Method Article

Optimierte quantitative Bewertung der Stabilität der Enhancer-RNA in embryonalen Mausstammzellen

DOI:

10.3791/69325

⸱

November 21st, 2025

 ,  ,  , 
1Department of Convergent Bioscience and Informatics, and Graduate School of Biological Sciences, Chungnam National University (CNU)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll misst quantitativ die Stabilität und Halbwertszeit intergener und intragenischer Enhancer-RNAs in embryonalen Mausstammzellen mittels Actinomycin-D-Behandlung, RT-qPCR und nichtlinearer Regressionsanalyse. Positionsspezifische Normalisierungsstrategien werden integriert, um die Zerfallsdynamik von eRNA kontextabhängig genau zu modellieren.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Enhancer-RNAs (eRNAs) sind nicht-kodierende Transkripte, die aus transkriptionell aktiven Enhancer-Regionen entstehen und zunehmend als wichtige Regulatoren der Genexpression anerkannt werden. Trotz ihrer funktionellen Bedeutung bleiben die Stabilitäts- und Abbaudynamiken der eRNA schlecht charakterisiert, insbesondere in embryonalen Stammzellen (ESCs), wo transkriptionelle Programme hochdynamisch und kontextabhängig sind. Dieses Protokoll stellt eine quantitative Methode zur Bewertung der Zerfallskinetik und Halbwertszeit intergener und intragenischer eRNAs in Maus-ESCs vor. Die Transkription wird mittels Actinomycin D gehemmt, und die gesamte RNA wird an mehreren definierten Zeitpunkten gesammelt. cDNA wird sowohl mit zufälligen Hexamer- als auch Oligo(dT)-Primern synthetisiert, um den Nachweis sowohl polyadenylierter als auch nicht-polyadenylierter Transkripte zu ermöglichen. Für intergene eRNAs wird die Normalisierung entweder mit einem Housekeeping-Gen oder dem Ct-Wert zum Zeitpunkt 0 Min durchgeführt. Für intragenische eRNAs wird ein dualer Normalisierungsansatz angewandt, um die Interferenz durch überlappende Pre-mRNA zu minimieren. Die Zerfallskurven werden mit einem einphasigen exponentiellen Zerfallsmodell analysiert, was eine genaue Abschätzung der Halbwertszeit ermöglicht. Das Protokoll zeigt, dass eRNAs in mESCs eine schnelle Fluktuation mit einer Halbwertszeit von etwa 2–3 Minuten aufweisen. Diese Methodik bietet einen robusten und reproduzierbaren Rahmen zur Untersuchung der eRNA-Stabilität und bietet Einblicke in die Aktivität von Enhancern und RNA-Dynamiken in pluripotenten Stammzellkontexten.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Enhancer sind cis-regulatorische Elemente (CREs), die die gewebe- und stimulusspezifische Genexpression regulieren, indem sie als Bindungsplattformen für Transkriptionsfaktoren und Co-Regulatorendienen 1,2,3,4,5,6. Obwohl Enhancer auf linearer Genomebene weit entfernt von ihren Zielgenen liegen können, ermöglichen Chromatin-Looping-Mechanismen räumliche Nähe zu Promotoren, was die transkriptionelle Regulation erleichtert. Aktive Enhancer werden bidirektional mit RNA-Polymerase II (Pol II) transkribiert und erzeugen lange, nicht-kodierende RNAs, die als Enhancer-RNAs (eRNAs) bekannt sind und typischerweise eine mediane Länge von etwa 1 kb 1,2,7,8,9 haben. Die Expression von eRNAs korreliert stark mit der Aktivierung benachbarter Zielgene 10,11,12, und funktionelle Studien haben durchgehend gezeigt, dass die Erschöpfung von eRNAs die Transkription ihrer Zielgene verringert, was darauf hindeutet, dass eRNAs als funktionelle Regulatoren und nicht als transkriptionelle Nebenprodukte wirken 13,14,15,16,17 . Trotz ihrer funktionellen Bedeutung bleiben experimentelle Protokolle zur zuverlässigen Erkennung und Quantifizierung von eRNAs begrenzt.

