Dieses Protokoll legt eine objektive Definition der Graft-Suffizienz auf Basis der täglichen Urinabgabe und der Werte der Serum-Nierenfunktion fest, um reproduzierbar und objektiv zu charakterisieren, ob das Transplantat unabhängig in der Lage ist, die Homöostase aufrechtzuerhalten, ohne innerhalb der ersten 7 Tage nach der Transplantation auf Dialyse angewiesen zu sein.
Methodenartikel
Ein standardisiertes Autotransplantationsprotokoll der Schweineniere zur Untersuchung verzögerter Transplantatfunktion
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Verzögerte Transplantatfunktion (DGF) wird üblicherweise als die Notwendigkeit einer Dialyse innerhalb von 7 Tagen nach der Nierentransplantation definiert; Allerdings stützen sich aktuelle Definitionen oft auf subjektives klinisches Urteil und es fehlen standardisierte Kriterien, die die Graft-Suffizienz genau beschreiben. Diese Inkonsistenz erschwert Diagnose und Forschungsvergleiche. Dieses Protokoll legt objektive Schwellenwerte für DGF fest, indem quantifizierbare Urinabgabe und Serum-Nierenfunktionswerte verwendet werden, um die Graft-Suffizienz und die unabhängige Fähigkeit zur Aufrechterhaltung der Homöostase objektiv zu beschreiben. Die Forschung an Schweinemodellen ist herausfordernd, da es keine konsensvollen diagnostischen Endpunkte für DGF gibt und es schwierig ist, über längere Zeiträume Dialyse durchzuführen. Um dem entgegenzuwirken, führen wir ein klar definiertes Protokoll zur Definition und Induzierung von DGF bei der Autotransplantation der Schweineniere nach 30 Minuten isolierter Nieren-Wärmeischämie ein, wobei eine Spender-nach-Kreislauf-Tod-ähnliche (DCD)-ähnliche Beschaffung simuliert wird. Wir beschreiben nicht-invasive Foley-Katheterisation, zentralvenösen Zugang und arterielle Linienüberwachungsmethoden bei weiblichen Schweinen, die eine genaue Urinabmessung, tägliche Laborwerte und intraoperative Überwachung ermöglichen. Diese Techniken werden detailliert ausgeführt, um Transparenz und Reproduzierbarkeit zu gewährleisten und so einen standardisierten Endpunkt für DGF-Studien an Schweinen zu schaffen, der den klinischen Phänotyp wiederholt.
Einleitung
Die Warteliste für Nierentransplantationen in den USA übersteigt 90.000 Patienten. Aufgrund des Transplantatsmangels werden jährlich weniger als 30.000 Nierentransplantationen durchgeführt, während eine ähnliche Gruppe neuer Patienten auf die Warteliste1 gesetzt wird. Um diesem sich verschlechternden Mangel entgegenzuwirken, werden zunehmend suboptimale Ischämie-geschädigte DCD-Nieren ausgewählt. Tatsächlich stammen seit 2023 50 % der in den USA transplantierten Nieren von DCD-Spendern. DCD-Nieren sind mit hohen Raten verzögerter Transplantatfunktion (DGF) assoziiert. DGF wird von den meisten als Dialysebedarf innerhalb von 7 Tagen nach der Nierentransplantation definiert. Obwohl DGF eine temporäre Graft-Insuffizienz darstellt, ist sie mit erhöhten Raten früher und später Graft-Abstoßung und einer kürzeren mittleren Überlebensdauer von 8–12 Jahren2 verbunden. Da es sich größtenteils um eine subjektive klinische Definition handelt, ist DGF aufgrund fehlender objektiver, standardisierter Definition und der Herausforderungen der Langzeitdialyse bei Schweinen schwierig zu untersuchen. In dieser Arbeit entwickelten wir ein objektives, standardisiertes Protokoll zur Definition der Graft-Suffizienz und zur Induzierung von DGF bei der Autotransplantation der Schweineniere. Aufgrund der xenotransplantationsbewiesenen Ähnlichkeiten in der Funktion von Schweine- und menschlichen Nieren lässt sich dieses Protokoll auf eine menschliche Nierentransplantation übertragen. Die Porcine Kidney-Autotransplantation wurde für dieses Modell ausgewählt, um hauptsächlich die Wirkung der Ischämie-Reperfusionsverletzung als Variable zur Kontrolle der frühen Transplantatinsuffizienz zu isolieren und die Alloimmunitäts- oder Immunsuppressionstoxizität als Störfaktoren zu neutralisieren.
Definition der verzögerten Transplantatfunktion: Um die beiden Hauptherausforderungen zu überwinden: 1) objektive Definition der Graft-Suffizienz und 2) die Definition des temporären Charakters des Phänotyps ohne Dialyseunterstützung als Brücke zur funktionellen Transplantat-Wiederherstellung, verwendeten wir objektive Urinabgabe und Nierenfunktionspanelwerte, um die Krankheit zu definieren. Die Standardisierung der Volumenwiederbelebung, die Kriterien für die Autotransplantation sowie das Fehlen einer anastomotischen Kompromittation (Arterie, Vene oder Harnleiter) schließen eine dauerhafte, anatomische Ursache der Transplantatinsuffizienz aus. Wir definierten die verzögerte Graftfunktion bei der Schweineautotransplantation als: Frühe temporäre Graftinsuffizienz aufgrund anhaltender Anurie (<100 mL/Tag) von mehr als 3 Tagen, was zu variablen Werten von BUN, Kreatinin und Kalium bis zu einem humanen Endpunkt von K ≥ 8 mEq/L (hohes Risiko für Herzarhythmie und objektive Indikation für dringende/emergente Dialyse) bei Abwesenheit von anastomotischer Kompromittation führt. Basierend auf dieser Definition produziert ein funktionelles Transplantat genügend Urinausscheidung, um das Elektrolytgleichgewicht zu erhalten und BUN und Kreatinin abzusenken. Umgekehrt produziert ein unzureichendes Transplantat nicht genug Urin, um BUN und Kreatinin auszuscheiden, und verursacht eine lebensbedrohliche Hyperkaliämie, die Dialyse (oder humane Euthanasie in deren Abwesenheit) erfordert, aufgrund reversibler parenchymaler Ischämie-Reperfusionsverletzung und nicht wegen irreversibler anastomotischer Kompromittation oder Abstoßung.
