Methodenartikel

Gewebespezifische hochwertige Protoplast-Isolierung für Einzelzellanalysen bei Arabidopsis

DOI:

10.3791/69330

⸱

6. Februar 2026

 ,  , 
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Studie präsentiert ein verbessertes Protoplast-Isolationsprotokoll für Wurzel-, Blatt-, Stängel- und Blütengewebe von Arabidopsis thaliana. Es nutzt optimierte Enzymverdauungs- und Reinigungsschritte, um Zellschäden und Ablagerungen zu minimieren, wodurch die Ausbeute erhöht und hochwertige Protoplaste für Einzelzellverfahren wie die Einzelzell-RNA-Sequenzierung erhalten werden.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNAseq) ist zu einem unverzichtbaren Werkzeug in der Pflanzenbiologie geworden, um hochauflösende Informationen über zelltypspezifische Genexpression, Entwicklungsdynamik und gewebespezifische Reaktionen auf Umweltfaktoren zu gewinnen. Eine große technische Herausforderung bei der Anwendung von scRNAseq auf Pflanzen ist die effiziente und reproduzierbare Isolierung lebensfähiger Einzelzellen ohne Zellwände, was die Heterogenität von Pflanzengeweben widerspiegelt. Die Protoplast-Isolierung, bei der die Zellwand enzymatisch entfernt wird, um einzelne, lebende Pflanzenzellen zu erhalten, ist ein weit verbreiteter Ansatz für diesen Zweck. Eine erfolgreiche Protoplast-Isolierung erfordert jedoch eine sorgfältige Optimierung, um die Zellviabilität zu erhalten und zelltypspezifische Transkriptomprofile zu erhalten. Hier präsentieren wir ein robustes und reproduzierbares Protokoll zur Isolierung hochwertiger Protoplaste aus mehreren Arabidopsis-thaliana-Geweben , einschließlich oberirdischer (Blätter, Stängel, Blüten) und Wurzelgewebe. Dieses Protokoll berücksichtigt die einzigartigen physiologischen Eigenschaften von Gewebetypen, optimiert enzymatische Verdauungsbedingungen und Reinigungsschritte, um eine hohe Erträge und eine breite Repräsentation vielfältiger Zelltypen zu gewährleisten. Die resultierenden Protoplaste eignen sich für Anwendungen wie scRNAseq, Flowzytometrie (FACS) und Analyse der transienten Genexpression. Sie ermöglicht die Erzeugung von Einzelzell-Suspensionen aus verschiedenen Gewebetypen. Die vorgestellte Methode unterstützt die Erforschung zellulärer Heterogenität und erhöht die Zuverlässigkeit einzelzelliger Ansätze in der Pflanzenforschung.

Einleitung

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Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNAseq) hat die Pflanzenbiologie revolutioniert, indem sie die Analyse der Genexpression mit beispielloser Auflösung ermöglicht. scRNAseq liefert Transkriptominformationen zur zellulären Heterogenität, Entwicklungsbahnen und Reaktionen auf Umweltreize bei zelltypspezifischer Auflösung 1,2,3.

Im Gegensatz zu Tiersystemen stellen die starre Pflanzenzellwand und die strukturelle Komplexität der Pflanzengewebe erhebliche Barrieren für die effiziente Isolierung einzelner Zellen für die transkriptomische Analyse dar. Unter den verfügbaren Methoden hat sich die enzymatische Entfernung der Zellwand zur Bildung von Protoplasten als weit verbreitete Methode etabliert,die vor mehr als 60 Jahren entwickelt wurde. Trotz ihrer weitverbreiteten Verwendung bleibt die Protoplast-Isolierung ein technisch anspruchsvolles Verfahren, das eine gewebespezifische Optimierung erfordert, um Zellertrag, Lebensfähigkeit und ein stabiles Transkriptom auszubalancieren. Alternative Methoden, wie die Single-Nucleus-RNA-Sequenzierung (snRNA-seq), vermeiden die Notwendigkeit einer Zellwandverdauung, indem Kerne7 isoliert werden. Dies geht jedoch auf Kosten des Verlusts von Informationen über reife Transkripte, die im Zytoplasma vorhanden sind. Andere physikalische Dissoziationsmethoden, wie mechanische und laserunterstützte Mikrodissektion, vermeiden die enzymatische Zellwandverdauung, sind aber oft anfällig für Kreuzkontamination und können zu einer geringeren Zelllebensfähigkeit und begrenztem Durchsatzführen.