In Stammzellen spielt die Aktivität des Enhancers eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Pluripotenz und der Förderung von Entwicklungsübergängen18,19. Enhancer können in intergenen Regionen (intergene oder extragene Enhancer) befinden oder in Genkörper als intragenische Enhancereingebettet sein 8. Während intergene Enhancer in verschiedenen Zelltypen umfassend untersucht wurden, bleiben intragenische Enhancer aufgrund technischer Herausforderungen wie der transkriptionellen Überlappung mit Wirtsgen-Pre-mRNAs und dem Vorhandensein von Histonmodifikationen, die mit der transkriptionellen Elongation 20,21 assoziiert sind, relativ wenig erforscht. Dennoch haben neuere Studien gezeigt, dass sowohl intergene als auch intragenische Enhancer zu Genregulationsnetzwerken beitragen, die an der Pluripotenz22,23 und der frühen Differenzierung24 in ESCs beteiligt sind. Bemerkenswert ist, dass fast die Hälfte aller annotierten Enhancers intragenischsind, und ihre Aktivität variiert je nach Entwicklungsstadi, oft steigt sie in differenzierten Gewebenzu. Die Prävalenz und funktionelle Rolle intragenischer Enhancer in ESCs sind jedoch weiterhin unvollständig verstanden. Insbesondere werden intergene eRNAs zwischen Genen transkribiert, während intragenische eRNAs innerhalb von Genkörpern transkribiert werden und sich mit Pre-mRNA-Transkripten überschneiden können. Dieser Positionsunterschied erfordert unterschiedliche analytische Ansätze bei der Interpretation und Quantifizierung intergener und intragenischer eRNAs.

Im Gegensatz zu mRNAs fehlt eRNAs typischerweise ein 3′ Poly(A)-Schwanz, was zu geringer Stabilität und schnellem Abbau führt. Diese intrinsische Instabilität erschwert die Analyse der eRNA-Expression, insbesondere in Zeitverlaufsexperimenten. In Neuronen wurde berichtet, dass eRNAs eine Halbwertszeit von bis zu 7,5 Minuten17 zeigen. Es bleibt jedoch unklar, ob diese Instabilität über verschiedene Zelltypen hinweg konsistent ist, insbesondere in ESCs, wo sowohl die Enhancer-Aktivität als auch die eRNA-Transkription stark zelltypspezifischsind (7,17,29,30). ESCs basieren auf dynamischen Genregulationsprogrammen, um die Pluripotenz aufrechtzuerhalten oder eine Differenzierung einzuleiten, was sie zu einem einzigartigen System zur Untersuchung des eRNA-Umsatzesmacht. Angesichts der schnellen transkriptionellen Verschiebungen in ESCs könnte das Verständnis des eRNA-Zerfalls in diesem Zusammenhang zeigen, wie die Aktivität von Enhancern zeitlich reguliert ist17. Darüber hinaus erfordern Unterschiede zwischen intergenen und intragenischen eRNAs, wie Überschneidungen mit Wirtsgen-Transkripten, unterschiedliche analytische Ansätze20. Trotz der Bedeutung dieser Fragen existieren nur wenige standardisierte Methoden zur Messung der eRNA-Halbwertszeit in ESCs oder zum Vergleich der Zerfallsdynamik verschiedener eRNA-Typen.

