Lebendzell-Bildgebung des endozytären Transports mit funktionalisierten Nanobodies in kultivierten Zellen

Die Endozytose von Rezeptoren und anderen Transmembran (TM)-Proteinen von der Plasmamembran zu verschiedenen intrazellulären Kompartimenten ist wichtig für die Aufrechterhaltung der Membranhomöostase ^1,2. Nach der Internalisierung durch Clathrin-abhängige oder -unabhängige Endozytose besiedeln die Proteinfrachten zunächst frühe Endosomen, von wo aus sie entweder entlang des endolysosomalen Systems weiter sortiert, zur Plasmamembran recycelt oder retrograd zum trans-Golgi-Netzwerk (TGN) transportiert ^werden3,4,5. Das Recycling von Endosomen und/oder der Zelloberfläche in das TGN ist Teil des Funktionszyklus einer Reihe von Transmembran-Frachtrezeptoren, wie z. B. den kationenabhängigen und kationenunabhängigen Mannose-6-phosphat-Rezeptoren (CDMPR und CIMPR), die neu synthetisierte lysosomale Hydrolasen aus dem TGN an späte Endosomen und Lysosomen liefern ^6,7,8, Wntless (WLS) transportiert Wnt-Liganden zur Zelloberfläche^{9, 10,11,12} oder TGN46, das lösliche sekretorische Frachtproteine, einschließlich des hochregulierten Pankreasfaktors (PAUF) und anderer CARTS-Fracht, aus dem TGN 13,14,15,16 eskortiert. Während alle diese Frachtrezeptoren durch das TGN pendeln, um neue Client-Proteine zu sammeln, ist der Transferrinrezeptor (TfR), der eisengebundenes Transferrin internalisiert, von der Golgi-Rückkehr ausgeschlossen 17,18,19,20,21.

Um den endozytären und retrograden Verkehr zu untersuchen, haben wir zuvor ein Nanobody-basiertes Toolkit entwickelt, mit dem Frachtproteine von der Zelloberfläche bis zu den intrazellulären Kompartimenten markiert und verfolgt werden^{können 17}. Nanobodies stellen eine neuartige Klasse von Proteinbindern dar, die aus homodimeren Nur-Schwerketten-Antikörpern (hcAbs) gewonnen werden, die natürlicherweise in Kameliden und Knorpelfischen vorkommen^22,23. Sie repräsentieren die variable Schwerkettendomäne (VHH) von hcAbs und bieten zahlreiche Vorteile gegenüber herkömmlichen Antikörpern (z.B. IgGs): Sie sind monomer, klein (~15 kDa), hochlöslich, haben keine Disulfidbindungen, können bakteriell exprimiert werden und sind für eine hochaffine Bindung selektierbar²⁴. Um die Vielseitigkeit und breite Anwendbarkeit dieses Nanobody-Toolkits zu verbessern, haben wir funktionalisierte Anti-GFP-Nanobodies eingesetzt, um Proteine, die mit GFP-Tags markiert sind, auf ihren extrazellulären oder lumenalen Domänen zu markieren und zu verfolgen. Durch rekombinante Konjugation von Nanobodies mit mCherry, Ascorbatperoxidase 2 (APEX2) oder Tyrosinsulfatierungssequenzen kann der retrograde Transport von Bona-fide-Transmembran-Frachtproteinen durch Fix- und Lebendzellfluoreszenzmikroskopie, Elektronenmikroskopie oder biochemische Assays mittels Autoradiographie analysiert werden. Angesichts der Tatsache, dass die Tyrosinsulfatierung, katalysiert durch die Tyrosylprotein-Sulfotransferasen TPST1 und TPST2, eine posttranslationale Modifikation ist, die auf das trans-Golgi/TGN beschränkt ist, ermöglicht diese Strategie eine direkte Beurteilung der Transportdynamik und -kinetik von der Zelloberfläche zum Golgi-Kompartiment 25,26,27. In jüngerer Zeit haben wir dieses Repertoire an funktionalisierten Proteinbindern um derivatisierte Anti-mCherry-Nanobodies erweitert. Diese Reagenzien haben sich als hilfreich erwiesen, um maschinenabhängige Transportwege von MPRs, insbesondere des CDMPR^17,28, zum TGN durch biochemische Analysen zu entschlüsseln.

Während sich die vorangegangene Studie hauptsächlich auf die Anwendung von Nanobodies konzentrierte, die mit Tyrosinsulfatierungssequenzen modifiziert wurden, um die Ankunft von TGN mittels Autoradiographie biochemisch zu beurteilen¹⁹, beschreibt dieser Methodenartikel die Erzeugung von fluoreszenzmarkierten, funktionalisierten Nanobodies (VHH-mCherry) und Reporterzelllinien für die Lebendzellbildgebung des endozytären Transports. In Kombination mit einem zusätzlichen Golgi-residenten fluoreszierenden Reporterprotein kann dieses Protokoll weiter angepasst werden, um als robuster Arbeitsablauf für die quantitative Analyse der Lebendzellbildgebung des Endosom-zu-TGN-Transports ausgewählter Frachtproteine zu dienen.

Vor der Anwendung dieses Protokolls sollten die Forscher sicherstellen, dass das Zielprotein als GFP-markiertes Fusionskonstrukt exprimiert wird, das typischerweise durch standardmäßige molekulare Klonierungsansätze erzeugt wird. Funktionalisierte Nanobodies können problemlos in Bakterien mit Ausbeuten hergestellt werden, die für Oberflächenmarkierungsexperimente ausreichen, wobei Arbeitskonzentrationen im niedrigen nanomolaren Bereich für die meisten Bildgebungsassays mit lebenden Zellen geeignet sind. Die Anwender sollten auch berücksichtigen, dass die Transportkinetik zwischen den Frachtproteinen variieren kann, was eine Anpassung der Markierungsdauer oder der Bildgebungsfrequenz für eine optimale Visualisierung des endozytären oder Endosom-zu-TGN-Transports erfordert.

1. Bakterielle Transformation mit VHH-mCherry

HINWEIS: Dieses Protokoll wurde für die Expression, Reinigung und Analyse von funktionalisierten Anti-GFP-Nanobodies optimiert, wie zuvor beschrieben¹⁷. Die folgenden Schritte wurden für VHH-mCherry angepasst und stimmen mit dem früheren Methodenbericht¹⁹ überein.