In den letzten Jahren wurden viele Pflanzenzellatlasse entwickelt, insbesondere für Arabidopsis, und liefern wichtige Einblicke in die transkriptomischen Landschaften verschiedener Gewebe 2,11,12,13,14,15,16,17,18 . Diese Atlanten basieren jedoch hauptsächlich auf Pflanzen im Juvenil- oder Setzlingsstadium und konzentrieren sich hauptsächlich auf Wurzel- oder Blattgewebe. Die in diesen Studien verwendeten Protokolle erfordern Optimierungsprozesse für ältere Arabidopsis-Gewebe, wie ausgewachsene Blätter, Blüten und Stängel. Zusätzlich wurden bis zum Einsatz zelltypspezifischer Sequenzierungsstudien wie scRNAseq oder Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) in Kombination mit RNA-Sequenzierung die durch die Protoplast-Isolierung verursachten Transkriptomänderungen19 nicht vollständig berücksichtigt.

Die hier vorgestellte Methode baut auf früheren Bemühungen auf und führt mehrere wichtige Verbesserungen ein: Sie berücksichtigt die physiologische und anatomische Variabilität zwischen Pflanzengeweben, indem sie die Pufferkonzentrationen sowohl für Wurzel- als auch oberirdisches Gewebe (Blätter, Stängel, Blüten) optimiert und sanfte Reinigungsmaßnahmen einsetzt, um Zellschäden zu minimieren und die Reinheit der Protoplaste zu verbessern. Im Vergleich zu nuklearbasierten Ansätzen hat diese Methode das Potenzial, das ganzzellige Transkriptom zu erhalten und so eine höher aufgelöste Information der reifen mRNA-Moleküle im Zytosol zu ermöglichen. Wichtig ist, dass das Verfahren eine hohe Vitalität, Heterogenität und reproduzierbare Konzentrationen über Gewebe hinweg liefert, von etwa 9,8 × 103Zellen /mg in Blüten bis zu 2,2 × 102 Zellen /mg in Blättern.

Das übergeordnete Ziel der vorgestellten Methode ist es, ein robustes und reproduzierbares Protoplast-Isolationsprotokoll zu präsentieren, das auf mehrere Gewebe von Arabidopsis thaliana zugeschnitten ist und einem kritischen Bedarf an hochwertigem Input gerecht wird, der verschiedene Zelltypen für Pflanzeneinzelzellstudien abdeckt.

Protokoll

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Die für diese Studie verwendeten Reagenzien und Ausrüstung sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Puffervorbereitung

  1. Bereite den jeweiligen Protoplast-Isolationspuffer17,18 gemäß Tabelle 1 in einem 15-mL-Zentrifugenrohr vor; Wurzelprotoplast-Isolationspuffer für Wurzelgewebe oder Protoplast-Isolierungspuffer für oberirdisches Gewebe.
    HINWEIS: Ungefähre Menge an Protoplast-Isolationspuffer benötigt für fünf geerntete Blütenpflanzen von Arabidopsis thaliana (Stadium 11-12 mit geschlossenen Blütenknospen): Wurzel (~ 375 mg): 7 mL, Blatt (~930 mg): 5 mL, Stängel (~215 mg): 3 mL, Blüte (~10 mg): 2 mL.
  2. Gib 2 % (mit Volumen) Cellulase RS und 1 % (mit Fleisch) Makerozym R10 frisch hinzu, bevor du den Wurzel-/Blatt-Protoplast-Isolierungspuffer verwendest. Mische gut, indem du den Protoplast-Isolationspuffer auf einen Rotator anbringst, bis das Pulver vollständig gelöst ist (etwa 10 Minuten bei 25 °C). Vermeiden Sie Luftblasen und achten Sie darauf, dass keine Pulverklumpen im Puffer zurückbleiben.