Diese Studie präsentiert ein quantitatives Protokoll zur Bewertung der Stabilität und Halbwertszeit von eRNAs, die von intergenen und intragenischen Enhancern in mESCs transkribiert werden. Die transkriptionelle Hemmung wird mit Actinomycin D (ActD) in definierten Zeitintervallen erreicht, gefolgt von Echtzeit-quantitativer PCR (RT-qPCR) und nichtlinearer Regressionsanalyse zur Quantifizierung des eRNA-Zerfalls. Um die positionsunterschiede zwischen intergenen und intragenischen Enhancern zu beheben, integriert die Methode unterschiedliche Normalisierungsstrategien, die einen systematischen und genauen Vergleich der eRNA-Abbaudynamik ermöglichen. Dieser strukturierte analytische Rahmen liefert wertvolle Einblicke in den eRNA-Umsatz in pluripotenten Stammzellen.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle Experimente dieser Studie wurden mit embryonalen Maus-Stammzellen (mESC; E14Tg2A), die nicht direkt in unserem Labor erzeugt wurden, sondern aus einer etablierten Zelllinie gewonnen wurden, die ebenfalls kommerziell bei ATCC (CRL-1821) erhältlich ist. Daher erfordert die in diesem Artikel beschriebene Arbeit keine Überprüfung durch das Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der Chungnam National University. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Zellkultur von mESCs

  1. Vorbeschichtung von 6-Well-Zellkulturplatten mit 0,1 % Gelatine (2 ml pro Bohrloch). Die Platten 10 Minuten bei 37 °C inkubieren.
  2. Aspirieren Sie die Gelatine und waschen Sie jedes Mal einmal mit 1 ml PBS. Sterilisiere die Platten mindestens 15 Minuten lang mit UV-Bestrahlung.
  3. Samen mESCs auf die gelatinebeschichteten Platten mit vollständigen 2 ml Zellkulturmedium (Tabelle 1) verwenden.
    HINWEIS: Fügen Sie LIF frisch in der erforderlichen Konzentration in das Kulturmedium unmittelbar vor der Verwendung hinzu, basierend auf dem für das Experiment benötigten Gesamtvolumen.
KomponentenAbschließende SchwerpunkteVerwendetes Volumen
Glasgows Mindestnotwendiges Medium (GMEM)-500 mL
KnockOut™ Serum-Ersatz (KOSR)10%50 mL
Penicillin-Streptomycin0.50%2,5 mL
Fetales Rinderserum (FBS)1%5 mL
Natriumpyruvat0,1 mM / 1 %5 mL
MEM-Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren (MnEA)0,1 mM/ 1 %5 mL
2-Mercapptoethanol0,1 mM910 uL
Leukämie-Inhibitorfaktor (LIF)1000 U/mL-

Tabelle 1: Zusammensetzung des mESC-Kulturmediums. Komponenten und ihre Endkonzentrationen, die zur Herstellung des mESC-Kulturmediums verwendet werden. Typische Volumina werden pro 500 mL Gesamtmedium angegeben.

  1. Halten Sie die Zellen unter Standardkulturbedingungen bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2(Abbildung 1A).

figure-protocol-1
Abbildung 1: Experimentelles Design für eRNA-Stabilitätsanalyse. (A) Schema des transkriptionellen Arrest-Experiments. Die Zellen wurden mit 0,1 % gelatinebeschichteten 6-Well-Platten plattiert und zu den angegebenen Zeitpunkten (0 Min, 5 Min, 10 Min, 15 Min, 20 Min, 20 Min) nach der Ernte mit ActD (Endkonzentration: 5 μg/mL) behandelt. (B) RT-qPCR-Assay-Layout. Die Gesamt-RNA wurde rückwärts transkribiert mit entweder zufälligen Hexamer- oder Oligo(dT)-Primern. cDNA-Proben aus jedem Zeitpunkt wurden mit RT-qPCR für die angezeigten Ziele analysiert: Tbp_mRNA, intergene eRNA und intragenische eRNA. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