Protokoll
Diese Studie wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Duke University genehmigt. In diesem Modell werden ausschließlich weibliche (für nicht-invasive Foley-Kathetereinführung) Yorkshire-Schweine mit einem Gewicht von 40–50 kg (für bequeme Niergefäss- und Harnröhrenostialdurchmesser für Cannulation) verwendet. Dieses Protokoll könnte von einem Team aus vier Personen durchgeführt werden: einem Chirurgen, einem Assistenten, einem Organperfusionist und einem Studienleiter (für Proben, Materialien und Daten).
1. Postoperativer Tag (POD) -1 (Nierenbeschaffung der Nieren)
- Anästhesie
- Behandeln Sie die Tiere mit intramuskulären (IM) Injektionen von Ketamin (22 mg/kg) und Midazolam (0,5 mg/kg) vorab mit Medikamenten.
HINWEIS: Der Beginn mit einer relativ höheren Ketamindosis hilft, den Bedarf an Isofluran während der Operation sicher zu reduzieren. - Geben Sie Isofluran zunächst über den Schnauzenkegel mit 1-1,5 % (maximal 2,5 %), bis Kiefer und obere Atemwege entspannt sind, um die Intubation zu ermöglichen. Stellen Sie das Gezeitenvolumen auf 7–7,5 mL/kg und die Belüftungsrate auf 18–20 Atemzüge pro Minute ein, um die physiologischen Sauerstoffsättigung und PCO2 zu erhalten. Tragen Sie vorsichtig Augensalbe auf und/oder kleben Sie die Augenlider zu, um die Augen vor Kratzen oder Austrocknungen zu schützen.
- Behandeln Sie die Tiere mit intramuskulären (IM) Injektionen von Ketamin (22 mg/kg) und Midazolam (0,5 mg/kg) vorab mit Medikamenten.
- Verlegung der tunnelförmigen zentralen Strecke
- Lege eine 9,6 Fr Single-Lumen-Hickman-tunnelierte Zentralkatheterkatheterin, die von der Rückseite des Schweins aus der Haut verlässt, zwischen die Schulterblätter, um schmerzfreie Blutproben auf Bedarf zu ermöglichen, während sie mit minimalem Stress und geringem Risiko einer Störung des zentralen Katheters auf der Seite liegen können (Abbildung 1).
- Nach der Vorbereitung der Haut werden mit einem 11-Blatt-Skalpell drei oberflächliche Hautstiche durch die Dermis zur subkutanen Fettschicht, zwischen den Schulterblättern, am Nacken und an der rechten vorderen Seite des Halses durchgeführt.
- Verwenden Sie den Gewebetunnel, um einen subkutanen Tunnel zu schaffen, der die drei Schnitte verbindet. Im Bauchliegen führen Sie den Katheter von zwischen den Schulterblättern bis zum rechten vorderen Hals.
- Um den zentralen Katheter in die rechte äußere Jugularvene (EJ) einzuführen, drehen Sie das Schwein in die liegende Trendelenburg-Position und verwenden Sie eine 18-G-Suchnadel, um das EJ mit der Flourney and Mani anatomischen Triangulationstechnik3 zu aspirieren. Führen Sie einen Draht mit Seldingers Technik4 in das Lumen, verwenden Sie den Peel-Away-Einbringer zur Erweiterung des Trakts, führen Sie den Hickman-Katheter in das Lumen des EJ ein und sichern Sie die zentrale Leitung auf der Rückseite. Nach Bestätigung des Blutrücklaufs wird die Heparinleitung verschlossen und nach jeder Anwendungwiederholt. Wenn der Zugang zum rechten EJ schwierig ist, verwenden Sie den Tissue Tunneler, um den subkutanen Tunnel vorne zur Luftröhre zu verlängern und den Katheter zur linken Seite des Halses zum Einsetzen in den linken EJ zu führen.
- Lege eine 9,6 Fr Single-Lumen-Hickman-tunnelierte Zentralkatheterkatheterin, die von der Rückseite des Schweins aus der Haut verlässt, zwischen die Schulterblätter, um schmerzfreie Blutproben auf Bedarf zu ermöglichen, während sie mit minimalem Stress und geringem Risiko einer Störung des zentralen Katheters auf der Seite liegen können (Abbildung 1).
- Foley-Platzierung (drei Methoden zur Erhöhung der Invasivität im Falle eines Versagens der Einführung)
- Manueller Ansatz
- Legen Sie das Tier in Rückenlage auf den Operationstisch. Bereiten Sie die Haut rund um das Vaginalgewölbe mit Betadin vor und füllen Sie das vaginale Gewölbe mit 10 ml Betadin (um die mikrobielle Last und das Harnwegsrisiko zu verringern).