1. Chemokompetente Bakterien (50-100 μl), die für die Proteinexpression geeignet sind (z. B. Escherichia coli , Rosetta BL21 (DE3) Zellen), auftauen, indem sie auf Eis gelegt werden.
   HINWEIS: Bereiten Sie chemokompetente Bakterienzellen gemäß den Standard-Laborprotokollen vor. Hierfür können handelsübliche BL21 (DE3) Zellen von NEB eingesetzt werden.
2. Fügen Sie 50 ng eines Plasmids hinzu, das für das funktionalisierte VHH-mCherry-Konstrukt (Addgen #109421) kodiert. Um eine effiziente ortsspezifische Biotinylierung des Nanobody-Reporters während der bakteriellen Expression zu gewährleisten, co-transformieren Sie mit einem dreifachen Überschuss (150 ng) eines Plasmids, das für die bakterielle Biotin-Ligase BirA (Addgen #109424) kodiert. Bewegen Sie das Röhrchen vorsichtig 4x-5x, um Zellen und Plasmid-DNA zu mischen.
   HINWEIS: Eine Co-Transformation mit dem BirA-kodierenden Plasmid ist nicht erforderlich, wenn keine Biotinylierung durch das Biotin-Akzeptorpeptid (BAP) erforderlich ist.
3. Die Mischung 30 min auf Eis inkubieren. Vermeiden Sie während dieses Schritts Unruhe.
4. Erhitzen Sie Bakterienzellen, indem Sie sie genau 20 s bei 42 °C in ein Wasserbad oder einen Heizblock legen.
5. Geben Sie 1 ml Luria-Bouillon (LB) bei Raumtemperatur (RT) hinzu und inkubieren Sie die transformierten Bakterien in einem Thermoshaker (250-500 U/min) für 1 h bei 37 °C, um die phänotypische Expression von Antibiotikaresistenzgenen zu ermöglichen.
   HINWEIS: Um 1 L LB Medium zuzubereiten, fügen Sie 5 g Hefeextrakt, 10 g Trypton und 10 g NaCl hinzu, füllen Sie das Volumen mit Wasser auf und sterilisieren Sie es durch Autoklavieren.
6. Pelletieren Sie die Bakterien durch Zentrifugation bei 11.000 x g für 1 min und resuspendieren Sie das Pellet in 100 μl frischem LB-Medium. Durch Pipettieren gründlich mischen.
7. Die suspendierten Bakterien werden auf vorgewärmte LB-Platten mit den entsprechenden Antibiotika aufgetragen (z. B. mit 50 μg/ml Kanamycin; wenn es mit BirA co-transformiert ist, fügen Sie auch 50 μg/ml Carbenicillin hinzu, siehe Schritt 1.2).
8. Inkubieren Sie die mit Antibiotika ergänzten LB-Platten kopfüber bei 37 °C für 13-15 h.
   HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden. Platten mit gewachsenen Kolonien können bei 4 °C gelagert und mit durchlässiger Folie verschlossen werden, um ein Austrocknen zu verhindern.

2. Bakterielle Flüssigkultur und Induktion der VHH-mCherry-Expression

1. Wählen Sie eine einzelne Bakterienkolonie aus der Transformationsplatte aus und inokulieren Sie sie in einen Erlenmeyerkolben mit 20 ml LB-Medium, das mit Antibiotika versetzt ist. Inkubieren Sie die Kultur in einem Schüttelinkubator für 13-15 h bei 37 °C (siehe auch Schritt 1.7 zur Auswahl von Antibiotika).
2. Am nächsten Tag wird die über Nacht 20 ml fassende Bakterienkultur in einen frischen Kolben verdünnt, der 1 l LB-Medium mit den entsprechenden Auswahlantibiotika enthält.
3. Die Inkubation bei 37 °C fortsetzen, bis die Kultur eine optische Dichte bei 600 nm (OD₆₀₀) von 0,6-0,7 erreicht.
   HINWEIS: Lassen Sie die Kultur auf RT oder 16 °C abkühlen, bevor Sie die Proteinexpression induzieren.
4. Induzieren Sie die Expression von VHH-mCherry (und BirA, falls co-exprimiert) durch Zugabe von 1 ml 1 M Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG), um eine Endkonzentration von 1 mM des Induktors zu erreichen (1:1000 Verdünnung). Wenn eine Co-Transformation mit dem BirA-Expressionsplasmid durchgeführt wurde, ergänzen Sie die Kultur ebenfalls mit 10 mL einer 20 mM D-Biotin-Stammlösung, wodurch eine endgültige Konzentration von 200 μM D-Biotin im Wachstumsmedium erreicht wird. Dies erleichtert die in vivo Biotinylierung des Epitops des Biotinakzeptors (BAP), das im VHH-mCherry-Konstrukt vorhanden ist.
   HINWEIS: Bereiten Sie die D-Biotin-Brühe in ddH₂O vor und lösen Sie sie durch schrittweise Zugabe von 500 mM NaH₂PO₄ auf.
5. Inkubieren Sie die IPTG-induzierte 1-Liter-Kultur für 13-15 Stunden bei 16 °C, um eine optimale Proteinfaltung und -ausbeute zu fördern.
   HINWEIS: Die Expressionsbedingungen für neu gestaltete Nanokörper-Konstrukte mit anderen Fluoreszenz-Tags können eine empirische Optimierung durch den Prüfer erfordern.
6. Füllen Sie die Kultur in eine 1-Liter-Zentrifugationsflasche um und ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 5.000 x g bei 4 °C für 45 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand in den entsprechenden flüssigen Bioabfall und fahren Sie mit den Reinigungsschritten fort.
   HINWEIS: Das Protokoll kann an dieser Stelle pausiert werden, indem das Bakterienpellet bei -80 °C gelagert wird. Das VHH-mCherry-Pellet erscheint typischerweise rosa, was auf eine korrekte Faltung des fluoreszierenden Fusionsproteins hinweist.

