Method Article

Visualisierung der räumlich-zeitlichen Dynamik der somatosensorischen Kortexneuronen während der Elektroakupunktur mittels Zwei-Photonen-In-vivo-Bildgebung

DOI:

10.3791/69340

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January 16th, 2026

 ,  ,  , 
1Traditional Chinese Medicine, School of Medicine, Acupuncture Research Institute, Jianghan University

In This Article

Summary

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Dieses Protokoll integriert Schädelfenster bei transgenen Mäusen von Thy1-GCaMP6f, standardisierte Elektroakupunktur und Zweiphotonenbildgebung, um die Dynamik kortikaler Ensembles im Millisekundenmaßstab während der Stimulation zu visualisieren und so schichtspezifische Plastizität zu erkennen.

Abstract

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Dieses Protokoll etabliert einen umfassenden experimentellen Rahmen zur Untersuchung der kortikalen Schaltungsdynamik während der EA (Elektroakupunktur-)Stimulation. Die Methodik integriert drei zentrale Komponenten: chronische Schädelfensterimplantation bei transgenen Mäusen von Thy1-GCaMP6f, standardisierte EA-Stimulation am ST36-Akupunktur mit 2/100-Hz-biphasischen Pulsen und hochauflösende Zweiphotonen-Calciumbildgebung. Dieser integrierte Ansatz ermöglicht eine Echtzeitvisualisierung der neuronalen Ensembleaktivität im primären somatosensorischen (S1) Kortex mit Millisekunden-Zeitpräzision und erfasst zuvor unzugängliche Details der Netzwerk-Reaktionen auf Neuromodulation. Die Technik zeigt erfolgreich unterschiedliche, schichtspezifische Aktivierungsmuster und Veränderungen der longitudinalen Plastizität auf und liefert wichtige Einblicke in die kortikalen Mechanismen, die den Effekten von EA zugrunde liegen. Indem sie die grundlegenden räumlich-zeitlichen Beschränkungen konventioneller fMRT und elektrophysiologischer Techniken überwindet, bietet diese hochauflösende Plattform beispiellose analytische Fähigkeiten zur Kartierung dynamischer neuronaler Schaltkreise. Das robuste Design des Protokolls und die reproduzierbaren Ergebnisse machen es besonders wertvoll zur Optimierung gezielter Neuromodulationstherapien und zur Verbesserung unseres Verständnisses der Plastizität auf Schaltungsebene als Reaktion auf periphere Stimulation.

Introduction

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Die Elektroakupunktur, eine moderne Anpassung der traditionellen Akupunktur, bei der kontrollierte elektrische Ströme über Nadeln an bestimmten Akupunktpunkten eingesetzt werden, ist bekannt für die Modulation neuronaler Schaltkreise, die an der Schmerzverarbeitung, motorischer Steuerung und autonomer Funktion beteiligt sind. Es wird angenommen, dass seine Effekte komplexe Signalkaskaden betreffen, die durch periphere sensorische Nervenaktivierung (hauptsächlich Aδ- und C-Fasern) ausgelöst werden, was zur Freisetzung von Neurotransmittern (z. B. Opioide, Serotonin, GABA) und zur anschließenden Modulation auf Wirbelsäulen-, Hirnstamm- und kortikalen Ebenen 1,2 führt. Wichtige beteiligte Strukturen sind die somatosensorischen Kortzen. Im S1-Kortex, der taktile und nozizeptive Informationen verarbeitet, beeinflusst EA wahrscheinlich sowohl lokale inhibitorisch-exzitatorische Gleichgewichte als auch die Langstreckenkonnektivität 3,4. Die genaue zeitliche Abfolge der Aktivierung/Hemmung zwischen verschiedenen neuronalen Populationen (z. B. pyramidale Neuronen, Interneuronen) und Schichten innerhalb von S1 während und unmittelbar nach der EA-Stimulation bleibt jedoch aufgrund der zuvor genannten methodischen Einschränkungenweitgehend unkartiert. Das Verständnis dieser Echtzeitdynamiken ist entscheidend, um EA-Parameter zu optimieren und therapeutische Ergebnisse vorherzusagen.