HINWEIS: Selbst wenn sie vollständig aufgeblasen sind, neigen 5-ml-Ballons dazu, herauszurutschen. - Führen Sie einen 12-14 Fr befeuchteten Foley-Katheter ein, der manuell mit einem Draht versteift wird, indem Sie nach der 4-5 cm tiefen Harnröhrenöffnung in die Vaginalöffnung an der vorderen (ventralen) Scheidenwand tasten.
- Legen Sie das Tier in Rückenlage auf den Operationstisch. Bereiten Sie die Haut rund um das Vaginalgewölbe mit Betadin vor und füllen Sie das vaginale Gewölbe mit 10 ml Betadin (um die mikrobielle Last und das Harnwegsrisiko zu verringern).
- Spekulum-Ansatz: Wenn der manuelle Ansatz fehlschlägt, verwenden Sie ein befeuchtetes Spekulum, um die Harnröhrenöffnung in der Vagina zu visualisieren. Verwenden Sie die lange DeBakey-Pinzette mit steriler Mullbinde, um das Betadine vorsichtig trocken zu tupfen, und führen Sie den 12-14 Fr, 10 ml Ballon-Foleykatheter mit oder ohne Versteifungsdraht unter direkter Visualisierung ein. Pumpen Sie den Ballon erst auf, nachdem Sie den Urinrückgang überprüft haben.
- Chirurgischer Ansatz: Wenn auch der Spekulum-Ansatz (Schritt 1.3.2) fehlschlägt, wird der Foley-Katheter chirurgisch über einen Draht eingeführt. Nach der Laparotomie wird eine 18-G-Nadel in die Blase eingeführt, ein 0,035" langer Draht von etwa 1 m Länge durch die Blase in die Harnröhre geführt und der Foley-Katheter darüber zur Blase geführt, um den Ballon aufzublasen. Ziehen Sie den Draht durch die Vagina (um eine Bauchkontamination zu vermeiden) und schließen Sie das kleine Nadelloch in der Blase mit einem einschichtigen 6-0 Prolene Acht-Verschluss. Nähen Sie den Körper des Foley und einen 1-Liter-Urinabfangbeutel an die Haut des Schweins (Abbildung 1).
- Manueller Ansatz
- Präinzisionsmedikamente
- Verabreichen Sie die erste der täglichen Thrombozyten-Dosis Aspirin 81 mg oral im Wangenbeutel, gefolgt von Ceftiofur Depot IM-Antibiotikum, 1 g Cefazolin intravenös über eine zentrale Venenkatatenleitung zur SSI-Prävention, IM Buprenorphin (0,005–0,01 mg/kg) zur Schmerzkontrolle und Beginn einer Gesamtdosis von 1 L ausgewogener Elektrolytlösung mit einer konstanten Infusion von 250 ml/h.
2. Lebenserhaltende Porcine DCD-Nieren-Autotransplantation
- Nierenbeschaffung
- Bereite die Haut des Bauches vor und drapiere sie. Führen Sie eine Mittellinien-Laparotomie vom Xyphoid bis zum Schamhaut durch.
HINWEIS: Es gibt 1–2 große Venen, die die Mittellinie subkutan in der Nähe des Schambeins durchqueren, stark bluten, wenn sie geschnitten werden, aber mit Elektrokauterie leicht kontrolliert werden können. - Stellen Sie einen Bookwalter-Retraktor (oder zwei Balfour-Retraktoren im 90°-Winkel) mit vier Körperwandklingen auf, die beide Seiten der Bauchwand nach oben halten, um ein Auslaufen des Dünndarms aus dem Bauch mit anschließender venöser und lymphatischer Kompression sowie einer Schwellung des Darms zu verhindern.
- Mit zwei warmen, mit Kochsalzlösung befeuchteten OP-Handtüchern wird der Darm auf die linke Seite des Bauches zurückgezogen und die darüberliegenden Retraktoren wieder eingesetzt, um vorsichtig das rechte Retroperitoneum mit der rechten Niere freizulegen.
HINWEIS: Ein gewisser Grad an Trendelenburg-Position (Kopf nach unten) kann ebenfalls bei der Darmretraktion helfen. - Öffnen Sie das hintere Peritoneum auf der lateralen Seite der Niere (um eine Verletzung des rechten Harnleiters vor der Visualisierung zu vermeiden). Schneiden Sie den rechten Harnleiter vom hinteren Peritoneum und von der rechten Nierenarterie ab und teilen Sie ihn auf zwei 2-0 Seidenbänder am unteren Pol der rechten Niere. Lassen Sie einen längeren Nahtschwanz am verbleibenden Harnleiter für die Identifizierung während des Implantats (24 Stunden später). Lassen Sie den Rest des Harnleiters unter der Peritonealschleimhaut bedeckt, um Narbenbildung und die Notwendigkeit einer umfangreichen Dissektion bei der zweiten Implantatoperation zu reduzieren.
HINWEIS: Achten Sie gut darauf, die beiden lumbalen Venen, die sich unmittelbar unter der Abnahme der rechten Nierenarterie von der Aorta (schweinespezifische Anatomie, die sich von der menschlichen retroperitonealen Anatomie unterscheidet) mit der IVC verbinden, nicht zu verletzen. Das Binden und Teilen dieser Lendenvenen ist ebenfalls eine sichere Option. - Schneiden Sie die Nierenarterie weg von der Nierenvene und entlang ihres Verlaufs unter der IVC bis zu ihrem Aortenursprungspunkt, um die maximale verfügbare arterielle Länge zu erreichen. Kurz zusammendrücken und zum linken Retroperitoneum rollen, um den Ursprung der rechten Nierenarterie freizulegen, die nach dem Start von der Bauchaorta darunter verläuft.