3. IMAC-basierte Aufreinigung von VHH-mCherry

1. Tauen Sie das gefrorene Bakterienpellet ggf. auf Eis auf (siehe auch Schritt 2.6).
2. Geben Sie 30 mL eiskalten Bindungspuffer (20 mM Imidazol in 1x PBS) zum Bakterienzellpellet und resuspendieren Sie es gründlich durch Auf- und Abpipettieren. Übertragen Sie die Suspension in ein beschriftetes 50-ml-Zentrifugenröhrchen.
3. Ergänzen Sie die resuspendierten Zellen mit 200 μg/ml Lysozym, 20 μg/ml DNase I, 1 mM MgCl₂ und 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF). Die Mischung wird 10 Minuten lang bei RT inkubiert, gefolgt von 1 h bei 4 °C auf einem durchgehenden Rotator.
   HINWEIS: PMSF ist giftig. Bereiten Sie Stammlösungen in einem chemischen Abzug vor und tragen Sie Handschuhe, einen Laborkittel und einen Augenschutz. PMSF-haltige Abfälle in halogenierten Bioabfallbehältern entsorgen. Für die Versuche wurde eine 0,1 M Stammlösung verwendet und weiter verdünnt.
4. Mechanisches Aufbrechen der Bakterienzellen mit einem Spitzensonicator, der direkt in die Suspension eingeführt wird. Wenden Sie konstant drei 1-minütige Ultraschallimpulse an, die ein Abkühlintervall von 1 Minute zwischen den einzelnen Impulsen mit den angegebenen Ultraschallgeräteeinstellungen ermöglichen (Sondenspitzengröße: 6 mm, feste Spitze; Amplitude 40%; Einschaltdauer (Impulsmodus): 1 s EIN / 1 s AUS)
5. Das Lysat wird durch Zentrifugation bei 15.000 x g bei 4 °C für 45 min geklärt, um bakterielle Zelltrümmer und intakte Bakterien zu pelletieren.
   HINWEIS: Das Lysat kann in eine Zentrifugenflasche überführt oder in 5-ml-Röhrchen für die Tischzentrifugation aliquotiert werden.
6. Füllen Sie den entstandenen Überstand vorsichtig in ein neues 50-ml-Röhrchen um und entsorgen Sie das Pellet in den entsprechenden Bioabfall.
7. Bewahren Sie das gereinigte Lysat auf Eis auf, während Sie sich auf die immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC) vorbereiten. Für die Isolierung von Histidin-markierten Nanobodies verwenden Sie vorverpackte His-Tag-Aufreinigungssäulen für den Einmalgebrauch, die für den Schwerkraftbetrieb optimiert sind.
8. Befestigen Sie Ni-NTA-Säulen (Nickel-Nitriotriessigsäure) auf einem Metallständer oder einem geeigneten Säulenhalter.
   1. Entleeren Sie den Lagerpuffer aus den Säulen und äquilibrieren Sie ihn mit 10 mL Bindungspuffer (20 mM Imidazol in 1x PBS).
   2. Lassen Sie den Puffer durch die Schwerkraft passieren. Entsorgen Sie den Durchfluss als Bioabfall.
9. Tragen Sie nach und nach das gereinigte bakterielle Lysat (~30 mL) auf die Säule auf. Lassen Sie es durch die Schwerkraft durchfließen und verwerfen Sie das Durchfließen.
10. Waschen Sie die Säule mit zwei aufeinanderfolgenden 10-ml-Volumina Bindungspuffer (20 mM Imidazol in 1x PBS).
11. Eluieren Sie die gebundenen Nanobodies mit 2 mL Elutionspuffer (500 mM Imidazol in 1x PBS) in ein 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen.
12. Führen Sie einen Pufferaustausch durch.
    1. Äquilibrieren Sie eine Entsalzungssäule, die in einem 50-ml-Röhrchenadapter platziert ist, durch 5-faches Spülen mit 5 mL 1x PBS.
    2. Lassen Sie den Puffer vollständig in das gepackte Harz eindringen. Verwerfen Sie den Durchfluss. Nach der letzten PBS-Wäsche zentrifugieren Sie die Säule bei 1.000 x g für 2 Minuten.
    3. Verwerfen Sie den Durchfluss. Setzen Sie die Säule mit dem Adapter auf ein neues 50-ml-Röhrchen auf. Laden Sie 2 mL des eluierten funktionalisierten Nanobodies (aus Schritt 3.11) auf die PBS-äquilibrierte Entsalzungssäule und drehen Sie ihn 2 Minuten lang bei 1.000 x g und sammeln Sie das Eluat.
       HINWEIS: Alternativ kann die Dialyse für den Pufferaustausch verwendet werden.
13. Quantifizieren Sie die Konzentration des gereinigten VHH-mCherry-Proteins mit einem Bicinchoninsäure (BCA)- oder Bradford-Assay gemäß den Protokollen des Herstellers.
    HINWEIS: Für eine effiziente Aufnahme von Nanobodies in Lebendzell-Imaging-Anwendungen wird eine Endkonzentration von 5-10 mg/ml empfohlen.

4. Validierung der VHH-mCherry-Expression und -Reinheit (Coomassie-Färbung)

1. Bereiten Sie ein 10%iges Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel (SDS-PAGE) gemäß den etablierten Laborprotokollen vor.
   HINWEIS: Als Alternative können handelsübliche vorgefertigte Gradientengele von Bio-Rad verwendet werden, um die Bequemlichkeit und Reproduzierbarkeit zu erhöhen.
2. Aliquotieren Sie 20 μg gereinigtes VHH-mCherry in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und denaturieren Sie es durch Sieden in einem Probenpuffer bei 95 °C für 5 min.
3. Laden Sie die denaturierte Nanobody-Probe auf das SDS-Polyacrylamid-Gel und führen Sie die Elektrophorese gemäß den Standard-PAGE-Verfahren durch, bis der Tracking-Farbstoff (z. B. Bromphenolblau) den Boden des auflösenden Gels erreicht.
4. Fahren Sie mit der Coomassie-Färbung und der Entfärbung des Gels fort.
   1. Nehmen Sie das Gel vorsichtig aus der Kassette und tauchen Sie es 20-30 Minuten lang bei RT auf einer leicht schüttelnden Plattform in Coomassie Färbelösung (5 % eines 10 g/l Coomassie Brilliant Blue Stoffes in 10 % Essigsäure und 45 % Methanol in ddH₂O). Stellen Sie sicher, dass das Gel vollständig in die Färbelösung eingetaucht ist.
   2. Entfärben Sie das Gel mit einer Entfärbungslösung (7,5 % Essigsäure und 15 % Methanol in ddH₂O) und führen Sie 2-3 aufeinanderfolgende Wäschen von je 1 h bei RT durch. Für eine optimale Hintergrundreduzierung lassen Sie das Gel 13-15 Stunden in frischer Entfärbungslösung.
      HINWEIS: Überschüssiger Farbstoff kann effektiv absorbiert werden, indem während des Entfärbungsprozesses Haushaltspapiertücher um das Gel gelegt werden. Färbe-/Entfärbungslösungen enthalten brennbares Methanol und reizende Essigsäure. Verwenden Sie es in einem Abzug, tragen Sie Handschuhe und Schutzbrille und sammeln Sie verbrauchte Lösungen in dafür vorgesehenen Behältern für brennbare Flüssigkeiten.
5. Visualisieren Sie das Gel mit einem Gel-Dokumentationssystem oder einer Kamera Ihrer Wahl.
   HINWEIS: Zur zusätzlichen Bestätigung der Nanokörper-Expression kann ein Immunblotting mit epitopspezifischen Antikörpern durchgeführt werden (siehe auch Abbildung 1C).

5. Generierung von GFP-markierten Reporter-HeLa-Zelllinien mittels retroviraler Transduktion

HINWEIS: Verschiedene GFP-Reporter-HeLa- α Kyoto-Zelllinien (hier einfach HeLa oder HeLa α genannt) wurden zuvor erzeugt¹⁷. Zum Zwecke der Demonstration des Lebendzell-Imaging-Assays werden GFP-markierte CDMPR oder TfR als repräsentative Frachtproteine verwendet. Während TM-Proteine mit Typ-I-Topologie am äußersten N-Terminus GFP-markiert sind, benötigen TM-Proteine mit Typ-II-Topologie eine C-terminale GFP-Fusion.

