigt.
  3. Die Beurteilung von Fusionsereignissen kann durch sorgfältige Auswahl der gesunden Mitochondrien und der photogebleichten Mitochondrien für die Fusion in der lebenden Zellbildgebung bestimmt werden. Eine Veränderung des Verhältnisses von Rot/Grün im Laufe der Zeit würde auf das Fusionsereignis hinweisen.

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Ergebnisse

Primäre tubuläre Epithelzellen wurden durch enzymatischen Verdau aus der Mausniere isoliert und in DMF-12 kultiviert, ergänzt mit 5 % FBS, 1 % Penicillin-Streptomycin bei 37 °C unter 5 % CO2. Bei Erreichen einer Konfluenz von 80 % wurden die Zellen trypsinisiert (0,25 % Trypsin-EDTA) und mit einer Dichte von 5 × 104 Zellen pro Vertiefung in Kulturplatten mit Glasboden ausgesät, die mit Kollagen vorbeschichtet waren.

Das Kulturmedium enthi...

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Diskussion

Mitochondriale Spaltung/Fusion sind entscheidende dynamische Prozesse, die die mitochondriale Homöostase und die zelluläre Lebensfähigkeit aufrechterhalten26. Eine korrekte Beurteilung dieser Prozesse erfordert fortschrittliche bildgebende Verfahren zur Visualisierung und Quantifizierung der mitochondrialen Morphologie, Dynamik und Funktion27,28. Verschiedene Techniken wurden zur Messung der mitochondriale...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie nichts offenzulegen haben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Forschungsstipendien des National Institute of Health mit der Fördernummer 5R01DK135470-03, des ISAC-NIH-Stipendiums 5U24DK128851-03 und des Postdoktorandenstipendiums der American Heart Association unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Zellkultur 
DMEM/F12 Basalmedium (Gibco/Katze. Nr.11320033 ) Proximale tubuläre Zellkultur 
Fetal Bovine Serum (FBS) 5–10 % Supplementierung (Biowest/Cat. Nr.S181B) Kulturmittelanreicherung 
Penicillin-Streptomycin 100X (Gibco/Katze. Nr.15140122) Antibiotikaschutz 
Kollagen IV Beschichtung (Sigma-C5533-5M) Ibidi-Plattenbeschichtung 
Trypsin-EDTA 0,25 % Lösung (Gibco/Katze. Nr.25200056) Zellablösung  
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (Gibco/Katze. Nr.10010023 ) Zellreinigung 
Behandlungen 
Cisplatin 2 & Mikro; M Arbeitsschwerpunkt  (Selleck Chemicals/Cat. Nr.S1166) Spannungseinduktion   
Dimethylsulfoxid (DMSO) Fahrzeugsteuerung (Fisher Scientific/Cat. Nr.D1391) Cisplatin-Lösungsmittelkontrolle 
Imaging 
Phenolrotfreies Medium Live Imaging (Gibco/Katze. Nr.21041025) Reduzierte Hintergrundfluoreszenz 
Molekularbiologie 
TRIzol®  RNA-Extraktion (Gibco/Katze. Nr.15596018) Totale RNA-Isolation  
SYBR Green Master Mix qPCR-Chemie (Thermowissenschaftlich/Katzen. Nr.K0221) Genexpression der Mitochondriendynamik (DNM1L, FIS1, MFN1, MFN2, OPA1) 
Fluoreszierende Werkzeuge 
Dendra2 Mitochondrienmatrix-Tag Jacson Laboratory(PhAMentfernt) Foto-umschaltbarer Reporter (405nm-Umwandlung, 488/561nm-Bildgebung) 
Mikroskope 
Konfokalmikroskop Leica DMi8 Lebendzellbildgebung und FRAP 405nm/488nm/561nm Laser 
Bild J https://imagej.net/software/fiji/downloads 
RGB Profiler Plugin https://imagej.net/ij/plugins/rgb-profiler.html. Analyse von Fusionsereignissen (Rot/Grün-Signal-Überlappung) 

Referenzen

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Mitochondriale Dynamikmitochondriale FusionKonfokalmikroskopieFRAP TechnikDendra2 ProteinImageJ AnalyseLive Cell Imagingmitochondriale Morphologie
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