HINWEIS: Bei Schweinen gibt es typischerweise 1–2 Lymphknoten, die mit der Nierenarterie verbunden sind und sie verdecken; Allerdings wird die Nierenarterie nach der Zerlegung und Entfernung dieser Knoten gut skelettisiert. - Seziere die rechte Nierenvene weg von der rechten Nebenniere und Schädel. Um einige Millimeter Abstand zwischen der rechten Nierenvene und der Nebenniere zu erreichen, heben Sie vorsichtig die hintere Peritonealschleimhaut von der rechten Nierenvene ab, bis die größeren adrenalen Drainagevenen sichtbar sind, die in die IVC eintreten.
- Um den DCD-Beschaffungsprozess zu simulieren, verabreichen Sie 500 U/kg Heparin über die zentrale Vene und lassen Sie es 5 Minuten zirkulieren, dann verbinden Sie die Nierenarterie doppelt und anschließend die Nierenvene am Ursprung (für maximale Länge) mit 2-0 Seidenbändern oder größer (3-0 Seidenbänder sind für dieses gefügte Gewebe zu dünn und spröde und rutschen häufig) und starten Sie eine Stoppuhr für 30 Minuten In-situ isolierte Nieren-Warm-ischämische Zeit. Während der warmen ischämischen Zeit verwenden Sie eine Tenotomie-Schere oder Elektrokauterie auf der Schnittstelle, um die Nierenarterie und Vene zu skelettisieren und voneinander zu trennen, damit die Implantation später erleichtert werden kann.
HINWEIS: Die Skelettisierung der Gefäße vor Ort während der warmen ischämischen Zeit nutzt die vaskuläre Kontrolle zur Verhinderung von Blutverlust im Falle einer Gefäßverletzung und ermöglicht es den blutgefüllten Gefäßen, kleine Gefäßlecks freizulegen, die durch Blutungen aus der isolierten Nierenzirkulation repariert werden könnten, die zur Simulation einer ischämischen Verletzung abgesperrt werden könnten. - Am Ende der warmen ischämischen Zeit wird die Gefäße und der Harnleiter geteilt, die Nierenarterie mit einer 3 mm langen geraden Kanüle gekanüliert und 250 ml eisige Lösung der Belzer University of Wisconsin über die Nierenarterie verabreicht.
HINWEIS: Eine 5 mm lange gerade Kanüle ist zu groß und könnte zu intimen Schäden und Klappenbildung führen. - Bewahren Sie das Transplantat durch hypothermische unoxygenierte Maschinenperfusion für 24 Stunden. Bewässern Sie den Bauch mit 1 L ausgewogener Elektrolytlösung und schließen Sie die Faszie mit kontinuierlichen 1-0 Prolene-Schleifennähten. Spülen Sie die Wunde und schließen Sie die Haut mit Klammern.
- Das Schwein wird extubiert und ins Gehege zurückgekehrt, um sich 24 Stunden von der Narkose zu erholen. Zur Schmerzlinderung geben Sie Bupivacain (gewichtsbasierte Dosierung) subkutan in die Wundränder und verabreichen Sie IM mit verlängerter Freisetzungsdosis Buprenorphin (gewichtsbasierte Dosierung).
HINWEIS: Paracetamol könnte ebenfalls ohne Auswirkungen auf GFR verabreicht werden (im Gegensatz zu NSAIDs).
- Bereite die Haut des Bauches vor und drapiere sie. Führen Sie eine Mittellinien-Laparotomie vom Xyphoid bis zum Schamhaut durch.
- Nierenimplantation
HINWEIS: Die Nierenimplantation erfolgt intraperitoneal nach dem modifizierten Starzl-Ansatz mit Nierenimplantat direkt auf die Bauchaorta und IVC mit Harnleiter-Harnleiter-Anastomose6. Die rechte Niere wird nach der Simforoosh-Technik explantiert und in einer niedrigeren Position wieder implantiert, umgekehrt im rechten Retroperitoneum, nach der Simforoosh-Technik7. Die Implantatoperationszeit liegt zwischen 3 und 5 Stunden, die Implantat-Nähzeit zwischen 20 und 40 Minuten, abhängig vom Ausbildungs- oder Fachwissen sowie der Komplexität der Anatomie.- Nach 24 Stunden Erholung prämedizieren, intubieren, vorbereiten und den Bauch des Schweins erneut im OP legen (Abbildung 2).
- Arterielle Linienplatzierung (drei Methoden im Falle eines Fehleinsatzes)
- Ohrarterienleitung: Um die Hämodynamik intraoperativ zu überwachen und die Wiederbelebung von Flüssigkeit und Pressor, insbesondere nach der Reperfusion, zu leiten, um das Tier durch das Reperfusionssyndrom zu unterstützen und eine sekundäre akute Niere-Nieren-Verletzung (AKI) zu vermeiden, wird eine 22-G-Angiokatharterielinie in der Ohrarterie durch Palpation des Pulses der Ohrarterie auf der Rückseite eines der Ohren des Schweins eingesetzt.