Traditionelle Methoden zur Untersuchung der neuromodulatorischen Effekte von EA (Elektroakupunktur) auf kortikale Schaltkreise, wie Verhaltensstudien und Post-Mortem-Analysen, bieten wertvolle Erkenntnisse, können jedoch keine Echtzeit-neuronale Aktivität mit hoher raumzeitlicher Auflösung 7,8 erfassen. Um diese Einschränkungen zu überwinden, ergibt sich die in vivo zwei-photonen-Kalziumbildgebung als leistungsstarke Alternative, die eine direkte Visualisierung der neuronalen Ensembledynamik während der Stimulation 8,9 ermöglicht. Diese Technik bietet unvergleichliche Vorteile für chronische Longitudinalstudien, da sie es Forschern ermöglicht, mit zellulärer Auflösung die schnelle und verteilte Aktivität über kortikale Schichten bei wachen, sich verhaltenden Tieren zu beobachten. Im Gegensatz zur akuten Elektrophysiologie, die eine hohe zeitliche Auflösung, aber begrenzte räumliche Abdeckung bietet, ermöglicht die Zweiphotonenbildgebung die großflächige Überwachung von Hunderten bis Tausenden von Neuronen gleichzeitig innerhalb eines definierten Sichtfelds 9,10. Darüber hinaus liefert die Zweiphotonen-Kalziumbildgebung im Vergleich zur funktionellen Magnetresonanztomographie (fMRT), die in der Abdeckung des gesamten Gehirns hervorragend ist, aber auf langsameren temporalen Skalen arbeitet und keine zelluläre Spezifität aufweist, eine feinkörnige Detektion der Aktivität spezifischer neuronaler Populationen auf einer für synaptische und schaltkreisebene relevanten Zeitskala11,12. Daher ist die Zwei-Photonen-Bildgebung einzigartig positioniert, um eine entscheidende Lücke in unserem Verständnis darüber zu schließen, wie periphere EA-Reize in räumlich und zeitlich präzise kortikale Aktivierungsmuster übersetzt werden, insbesondere in Regionen wie dem primären somatosensorischen Cortex (S1). Als primärer Knotenpunkt für somatosensorische Verarbeitung (einschließlich Signale von Akupunkten) und da EA seine Aktivität robust moduliert, stellt S1 ein strategisches Tor zur Untersuchung kortikaler Schaltkreisdynamiken dar, die durch Elektroakupunktur induziert werden.

Die Zweiphotonen-Laserrastermikroskopie (2PLSM) in Verbindung mit genetisch codierten Kalziumindikatoren (GECIs) wie GCaMP6 stellt ein revolutionäres Werkzeug der Neurowissenschaft dar. Es ermöglicht eine chronische, hochauflösende Bildgebung neuronaler Aktivität in vivo mit zellulärer und subzellulärer Spezifität13. GECIs fluoreszieren proportional zu intrazellulären Kalziumtransienten und dienen als zuverlässiger Proxy für neuronaleFeuerung 14. Entscheidend ist, dass der Einsatz von Nahinfrarot-Anregungslicht durch 2PLSM eine überlegene Tiefendurchdringung (Hunderte Mikrometer) im Vergleich zur herkömmlichen Mikroskopie bietet, was die Visualisierung der Aktivität in oberflächlichen und noch tieferen kortikalen Schichten (z. B. L2/3, L4, L5) ermöglicht. Seine inhärente optische Schnittstruktur minimiert unscharfe Fluoreszenz und Fotoschäden und macht sie ideal für Längsstudien über Wochen oder Monate15, 16, 17. Diese Technologie stellt einen revolutionären Fortschritt in der EA-Forschung dar, mit dem Potenzial, unser Verständnis grundlegend zu verändern, indem sie die Möglichkeit bietet, die Dynamik von Hunderten bis Tausenden einzelnen Neuronen gleichzeitig innerhalb eines definierten kortikalen Volumens während der Stimulation im Millisekundenbereich zu verfolgen.