1. Die Gene, die für EGFP-CDMPR (Addgen #182642) oder TfR-EGFP (#243763) kodieren, wurden zuvor unter Verwendung von Standard-Restriktionsenzymklonierungstechniken in den retroviralen Vektor pQCXIP subkloniert¹⁷. Nach der Umwandlung in chemokompetente E. coli bereiten Sie hochreine Plasmid-DNA mit Midi-Prep-Kits (z. B. von Macherey-Nagel) vor.
   HINWEIS: Chemokompetente Bakterienzellen sollten gemäß den Standard-Laborprotokollen hergestellt werden. NEB 5-alpha Kompetente E. coli von NEB können für die Klonierung und Plasmidaufreinigung verwendet werden.
2. Um stabile GFP-Reporter-HeLa-Zelllinien zu erzeugen, werden retrovirale Partikel durch Transfektion der Verpackungszelllinie Phoenix ampho hergestellt. Alle Zellkulturarbeiten werden unter BSL2-Laminar-Flow-Bedingungen durchgeführt.
   1. Am Tag vor der Transfektion werden 2,0-3,0 x 10⁶ Phoenix Amphozellen in eine 10 cm große Schale in 10 ml Medium gesät, um bis zum nächsten Tag eine Konfluenz von 60 % bis 80 % zu erreichen. Phoenix-Ampho werden in DMEM-GlutaMAX-I mit hohem Glukosegehalt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 100 Einheiten/ml Penicillin/Streptomycin und 1 mM Natriumpyruvat gehalten.
   2. Ersetzen Sie das Medium am Tag der Transfektion durch 10 ml frisches vollständiges Medium.
   3. Kombinieren Sie in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen 1 ml serum- und supplementfreies DMEM-Hochglukose-GlutaMAX-I mit 10 μg pQCXIP-EGFP-CDMPR oder pQCXIP-TfR-EGFP und 30 μl FuGENE HD-Transfektionsreagenz. Durch Pipettieren gründlich mischen.
   4. Inkubieren Sie die Mischung 15 Minuten lang bei Raumtemperatur, um die Bildung von DNA-Reagenzienkomplexen zu ermöglichen.
   5. Geben Sie die gesamte Transfektionsmischung tropfenweise in die Phoenix-Ampho-Kultur. Schwenken Sie die Platte vorsichtig, um die Komplexe gleichmäßig zu verteilen.
   6. Inkubieren Sie transfizierte Phoenix-Amphozellen für 13-15 h bei 37 °C mit 5 % CO₂.
      HINWEIS: Es können alternative Verpackungszelllinien verwendet werden, sofern sie mit dem Retro-X Q-Vektorsystem kompatibel sind.
3. Am nächsten Tag verwerfen Sie das Transfektionsmedium und ersetzen Sie es durch 7 ml frisches vollständiges Medium, um die Virusproduktion zu verbessern.
4. 48 h und optional 72 h nach der Transfektion ist der Kulturüberstand (~7 mL), der Viruspartikel enthält, mit einer Pipettenhilfe zu entnehmen. Überwachen Sie die GFP-Expression in transfizierten Phoenix-Amphozellen mit einem Fluoreszenzmikroskop oder einem Bildgebungssystem (z. B. Bio-Rad ZOE).
   HINWEIS: Auch hier ist bei retroviralen Manipulationen ein BSL-2-Containment erforderlich. Führen Sie alle Arbeiten in einer zertifizierten Biosicherheitswerkbank durch, tragen Sie Handschuhe, einen Laborkittel und einen Augenschutz und dekontaminieren Sie Oberflächen mit 1 % Hexaquart gefolgt von 70 % Ethanol, bevor Sie den Abfall im Autoklaven entsorgen.
5. Filtrieren Sie den gesammelten Virusüberstand durch einen 0,45 μm großen Filter. Der gefilterte Überstand kann sofort verwendet werden (siehe Schritt 5.7) oder bei 4 °C für den kurzfristigen Gebrauch oder bei -80 °C für die langfristige Lagerung gelagert werden. Beachten Sie, dass die Virustiter beim Einfrieren abnehmen können.
6. Um stabile GFP-Reporter-HeLa-Zellen zu etablieren, fahren Sie mit der retroviralen Transduktion unter Verwendung des gefilterten Virusüberstands fort. Alle Verfahren müssen unter BSL2-Bedingungen durchgeführt werden.
   1. Einen Tag vor der Transduktion säen Sie etwa 2,0-3,0 x 10⁶ HeLa-α-Zellen in einer 10-cm-Schale mit 10 ml Medium aus, um am nächsten Tag eine Konfluenz von 60 % bis 80 % zu erreichen. HeLa-α-Zellen werden in DMEM-hochglukosereichem GlutaMAX-I kultiviert, das mit 10 % FBS und 100 U/ml Penicillin/Streptomycin ergänzt wird.
   2. Mischen Sie den gefilterten Virusüberstand mit 15 μg/ml Polybren (Hexadimethrinbromid), um die Infektionseffizienz zu erhöhen.
      HINWEIS: Polybren ist ein Reizstoff - während der Stoffaufbereitung mit Handschuhen und Augenschutz anfassen, Aerosolbildung vermeiden und polybrenehaltige Lösungen als gefährlichen chemischen Abfall entsorgen.
   3. Ersetzen Sie am nächsten Tag das Standard-Wachstumsmedium durch einen unverdünnten Virusüberstand, der Polybren enthält, und stellen Sie sicher, dass die gesamte Oberfläche der Schale bedeckt ist.
   4. Inkubieren Sie HeLa α Zellen unter Transduktion für 13-15 h bei 37 °C mit 5% CO₂.
      HINWEIS: Zur Bestimmung des Virustiters können serielle Verdünnungs- und Infektionsassays an HeLa-α-Zellen durchgeführt werden. Das Titern ist in diesem Fall optional, da Retroviren nur sich teilende Zellen infizieren.
7. Am Tag nach der Transduktion entsorgen Sie das Virusmedium in den BSL2-Abfall und ersetzen Sie es durch 10 ml frisches vollständiges HeLa-α-Medium. 13-15 h bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubieren.
8. Beginnen Sie am nächsten Tag mit der Auswahl, indem Sie das Medium durch ein vollständiges Medium mit 1,5 μg/ml Puromycin ersetzen.
9. Halten Sie den Selektionsdruck für 2-3 Wochen aufrecht und übergeben Sie die Zellen nach Bedarf. Stellen Sie vor dem Transfer genetisch veränderter Zellen in eine BSL1-Umgebung sicher, dass sie frei von replikationskompetenten Viruspartikeln sind.
10. Um eine homogene Population zu erhalten, verwenden Sie entweder die klonale Isolierung mit Klonierungsringen oder -zylindern oder die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS). FACS kann an transduzierten HeLa-α-Zellen mit FACSAria III oder Fusion (BD Biosciences) durchgeführt werden, um eine Population mit einheitlicher GFP-Expression basierend auf der Fluoreszenzintensität anzureichern.
    HINWEIS: Die Expression des GFP-Reporters in HeLa-α-Zellen kann durch Fixzell-Fluoreszenzmikroskopie oder Immunblotting mit Anti-GFP-Antikörpern weiter validiert werden (siehe auch Abbildung 2C).