2. Behandlung mit Actinomycin D (ActD)

  1. Lösen Sie actD in DMSO auf, um eine Grundlösung mit einer Konzentration von 1 mg/mL33 herzustellen.
    HINWEIS: Während Actinomycin D hier zur kurzfristigen transkriptionellen Hemmung verwendet wird, können alternative Inhibitoren wie Triptolid in zukünftigen Studien auch eingesetzt werden, um den Transkriptionsinitie zu blockieren. Da sowohl Actinomycin D als auch DMSO lichtempfindlich sind, bereiten Sie die Grundlösung in bernsteinfarbenen Mikroröhren vor, schützen Sie sie vor Licht und lagern sie bis zur Anwendung bei -20 °C.
  2. Zwei Tage nach der Zellaussaat (oder am Erntetag) wird die ActD-Lagerlösung dem Kulturmedium auf eine Endkonzentration von 5 μg/mL33 gegeben. Proben werden 0 Minuten, 5 Minuten, 10 Minuten, 15 Minuten, 20 und 30 Minuten nach der Behandlung entnommen (Abbildung 1A).
    HINWEIS: Während die meisten eRNAs einen schnellen Zerfall im Bereich von 0–30 Minuten aufweisen, können einige eRNAs eine längere Halbwertszeit aufweisen. Je nach den Eigenschaften des Ziellokus kann zusätzliche Probenahme zu verlängerten Zeitpunkten (z. B. 1 H, 3 H oder 6 H) einbezogen werden, um die Zerfallskinetik genauer zu erfassen. In dieser Studie wurde Actinomycin D bei einer Konzentration von 5 μg/mL für eine kurzfristige (≤30 min) transkriptionelle Blockade verwendet; für längere Inkubationen (>1 H) wird jedoch empfohlen, die Konzentration auf 1–2 μg/mL zu reduzieren, um zelluläre Stressreaktionen zu minimieren. Da DMSO selbst die transkriptionelle Aktivität beeinflussen kann, sollte auch eine nur DMSO-basierte Kontrolle einbezogen werden.