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Protocol

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Alle Experimente nutzten 8-12 Wochen alte transgene Thy1-GCaMP6f-Mäuse18 Jahre alt. Alle experimentellen Verfahren und Tierpflegeprotokolle wurden gemäß dem Leitfaden des National Institutes of Health (NIH) zur Pflege und Nutzung von Labortieren durchgeführt und vom Animal Care and Use Committee der Huazhong University of Science and Technology (IACUC; Protokollgenehmigungsnummer: 3603). Es wurde alles unternommen, um die Anzahl der eingesetzten Tiere und ihr Leiden zu minimieren. Ein Schaltplan des experimentellen Aufbaus ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Chronische Schädelfensterimplantation

  1. Anästhesie-Induktion und stereotaktische Stabilisierung
    1. Beginnen Sie die Anästhesie, indem Sie die 8-12 Wochen alte Thy1-GCaMP6f-Maus in eine Induktionskammer mit 4-5 % Isofluran (Vol/Vol) in 100 % medizinischem Sauerstoff bei einer Durchflussrate von 1 L/min einleiten.
    2. Nach Verlust des Aufrichtreflexes (typischerweise innerhalb von 2–3 Minuten) wird das Tier auf ein thermostatisch gesteuertes Heizpad (bei 37 °C gehalten) in ein digitales stereotaxisches Gestell übertragen.
    3. Sichern Sie die Maus mit einem Nasenkegel, der 1,5–2,0 % Isofluran für die chirurgische Wartung liefert. Tragen Sie eine Augensalbe (z. B. Puralube Vet Salbe) auf beide Augen auf, um eine Hornhauuttrocknung zu verhindern.
    4. Führen Sie vorsichtig nicht-traumatische Ohrstäbe in den äußeren auditiven Meatus ein, um eine symmetrische Positionierung ohne übermäßigen Druck zu gewährleisten, der Gewebeschäden oder einen Ruptur der Trommelhautverursachen könnte.
    5. Sichern Sie den Maxillargaumen mit der Nasenklemme, um eine Atemwegsverstopfung zu vermeiden.
    6. Bestätigen Sie die Tiefbetäubung durch das Ausbleiben eines Pedalrückzugsreflexes, festen Zehenkneifen und stabile, langsame Atemfrequenz (80-120 Atemzüge/min). Überwachen Sie kontinuierlich die Körperkerntemperatur mit einer rektalen Sonde und passen Sie das Heizkissen entsprechend an.
    7. Verabreichen Sie subkutane (s.c.) präemptive Analgesie (z. B. Carprofen, 5 mg/kg) und Flüssigkeitsunterstützung (sterile Kochsalzlösung, 0,5–1 ml s.c.). Stabile physiologische Parameter (SpO₂ > 95 %, regelmäßige Atmung) während der gesamten Einrichtung überprüfen.
  2. Chirurgische Exposition des Schädels
    1. Rasieren Sie die dorsale Kopfhaut sorgfältig mit elektrischen Haarschneidern und tragen Sie anschließend eine chemische Enthaarungscreme für eine vollständige Haarentfernung auf. Gründlich mit steriler Kochsalzlösung abspülen.
    2. Durchführen Sie sequentielle Antisepsis: Schrubben Sie die freiliegende Haut dreimal, abwechselnd Povidon-Jod (10 %) und 70 % Isopropylalkohol-Abstriche, abschließend mit einer Chlorhexidinglukonat-Lösung (2 %).
    3. Mit sterilen Mikro-Dissektionsscheren und feiner Pinzette (Dumont #5) wird ein sagittaler Schnitt in der Mitte (~15–20 mm lang) durch die Haut und das darunterliegende Bindegewebe geschaffen, beginnend ~2 mm hinter den Augen und bis zum interparietal-okzipitalen Übergang.
    4. Verwenden Sie mikrohämostatische Pinzetten oder bipolare Kauterie (niedrige Einstellung), um die Kapillarblutung entlang der Schnittränder zu kontrollieren. Ziehe die Hautlappen vorsichtig seitlich mit gebogenen Mikro-Retraktoren oder 5-0 Seidennähten, die am umliegenden Hang verankert sind.
    5. Das gesamte dorsale Kalvarium, einschließlich Frontal-, Parietal- und Interparietalknochen, freizulegen. Mit einer Mikrokurette (#00) wird das Periost – eine fibröse Gefäßmembran, die an der Knochenoberfläche haftet – unter hoher Vergrößerung (chirurgisches Mikroskop) sorgfältig entfernt.