6. Aufnahme von VHH-mCherry durch kultivierte Zellen für die Bildgebung lebender Zellen

HINWEIS: Alle Zellkulturverfahren werden vor der Lebendzellmikroskopie unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt.

1. 6.1Unter steriler laminarer Strömung säen etwa 50.000 bis 110.000 HeLa-Zellen, die stabil GFP-markierte CDMPR- oder TfR-Reporterkonstrukte exprimieren, in jede Vertiefung eines μ-Objektträgers mit 4 Vertiefungen ibiTreat Kammer. Verwenden Sie 700 μl vollständiges Kulturmedium mit Antibiotika (DMEM mit hohem Glukosegehalt, phenolrotfrei), ergänzt mit 10 % FBS, 100 μl/ml Penicillin/Streptomycin, 2 μm/μg/ml Puromycin und 1,5 μg/ml Puromycin.
2. Inkubieren Sie die Zellen für 13-15 Stunden bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂ , um eine ordnungsgemäße Adhäsion und Proliferation zu ermöglichen. Die Zellen sollten bis zum nächsten Tag eine Konfluenz von etwa 80 % erreichen.
3. Ersetzen Sie am Tag der Bildgebung, kurz vor dem Experiment, das Medium in jeder Vertiefung vorsichtig durch 350 μl frisches, phenolrotfreies Vollständigmedium.
4. Parallel dazu wird eine VHH-mCherry-Arbeitslösung mit einer Endkonzentration von 2,5 μg/ml (ca. 50 nM) in einem vorgewärmten, phenolrotfreien Medium hergestellt. Halten Sie die Lösung bis zur Verwendung bei 37 °C.
5. Nach der Initialisierung des automatisierten Lebendzell-Imaging-Systems (z. B. FEI MORE oder Nikon Ti2 X-Light V3) heizen Sie die Inkubationskammer des Mikroskops auf 37 °C mit 5 % CO₂ vor, bevor Sie die ibidi-Mikroskopiekammer auf das Mikroskop übertragen und die Aufnahmeeinstellungen wie folgt konfigurieren.
   1. Wählen Sie den U PlanS Apo 100x NA 1.4 und fügen Sie die ibidi Mikroskopiekammer auf dem Mikroskoptisch hinzu.
   2. Richten Sie zwei Kanäle mit der entsprechenden Anregungswellenlänge und Einbandpass-Emissionsfiltern für EGFP (z. B. 470/20 nm, em: 517/20 nm) und mCherry (z. B. 550/15 nm, em: 590/20 nm) ein.
   3. Wählen Sie eine kurze Belichtungszeit und eine geringe Beleuchtungsintensität, um Photobleaching zu vermeiden (z. B. 50 ms und 5 % Leistung für EGFP, 160 ms und 25 % für mCherry). Es ist wichtig, dass die gewählten Werte für alle Experimente konstant gehalten werden.
   4. Speichern Sie pro Bedingung (=gut) die Koordinaten von 10 verschiedenen Sichtfeldern mit 3-4 Zellen im Fokus in einer Punktliste.
   5. Stellen Sie sich jede Position in dieser Punktliste einmal mit einem einzigen Schnappschuss vor. Dies sind die Referenzbilder vor der Zugabe von VHH-mCherry.
   6. Um die endozytäre Aufnahme zu initiieren, geben Sie vorsichtig 350 μl der vorgewärmten VHH-mCherry-Lösung in jede Vertiefung, um eine minimale Störung der Zellmonoschicht zu gewährleisten. Die Inkubation bei 37 °C mit 5 % CO₂ fortsetzen.
   7. Bilden Sie jeden Punkt in der Punktliste in einem Zeitrafferexperiment für 100 Bilder mit einer Verzögerung von 36 s zwischen den Bildern bei 37 °C und 5 % CO₂ wiederholt ab.
   8. Um das Photobleaching zu verringern, ordnen Sie die Erfassung der Kanäle an, um zuerst mCherry und dann EGFP abzubilden.
   9. Um den Durchsatz zu erhöhen, ordnen Sie die Akquisition an, zuerst alle Positionen nacheinander zu erwerben und dies für jeden Zeitpunkt zu wiederholen.

7. Bildanalyse der endozytären Aufnahme von VHH-mCherry

1. Bildvorverarbeitung und Datenextraktion nach der Aufnahme in Fidschi.
   1. Laden Sie das Zeitrafferbild mit dem Import-Plugin "Bio-Formate" und aktivieren Sie die Option "Kanäle teilen".
   2. Korrigieren Sie die laterale Drift mit dem MultiStackReg-Plugin. Verwenden Sie den EGFP-Kanal als Referenz und wenden Sie die Transformation auch auf den mCherry-Kanal an.
   3. Zeichnen Sie pro Zelle mit dem Polygonwerkzeug einen Bereich of Interest (ROI) (z. B. um den perinukleären Bereich) und fügen Sie ihn dem ROI-Manager hinzu.
   4. Messen Sie für beide Kanäle die mittlere Intensität in allen ROIs und Zeitpunkten mit der Multi-Measure-Funktion des ROI-Managers und speichern Sie die resultierende Tabelle als Textdatei.
   5. Öffnen Sie das entsprechende Referenzbild und wiederholen Sie die Messung für jeden ROI.
2. Datenanalyse zur Bestimmung endozytärer Aufnahmekurven
   1. Öffnen Sie die Textdatei und subtrahieren Sie jede Frame-Nummer durch 1, so dass sie bei 0 beginnt, und multiplizieren Sie dann jede Frame-Nummer mit der Verzögerung zwischen den Frames in s (d. h. 36).
   2. Subtrahieren Sie für jede ROI die mittlere Intensität im VHH-mCherry-Kanal des Referenzbildes von jedem Frame des entsprechenden Zeitrafferbildes im VHH-mCherry-Kanal, um die Autofluoreszenz und den Hintergrund zu entfernen.
   3. Teilen Sie für jedes Frame und jeden ROI die vom Hintergrund subtrahierte VHH-mCherry-Intensität durch die mittlere Intensität der EGFP-Kanäle, um Intensitätsschwankungen innerhalb des ROI zu berücksichtigen, die nicht VHH-mCherry sind, z. B. durch Golgi-Bewegung, Zellkontraktion, z-Drift oder Beleuchtungsinstabilitäten.
   4. Normalisieren Sie die resultierende Kurve auf ihr eigenes Maximum.
   5. Wählen Sie einen Bereich von Frames aus, um Artefakte am Anfang (d. h. Medienhinzufügung) oder Ende (d. h. Drift, Bleichen) des Zeitraffers auszuschließen.
   6. Passen Sie die Kurvendaten mit einer einzelnen exponentiellen Zerfallsfunktion an, die einen kinetischen Prozess erster Ordnung modelliert:
      
      wobei I(t) die normierte Intensität zum Zeitpunkt t ist und t₀ die Zeitverzögerung zwischen der VHH-mCherry-Addition und dem Beginn der Aufzeichnung berücksichtigt. Aus der Geschwindigkeitskonstante k wird die Halbwertszeit τ_1/2 des Prozesses wie folgt berechnet:
      
      HINWEIS: Bei der Durchführung eines Experiments mit mehreren nachträglich abgebildeten Sichtfeldern (FOV) pro Zeitpunkt kann jedes entsprechende t0 leicht unterschiedlich sein, sollte jedoch von einem FOV zum nächsten auf höhere Werte erhöht werden.
   7. Wiederholen Sie den Vorgang für alle Datensätze, und geben Sie die Halbwertszeiten in Boxplots an.