- Halsschlagaderarterienlinie: Wenn die Ohrinsertion fehlschlägt, wird alternativ ein Mittellinienschnitt im Hals bis zur Luftröhre geschaffen. Sezieren Sie das Bindegewebe neben der Luftröhre und ziehen Sie es mit einem Weitlaner oder einem Gelpi selbsthaltenden Retraktor zurück. Nach der Visualisierung umschließen Sie die Halsschlagader mit einem 2-0 Seidenband. Setzen Sie eine perkutane 4-Fr-Cordis-Halsschlagaderlinie mittels Seldinger-Technik ohne Arterielle Dilatation. Binden Sie das distale Ende der Halsschlagader ab und lassen Sie am Ende der Operation nach Entfernung der arteriellen Linie eine 2-0-Seidenbande, um das proximale Ende abzuschließen, gefolgt von einem gehefteten Hautverschluss.
- Femoralarterienlinie. Alternativ könnte eine Femorallinie perkutan oder durch Cutdown eingesetzt werden.
HINWEIS: Eine Femurlinie wird während des Klemmens der Aorta für die arterielle Anastomose während der Implantation vorübergehend funktionsunfähig gemacht.
- Arterielle Linienplatzierung (drei Methoden im Falle eines Fehleinsatzes)
- Präinzisionsmedikamente
- Verabreichen Sie die zweite der täglichen Thrombozyten-Dosis, Aspirin 81 mg, oral im Wangenbeutel, gefolgt von 1 g Cefazolin intravenös über die Zentralkatheter zur SSI-Prävention, IM Buprenorphin (0,005–0,01 mg/kg) zur Schmerzkontrolle und beginnen mit insgesamt 4 L ausgewogener Elektrolytlösung mit einer konstanten Dosis von 250 ml/h.
- Beginnen Sie mit einer konstanten, nicht-titraierbaren Dopamininfusion durch die Zentralkatheter bei 2 μg∙kg-1∙min-1 und einer Noradrenalininfusionsinfusion bis maximal 0,4 μg∙kg-1∙min-1 für eine Ziel-MAP von 80-100 mmHg.
HINWEIS: Die Flüssigkeitsinreichung kann vorübergehend auf 1 L/h oder höher über einen Druckbeutel unmittelbar vor der Reperfusion erhöht werden, um eine bessere hämodynamische Unterstützung zu bieten, wenn die Hypotonie während des Reperfusionssyndroms besonders herausfordernd ist.
- Öffnen Sie den Bauch wieder, indem Sie die Hautklammern entfernen und die Faszienähte durchtrennen und den Bookwalter-Retraktor wieder einführen.
- Die absteigende Colon-Peritonealbedeckung an der Mittellinie, die über der Aorta und IVC liegt (bei Schweinen ist der absteigende Dickdarm über eine kürzere Peritonealabdeckung an die Mittellinie, die über der Aorta liegt, und IVC von den linken Nierengefäßen zur unteren Mesenterienarterie befestigt, um die Aorta und IVC im Retroperitoneum (Ort der Nierentransplantation) freizulegen.
HINWEIS: Seien Sie darauf bedacht, nur den Peritonealansatz des Dickdarms unmittelbar oberhalb der großen Gefäße zu trennen und den absteigenden Dickdarm nicht zu devaskularisieren, indem Sie die gebogenen oberen und unteren mesenterialen Arten, die näher an der Darmwand verlaufen, trennen.
Bei dieser Bewegung wurde kein innerer Hernie beobachtet, wie die Nekropsien zeigten, die zeigten, dass dieser Raum bereits am postoperativen Tag 7 vernarbt und sich spontan geschlossen hatte. - Schneiden Sie die Aorta und IVC beidseitig von ihrer lateralen Peritonealbefestigung zu den Psoasmuskeln auf. Anschließend werden Aorta und IVC voneinander entfernt getrennt, bis die Lendenarterien und Venen sichtbar sind. Optional: Maximale Elevation und Lumenfreilegung der Aorta in der Satinsky-Klemme während des Nähens ermöglichen, die 1–2 Wirbelarterien und Venen, die sich üblicherweise in diesem Abschnitt der großen Gefäße (von den linken Nierengefäßen bis zur unteren Mesenterienarterie) befinden, im Segment der lumbalen Aorta zwischen 2–0 Seidenbändern zu zerlegen, binden und teilen. Skelettisieren Sie den Lendenbereich der Aorta aus ihrer schweren Adventitialschicht, um sie auf die Einnistung vorzubereiten.
HINWEIS: Bei diesem Manöver wurden keine Spinalkomplikationen festgestellt. - Verabreichen Sie systemisch 100 U/kg Heparin über die Zentralkatheter und lassen Sie es 5 Minuten zirkulieren. Gleichzeitig wird das Anästhesieteam gebeten, die Geschwindigkeit der ausgewogenen Elektrolytlösungsinfusion vorübergehend von 250 mL/h auf 1 L/h zu erhöhen und Noradrenalin bei Bedarf auf maximal 0,4 μg∙kg-1∙min-1 zu titrieren, um eine MAP von 80-100 mmHg als Vorbereitung auf das Reperfusionssyndrom zu erreichen.
- Klemme die IVC mit einer seitlich beißenden Satinsky-Klemme, die schräg caudal ist (um die Hände des Nähchirurgen auf der linken Seite des Schweins nicht zu beeinträchtigen) und führe eine Venotomie durch und saug/spüle das Innere der IVC.
- Nehmen Sie die Niere aus dem Eis oder aus der Maschinenperfusion, spülen Sie sie mit 250 ml eiskalt ausgewogener Elektrolytlösung und bringen Sie sie ins Operationsfeld, was den Beginn der zweiten warmen ischämischen (Näh-)Zeit markiert.