3. RNA-Extraktion und cDNA-Synthese

  1. Entfernen Sie das Zellkulturmedium durch Absaugung und geben Sie jedem Brunnen 1 ml Trizol-Reagenz. Inkubieren Sie die Platten auf einem Shaker für 10 Minuten bei Raumtemperatur (RT)34,35 und übertragen Sie das Lysat dann in ein neues 1,5-ml-Rohr.
    HINWEIS: Nach der TRIzol-Behandlung können Proben bis zu einer Woche vor der RNA-Extraktion bei -80 °C gelagert werden. Da Trizol-Reagenz Phenol und Guanidiniumisothiocyanat enthält, die hochgiftig und korrosiv sind, sollten Sie es mit großer Vorsicht behandeln. Alle TRIzol-Abfälle sollten in einem dafür vorgesehenen organischen Lösungsmittelabfallbehälter gesammelt werden, um ordnungsgemäß entsorgt zu werden.
  2. Fügen Sie 500 μL Chloroform zu jeder Probe hinzu. Die Röhren kräftig schütteln und 3 Minuten lang im RT inkubieren.
  3. Zentrifugieren Sie die Proben bei 13.500 × g für 10 Minuten bei 4 °C.
  4. Übertragen Sie vorsichtig die wässrige Phase auf ein neues 1,5-ml-Rohr mit gleichem Volumen Isopropanol. Inkubieren Sie das Gemisch bei RT für 10 Minuten, um die RNA-Niederschlagung zu verbessern.
    HINWEIS: Führen Sie vorsichtig nur die klare obere wässrige Phase um, um eine Kontamination mit der Zwischenphase zu vermeiden. Für eine erhöhte RNA-Ausbeute inkubieren Sie Proben bei -20 °C für 1 Stunde bis Nacht (O/N) nach Zugabe von Isopropanol. Für Proben mit geringem Input fügen Sie Glykogen (letzte 10-20 μg/mL) oder GlycoBlue kurz vor der Zugabe von Isopropanol hinzu, um die Sichtbarkeit und Wiederherstellungseffizienz der RNA-Pellets zu verbessern. Isopropanol ist hochentzündlich und potenziell schädlich für die menschliche Gesundheit; Das Einatmen von Dämpfen oder Kontakt mit Haut oder Augen kann Reizungen, Kopfschmerzen, Schwindel oder eine Depression des zentralen Nervensystems verursachen. Gehen Sie vorsichtig mit und sammeln Sie alle verbleibenden Lösungen in einem zugelassenen organischen Lösungsmittelabfallbehälter für eine ordnungsgemäße Entsorgung.
  5. Zentrifugieren Sie die Proben erneut bei 13.500 × g für 10 Minuten bei 4 °C und entsorgen Sie das Überlagermittel.
  6. Waschen Sie das resultierende RNA-Pellet mit 1 ml 75 % Ethanol. Zentrifugiere bei 6.800 × g für 5 Minuten bei 4 °C.
    HINWEIS: Wenden Sie das Rohr nach der Ethanolzugabe vorsichtig um, um das Pellet anzuheben.
  7. Entfernen Sie das Überdachungsmittel vorsichtig und lassen Sie das Pellet 10 Minuten bei 42 °C an der Luft trocknen. Das getrocknete Pellet in RNase-freiem Wasser wieder suspendieren und 10 Minuten bei 55 °C inkubieren.
    HINWEIS: Bei hoher RNA-Reinheit kann das weiße Pellet während des Lufttrocknungsprozesses durchsichtig werden. Vermeiden Sie es, das Pellet länger als 10 Minuten zu lange zu trocknen, da übermäßiges Trocknen die Effizienz der Resuspension verringern kann.
  8. Missen Sie RNA-Konzentration und -Reinheit mit einem NanoDrop-Spektrophotometer.
  9. Synthetisieren Sie cDNA aus μg RNA mit dem M-MLV cDNA Synthesis Kit, gemäß den Anweisungen des Herstellers (Tabelle 2).
KomponentenVerwendetes Volumen 
10X M-MLV RT-Puffer2 μL
dNTP2 μL
Primer (Zufällig / Olido dT)1uL
M-MLV RT1uL
RNASE-Inhibitor0,5 uL
RNA-Probe2ug (Volumen angepasst basierend auf der RNA-Probenkonzentration)
DWDas Volumen wird je nach RNA-Probekonzentration angepasst (um das Endvolumen zu bilden)
Gesamtvolumen20 μL

Tabelle 2: Zusammensetzung der cDNA-Synthesereaktion (M-MLV-Reverse-Transkriptase). Detaillierte Volumina und Reagenzien, die für die Reverse-Transkription von 2 μg Gesamt-RNA mit dem M-MLV cDNA Synthesis Kit verwendet werden. Das Volumen der RNA-Probe wurde je nach Konzentration angepasst, und nukleasefreie DW wurde hinzugefügt, um das Endreaktionsvolumen auf 20 μL zu bringen.

  1. Inkubieren Sie die cDNA-Reaktion bei 37 °C für 2 Stunden und inaktivieren Sie das Enzym dann bei 85 °C für 5 Minuten.
    HINWEIS: Lagere synthetisierte cDNA bei -20 °C. Die typische cDNA-Konzentration beträgt etwa 100 ng/μL. Um intragenische eRNAs zu detektieren, synthetisieren Sie cDNA aus derselben RNA-Probe mit sowohl zufälligen Hexamerprimern als auch Oligo(dT)-Primern.