    6. Wenden Sie sanfte, tangentiale Striche an, um Schädelschäden oder beschädigte Nähte (Bregma, Lambda, Sagittal, Koronal) zu vermeiden. Erreichen Sie eine glatte, avaskuläre Knochenoberfläche, die für eine präzise Kraniotomie und anschließende Haftbindung unerlässlich ist.
    7. Bewässern Sie das Feld häufig mit sterilem, warmem (37 °C) 0,9 % Kochsalzlösungsgehalt, um Knochenstaub zu entfernen und die Feuchtigkeit des Gewebes zu erhalten.
  3. Stereotaktische Zielsetzung des S1-Hintergliedmaßen-Bereichs
    1. Mit einem hochpräzisen stereotaxischen Manipulatorarm wird die Spitze eines feinen chirurgischen Markerstifts oder Mikrobohrers direkt über dem anatomischen Bezugspunkt Bregma (dem Schnittpunkt von koronaler und sagittaler Naht) positioniert. Koordinaten unter der Mikroskop-Visualisierung bestätigen (10x).
    2. Stellen Sie den Manipulator so ein, dass der Marker genau anteroposterior (AP) -1,5 mm (hinten zum Bregma) und mittelseitlich (ML) +2,0 mm (rechte Hemisphäre) relativ zur Mittellinie (sagittale Naht) bewegt wird.
      HINWEIS: Dieser Ort entspricht dem primären somatosensorischen Kortex (S1) des Hintergliedmaßen-Repräsentationsbereichs (S1HL).
    3. Ritzen Sie an dieser Koordinate leicht ein kleines Fadenkreuz (<0,5 mm) auf die freiliegende Scheitelbeinoberfläche, um die Sichtbarkeit zu gewährleisten, ohne den Knochen zu durchdringen.
    4. Überprüfen Sie das Fehlen einer größeren Oberflächengefäße, die die markierte Stelle durchqueren; Wenn bedeutende Gefäße vorhanden sind, sollten die ML-Koordinaten minimal angepasst werden (±0,1–0,2 mm), um diese zu vermeiden, da durale Gefäße bei Durchbruch stark bluten und die optische Klarheit beeinträchtigen können.
    5. Dokumentiere die endgültig angepassten Koordinaten.
  4. Präzise Kraniotomie-Ausführung
    1. Zentriere eine sterile, einwegwegige Biopsiestanz mit 3 mm Durchmesser präzise über der markierten S1HL-Koordinate. Üben Sie festen, gleichmäßigen Abwärtsdruck aus, während Sie den Stempel sanft drehen, um die äußere kortikale Knochenschicht vollständig um den Umfang zu streifen. Nimm den Punch ab.
    2. Mit einem Hochgeschwindigkeits-mikrochirurgischen Bohrer (z. B. mit 0,5–0,8 mm Karbidmahl), der unter konstanter 0,9 % salzhaltiger Bewässerung (Kühlung und Entfernung von Ablagerungen) an einen stereotaxischen Arm befestigt ist, wird der Knochen innerhalb des geschnittenen Kreises vorsichtig verdünnt.
    3. Bohren Sie in kurzen Stößen mit einer leichten, tangentialen Fräsbewegung und bewegen Sie sich systematisch vom Rand zur Mitte voran. Überwachen Sie die Knochentransparenz unter Vergrößerung genau.
    4. Hören Sie sofort auf mit dem Bohren, wenn Sie ein subtiles "Erröten" der darunterliegenden Dura Mater beobachten, was auf eine minimale Knochendicke (<50 μm) hinweist. Wechsel zu feinen Mikropinzetten (Dumont #5/45) und Mikroskopscheren, um die verbleibenden dünnen Knochenfragmente sorgfältig anzuheben und abzuziehen, radial nach außen vom Zentrum heraus.
    5. Bewahren Sie die Dura Mater intakt – stellen Sie sicher, dass sie durchsichtig und glänzend wirkt, ohne Risse oder starke Blutungen. Kontrolliere jede leichte Duralblutung sofort, indem du sanften Druck mit einem sterilen, komprimierten Schaumstoff-Pledget ausübst, der in 0,9 % Kochsalzlösung oder Thrombin getränkt ist.
    6. Spülen Sie die freiliegende Dura reichlich mit warmem, sterilem künstlichem Rückenmarkswasser (aCSF) oder 0,9 % Kochsalzlösung, um alle Knochenreste zu entfernen. Vermeide Austrocknung17,20.
  5. Chronische Schädelfensterimplantation und Fixierung der Kopfstange