Um den retrograden Proteintransport zu verschiedenen intrazellulären Kompartimenten zu untersuchen, haben wir kürzlich ein Anti-GFP-Nanobody-basiertes Werkzeug zur Markierung und Verfolgung rekombinanter Fusionsproteine von der Zelloberfläche etabliert17. Hier beschreiben wir die bakterielle Produktion solcher derivatisierten Nanobodies und zeigen ihren Nutzen bei der Überwachung der endozytären Aufnahme durch Lebendzell-Bildgebung. In Kombination mit einem Golgi-residenten fluoreszierenden Reporter bietet dieses Protokoll eine robuste Plattform, um den retrograden Transport ausgewählter Frachtproteine zum trans-Golgi-Netzwerk (TGN) in Echtzeit quantitativ zu untersuchen.

Wir haben eine Sammlung unterschiedlicher funktionalisierter Anti-GFP-Nanobodies mit einer gemeinsamen modularen Architektur unter Verwendung von Standard-molekularen Klonierungstechniken17 generiert. Obwohl sich die aktuelle Studie auf die fluoreszierende Variante VHH-mCherry konzentriert, beziehen wir auch zusätzliche derivatisierte Nanobodies mit ein, um die Vielseitigkeit dieses Toolsets zu veranschaulichen und ihr Potenzial für zukünftige Anwendungen hervorzuheben. Unser grundlegendstes Konstrukt, VHH-std (std für standard), besteht aus der VHH-Domäne, T7- und HA-Epitopen für den antikörperbasierten Nachweis, einem C-terminalen Hexahistidin (His6)-Tag für die Aufreinigung und einer Biotin-Akzeptorpeptid (BAP)-Sequenz, um enzymatische Biotinylierung und hochaffine Streptavidin-basierte Pulldown-Assays zu ermöglichen (Abbildung 1A). Aus diesem Kerndesign wurden verschiedene Nanobody-Derivate entwickelt, um die Untersuchung des endozytären und retrograden Transports durch biochemische Analysen, Bildgebung von fixierten und lebenden Zellen sowie Elektronenmikroskopie zu erleichtern.

Für die Bildgebung des endozytären Transports in lebenden Zellen haben wir einen fluoreszierenden Anti-GFP-Nanobody entwickelt, der ein Fluorophor mit Anregungs- und Emissionsspektren enthält, die sich von denen von GFP unterscheiden, wodurch eine optimale spektrale Trennung während der Fluoreszenzmikroskopie gewährleistet wird. Aufgrund seiner überlegenen Faltungseigenschaften in IPTG-induzierten E. coli und seiner gut charakterisierten photophysikalischen Eigenschaften haben wir mCherry als Fluoreszenzmarkierung der Wahl ausgewählt. Auch andere rotverschobene Fluorophore, wie das monomere rot fluoreszierende Protein (mRFP), wären prinzipiell geeignete Alternativen, aber mCherry erwies sich in diesem System als besonders robust und effektiv.

Was ist das Potenzial anderer funktionalisierter Nanobodies als VHH-mCherry? Um den Proteintransport von der Plasmamembran zum trans-Golgi-Netzwerk (TGN) zu untersuchen, nutzten wir die kompartimentspezifische Lokalisierung von TPSTs, die sich ausschließlich in den TGN- und trans-Golgi-Zisternen befinden. Zu diesem Zweck modifizierten wir VHH-std mit einem Tandem-Tyrosinsulfatierungsmotiv (2xTS), das von Rattenprocholecystokinin29 abgeleitet ist, und ermöglichten so eine biochemische Auslesung der Ankunft der Fracht in diesen Kompartimenten. Während die Fusion von VHH-std mit mCherry die direkte Visualisierung des retrograden Transports durch fixierte oder lebende Zellbildgebung ermöglicht, ermöglicht die Funktionalisierung mit Peroxidasen wie APEX230 die ultrastrukturelle Lokalisierung durch Elektronenmikroskopie, gezielte zytochemische Ablation oder näherungsbasierte Biotinylierungsassays. Darüber hinaus bietet der Einbau einer Protease-Spaltstelle des Tabakätzvirus (TEV) in das Nanobody-Gerüst ein biochemisches Mittel zur Unterscheidung zwischen internalisierten und oberflächengebundenen Nanobodies (Abbildung 1A). Wir haben das VHH-tev-Konstrukt bereits verwendet, um die Recyclingkinetik von nanobody-gebundenen EGFP-CDMPR und TfR-EGFP17 zu überwachen. Das Wiederauftreten von Nanobody-markierten Rezeptoren an der Zelloberfläche konnte durch extrazelluläre Applikation rekombinanter TEV-Protease leicht nachgewiesen werden, was zu einem spezifischen Verlust der C-terminalen Epitopkassette des Nanobodies führte. Analog dazu ermöglicht die Einbeziehung einer TEV-Spaltstelle in den hier vorgestellten mCherry-funktionalisierten Nanobody VHH-mCherry eine dynamische Bewertung des EGFP-Reporterrecyclings durch Lebendzell-Bildgebung. Die Funktionalisierung mit alternativen Proteindomänen - wie zusätzlichen Fluorophoren, enzymatischen Tags oder Sequenzmotiven für die posttranslationale Modifikation - kann leicht durch Subklonierung gewünschter Inserts in das VHH-std-Rückgrat durch die SpeI- und EcoRI-Restriktionsstellen erreicht werden. Alle funktionalisierten Anti-GFP-Nanokörper-Konstrukte, die in der ursprünglichen Studie17 verwendet wurden, wurden bei Addgene zur öffentlichen Verteilung hinterlegt.

Unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls wurden alle hier dargestellten Nanobody-Varianten auf hohe Ausbeute und Reinheit aufgereinigt (Abbildung 1B). Lediglich die mCherry-Fusion zeigte nach der Aufreinigung ein geringes proteolytisches Clipping der Proteindomänen (Abbildung 1B, Spur 5). Die beiden beobachteten Abbauprodukte entsprechen höchstwahrscheinlich den einzelnen VHH- und mCherry-Domänen, wie aus ihren scheinbaren Molekulargewichten abgeleitet und durch epitopspezifische Immunoblot-Detektion verifiziert wurde (Abbildung 1C). In Abwesenheit von co-exprimiertem BirA wurde VHH-mCherry in der Regel mit einer Ausbeute von etwa 20 mg pro Präparat wiedergewonnen. Basierend auf unseren Erfahrungen reduziert die Co-Expression von BirA die Nanokörperausbeute konsequent um etwa 1/3 bis 1 /2. Die Biotinylierung war ziemlich vollständig, da die Nanobodies aus einer 1:1-Mischung mit BSA vollständig durch Streptavidin-Agarose zurückgewonnen wurden (Abbildung 1D).