- Drehen Sie das rechte Nierenautotransplantat auf den Kopf (Simforoosh-Technik), sodass der Harnleiter nach oben zeigt, die Arterie medial und die Vene lateral und auf der rechten Seite des Bauches zur infrarenalen Aorta 7,9 platziert wird.
- Venöse Anastomose: Verwenden Sie zwei doppelt armelige 6-0 Prolene-Nähte, um eine laufende venöse Anastomose durchzuführen. Setzen Sie eine Bulldoggenklemme auf die Nierenvene und entfernen Sie die Satinsky-Klemme. Unabhängig vom Zeitpunkt des Nähens der Vene sollten Sie die Satinsky-Klemme für standardisierte 25 Minuten am IVC lassen, um eine standardisierte ischämische Verletzung des Transplantats zu ermöglichen.
- Arterielle Anastomose: Nach der 25-minütigen IVC-Klemme und 5-minütigem Halten zwischen den Gefäßen verwenden Sie erneut die Satinsky-Klemme, um die Aorta vollständig abzuklemmen. Mache einen Schlitzschnitt und verbreite ihn mit einem 4,0 mm Rundloch, um eine saubere Öffnung zu sichern. Verwenden Sie eine doppelarmige 6-0-Prolene-Naht, um eine Fallschirmspring- oder Arterienanastomose von der Heile bis zur Zehe durchzuführen. Ebenso sollte die Satinksy-Klemme unabhängig von der Geschwindigkeit des Abschlusses der arteriellen Anastomose 25 Minuten an der Aorta gehalten werden, um eine Gesamt-Nähzeit von 55 Minuten zu standardisieren.
HINWEIS: Die gesamte warme ischämische Zeit (30 Minuten simulierende Spende und 55 Minuten simulierende Implantatmanipulation) führte zur Einleitung von DGF. - Transplantat-Reperfusion: Nach der gesamten standardisierten 55 Minuten der Nähzeit der warmen ischämischen Nähzeit entfernen Sie zuerst die Bulldog-Klemme an der Nierenvene, gefolgt von der Satinksy-Klemme an der Aorta und prüfen Sie auf Transplantatreperfusion und Hämostase. Halten Sie eine aggressive Flüssigkeits- und Noradrenalin-Wiederbelebung aufrecht, um eine MAP von 80–100 mmHg für etwa 1 Stunde nach der Reperfusion zu erreichen, um das Tier durch das Reperfusionssyndrom zu unterstützen.
HINWEIS: Vergessen Sie nicht, alle 18-G-Nadelbiopsiestellen – falls durchgeführt – mit Druck und hoher koagulativer Oberflächenelektrokauterität zu kontrollieren. - Harnleiteranastomose: Skelettisieren Sie die verbleibenden und die Transplantat-Harnleiter, indem Sie 1 cm des umgebenden Fettgewebes entfernen. Spatuleer 1 cm des Transplantatharnleiters und des restlichen rechten Harnleiters. Verwenden Sie zwei doppelarmige 6-0 Prolene (PDS bei der Planung des längeren Überlebens, um das Risiko einer Steinbildung zu verringern) als Annäherung. Führen Sie einen 7F x 24 cm großen Doppel-J-Harntreiberstent über die frische Anastomose und schließen Sie die Anastomose mit laufenden Nähten ab.
- Kontralaterale Nephrektomie
- Damit die transplantierte Niere die lebenserhaltende Niere ist, entfernen Sie die kontralaterale (linke) Niere.
- Bauchverschluss
- Nach der Überprüfung auf Hämostase und Zählungen spülen Sie den Bauch mit 1 Liter ausgewogener Elektrolytlösung und schließen Sie die Faszie mit 1-0 geschleiftem Prolene, gefolgt von einer Hautspülung und Schließung mit einem Tacker. Geben Sie 0,25 % Bupivacain in die Nahtleitung zur lokalen Betäubung und injizieren Sie SQ-Verlängerungsmittel zur Schmerzlinderung. Extubieren Sie das Schwein und bringen Sie es über Glas- oder Kunststoffbarrieren zurück in ihr separates Gehege, um zu verhindern, dass sie sich gegenseitig in die Zentralkatheter und Foley-Katheter beißen.
- Nach 24 Stunden Erholung prämedizieren, intubieren, vorbereiten und den Bauch des Schweins erneut im OP legen (Abbildung 2).
- Tägliche postoperative Pflege
- Überprüfen Sie die Ferkel bei der Runde QID, hauptsächlich um sicherzustellen, dass der Urinabfangbeutel nicht überfüllt wird, was zu iatrogenen postrenalen Verschluss sowie Blasen- oder Harnleiterrupturen führt.
- Am Morgen verabreichen Sie 81 mg Aspirin orale Antithrombozyten, entnehmen Sie eine Blutprobe aus der Zentralvente und setzen sie mit einem Hep-Lock-Effekt, messen Sie die Urinabgabe im Urinbeutel und nehmen Sie eine Probe.
HINWEIS: Keine weiteren intravenösen Flüssigkeiten oder Medikamente sind angezeigt, da die Schweine normalerweise durch POD1 ihren Appetit und ihre Darmfunktion zurückgewinnen.
- Opfer
- Am Ende der Studie zu POD7 oder früher, um einen humanen Endpunkt zu gewährleisten, wird das Schwein erneut unter Vollendotrachealnarkose gelegt und das Transplantat mit Ultraschall auf anastomotische Integrität untersucht, gefolgt vom Wiederöffnen des Bauches wie zuvor beschrieben.