    1. Bereiten Sie einen sterilen 3 mm Durchmesser großen, #1 dicken (ca. 150 μm) kreisförmigen Glasdeckmantel vor. Können Sie die Innenseite optional mit einer dünnen Schicht Silikonelastomer beschichten, um optische Klarheit zu gewährleisten und die Haftung zu verringern.
    2. Positioniere den Deckdeckel präzise über der Kraniotomie mit einer feinen Pinzette. Bereiten Sie einen schnell aushärtenden, leicht ausgehärteten Zahnkleber (z. B. Metabond oder Charisma) gemäß den Herstelleranweisungen vor.
    3. Arbeiten Sie schnell (<90 Sekunden Arbeitszeit) und tragen Sie eine dünne Zementkugel um den Rand des Deckdeckels direkt auf die trockene, saubere Schädeloberfläche auf. Stellen Sie sicher, dass der Zement die Deckungskante vollständig abdichtet, aber nicht darunter auf die Dura zieht.
    4. Härte den Zement sofort mit einem Zahnaushärtungslicht (blaues Licht, 450 nm) für 20-30 Sekunden pro Quadranten aus. Verstärken Sie die Versiegelung mit mehreren Schichten eines langsamer aushärtenden, 5 ml schweren, selbsthärtenden Acrylzahnements (z. B. Jet Repair Acrylic oder Paladur) und bauen Sie eine robuste, niedrigprofilige (<2 mm hohe Zementdecke), die mehrere Millimeter über den Rand der Kraniotomie hinaus auf den umliegenden Schädel ragt.
    5. Einen leichten, maßgefertigten Edelstahl- oder Titankopfstab (z. B. 15–20 mm lang mit zentraler Öffnung) während der Anfangsaushärtungsphase in die Zementkappe einbetten.
    6. Stellen Sie sicher, dass die Kopfstange parallel zur sagittalen Naht positioniert und über dem Fenster zentriert ist, sodass starre, ausgewogene Fixierungspunkte für zukünftige Kopfstützen unter dem Mikroskop bereitgestellt werden, ohne den optischen Zugang zu behindern.
    7. Lass den Zement vollständig aushärten (≥15 min). Überprüfen Sie vollständige Hämostase und Fensterfreiheit21.
  6. Postoperative Erholung und Überwachung
    1. Nach dem Aushärten des Zements löst man die Maus vorsichtig aus den Ohrstangen und der Nasenklemme. Isofluran absetzen und 100 % Sauerstoff verabreichen, bis die spontane Atmung vollständig wieder aufgenommen wird.
    2. Geben Sie Buprenorphin HCl (0,05–0,1 mg/kg s.c.) unmittelbar nach der OP zur Analgesie. Bringen Sie das Tier in eine vorgewärmte (30–32 °C), sauerstoffverstärkte Erholungskammer, die mit sauberem Papierbett ausgekleidet ist.
    3. Überwachen Sie kontinuierlich, bis die sternale Recumbency und vollständige Bewegung wiederhergestellt sind (typischerweise 30–60 Minuten). Verabreichen Sie 24 Stunden nach der OP eine zweite Dosis Carprofen (5 mg/kg s.c.). Bieten Sie bei Bedarf erwärmte, laktierte Ringer-Lösung (1 ml s.c.) zur Unterstützung der Flüssigkeitszufuhr bereit.
    4. Halten Sie die Maus einzeln in einem Standardkäfig unter, der mit Nistmaterial angereichert ist, um zu verhindern, dass die Käfiggenossen das Kopfimplantat beschädigen. Halte Umweltbedingungen (22–24 °C, 40–60 % Luftfeuchtigkeit, 12:12 H Hell/Dunkel-Zyklus) mit Ad-Libitum-Zugang zu Lebensmitteln und Hydrogel aufrecht.
    5. Überwachen Sie die Maus mindestens zweimal täglich für 7 Tage nach der Operation auf Anzeichen von Schmerzen/Belastung (gekrümmte Haltung, Piloerektion, verminderte Aktivität, Gewichtsverlust >15%), Infektion (eiriger Ausfluss, Schwellungen, Rötung), neurologisches Defizit oder Lockerung der Kopfstange.
    6. Einen Mindesterholungszeitraum von ≥7 Tagen einplanen, bevor experimentelle Verfahren (Bildgebung oder EA) begonnen werden, um die Beseitigung der akuten chirurgischen Entzündung, die Wiederherstellung des normalen Verhaltens und die glymphatische Entfernung sowie die Stabilisierung der Ausgangs-Kortikale Aktivität sicherzustellen. Wiegen Sie das Tier täglich, um die Genesungzu verfolgen.