2. Gewebeverdauung

  1. Filtern Sie den jeweiligen Protoplast-Isolationspuffer vor der Verwendung durch einen 0,2-μm-Filter. Verwenden Sie eine Standardgröße Petrischale (100 mm x 15 mm) für Blätter und Wurzeln und eine kleine Petrischale (30 mm x 15 mm) für kleine Mengen Gewebe wie Blüten. Gib vor dem Übertragen des Gewebes ein paar Tropfen Protoplast-Isolierpuffer in die Petrischale.
  2. Übertrage das jeweilige Gewebe in die Petrischale und schneide es mit einer Rasierklinge so fein und schnell wie möglich mit einer Rasierklinge in kleinere Stücke (Abbildung 1A).
    HINWEIS: Verwenden Sie für jede Probe immer unterschiedliche Klingen und Pinzetten, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Tragen Sie beim Umgang mit der Rasierklinge Schutzhandschuhe.
  3. Gib den restlichen Protoplast-Isolierpuffer in die jeweilige Petrischale, um das gehackte Gewebe einzutauchen, und brüte bei 25 °C für 1 Stunde. Bewahren Sie das oberirdische Gewebe auf der Bank (kein Schütteln) und übertragen Sie das Wurzelgewebe auf eine orbitale Schütterplattform (60 U/min).

3. Filtration

  1. Wurzelprobe nach der Inkubation:
    1. Mit einer Pasteur-Pipette werden die Protoplaste von der Petrischale auf ein 40 μm Zellsieb übertragen, das auf ein vorgekühltes, offenes 50-mL-Zentrifugenrohr gelegt wird.
    2. Um die verbleibenden Protoplaste zu ernten, geben Sie genau das gleiche Volumen W5-Lösung (2 mM MES pH 5,7, 154 mM NaCl, 125 mM CaCl2, 5 mM KCl) in dieselbe Petrischale, um die an der Basis der Petrischale haftenden Protoplasten zu sammeln. Übertragen Sie die in der W5-Lösung neu suspendierten Protoplaste auf dasselbe 40-μm-Zellsieb, das auf einem vorgekühlten, offenen 50-mL-Zentrifugenrohr platziert wird.
    3. Führen Sie es ein zweites Mal durch ein neues 40-μm-Zellsieb in ein neues vorgekühltes 50-mL-Zentrifugenrohr. Ab jetzt solltest du die Proben auf Eis lassen und beim Umgang mit den Protoplasten sehr vorsichtig sein.
  2. Oberirdische Proben nach der Inkubation:
    1. Mit einer Pasteur-Pipette werden die Protoplaste von der Petrischale auf ein 70-μm-Zellsieb übertragen, das auf einem vorgekühlten, offenen 50-mL-Zentrifugenrohr platziert wird.
    2. Um die verbleibenden Protoplasten zu ernten, geben Sie genau das gleiche Volumen W5-Lösung (2 mM MES pH 5,7, 154 mM NaCl, 125 mM CaCl2, 5 mM KCl) in dieselbe Petrischale ein, um die an der Basis der Petrischale haftenden Protoplasten zu sammeln. Übertragen Sie die in der W5-Lösung neu suspendierten Protoplasten auf dasselbe 70-μm-Zellsieb, das auf einem vorgekühlten, offenen 50-mL-Zentrifugenrohr platziert wird. Ab jetzt solltest du die Proben auf Eis lassen und sehr vorsichtig mit den Protoplasten umgehen.