- Untersuchen Sie das Transplantat auf Anzeichen von Durchfluss und prüfen Sie die drei Anastomosen auf Öffnung. Entfernen Sie das Transplantat mit den drei Anastomosen intakt und spatulieren Sie sie entlang ihrer Länge, um ihre innere Integrität und Öffnung zu überprüfen.
- Biopsie des Parenchyms der Niere mit einer 18-G-Biopsiepistole.
Ergebnisse
Sofortige versus verzögerte Transplantationsfunktion. Wir führten n = 5 porcine 30-minütige DCD-Nieren-Autotransplantationen nach 24 Stunden hypothermischer unoxygenierter Maschinenkonservierung mit (MAP = 40 mmHg) durch und überwachten in der ersten Woche nach der Transplantation den Phänotyp der Transplantatwiederherstellung und -funktion, wobei tägliche Blutproben und die gesamte Urinproduktion verwendet wurden. Wir beobachteten zwei Phänotypen der Genesung nach der Transplantation. Der erste Phänotyp zeigte eine sofortige/frühe Transplantationswiederherstellung/Suffizienz. Drei von fünf Schweinen, die mit den simulierten DCD-Transplantaten implantiert wurden (60 %) hatten eine Rückkehr der Urinproduktion (tägliche Urinproduktion > 500 mL/Tag) durch POD 2-3, was eine kontinuierliche Elektrolyt-Homöostase ohne Eingriff (Dialyse, Kaliumchelation oder insulinvermittelte intrazelluläre Verschiebung) ermöglichte (Abbildung 3). Der zweite Phänotyp war die verzögerte Graftfunktion (DGF), gekennzeichnet durch anhaltende Anurie nach POD 3, verbunden mit der Ansammlung von Serum-BUN, Kreatinin sowie der Entwicklung von Hyponatriämie und Hyperkaliämie, die eine objektive klinische Indikation für die Dialyse wären. Anurie und Hyperkaliämie verschlimmerten sich und führten zu EKG-Veränderungen (gespitzte T-Wellen) bei K ≥ 8 mEq/L. Dies stellte eine dringende Dialyse-Indikation dar und wurde daher als humaner Endpunkt behandelt. Sobald dieser Endpunkt erreicht war, wurde eine Euthanasie unter Vollnarkose durchgeführt, um weitere Gründe für Insuffizienz/-versagen des Transplantats durch anastomotische Kompromittation oder andere chirurgische Komplikationen auszuschließen. Nach dieser Definition von DGF entwickelten schweinesche DCD-Nieren mit 30 Minuten in-situ warmer Ischämie, gefolgt von 24 Stunden hypothermischer, nicht sauerstoffhaltiger Maschinenkonservierung und 55 Minuten Nähzeit warmischämische Ischämiezeit DGF mit einer Rate von 40 % (zwei von fünf Schweinen). Diese DGF-Rate wiederholt die berichtete Rate bei humaner DCD-Nierentransplantation1.
Abbildung 1: Tunnelgeführte Zentralleitung und Platzierung des Foley-Katheters. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Lebenserhaltende Porcine DCD-Nieren-Autotransplantation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 3: Verzögerte Transplantationsfunktion im Schweinemodell. Der Unterschied in der (A) Urinproduktion zwischen sofortigen und verzögerten Transplantaten; (B) Kaliumspiegel zwischen sofortiger und verzögerter Funktionstransplantation; (C) tägliche Serumkreatininwerte zwischen sofortigen und verzögerten Transplantaten. Alle Abbildungen werden als Mittelwert + SEM dargestellt, wobei Werte als LOCF angegeben und mit Mischmodellanalysen analysiert werden. Abkürzung: LOCF = letzte Beobachtung, die weitergeführt wurde. N=5 Schweine pro Arm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.
Diskussion
Verzögerte Transplantatfunktion wirkt sich negativ auf den klinischen Verlauf nach der Nierentransplantation aus. In der frühen Posttransplantationsphase ist es mit längeren Krankenhausaufenthalten, einer höheren Rate invasiver Eingriffe und einem erhöhten Abstoßungsrisiko verbunden. Langfristig ist DGF auch mit einer kürzeren Überlebenszeit verbunden. DGF ist eine Manifestation einer schweren Ischämie-Reperfusionsverletzung (I/RI), was sich an ihrer höheren Prävalenz bei DCD-Transplantationen im Vergleich zu DBD oder Nierentransplantationen mit lebenden Spendern zeigt. Akute Nierenschädigung (AKI) ist sekundär zur akuten tubulären Nekrose, verursacht durch I/RI, und gilt als der häufigste Grund dafür, dass ein Allograft sofort nicht mehr funktioniert. Klinisch wird DGF durch die Notwendigkeit einer Dialyse innerhalb der ersten Woche nach der Transplantation definiert. In Großtiermodellen war DGF schwierig zu definieren und zu untersuchen, da eine standardisierte Definition der Graft-Suffizienz fehlte und die Dialyse nicht durchgeführt werden konnte, um die vorübergehende Natur der Erkrankung mit Dialyse als Brücke zur funktionellen Transplantatwiederherstellung festzustellen.