2. Elektroakupunkturstimulation

  1. Präzise anatomische Lokalisierung des ST36-Akupunkts
    1. Ziel ist die ST36 ("Zusanli") Akupunktur basierend auf etablierten anatomischen Orientierungspunkten im Hintergliedmaßen der Maus. Vor dem Einsetzen der Nadel wird die proximale vordere Tibia abtast, um die Tibia-Tuberosität zu identifizieren – die markante knöcherne Prominenz direkt distal vom Kniegelenk, wo das Patellarband eingesetzt wird.
    2. Mit feinen Bremssätteln oder einem sterilen Marker messen Sie 2 mm lateral (zur Fibula hin) und 2 mm kaudal (posterior) relativ zum Zentrum der Tibia-Tuberositis. Dieser Ort entspricht dem vorderen Bauch des Musculus tibialis, oberflächlich zum tiefen Peroneusnervenast und proximal zur Bifurkation der vorderen Tibiasarterie.
    3. Bestätigen Sie das Fehlen großer oberflächlicher Blutgefäße an der Stelle bei Bedarf durch Transillumination.
      HINWEIS: Die Genauigkeit ist entscheidend, da leichte Abweichungen (>0,5 mm) die stimulierten neuronalen Strukturen und die daraus resultierenden kortikalen Reaktionen in S1 erheblich verändern können. Die Identifizierung von Orientierungszeichen sollte konsequent von geschultem Personal durchgeführt werden, um die Variabilität zwischen den Bedienern zu minimieren23,24.
      HINWEIS: Methoden zur Sicherstellung der Nadelstabilität sind: (i) Nach dem Einführen und Fixieren der Nadel wird eine Anpassungsphase eingeräumt, damit sich die Maus akklimatisieren und anfängliche Schwierigkeiten reduzieren kann. (ii) Die vom Elektroakupunkturstimulator erzeugte Schwingungsfrequenz (z. B. 2 Hz) ist von Natur aus amplitudegering. Außerdem besitzen die verwendeten feinen Nadeln (z. B. Φ0,16 mm) eine ausreichende Steifigkeit, um dieser minimalen Schwingung effektiv standzuhalten. (iii) Während des gesamten Experiments überwacht der Bediener kontinuierlich die Position der Nadelspitze. Studiendaten werden ausgeschlossen, wenn eine signifikante Verschiebung durch Tierbewegungen festgestellt wird.
  2. Sterile Nadeleinführungstechnik
    1. Nach der Hautdesinfektion (abwechselnd 70 % Ethanol und Chlorhexidin-Scrub) wird eine sterile, einweg-Edelstahl-Akupunkturnadel (Nenndurchmesser: 0,18 mm, entspricht 36 Gauge; Länge: 13 mm) senkrecht in die Haut an der markierten ST36-Koordinate eingeführt.
    2. Führen Sie die Nadel stetig durch die Haut, das subkutane Gewebe und in den darunterliegenden vorderen Musculus tibialis mit einer glatten Rotationsbewegung, um Gewebeverletzungen zu minimieren.
      HINWEIS: Die Zieleinsatztiefe beträgt 3 mm von der Hautoberfläche. Diese Tiefe gewährleistet eine optimale Einbindung der Typ-II/III-Muskelafferenten (Aδ-Fasern) und potenziell somatischer Fasern mit kleinem Durchmesser, ohne das Risiko eines Kontakts mit den darunterliegenden Tibia oder tiefen neurovaskulären Bündeln.
    3. Sichern Sie die Nadelnabe fest mit einem kleinen sterilen Klebepad oder einem individuellen Clip, um ein Lösen bei nachfolgender elektrischer Stimulation und mögliche subtile Gliedmaßenbewegungen zu verhindern.
    4. Überprüfen Sie die stabile Nadelplatzierung, indem Sie beim Einsetzen eine leichte, vorübergehende lokale Muskelfaszikulation beobachten – ein physiologischer Indikator für eine korrekte intramuskuläre Positionierung.
    5. Halten Sie eine strenge aseptische Technik durchgehend aufrecht, um Infektionen zu verhindern, insbesondere in chronischen Stimulationsparadigmen23.
  3. Elektroakupunkturstimulation, Parametrisierung und Verabreichung