4. Waschen und Fikollreinigung

  1. Die Zentrifuge auf 4 °C vorkühlen und die Protoplaste 5 Minuten lang bei 500 × g mit null Bremseinstellung der Zentrifuge sammeln (Pellet).
  2. Wurzelprobe nach Zentrifugation:
    1. Entsorge das Supernatant, ohne das Protoplast-Pellet zu stören.
    2. Setzen Sie die Protoplaste sehr vorsichtig in vorgekühltem (4 °C) 600-700 μL Wurzel-Resuspensionspuffer (gleiche Teile Wurzelprotoplast-Isolationspuffer (ohne Enzyme) und W5-Lösung) mit einer Pasteur-Pipette oder 1 ml Gilson-Pipette mit Schnittspitze wieder auf, um Scheren zu vermeiden.
    3. Übertragen Sie die Federung auf 1,5 ml vorgekühlte (4 °C) Röhren.
  3. Oberirdische Proben nach Zentrifugation:
    1. Entsorge das Supernatant, ohne das Pellet zu stören.
    2. Setzen Sie das Pellet sehr vorsichtig in vorgekühltem (4 °C) 600-700 μL Blüten-/Stängel-/Blatt-Resuspensionspuffer (gleichermaßen Blüte/Stängel/Blatt-Protoplast-Isolierpuffer (ohne Enzyme) und W5-Lösung) mit einer Pasteur-Pipette oder einer 1 ml Gilson-Pipette mit Schnittspitze wieder auf, um Scheren zu vermeiden.
    3. Übertragen Sie die Federung auf 1,5 ml vorgekühlte (4 °C) Röhren.
    4. Bereiten Sie 300 μL 13,3 % (w/v) Ficoll PM 400-Lösung in einem 1,5-mL-Rohr vor. Mischen und auf Eis lassen.
    5. Gib die umgedrehte Protoplastprobe (600–700 μL) langsam auf die vorbereitete Ficoll-Lösung, ohne die Ficoll-Schicht zu berühren oder zu mischen.
    6. Zentrifugiere bei 4 °C für 5 Minuten bei 700 × g mit Nullpausenstellung der Zentrifuge.
    7. Sammeln Sie die Protoplaste, die sich in der mittleren Schicht (Grenzfläche) befinden, zusammen mit der oberen Phase (erste Schicht) (Abbildung 1B). Seien Sie vorsichtig, die untere dritte Schicht nicht zu sammeln, die Ficoll und die getrennten Trümmer enthält. Lagern Sie bei 4 °C bis zum weiteren Gebrauch.

5. Zählen und Qualitätskontrolle

  1. Verwenden Sie 10 μL der Protoplastlösung, um die Anzahl der isolierten Protoplaste mit einem Neubauer-Hämozytometer zu zählen.
    OPTIONAL: 1 % (w/v) Evans Blue Farbstoff kann hinzugefügt werden, um die Viabilität der Protoplaste zu bewerten (Abbildung 1C).
  2. Verdünnen Sie die Protoplastlösung auf die erforderliche Konzentration von Protoplasten/mL mit einem vorgekühlten (4 °C) Resuspensionspuffer (erklärt in Schritt 4.2.2 für Wurzel und Schritt 4.3.2 für oberirdisches Gewebe) des jeweiligen Gewebes.
  3. Führen Sie das beabsichtigte Experiment so schnell wie möglich durch, z. B. Einzelzell-RNA-Sequenzierung und/oder FACS15,19.

Ergebnisse

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Die implementierten Protoplast-Isolationsprotokolle für oberirdisches und Wurzelgewebe ermöglichen erfolgreich eine effiziente Verdauung der Zellwand und die Freisetzung intakter Einzelzellen aus allen Arabidopsis-thaliana-Geweben. Bei den getesteten Gewebetypen, zu denen Blüten, Stängel, Blätter und Wurzeln gehörten, erzeugte der enzymatische Verdauungsprozess gut getrennte Protoplaste mit minimaler Anzahl unverdauter Zellgruppen (Abbildung 2A-D). Die Evans-Blue-Farbstofftests bestätigten, dass die Protoplaste, die sphärische Morphologie mit glatten Plasmamembrangrenzen aufwiesen, lebensfähige Zellen sind (Abbildung 1C). Für jeden Gewebetyp wurden kugelförmige Protoplasten gezählt. Die Blüten enthielten im Durchschnitt 97.875 ± 7.531 (9.788 Zellen/mg, n = 3), Stängel 119.025 ± 22.508 (550 Zellen/mg, n = 4), Blätter 210.483 ± 15.572 (225 Zellen/mg, n = 3) und Wurzeln 225.363 ± 52.561 (599 Zellen/mg, n = 4).