Um die Eignung dieses Nanobody-Toolkits für die Untersuchung des endozytären Transports zu evaluieren, haben wir stabile HeLa-Zelllinien generiert, die EGFP-markierte Oberflächenrezeptorproteine mit unterschiedlichen intrazellulären Transportwegen exprimieren. Dazu gehörte TfR, das zwischen der Plasmamembran und frühen (Sortier- und Recycling-)Endosomen zirkuliert; TGN46, das über frühe Endosomen zwischen der Plasmamembran und dem TGN verkehrt; und beide MPRs, die zwischen dem TGN, der Plasmamembran und sowohl den frühen als auch den späten Endosomen pendeln17. EGFP wurde mit der extrazellulären Domäne jedes Rezeptors - spezifisch zwischen dem Signalpeptid und der Rezeptorsequenz für CDMPR, CIMPR und TGN46 - und mit dem C-Terminus von TfR fusioniert. Dieses Design bewahrte die nativen zytoplasmatischen Domänen und stellte sicher, dass alle bekannten Sortiersignale intakt blieben und der EGFP-Tag für die Bindung durch extrazelluläre Anti-GFP-Nanobodies zugänglich war (Abbildung 1E). Für CIMPR, dessen extrazelluläre Domäne ungewöhnlich groß ist, wurde eine verkürzte Version verwendet, die mit früheren Studien übereinstimmt, die gezeigt haben, dass eine solche Trunkierung das normale Transportverhalten beibehält31,32.

Stabile Zelllinien wurden durch retrovirale Transduktion etabliert, gefolgt von fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS), um homogene Zellpopulationen mit moderaten und vergleichbaren Expressionsniveaus zu isolieren. Bemerkenswert ist, dass EGFP-CDMPR in Immunblots konsistent als Doppelbande auftrat, ähnlich wie sein endogenes Gegenstück33, was auf eine heterogene Glykosylierung hinweist. Um zu beurteilen, ob die EGFP-Fusionsproteine die Steady-State-Lokalisations- und Expressionsmuster der endogenen Proteine rekapitulieren, wurden die stabil exprimierenden Zellen mit elterlichen HeLa-Zellen co-kultiviert und mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie analysiert (Abbildung 2B). Das EGFP-Signal spiegelte die Verteilung der entsprechenden endogenen Proteine originalgetreu wider. Wie erwartet lokalisierten CDMPR, CIMPR und ihre EGFP-markierten Versionen überwiegend in der perinukleären Region - was TGN und späte endosomale Kompartimente widerspiegelt - mit zusätzlicher Markierung in peripheren Endosomen. Sowohl endogenes als auch EGFP-markiertes TGN46 wurden fast ausschließlich im perinukleären TGN gefunden, während TfR und TfR-EGFP die charakteristische frühe Endosomenverteilung aufwiesen, mit ausgeprägter peripherer Sortierung und perinuklearen Recycling-Endosomen. Obwohl die verwendeten Antikörper sowohl die endogene als auch die EGFP-markierte Form (mit Ausnahme von CIMPR) nachweisten, war die Gesamtfärbeintensität in Zellen, die die Fusionsproteine exprimierten, nicht signifikant erhöht, was darauf hindeutet, dass die EGFP-Konstrukte nicht wesentlich überexprimiert waren. Der Hof hat EGFP-TGN46 und EGFP-CIMPR in Abbildung 2B zum direkten Vergleich mit EGFP-CDMPR und TfR-EGFP aufgenommen. Die Protokolle, die für die Zellfixierung und die Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden, sind in früheren Studien beschrieben17,19.

Mit Hilfe von VHH-mCherry kann der endozytäre Transport von EGFP-markierten Reporterproteinen durch Lebendzellbildgebung überwacht werden. Zu diesem Zweck haben wir als Beispiele Zellen verwendet, die EGFP-CDMPR und TfR-EGFP exprimieren. Die Zellen wurden im Zeitverlauf mit einem inversen Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop unter Zugabe von VHH-mCherry zum Medium abgebildet (Video 1 und Video 2). In Abbildung 3 sind Standbilder zu verschiedenen Zeitpunkten dargestellt. Die Aufnahme wurde quantifiziert, indem das Signal im mCherry-Kanal gemessen, der Autofluoreszenzhintergrund subtrahiert und auf das EGFP-Signal normalisiert wurde, um Schwankungen aufgrund der Bewegung markierter Kompartimente oder möglicher kleiner Verschiebungen in der Fokusebene zu eliminieren. Die Fluoreszenz von VHH-mCherry im Medium bei 25 nM war vernachlässigbar und beeinflusste die Messungen nicht. Die Analyse des Transports der Reporter von der Zelloberfläche zu ihren intrazellulären Kompartimenten zur Steady-State-Verteilung lieferte die gleichen kinetischen Ergebnisse wie die in Abbildung 2 der vorherigen Veröffentlichung gezeigten biochemischen Experimente17, mit scheinbaren Halbwertszeiten der Aufnahme von ~9 min für EGFP-CDMPR und ~4 min für TfR-EGFP und Sättigung nach ~43 min und ~20 min, beziehungsweise. Diese Werte waren vergleichbar mit Werten, die aus biochemischen Aufnahmeexperimenten mit Immunoblotting-Assays gewonnen wurden17. Prinzipiell kann auch die Kinetik des retrograden Transports in subzelluläre Regionen von Interesse, wie z.B. die perinukleäre Region mit der höchsten Konzentration von MPRs, analysiert werden. Die perinukleäre Region enthält jedoch nicht nur Golgi/TGN, sondern ist auch mit späten Endosomen und Recycling-Endosomen angereichert. Die Kinetik der Aufnahme von Nanobodies in den perinukleären Bereich ist nicht spezifisch genug, um den retrograden Transport zu einem definierten Organell zu analysieren. Um den Transport von der Plasmamembran zum TGN zuverlässiger beurteilen zu können, muss ein anderes fluoreszierendes Protein, ein TGN-residentes Transmembranprotein, zusammen mit dem GFP-Reporterprotein stabil co-exprimiert werden, so dass es keine spektrale Überlappung der Fluorophoreigenschaften gibt. Die Verwendung dieses zusätzlichen Markers ermöglicht den Nachweis von Reporter-importiertem VHH-mCherry, analog zur Tyrosinsulfatierung, die durch TPSTs vermittelt wird, wie zuvor dokumentiert19.

