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Methodenartikel

Vergleichende Strategien zur Nachweisung der Uquitination in Säugetierzelllysaten unter Verwendung von SMAD2/SMURF2 als Modell

948 Ansichten

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DOI:

10.3791/69321

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17. April 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Emergency Surgery, Wuhan Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 2Department of Medical Genetics, School of Basic Medicine, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Ubiquitination ist ein entscheidender Regulator der intrazellulären Proteinfunktionen. Hier beschreiben wir zwei Zelllysemethoden zur Erkennung der Substratprotein-Ubiquitinationswerte in Säugetierzellen und vergleichen deren Wirksamkeit bei der Analyse von Ubiquitinationsniveaus. Die Proteinüberexpression in HEK293T Zellen wurde durch vorübergehende Transfektion induziert, und ubiquitinierte Proteine wurden durch Western-Blot-Analyse nachgewiesen.

Zusammenfassung

Ubiquitination, eine posttranslationale Modifikation, ist ein entscheidender Regulator der intrazellulären Proteinfunktion. Ubiquitination moduliert die Proteinfunktionen, indem sie den proteasomalen Abbau fördert oder die subzelluläre Lokalisierung durch Ubiquitin-kettenabhängige Signalübertragung verändert. Hier beschreiben wir zwei Zelllysemethoden zur Erkennung der SMAD2-Ubiquitinierungswerte in HEK293T Zellen und vergleichen deren Wirksamkeit bei der Analyse der Protein-Ubiquitinierungswerte. Die Proteinüberexpression in Zellen wurde durch vorübergehende Transfektion indusert. Die Plasmide (HA-Ub, FLAG-SMAD2 und MYC-SMURF2) und Transfektionsreagenzien wurden separat dem Basalmedium zugesetzt, gemischt, und die Mischung wurde den Zellen zugegeben. Vor der Ernte wurde MG132 hinzugefügt, um den proteasomalen Abbau zu hemmen und die Ubiquitinierte Proteinakkumulation zu fördern. Der Hauptunterschied zwischen den beiden experimentellen Ansätzen liegt in ihren Zelllysemethoden – der Eisbadmethode (durchgeführt bei 4 °C) und der Wärmebehandlungsmethode (mit Inkubation bei 95 °C), die die Effizienz der Proteinlyse erheblich beeinflusst. Nach Abschluss der Zelllyse wurden das Zelllysat, die Agaroseperlen und der FLAG-Antikörper über Nacht gemischt und bei 4 °C inkubiert. Ubiquitinierte Proteine wurden dann durch Western-Blot-Analyse nachgewiesen. Vor dem Nachweis ubiquitinierter Proteine wurde ein leichter Antikörper für die sekundäre Antikörperinkubation verwendet. Dann wurden Gebänder für Ubiquitination entdeckt. Die Ergebnisse zeigen, dass sowohl die Eisbadmethode als auch die Wärmebehandlungsmethode zur Erkennung von Ubiquitinationsniveaus eingesetzt werden können, während die Wärmebehandlungsmethode die Nachweis der Ubiquitination von SMAD2 erleichtern kann. Diese Studie unterscheidet und vergleicht zwei Zelllysemethoden zur Messung der Ubiquitinierungswerte in Säugetierzellen unter Verwendung von SMURF2/SMAD2 als Modell, um Forschern bei der Auswahl geeigneterer Methoden zur Erkennung der Ubiquitinierungswerte von Substratproteinen zu helfen.

Einleitung

Ubiquitination, eine unverzichtbare posttranslationale Modifikation, ist ein entscheidender Regulator der intrazellulären Proteinfunktionen1. Das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS), das den Abbau von über 80 % der Proteine in Eukaryoten vermittelt, besteht aus Ubiquitin (Ub), E1-aktivierenden Enzymen, E2-konjugierenden Enzymen, E3-Ligasen, deubiquitylierenden Enzymen (DUBs) und dem 26S-Proteasom2. Dieses System reguliert den Proteinumsatz mit hoher Spezifität und steuert so wesentliche zelluläre Prozesse wie Zellzyklusprogression3, Signaltransduktion 4,5 und Stressreaktionen 6,7. Ubiquitination ist ein mehrstufiger enzymatischer Prozess. E1 hydrolysiert ATP, um den C-Terminus von Ub zu adenylieren und bildet so ein Ub-AMP-Zwischenprodukt. Anschließend wird das aktivierte Ub von E1 in das aktive Cystein eines E2-konjugierenden Enzyms übertragen und bildet eine Thioesterbindung. Schließlich rekrutiert eine E3-Ligase sowohl den E2-Ub-Komplex als auch ein Zielprotein und katalysiert so den Transfer von Ub von E2 zu einem Lysinrest auf dem Substrat8.