In diesem Protokoll wurde ein Schweinemodell gewählt, da es weithin akzeptiert wird, dass es der menschlichen Nierenphysiologie nahe steht (wie durch die kürzlich erfolgreiche Xenotransplantation bewiesen ist)10,11. Die Autotransplantation wurde gewählt, um die Allo-Immunantwort, Abstoßung sowie den Bedarf an und störende toxischen Effekten von Calcineurin-Inhibitoren zu beseitigen. Die Definition von DGF basiert auf einer verlängerten Anurie (<100 ml Urin pro Tag) nach POD3, die zu schweren, hyperkalämieassoziierten EKG-Veränderungen führt. Die Foley-Katheterisierung ermöglicht eine präzise Urinentnahme, die die Definition der verzögerten Transplantatfunktion und -genügsamkeit mit dem funktionellen Ergebnis der Urinqualität und -menge verbindet. Die tägliche Blutentnahme ermöglicht die tägliche Überwachung der traditionellen Parameter des Nierenfunktionspanels und liefert so ein umfassendes Bild der Elektrolyt-Homöostase.
Die Etablierung eines zuverlässigen und reproduzierbaren Tiermodells der verzögerten Transplantatsfunktion würde unserer Ansicht nach die Untersuchung wirksamer Therapien für verzögerte Transplantatsfunktion beschleunigen und letztlich zu verbesserten Nierentransplantationsergebnissen führen. Zusammenfassend etabliert dieses Protokoll ein reproduzierbares Autotransplantationsmodell für die Niere, das eine objektive Charakterisierung der verzögerten Transplantatfunktion mittels quantifizierbarer Urinabgabe und serumbiochemischer Parameter nach kontrollierter warmischämischer Verletzung ermöglicht. Durch die Einbeziehung standardisierter chirurgischer Zustände, nicht-invasiver Urinentnahme und serielle Laborüberwachung bietet dieser Ansatz einen praktischen Rahmen zur Untersuchung von DGF ohne Dialyse und erleichtert den Vergleich mit klinisch relevanten Phänotypen der posttransplantierten Graftdysfunktion 12,13,14,15.
Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.
Danksagungen
Wir danken dem Toronto Organ Perfusion Lab (Top Lab) dafür, dass es während der Schulung zur Niertransplantation von Schweinebeinern seine Expertise geteilt hat. Wir danken auch Michelle Mendiola Pla dafür, dass sie ihr Fachwissen zum Einsetzen nicht-invasiver Foley-Schleicher bei Schweinefleischern geteilt hat.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Supinen-Foley-Einführung | |||
| 12 Pater Foley | Urinsammlung | ||
| Chirurgisches Gleitmittel | Foley-Einfügung | ||
| 1 L Urinbeutel | Urinsammlung | ||
| 2-0 Nylonnaht | Foley- und Zentralleitungssicherung | ||
| Spekulum & Lange Debakey & Licht | Foley-Einfügung | ||
| Urinprobenröhrchen (50 ml konisch) | Urinprobenentnahme | ||
| CG8 + Chem 8 + Piccolo-Patronen | Tägliche Labore | ||
| Zentralvente in der Leine | |||
| 9,6 Fr Hickman-Katheterschub mit einzigem Lumen | Tägliche Labore | ||
| 10-Klinge | Stichschnitte für CVC-Einführungen | ||
| Zentrale Leitung neddless Luer-Lock-Kappe | |||
| Hep-Kochsalzbeutel (1 Liter Kochsalzlösung + 10 Heparin-Fläschchen) | Heplock-CVC | ||
| Explanting | |||
| Laparotomie-Paket | |||
| Bovie | |||
| Sterile Lichtgriffe | |||
| Schwammpack | |||
| OR-Handtücher – weiße 17X23 Zoll (4 pro Packung) | |||
| 2-0 Seidenkrawatten | Gefäßkontrolle | ||
| 1 L Plasmalyt | Symmetrische Elektrolytlösung | ||
| Sterile allgemeine Laparotomie-Instrumentenschale | |||
| Warme, normale Kochsalzlösung für feuchte Darmtücher | Darmhandhabung | ||
| Nadelmanagementbox | |||
| Bookwalter-Retraktor | |||
| Backtable | |||
| Sterile Organbeutel – 2 pro Niere | |||
| 1 L Kristalloidbeutel für Slushy | |||
| UW-Lösung – 250 ml pro Niere | |||
| Spülrohr | |||
| 14-Gauge-Angiokath | |||
| Maschinendraperung | |||
| Organgewicht (Waage + Schale + sterile Orgeltasche) | |||
| Maschinenperfusion | |||
| Perfusionsmaschine | Lifeport-Nierentransporter | ||
| Einweg-Organkammer | Lifeport-Nierentransporter | ||
| Perfusionslösung | KPS-1-Lösung | ||
| Implantat | |||
| Saugschlauch | |||
| Yankauer-Saugspitze | |||
| Saugkanister | |||
| Gummischüpfe | |||
| 4 mm Aortenschlag | arterielle Anastomose | ||
| Mikrochirurgische Instrumente + Klemme | |||
| Harnleiter-Leitdraht | |||
| Harnleiter-Stent – 4,8 fr x 12 mm | Harnleiteranastomose | ||
| Bauchverschluss | |||
| 1 geloopte Prolene | |||
| Bupivacain | |||
| Haut-Tacker | |||
| Proben | |||
| Probentablett | |||
| 14-G-Biopsiepistole | |||
| NBF-Biopsiegläser | |||
| Eppendorf-Röhren | |||
| Blutröhrchen mit grünem Oberteil | |||
| 15-mL-Konische | |||
| Medikamente | |||
| Noradrenalin-Fläschchen | |||
| Dopamin-Fläschchen | |||
| 1 L Plasmalyt | Symmetrische Elektrolytlösung | ||
| Aspirin 81 mg po-qd-Tabletten | |||
| Cefazolin-Fläschchen | |||
| Exceed | |||
| Heparin 10K-Einheiten |
Referenzen
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Nachdrucke und Genehmigungen