4. Echtzeit-quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR)

  1. Bereiten Sie eine 10 μL Reaktionsmischung vor, die 15 ng cDNA, 5 μL Power SYBR Green PCR Mastermischung, 5 pmol jedes Primers und destilliertes Wasser (DW) enthält.
    HINWEIS: eRNA-Loci enthalten oft oder liegen angrenzend an repetitive Sequenzen, was ein sorgfältiges Primerdesign erfordert. Verwenden Sie wiederholt maskierte Sequenzen, um Kandidatenregionen einzuschränken und die Primerpaar-Spezifität im gesamten Genom mit BLAST zu überprüfen. Wenn möglich, beziehen Sie nahegelegene Kontrollregionen ein, um unspezifische Amplifikationauszuschließen 36.
  2. Führen Sie eine Amplifikation mit einem Echtzeit-PCR-System mit folgender thermischer Zyklierung durch: ein initialer Aktivierungs- und Denaturierungsschritt bei 50 °C für 2 Minuten und 95 °C für 10 Minuten, gefolgt von 40 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 15 Sekunden sowie Glüh-, Extension- und Fluoreszenzmessung bei 60 °C für 1 Minute34, 37 (Tabelle 3).
BühneSchrittTemperatur (°C)ZeitZyklus
Halte-StageUmgekehrte Transkription502 Minuten1
Anfängliche Denaturierung9510 Minuten1
PCR-StufeDenaturierung9515 s40
Glühen/Verlängerung601 Min.40
SchmelzkurvenstadiumDenaturierung9515 s1
Glühen601 Min.1
Dissoziation (Schmelzkurve)9515 s1

Tabelle 3: Thermische Zyklenbedingungen für RT-qPCR. Zusammengefasste Temperatur-, Zeit- und Zyklusbedingungen für Reverse-Transkription, 40-Zyklus-qPCR (10 μL-Reaktion) und Standard-Schmelzkurvenanalyse.

  1. Für die Quantifizierung der intragenischen eRNA analysieren Sie sowohl Tbp (oder ein anderes Haushalts-/Kontrollgen) als auch die Region des intragenischen Enhancers mit cDNA, die mit Oligo(dT)-Primern synthetisiert wird. Für intergene eRNAs verwenden Sie ausschließlich cDNA, die mit zufälligen Hexamerprimern synthetisiert wurde (Tabelle 4 und Abbildung 1B).
    HINWEIS: Führen Sie jede Probe in technischen Duplikaten (zwei Brunnen) durch, um während der Datenanalyse eine Durchschnittsbildung zu ermöglichen.
GennameZünderprobenSequenz (1,5 m bis 1,90 m)Amplicon-Größen 
TBPVorwärtsTGACTCCTGGAATTCCCATC122 BP
RückwärtsTTGCTGCTGCTGTGTTTTTGTT
Nsun2_mRNAVorwärtsGGATGAAGCAGTGATCGCAG93 BP
RückwärtsATCCACTTCAGTCCTGGCAA
Pou5f1_mRNAVorwärtsTCCCTACAGCAGATCACTCAC80 Basispunkte
RückwärtsCGCCGGTTACAGAACCATAC
Sox2_mRNAVorwärtsACAGATGCAACCGATGCACC105 BP
RückwärtsTGGAGTTGTACTGCAGGGCG
Nsun2_eRNAVorwärtsCCTGAGAGGTGTTTTTTTTTGT110 BP
RückwärtsAGGTTAACACATCAGCCCA
Pou5f1_eRNAVorwärtsCACTTCTCTGGGGTCTCTGG107 BP
RückwärtsCCAGGACAAGACAGCCATTG
Sox2_eRNAVorwärtsAGTCAGCTACATGGGCAGAG119 BP
RückwärtsCCCCTCTTCTCACCGTACAG
Nsun2_negative KontrolleVorwärtsCCCCGTGTTTAAGAGGAATGA88 BP
RückwärtsACTGAGAACAACCCACTAGCA

Tabelle 4: Primer-Sequenzen für die RT-qPCR-Analyse. Vorwärts- und Rückwärts-Primersequenzen werden für die spezifische Amplifikation jedes Zielgens in RT-qPCR-Experimenten verwendet. Diese Primer wurden optimiert, um eine genaue Quantifizierung der mRNA- und eRNA-Expression sicherzustellen.