Die Protoplast-Suspensionen zeigten eine breite Verteilung der Zellgrößen und das Vorhandensein von grünen oder blassen Plastiden, was die heterogene zelluläre Zusammensetzung jedes entnommenen Gewebes widerspiegelt (Abbildung 3A-D). Zur Bestätigung wurde eine Protoplast-Isolierung mit einer transgenen Begleitzell-spezifischen YFP-Reporterlinie durchgeführt, und die Suspension enthielt lebensfähige kleine Protoplaste mit einem YFP-Signal, das Begleitzellen repräsentiert (Abbildung 3E). Dies unterstreicht, dass das verwendete Protoplast-Isolationsprotokoll für schwer zu isolierende Gefäßzellen mit starren Zellwänden geeignet ist.

Mit der vorgestellten optimierten Methode kann man eine hohe Anzahl lebensfähiger Protoplaste mit minimaler Menge an Ablagerungen aus verschiedenen Geweben adulter Pflanzen isolieren. Um die Reinigung der oberirdischen Proben zu verbessern, haben wir einen Ficoll-Polsterreinigungsschritt eingebaut, um freigesetzte Organellen und andere Zellreste aus den verdauten Proben zu entfernen und dabei die Transkriptomqualität zu erhalten (Abbildung 4).

In den scRNAseq-cDNA-Bibliotheken, die aus den Protoplasten erzeugt wurden, wurden hochexprimierte Housekeeping-Transkripte wie ACTIN2 und seltene/niedrig exprimierte Transkripte wie der Homeodomänen-Transkriptionsfaktor KNAT1, ein spezifischer Marker für kambische und meristematische Zellen, sowie die Begleitzellen SUC2 und PARCL1 durch spezifische cDNA-PCR-Assays15 nachgewiesen (Abbildung 5). Dies weist auf eine breite Zelltyprepräsentation und Heterogenität der erhaltenen Protoplastpopulation hin, was durch die Analyse der mit dieser Methode erzeugten scRNAseq-Datenweiter bestätigt wurde.

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Abbildung 1: Arbeitsablauf der Protoplast-Isolationsschritte. Sechs Hauptschritte werden gezeigt: (1) Puffervorbereitung, (2) Gewebeverdauung, (3) Filtration, (4) Waschen und Ficoll-Reinigung, (5) Zählen und Qualitätskontrolle sowie (6) Fortsetzung mit nachgelagerten Experimenten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 2: Bilder der Protoplast-Vorbereitungsschritte. (A) Repräsentatives Bild der Hackphase der Blattprobe (Schritt 2.1). Das obere Bild zeigt das entnommene Gewebe mit ein paar Tropfen Puffer in einer Standardgröße Petrischale und einer Rasierklinge zum Hacken. Das untenstehende Bild links zeigt das Gewebe nach einigen vertikalen Strichen mit der Rasierklinge (siehe Pfeil). Das untenstehende Bild rechts zeigt die gehackte Probe, bereit für den nächsten Schritt. (B) Bild eines Ficoll-Polsters nach Zentrifugation in einem 1,5-mL-Rohr (Schritt 4.3.7). Der weiße Pfeil zeigt die mittlere Schicht an, die Protoplaste enthält. (C) Repräsentatives Mikroskopbild von Blattprotoplasten, die in Evans-Blue-Farbstoff inkubiert wurden. Maßstabsleiste: 250 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