Ubiquitin kann verschiedene Polyubiquitin-Ketten durch Verknüpfung an sieben Lysinresten (Lys6, Lys11, Lys27, Lys29, Lys33, Lys48, Lys63) oder Met1(M1)4 bilden. Jeder Verknüpfungstyp bestimmt unterschiedliche biologische Ergebnisse: K48-gelinkte Ketten zielen hauptsächlich auf Proteine für den proteasomalen Abbau9, K63-gelinkte Ketten regulieren Signalübertragung und DNA-Reparatur10,11, und M1-gelinkte Ketten sind entscheidend für angeborene Immunantworten12. Ubiquitination und Debiquitination sind zentrale posttranslationale Modifikationsprozesse, die verschiedene zelluläre Ereignisse steuern, von der Proteinabbau bis zur Signaltransduktion. Beispielsweise führt bei Kolorektalkrebs die aberrante Aktivierung der MDM2-vermittelten P53-Ubiquitination zu einer übermäßigen Abbauung von p53, wodurch seine Fähigkeit zur Aufnahme eines Zellzyklusstillstands und Apoptose beeinträchtigt wird und somit das Tumorprogression und die Chemoresistenz13,14 vorangetrieben wird. Bei der Leberischämie-Reperfusionsverletzung stabilisiert OTUD1 NRF2, indem es die K48-gekoppelte Polyubiquitination entfernt und so die intrazellulären oxidativen Stresswerte15,16 mildert. Eine Reihe von Proteasomenhemmern wie Bortezomib, Carfilzomib und Ixazomib ist schrittweise in die klinische Praxis für Erkrankungen wie multiples Myelom 17,18,19 eingetreten.

Derzeit gibt es zahlreiche Methoden zur Erkennung ubiquitinierter Proteine, darunter Western Blotting, radioaktivitätsbasierte Tests und Fluoreszenztests20. In der wissenschaftlichen Forschung bleibt der Western Blot jedoch aufgrund seines relativ schnellen und unkomplizierten Protokolls die bevorzugte Methode zur Detektion der Protein-Ubiquitination. Traditionelle Methoden zur Erkennung ubiquitinierter Proteine ähneln der Co-Immunpräzipitation (Co-IP)-Technologie: Sie verwenden einen Lysepuffer, um Zellpellets bei niedriger Temperatur zu inkubieren und zu lysieren, um Proteine freizusetzen, und verwenden dann Antikörper, um die Ubiquitination von Substratproteinen21,22 nachzuweisen. Dieses experimentelle Protokoll erfordert jedoch oft eine große Anzahl von Zellen. Außerdem erhöht die relativ milde Lysemethode bei niedriger Temperatur die Proteininteraktionen nicht vollständig stören, was die Wahrscheinlichkeit von falsch-positiven Ergebnissen bei erkannter Ubiquitination erhöht. Erhitzen und der Einsatz von SDS können die Proteinstruktur erheblich stören, deren vollständige Denaturierung induzieren und so die falsch-positiven Ergebnisse durch Protein-Protein-Interaktionen effektiv reduzieren 23,24,25. Ebenso durchlaufen die Zellen eine ausreichende Lyse bei Erhitzen und SDS-Behandlung, wodurch mehr Proteine freigesetzt werden und entsprechend die Anzahl der für das Experiment benötigten Zellen reduziert wird. Zusammenfassend lassen sowohl die Eisbadmethode als auch die Wärmebehandlungsmethode Zellen und erkennen die Ubiquitinationswerte von Substratproteinen mittels Antikörperinkubation. Die Erhitzungsmethode führt jedoch zu einer besseren Zelllyse und einer stärkeren Proteindenaturierung.