    1. Verbinden Sie den isolierten Griff der eingesetzten Nadel mit dem Anoden(+)-Ausgangskanal eines programmierbaren Elektroakupunktur-Stimulators (z. B. HANS Akupunktur-Nervenstimulator, Modell LH202).
    2. Positionieren Sie eine Referenzkathode (-)Elektrode, typischerweise eine kleine Edelstahlplatte oder Clip-Elektrode, die mit leitfähigem Gel beschichtet ist, auf der ipsilateralen Hinterpfote (z. B. Plantarfläche nahe der Ferse).
    3. Gewährleisten Sie sicheren Kontakt und niedrige Impedanz (<5 kΩ) an beiden Standorten. Programmieren Sie den Stimulator so, dass er biphasische Rechteckwellenimpulse (ausgewogene positive/negative Phasen) abgibt, um die Elektrodenpolarisation und Gewebeschäden zu minimieren.
    4. Stellen Sie das Stimulationsparadigma auf den dichten Dispersionsmodus: abwechselnde Bursts von 2 Hz (niedrige Frequenz) für 3 Sekunden, gefolgt von 100 Hz (hohe Frequenz) für 3 Sekunden.
      HINWEIS: Dieses kombinierte Frequenzmuster (oft als 2/100 Hz bezeichnet) wird empirisch nachgewiesen, dass es die endogene Freisetzung von Opioiden (z. B. β-Endorphin, Enkephalin) und Monoaminen (z. B. Serotonin, Noradrenalin) im ZNS effektiver fördert als einzelne Frequenzen allein.
    5. Stellen Sie die aktuelle Intensität schrittweise an, beginnend bei 0,1 mA, bis ein leichtes, rhythmisches Pfotenzucken (Beugung der Finger oder des Knöchels) visuell beobachtet wird – typischerweise bei erwachsenen Mäusen unter leichter Anästhesie zwischen 1,0 mA. Diese Zuckschwelle zeigt eine ausreichende Rekrutierung von motorischen Efferenten und zugehörigen Afferenten mit großem Durchmesser (Aβ-Fasern) an, was die physiologische Aktivierung bestätigt, ohne Stress oder heftiges Ringen zu verursachen. Halten Sie diese kalibrierte Intensität während der 20-minütigen Stimulationssitzungaufrecht.
  4. Kritische prozedurale Kontrollen und physiologische Überwachung
    1. Stimulationsartefaktminderung
      1. Trenne EA-Kabel physisch von Bildgeräten/Headstage.
      2. Implementieren Sie eine robuste Erdung: Verbinden Sie den Erdungsanschluss des Stimulators mit einer eigenen Erdung und stellen Sie sicher, dass der Rahmen des Mikroskops und das Tierheizpad einen gemeinsamen Erdungspunkt teilen.
      3. Synchronisieren Sie zeitlich die Stimulationsimpulse mit dem Blanking-Signal des Mikroskops, falls verfügbar, oder setzen Sie eine post-hoc-Signalverarbeitung ein, um verbliebene elektrische Artefakte aus Calciumspuren zu entfernen.
    2. Physiologische Stabilität
      1. Überwachen Sie kontinuierlich die Körperkerntemperatur (gehalten bei 37,0 ± 0,5 °C mittels rückkopplungsgesteuertem Heizkissen), die Atemfrequenz (80–120 Atemfrequenzen/min) und SpO₂ (>95 %) während der 20-minütigen EA-Sitzung.
      2. Leichte Isofluran-Anästhesie (1,0–1,5 %) bei Immobilie während kombinierter Bildgebende und Stimulation aufrechterhalten. Beobachte kontinuierlich das induzierte Pfotenzucken; falls sie abnimmt oder aufhört, überprüfen Sie Nadelkontakt und Impedanz und passen Sie die Intensität leicht an (≤0,1 mA-Schritte), um eine konstante, milde motorische Aktivierung zu gewährleisten.
      3. Beenden Sie die Stimulation sofort, wenn Anzeichen von Belastung (z. B. Tachypnoe, starkes Kämpfen) auftreten.
    3. Reproduzierbarkeit
      1. Verwenden Sie identischen Nadeltyp, Einführungstiefe, Stimulatormodell und Kalibrierungsmethode (Pfotenzuckschwelle) bei allen Tieren und Sitzungen. Dokumentiere die endgültige Stimulationsintensität für jedes Testobjekt.
      2. Planen Sie eine Mindestzeit von 5 Minuten nach der Stimulation ein, bevor die Anästhesie beendet oder zusätzliche Eingriffe durchgeführt werden27,28.