5. eRNA-Stabilitätsdaten Analyse 22

  1. Analysieren Sie alle Daten mit der ΔCt-Methode und normalisieren Sie die relativen eRNA-Spiegel auf Tbp_mRNA (Supplementary File 1 und Abbildung 2A).
    HINWEIS: Wenn die Differenz des Ct-Werts zwischen zwei technischen Replikaten 0,5 übersteigt, schließen Sie die Daten von der weiteren Analyse aus. Berechnen Sie relative Genexpressionsniveaus mit der ΔCt-Methode, indem Sie den Ct-Wert des Kontrollgens (z. B. Tbp_mRNA) vom Wert des Zielgens subtrahieren (ΔCt = Control_Ct - Target_Ct). Der relative Ausdruck kann dann als 2^-ΔCt berechnet werden (Supplementary File 2B).
  2. Für die intragenische eRNA-Quantifizierung normalisieren Sie Expressionswerte, indem man die Werte aus cDNA, die mit zufälligen Hexamern synthetisiert wurde, durch die aus cDNA, die mit Oligo(dT)-Primern synthetisiert wurde, geteilt werden.
    HINWEIS: Führen Sie alle qPCR-Reaktionen mit drei unabhängigen biologischen Replikaten durch (n = 3).
  3. Normalisieren Sie das Ausdrucksniveau jedes Zeitpunktes ( erhalten mitder ΔCt-Methode) auf den 0-Minutenwert und zeichnen Sie die Zerfallskurve auf.
    HINWEIS: Obwohl dieses Protokoll eine kurze Behandlung mit Actinomycin D verwendet, kann eine längere Exposition gegenüber Transkriptionsinhibitoren (z. B. ActD) ebenfalls die Expression von Pflegegenen reduzieren. Für eine präzisere Quantifizierung empfehlen wir, im Zelllyseschritt eine exogene Spike-in-RNA (z. B. ERCC) hinzuzufügen, um Variationen in RNA-Extraktionseffizienz, Reverse-Transkriptionseffizienz und Pipettierungsgenauigkeit zu korrigieren und so eine konsistentere Normalisierung über Proben38,39 zu ermöglichen.
  4. Diagramme normalisierte eRNA-Niveaus über die Zeit und passe sie mit einem nichtlinearen Regressionsmodell (einphasiger exponentieller Zerfall) in GraphPad Prism an (Supplementary File 3).
  5. Schätzung der eRNA-Halbwertszeit anhand einzelner biologischer Replikate.
    1. Öffne das GraphPad-Prisma und wähle Create > XY (Optionen: X = Zahlen; Y = Geben Sie für jeden Punkt einen einzelnen Y-Wert ein und zeichnen).
    2. Geben Sie die Zeitpunkte (0, 5, 10, 15, 20 und 30 Min) als X-Achsenwerte ein.
    3. Listen Sie die Beispielnamen auf der Y-Achse (Gruppe) auf und geben Sie den entsprechenden Einzeldatenwert für jeden Zeitpunkt ein.
    4. Wählen Sie > Regression und Kurven analysieren > nichtlineare Regression (Kurvenanpassung).
    5. Im Reiter Exponentiell wählen Sie das Einphasen-Zerfallsmodell .
    6. Berechnen Sie im Tabellenblatt die Durchschnitts- und Standardabweichung der Halbwertszeiten jeder Probe mit Excel oder ähnlicher Software. Plotte die resultierenden Werte.
  6. Fit-Zerfallskurven mit 95%-Konfidenzintervallen
    1. Öffne das GraphPad-Prisma und wähle Create > XY (Optionen: X = Zahlen; Y = Geben Sie 3 Replikationswerte in nebeneinander liegenden Unterspalten ein).
    2. Geben Sie die Zeitpunkte (0, 5, 10, 15, 20 und 30 Min) als X-Achsenwerte ein.
    3. Listen Sie die Probennamen auf der Y-Achse (Gruppe) auf und geben Sie die drei Replikationswerte für jede eRNA-Probe in das entsprechende Datenblatt ein.
    4. Wählen Sie > Regression und Kurven analysieren > nichtlineare Regression (Kurvenanpassung).
    5. Im Reiter Exponentiell wählen Sie für die Analyse das Einphasen-Zerfallsmodell .