Abbildung 1: Design und Herstellung von derivatisierten Nanobodies zur Verfolgung von EGFP-markierten Zelloberflächenproteinen. (A) Schematischer Überblick über die derivatisierten Nanobodies. Das Standard-Nanobody-Konstrukt besteht aus einer GFP-spezifischen VHH-Domäne, T7- und HA-Epitop-Tags, einem Biotin-Akzeptorpeptid (BAP) und einem C-terminalen Hexahistidin-Tag (His6) für die Aufreinigung. Zu den weiteren Nanobody-Varianten gehören Modifikationen mit Tandem-Tyrosinsulfatierungsstellen (2xTS), der technisch hergestellten Peroxidase APEX2 oder dem fluoreszierenden Protein mCherry. Der Maßstabsbalken zeigt die Länge der Aminosäure (aa) an. (B) Bakteriell exprimierte und affinitätsgereinigte Nanobodies (20-50 μg) wurden mittels Gradient SDS-PAGE analysiert und durch Coomassie-Färbung sichtbar gemacht. Die Molekulargewichtsstandards (in kDa) sind auf der linken Seite angegeben. Geringfügiges proteolytisches Clipping wurde nur bei VHH-mCherry beobachtet, das wahrscheinlich zwischen den VHH- und mCherry-Domänen auftritt. (C) Immunoblot-Analyse von Nanokörper-Präparaten (10 ng) unter Verwendung von Antikörpern, die gegen T7-, HA- oder His-6-Epitope gerichtet sind oder durch Streptavidin-HRP (SA-HRP) zur Beurteilung der Biotinylierung nachgewiesen werden. (D) Das Ausmaß der Nanobody-Biotinylierung wurde durch Inkubation von Nanobodies im Verhältnis 1:1 mit BSA bewertet, gefolgt von Streptavidin-Agarose-Pulldown, Pelletierung und Waschen der Kügelchen. Gleiche Volumina des Überstands (S) und des perlengebundenen Materials (B) wurden anschließend mittels SDS-PAGE und Coomassie-Färbung analysiert. Die quantitative Rückgewinnung des Nanobodies in der beadgebundenen Fraktion deutet auf eine vollständige Biotinylierung hin. Das Vorhandensein von VHH- und mCherry-Fragmenten in der gebundenen Fraktion deutet auf eine partielle Degradation hin, die wahrscheinlich während der Probenvorbereitung für die SDS-PAGE-Analyse auftritt. Die weiße Linie zwischen den Fahrspuren 2 und 3 zeigt das Löschen von zwei nicht miteinander verknüpften Fahrspuren an. Diese Zahl wurde von17 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Expression und intrazelluläre Lokalisation von fluoreszenzmarkierten EGFP-markierten Frachtrezeptoren. (A) Schematische Darstellung der EGFP-Fusionskonstrukte. Sequenzen, die von sekretorischen Transmembranproteinen abgeleitet sind, sind schwarz dargestellt, wobei N-terminale Signalpeptide und interne Transmembrandomänen gelb hervorgehoben sind. Der EGFP-Anteil ist grün dargestellt. Für CDMPR, TfR und TGN46 wurden Konstrukte in voller Länge generiert, während für CIMPR eine gut charakterisierte verkürzte Variante verwendet wurde, um das normale Trafficking-Verhalten zu erhalten. Der Maßstabsbalken zeigt die Länge der Aminosäure (aa) an. EGFP-CDMPR und TfR-EGFP wurden bereits beschrieben17. (B) Um die subzelluläre Lokalisation zu beurteilen, wurden HeLa-Zellen, die EGFP-Fusionsproteine stabil exprimieren, mit elterlichen HeLa-Zellen co-kultiviert und mittels Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Der Maßstabsbalken stellt 10 μm dar. (C) HeLa-Zellen, die stabil EGFP-markierte Reporterproteine exprimieren, wurden lysiert, und Proteinextrakte wurden einer SDS-PAGE unterzogen, gefolgt von Immunblotting mit Antikörpern gegen GFP und Aktin. Auf der rechten Seite sind die Molekulargewichtsmarker (in kDa) angegeben. Diese Zahl wurde von17 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Lebendzell-Bildgebung der endozytären Aufnahmekinetik von Nanobodies, vermittelt durch EGFP-CDMPR und TfR-EGFP. Die Lebendzell-Bildgebung wurde nach Zugabe von 25 nM VHH-mCherry zu HeLa-Zellen durchgeführt, die stabil (A) EGFP-CDMPR oder (B) TfR-EGFP in phenolrotfreiem Vollmedium bei 37 °C exprimierten. Die Zellen wurden in den GFP- und mCherry-Kanälen mit einem halbautomatischen Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop in 36-s-Intervallen abgebildet. Es werden repräsentative zusammengefügte Standbilder gezeigt, begleitet von vergrößerten Ansichten der perinukleären Region (Vergrößerung: 2,2x) in einzelnen Kanälen unten. (Maßstabsleisten, 10 μm.) Siehe auch Video 1 und Video 2. Die quantitative Analyse der Aufnahmekinetik von Nanobodies in (C) EGFP-CDMPR und (D) TfR-EGFP wurde anhand von Daten aus drei unabhängigen Experimenten durchgeführt, die jeweils etwa 40 einzelne Zellen erfassten. Um die Bewegung der Organellen und die Variabilität der Fokalebene zu berücksichtigen, wurde die mCherry-Fluoreszenzintensität auf das GFP-Signal normiert (Norm) und als mittlerer ± SD für alle Zellen aus den drei Experimenten aufgetragen. Das durchschnittliche maximale Aufnahmesignal wurde auf 1 normiert. Die Aufnahmekinetik für jede Zelle wurde individuell unter Verwendung eines kinetischen Modells erster Ordnung angepasst. Die gezeichneten Linien stellen die gemittelten Kurven dar, die aus dem Mittelwert der entsprechenden Kurskonstanten abgeleitet wurden. Diese Zahl wurde von17 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Video 1: Lebendzell-Imaging der mCherry-Nanobody-Aufnahme mittels EGFP-CDMPR. HeLa-Zellen, die stabil EGFP-CDMPR exprimieren, wurden bei 37 °C in vollständigem Medium mit 25 nM VHH-mCherry inkubiert und sowohl im EGFP- als auch im mCherry-Fluoreszenzkanal in Abständen von 36 s abgebildet. Der Film wurde mit einer Wiedergaberate von 5 Bildern/s gerendert, was einer Echtzeitkompression von 3 min/s entspricht. Dieser Film wurde von17. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Video 2: Lebendzell-Imaging der mCherry-Nanobody-Aufnahme mittels TfR-EGFP. HeLa-Zellen, die stabil TfR-EGFP exprimieren, wurden bei 37 °C in vollständigem Medium inkubiert, das mit 25 nM VHH-mCherry ergänzt wurde, und in Abständen von 36 s auf EGFP- und mCherry-Fluoreszenz abgebildet. Der Film wurde mit 5 Bildern/s gerendert, was einer Zeitrafferrate von 3 min/s entspricht. Dieser Film wurde vom17. Bitte klicken Sie hier, um das Video herunterzuladen.

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