TGF-β spielt eine doppelte Rolle in den pathophysiologischen Prozessen verschiedener Krankheiten26,27. SMAD2 ist ein kritischer nachgelagerter Transkriptionsfaktor von TGF-β. Die SMURF2-vermittelte Ubiquitination von SMAD2 zielt auf den proteasomalen Abbau ab und feinjustiert so die TGF-β Signalintensität28. Diese Studie unterscheidet und vergleicht zwei Zelllysemethoden zur Messung der Ubiquitinationswerte in Säugetierzellen unter Verwendung von SMURF2/SMAD2 als Modell. Hier wurde die Protein-Überexpression in HEK293T Zellen durch transienten Transfektion mit HA-Ub-, FLAG-SMAD2- und MYC-SMURF2-Plasmiden induziert. Die Zellen wurden jeweils mit der Eisbadmethode und der Wärmebehandlungsmethode lysiert. Ubiquitinierte Proteine wurden durch Western-Blot-Analyse nachgewiesen. Wir fanden heraus, dass sowohl die Eisbad-Methode als auch die Wärmebehandlungsmethode zur Erkennung von Ubiquitinationsniveaus verwendet werden können und die Wärmebehandlungsmethode es erleichtern könnte, die Ubiquitination von SMAD2 nachzuweisen. Dieses Protokoll bietet eine neue Alternative zur Erkennung ubiquitinierter Proteine. Darüber hinaus erreicht die Wärmebehandlungsmethode bei bestimmten Substratproteinen, die stark mit Ubiquitination assoziiert sind, eine bessere Effizienz bei der Proteinlyse, was den Nachweis der Ubiquitination erleichtert.

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Protokoll

1. Herstellung von Lysepuffer und Reagenzien

HINWEIS: Bereiten Sie alle Puffer auf den angegebenen Konzentrationen vor. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für Reagenzienpulver, um Konzentrationsabweichungen zu vermeiden.

  1. Bereiten Sie einen Lysepuffer vor, der 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8,0) und 1 % Triton X-100 enthält. Passen Sie die NaCl-Konzentration bei Bedarf zwischen 50 und 150 mM an. Bereiten Sie alle Puffer mit doppelt destilliertem H₂O vor.
  2. Bereiten Sie eine funktionierende Lösung vor, indem Sie den Lysispuffer mit einem 1%igen Proteaseinhibitor-Cocktail (ohne EDTA) ergänzen. Gründlich verrühren und bis zur Anwendung auf Eis lassen.
  3. Bereiten Sie 10 % SDS vor, indem Sie 1 g SDS-Pulver in 10 ml PBS auflösen. Rühren, bis es vollständig aufgelöst ist. Lagern Sie bei Zimmertemperatur.
  4. Bereiten Sie einen 5× Proteinladepuffer vor, der 250 mM Tris-HCl (pH 6,8), 10 % SDS, 50 % Glycerol, 0,5 % Bromphenolblau und 5 % β-Mercapptoethanol enthält. Lösen Sie die Komponenten in doppelt destilliertem H2O auf. Vor der Verwendung gründlich mischen.
    HINWEIS: Führen Sie SDS und β-Merccaptoethanol in einer Abzughaube und tragen Sie geeignete Schutzausrüstung. Entsorgen kontaminierte Materialien gemäß den institutionellen Richtlinien für chemische Abfälle.

2. Zellvorbereitung

  1. Halten Sie HEK293T Zellen in einem hochglukosereichen DMEM, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin. Inkubieren Sie bei 37 °C mit 5 % CO₂ unter sterilen Bedingungen. Passagezellen bei etwa 90 % Konfluenz.
  2. Samenzellen in 6-Well-Platten mit 5 × 10⁵-Zellen pro Bohrloch. Poolzellen aus zwei Brunnen, um eine Probe zu erzeugen.
  3. Bereite Transfektionsmischungen so vor, dass sie 10 % des gesamten Kulturvolumens ausmachen, und nutze SMAD2-Ubiquitination als experimentelles Modell. Kombinieren Sie 1 μg HA-Ub-Plasmid, 1 μg FLAG-SMAD2-Plasmid und 0,5 μg leeren Vektor- oder MYC-SMURF2-Plasmid in 100 μL serumfreiem DMEM. In einem separaten Röhrchen werden 3,75 μL Transfektionsreagenz in 100 μL serumfreiem DMEM verdünnt. Geben Sie die Reagenzmischung tropfenweise zur Plasmidlösung, inkubieren Sie 15 Minuten bei Raumtemperatur und verteilen Sie es gleichmäßig auf die Zellen.
  4. Ersetze das Transfektionsmedium nach 6-8 Stunden durch 2 ml frisches, vollständiges DMEM pro Bohrloch. Zellen 48 Stunden lang inkubieren.
  5. Behandle die Zellen mit 5 μM MG132 für 12 Stunden vor der Entnahme.
    HINWEIS: Führen Sie MG132 in einem Biosicherheitsschrank mit Handschuhen. Entsorgen kontaminierte Materialien gemäß institutionellen Sicherheitsvorschriften.