    6. Im Table to Results-Blatt werden die 95%-Konfidenzintervallwerte (KI) extrahiert, die aus der Analyse der dreifachen Proben gewonnen wurden.
      HINWEIS: Verwenden Sie folgende Zerfallsgleichung: Y = (Y0 – Plateau) • e-kt + Plateau, wobei Y das relative eRNA-Niveau zum Zeitpunkt t ist, Y0 das anfängliche eRNA-Level und k die Zerfallskonstante. Fixieren Sie das Plateau während der eRNA-Kurvenanpassung nicht auf null, da frühere Studien zeigen, dass eRNAüber die Zeit bestehen bleibt und nicht vollständig abbaut. Allerdings sollte das Plateau bei der Analyse des mRNA-Zerfalls nach den vorherigen mRNA-Protokollen 41,42 auf null fixiert werden. Erlauben Sie GraphPad Prism, die eRNA-Halbwertszeit (t₁/₂) automatisch mit der Formel zu berechnen: t1/2 = In(2)/ k. Geben Sie die Zeit in Minuten ein; Melde die resultierenden Halbwertszeiten in min.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zur Bewertung der RNA-Stabilität nach einem transkriptionellen Stillstand wurden mESCs mit actD behandelt, und die Gesamt-RNA wurde zu definierten Zeitpunkten (0 Min, 5 Min, 10 Min, 15 Min, 20 Min. und 30 Min) gesammelt. Nach der cDNA-Synthese wurde RT-qPCR durchgeführt, um die intragenische eRNA von Nsun2 und Sox2, die intergene eRNA von Pou5f1 und deren entsprechende mRNAs zu quantifizieren. Diese Daten wurden verwendet, um ze...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt eine zuverlässige und reproduzierbare Methode zur Messung der eRNA-Stabilität in mESCs. Kritische experimentelle Schritte, darunter Zellkultur, Actinomycin-D-Behandlung, RNA-Extraktion und RT-qPCR-Quantifizierung, sind in den Abbildungen und ergänzenden Dateien klar dargestellt, um die Nutzer durch den Workflow zu führen. Zusätzlich sind detaillierte analytische Verfahren wie nichtlineare Regressionsmodellierung und Interpretation von Konfidenzintervallen in <...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte offengelegt werden müssen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Studie wurde vom Forschungsfonds der Chungnam National University [2024-0991-01 (S.-K.K.)] unterstützt; das Basisforschungsprogramm [RS-2023-00209842 (S.-K.K.)] und das Programm zur Entwicklung von Bio- und Medizinischer Technologie [RS-2025-02305916 (S.-K.K.)] der Nationalen Forschungsstiftung (NRF), finanziert von der koreanischen Regierung (MSIT).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-MercapptoethanolGibco21985023
Actinomycin DSigma-AldrichA9415
ChloroformDaejung-Chemikalien2548-4105
DMSOGenDEPOTD2680
Fetales Rinderserum (FBS)Sigma-AldrichF0392
GelatineSigma-AldrichG1890-100G
Glasgow' s Minimum Essential Medium (GMEM)Gibco11710035
GraphPad Prism (Version 9)GraphPad-Software
IsopropanolDaejung-Chemikalien5035-4105
KnockOut Serum-Ersatz (KOSR)Gibco, 10828028
Leukämie-Inhibitorfaktor (LIF)MerckESG1106
MEM-Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren (MnEA)WelgeneLS005
M-MLV cDNA-Synthesekit EnzynomikEZ006S
OPTIZEN NanoQ Plus KLAB01-QI685-M-16-C
Penicillin-StreptomycinWelgeneLS202-02
Power SYBR-Green PCR Mastermix Angewandte Biosysteme4368708
QuanStudio1 Echtzeit-PCR-System Angewandte BiosystemeA40425
NatriumpyruvatWelgeneLS013
TRIzol Invitrogen15596018

References

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