figure-results-3
Abbildung 3: Mikroskopbilder erzeugter Protoplaste. Protoplast-Bilder von jedem Gewebetyp werden angezeigt. (a) Blume, (b) Stängel, (c) Blatt, (d) Wurzel. Maßstabsleiste: 250 μm. (E) Konfokalmikroskopaufnahmen einer zellspezifischen Begleitzell-spezifischen YFP-Reporterlinie. Das erste Bild (links) zeigt die Expression des YFP-Begleitzellreporters in der Blattgefäße (grüne Farbe). Das zweite Bild (rechts) stellt Protoplaste von Zellen dar, die den YFP-Reporter ausdrücken (grünes Signal). Die violette/blaue Farbe steht für Chloroplasten-Autofluoreszenz. Maßstabsleiste 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

figure-results-4
Abbildung 4: Mikroskopaufnahmen von Blattprotoplasten vor (A) und nach (B) der Reinigung des Ficoll-Polsters. Maßstabsbalken: 250 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

figure-results-5
Abbildung 5: Qualitätskontroll-PCRs von scRNAseq-Bibliotheken. Repräsentative Gelbilder von Qualitätskontroll-PCRs von Wurzel- und oberirdischen Gewebe-Einzelzell-RNAseq-Bibliotheken. Getestete GeneSUC2, PARCL, KNAT1, ACT2 (jeweils A bis D) und für jedes Gewebe: Blüte, Stängel, Blatt, Wurzel von links nach rechts. cDNA (+) wird als positive Kontrolle verwendet, Wasser als negative Kontrolle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Wurzelprotoplastierender PufferPuffer für Blüte/Stängel/Blatt
600 mM Mannitol400 mM Mannitol
2 mM MgCl2-
0,1 % BSA0,1 % BSA
2 mM CaCl210 mM CaCl2
2 mM MES pH 5,720 mM MES pH 5,7
10 mM KCl20 mM KCl
Stellen Sie den pH-Wert bei Bedarf mit einer 1-Meter-Tris-Basis auf 5,5 einStellen Sie den pH-Wert bei Bedarf mit einer 1-Meter-Tris-Basis auf 5,5 ein

Tabelle 1: Kompositionen von Protoplast-Isolationspuffern. Protoplast-Isolierungspufferrezepte für Wurzel- und oberirdische (Blüte-, Stängel-, Blatt-)Gewebe werden bereitgestellt.

Diskussion

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Dieses optimierte Protokoll zur Isolierung von Protoplasten aus verschiedenen Arabidopsis-Geweben wurde für scRNAseq-Anwendungen angepasst und analysierte das gesamte Transkriptom im Zytoplasma und den Kernen. Die gewebespezifische Optimierung der Puffer sowie zusätzliche Schritte zur Verdauung und Reinigung führten zu robusten und reproduzierbaren Erträgen über verschiedene Gewebe hinweg. Konkret lagen Blütenprotoplasten im Durchschnitt bei ~98.000 Zellen pro Probe (~9.788 Zellen pro mg Gewebe), Stammprotoplasten bei ~119.000 Zellen (~550 Zellen pro mg), Blattprotoplasten bei ~210.500 Zellen (~225 Zellen pro mg) und Wurzelprotoplasten bei ~225.000 Zellen (~599 Zellen pro mg), was die strukturelle und physiologische Vielfalt dieser Gewebe widerspiegelt.

Eine wesentliche Verfeinerung dieses Protokolls war die Verwendung eines Ficoll-basierten Polsters anstelle der gebräuchlicheren saccharosebasierten Verläufe/Polster zur Reinigung. Im Gegensatz zu Saccharose, das von Zellen aufgenommen wird und einen großen Einfluss auf das Transkriptom 13,20,21 hat, ist Ficoll osmotisch inert und membrandurchlässig, wodurch die RNA-Integrität während der Isolation22 erhalten bleibt. Dieser Schritt verringerte auch die Anzahl freier Organellen, wie Chloroplasten, aus gebrochenen Zellen und Zellresten in der Suspension. Das Vorhandensein solcher Ablagerungen kann die Tröpfchenbildung beeinträchtigen, indem sie die Kanäle von mikrofluidischen Geräten verstopft oder dazu führt, dass mehr als eine Zelle in den gebildeten Tröpfchen vorhanden ist, was zur RNA-Kontamination in der Umgebung beiträgt. All diese Faktoren können zu falschen Schlussfolgerungen oder Verzerrungen bei der Analyse von scRNA-seq-Daten führen.