3. Zellsammlung

  1. Entnehmen Sie Zellen bei 90-100 % Konfluenz (~3 × 10⁶ Zellen). Medium aspirieren und jedes gut mit 1 ml vorgekühltem PBS abwaschen. Entfernen Sie PBS komplett.
  2. Geben Sie jedem Bohrloch 1 ml PBS hinzu und lassen Sie die Zellen vorsichtig wieder suspendieren. Übertragen Sie die Federung in ein 1,5-ml-Rohr und legen Sie es auf Eis.
  3. Zentrifugiere bei 380 × g für 5 Minuten bei 4 °C. Entferne das Überdachungsmittel und behalte das Pellet.

4. Vorbereitung von Agaroseperlen

  1. Übertragen Sie 50 μL Protein-A/G-Agaroseperlen pro Probe in ein neues Rohr. Wasche Perlen dreimal mit 1 ml Lysis-Puffer. Zentrifugiere bei 100 × g für 1 Minute bei 4 °C zwischen den Waschphasen.
  2. Entferne den Restpuffer, ohne das Pellet zu stören. Fügen Sie 100 μL Arbeitslösung und 5 μL Anti-FLAG-Antikörper hinzu. Inkubieren Sie 6 Stunden bei 4 °C mit sanfter Rotation.

5. Zelllyse

  1. Eisbad-Methode
    1. Fügen Sie dem Pellet 500 μL vorgekühlte Arbeitslösung hinzu. Brüte 30 Minuten auf Eis.
    2. Sonikate bei 2 W mit 4 Sekunden Ein/4 Sekunden Aus-Zyklen für fünf Wiederholungen. Bewahren Sie Proben während der Sonikation auf Eis auf. Proben für den Rest der Brützeit wieder ins Eis bringen.
      HINWEIS: Bei schwachen Proteinwechselwirkungen wird die NaCl-Konzentration auf 50–75 mM reduziert und die Sonikation weggelassen.
  2. Wärmebehandlungsmethode
    1. Fügen Sie 45 μL Arbeitslösung zum Pellet hinzu. Füge 5 μL 10 % SDS hinzu, während du kontinuierlich mischst.
    2. Vortex kurz und erhitze bei 95 °C, bis die Suspension transparent und vollständig verflüssigt ist. Invertiere intermittierend, um eine gleichmäßige Denaturierung sicherzustellen.
    3. Fügen Sie 450 μL Arbeitslösung hinzu. Sonikate bei 2 W mit 4 Sekunden Ein/4 Sekunden Aus-Zyklen für fünf Wiederholungen, während die Proben auf Eis bleiben.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die endgültige SDS-Konzentration <0,1 % bleibt. Vollständige Lyse bestätigen Sie, indem Sie das Verschwinden sichtbarer Pellets und die gleichmäßige Klarheit der Lösung überprüfen.

6. Immunpräzipitation und Ubiquitinationsnachweis

  1. Zentrifugiert Lysate bei 13.680 × g für 15 Minuten bei 4 °C. Überschieben Sie das Überdachungsmittel in ein neues Rohr.
  2. Reservieren Sie 60 μL Lysat und fügen Sie 15 μL 5× Ladepuffer hinzu. Erhitze bei 95 °C für 15 Minuten und kenne sie als Eingabe.
  3. Fügen Sie 100 μL antikörpergekoppelte Perlen zum verbleibenden Lysat hinzu (Endvolumen 540 μL). Inkubiere bei 4 °C 8–12 Stunden mit Rotation.
  4. Zentrifugiere Perlen mit 100 × g für 1 Minute bei 4 °C und entsorge Überwasser. Wasche Perlen dreimal mit Lysis-Puffer. Fügen Sie 75 μL 1× SDS-Ladepuffer hinzu und erhitzen Sie bei 95 °C für 15 Minuten, um Proteine zu elutieren. Etikettiere sie als IP.
  5. Erkennen Sie ubiquitinierte Proteine mit Western Blot gemäß einem Standard-JoVE-Protokoll.
    HINWEIS: Für detaillierte Übertragungs- und Erkennungsverfahren siehe das Western Blot Protokoll29 . Vollständige unbeschnittene Flecken mit Molekulargewichtmarkern sind in Supplemental File 1 bereitgestellt.