Es wurde gezeigt, dass die Protoplast-Isolierung das Transkriptom von Pflanzenzellenverändern kann 2,15,16,19. Eine zentrale Strategie dieses Protokolls, um dieses Artefakt zu minimieren, besteht darin, die Protoplaste nach der enzymatischen Verdauung bei 4 °C (auf Eis) zu halten, was die Stoffwechsel- und Transkriptionsaktivität verlangsamt und somit die mit der Protoplast-Isolation assoziierten transkriptionalen Veränderungen reduziert. Darüber hinaus ist es entscheidend, die Gewebeentnahmezeit über Replikate hinweg konsistent zu halten und sie mit dem Studienziel abzustimmen, da gezeigt wurde, dass Zeitunterschiede sowohl protoplast-induzierte Gene als auch circadian-regulierte Transkripte, die in scRNA-seq-Datensätzen15 detektiert werden, beeinflussen.

Bei dieser Methode war neben der Produktion einzelner Zellen mit minimalem Abfall ein weiterer sehr wichtiger Punkt, die Heterogenität der Gewebe so zu bewahren, dass sie potenziell alle Zelltypen repräsentieren kann. Die Vielfalt der Protoplast-Suspensionen wurde durch den Nachweis unterschiedlicher Morphologien der Protoplaste bestätigt, einschließlich unterschiedlicher Größen und des Vorhandenseins von Signalen von zelltypspezifischen Reporterlinien innerhalb der erhaltenen Population (Abbildung 2). Zusätzlich wurde die Protoplast-Population durch den Nachweis seltener und zelltypspezifischer sowie haushaltsspezifischer Transkripte in scRNA-seq cDNA-Bibliotheken mittels PCR untersucht (Abbildung 4). Dazu gehörten seltene Marker-Gene des Trieb-apikalen Meristems und Marker von Begleitzellen15. Die erfolgreiche Erfassung dieser Transkripte bestätigt, dass die vorgestellte Methode die Isolierung verschiedener Zelltypen mit hoher Integrität ermöglicht, was sie zu einem wertvollen Werkzeug zur Förderung der Einzelzellforschung in Pflanzen macht. Zusätzlich zu scRNAseq kann diese Methode auch für Durchflusszytometrie, Analyse der transienten Genexpression und Pflanzenregenerationstests verwendet werden.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklärten keinen Interessenkonflikt.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieser Artikel ist Teil eines Projekts, das vom Europäischen Forschungsrat (ERC) im Rahmen des Forschungs- und Innovationsprogramms Horizon 2020 der Europäischen Union (Grant Agreement Nr. 810131) gefördert wurde.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Cellulase RS Duchefa BiochemieC8003
Zentrifuge 5810R-ModellEppendorf5810000010
Ficoll PM 400 Sigma-Aldrich26873-85-8
Macerozym R10Duchefa BiochemieM8002
Mikrozentrifuge 5417R-ModellEppendorfeingestellt
Puradisc 30 steriler Spritzenfilter, 0.2 & micro; mCytiva10462200Bezeichnet als 0.2 & micro; m-Filter im Protokoll
Sterile Cell Sieb 40 & Micro; m Nylon Mesh Fisherbrand22363547
Sterile Cell Sieb 70 & Micro; m Nylon Mesh Fisherbrand22363548

Referenzen

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Schlagwörter

Protoplast IsolationSingle Cell AnalysisArabidopsis ThalianaSingle Cell RNAseqTissue Specific IsolationEnzymatic DigestionCell ViabilityFlow CytometryGene Expression AnalysisPlant Cell Suspension

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