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Ergebnisse

Als "molekularer Bote" im TGF-β-Signalweg bildet SMAD2 nach der Phosphorylierung durch TGF-β-Rezeptoren einen Komplex mit SMAD3 und SMAD4, translokiert in den Zellkern und initiiert die Transkription der nachgelagerten Zielgene30. Es ist somit ein Schlüsselmolekül, das extrazelluläre Signale mit der intrazellulären Genexpression verbindet. Sein Abbau wird durch SMURF2 vermittelt, eine E3-Ubiquitin-Ligase, die die Polyubiquitinierung des Zielproteins katalysiert un...

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Diskussion

Diese Studie präsentiert und vergleicht zwei detaillierte Proteinlyseprotokolle, die speziell für die Erkennung der E3-ligase-vermittelten Substrat-Ubiquitination optimiert sind. Um die Nachweisbarkeit sicherzustellen, verwendeten wir plasmidbasierte Überexpression (z. B. markiert als SMAD2, SMURF2 oder Ub) in Zellen, was ausreichende Proteinniveaus lieferte, um spezifische Ubiquitinationssignale zu visualisieren, was für die Validierung von E3-Ligase-Substrat-Interaktionen in dieser Stu...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Danksagungen

Diese Forschungsstudie wurde von der National Natural Science Foundation of China, Nr. 82370647 (W.H.), Nr. 82170642 (J-X. Z), Nr. 81801923 (X-F. Z), Nr. 81670575 (J-X. Z), Nr. 81570570 (W.H.) und Nrs. 81070355 (J-X. Z) und das Programm des HUST Academic Frontier Youth Team, Huazhong University of Science and Technology (2018QYTD02). Die Offene Stiftung des Hubei-Schlüssellabors für regenerative Medizin und multidisziplinäre translationale Forschung (2022zsyx003). Das Nationale Schlüsselforschungs- und Entwicklungsprogramm Chinas (2024YFA1107601).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,5 mL MikroröhreServicebioEP-150-M
100 mm TC-behandelte kultivierte SchaleServicebioCCD-100
6-Well-ScheibeServicebioCCP-6H
Anti-FLAG-AntikörperProteintech20543-1-APVerdünnung verwendet 1:200 für IP 1:10000 für WB
Anti-GAPDH-AntikörperProteintechMA5-15738Verdünnung verwendet 1:10000
Anti-HA-AntikörperProteintech51064-2-APVerdünnung verwendet 1:10000
Anti-IgG-AntikörperCST#3900Verdünnung verwendet 1:200 für IP
Anti-MYC-AntikörperProteintech60003-2-IgVerdünnung verwendet 1:10000
Anti-SMAD2-AntikörperCST#5339Verdünnung verwendet 1:200 für IP 1:2000 für WB
BromophenolblauServicebioGC307006-5g
EDTA (pH = 8,0)ServicebioG1207-1L
FBSABW
GlycerolSinopharm10010618
Heiz-/Kühl-TrockenbadGuocheng
HEK293T ZellenATCCCRL-3216
Glukosehoch-DMEMServicebioG4515-500ML
HRP-konjugierte Ziegen-Anti-Maus IgG Light Chain AbklonalAS062Verdünnung verwendet 1:5000
HRP-konjugierte Maus-Anti-Rabbit IgG Light Chain AbklonalAS061Verdünnung verwendet 1:10000
Lipo8000BeyotimeC0533
MG132AladdinM421264
MikrozentrifugeLabgicCF1524R
NaCl-PulverServicebioGC102004
PBS ServicebioG4202-500ML
pCMV-FLAG-SMAD2Für die Säugetierexpression
pCMV-HA-UbFür die Säugetierexpression
pCMV-MYCFür die Säugetierexpression
pCMV-MYC-SMURF2Für die Säugetierexpression
Penicillin-StreptomycinServicebioG4003-100ML
Proteaseinhibitor-Cocktail ohne EDTATargetMolC0001
Protein A/G AgaroseperlenBeyotimeP2017
PVDF-MembranVayzmeE801
SDS-PulverSolarbioS8010-500g
SDS-PAGE-SysytemAervicebioBVE4-BVT4
SonicsUibra-Zelle
Tris-HCl-PulverBiotoppedHST-0372
Triton X-100ServicebioGC204003-100ml
TrypsinServicebioG4021-100ML
Vortex-MixerFreundlicherweise gespendet von Vayzme
β-MercapptoethanolAladdinM301573

Referenzen

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Schlagwörter

Protein UbiquitinierungSMAD2 UbiquitinierungSMURF2 ModellZelllysemethodenhitzebehandelte LyseEisbad LyseWestern BlotHEK293T Zellenproteasomaler Abbau
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