3. Zwei-Photonen-Bildgebung während EA

  1. Tiervorbereitung, Kopffixierung und physiologische Pflege
    1. Nach ≥7 Tagen postoperativer Genesung wird die Thy1-GCaMP6f-Maus mit der implantierten Kopfstange in einem speziell entwickelten, vibrationsgedämpften Fixierungsapparat auf einer motorisierten XY-Stufe fixiert.
    2. Positioniere das Tier bequem auf einem reibungsarmen, luftbefeuchteten zylindrischen Laufband, sodass die Hintergliedmaßen ungehindert beweglich sind. Pflegen Sie eine leichte chirurgische Anästhesie durch die Gabe von 0,5–0,8 % Isofluran in 100 % O₂. Dieser reduzierte Isofluranspiegel minimiert die Unterdrückung der neuronalen Aktivität und gewährleistet gleichzeitig eine ausreichende Unbeweglichkeit für hochauflösende Bildgebung.
    3. Überwachen und zeichnen Sie kontinuierlich die Körperkerntemperatur (gehalten bei 37,0 ± 0,2 °C mittels rückkopplungsgesteuertem Heizkissen), Atmungsrate (100–140 Atemzüge/min) und periphere Sauerstoffsättigung (SpO₂ > 95 %).
    4. Tragen Sie ophthalmisches Gel auf, um das Austrocknen der Hornhaut während längerer Bildgebung zu verhindern. Stellen Sie sicher, dass die Hintergliedmaße ipsilateral zum S1HL-Schädelfenster für die EA-Nadeleinführung bei ST36 zugänglich ist.
    5. Planen Sie 15–20 Minuten für die physiologische Stabilisierung nach der Kopffixierung ein, bevor mit der Bildgebungbegonnen wird.
  2. Optische Zielsetzung und Optimierung für die Bildgebung der Schicht II/III
    1. Bestimmen Sie genau die Fokalebene, um hochwertige neuronale Signale zu erfassen. Befolgen Sie dieses Überprüfungsverfahren.
      1. Reduziere die Laserleistung auf ein niedriges Niveau (typischerweise 10–20 % der Bildleistung, z. B. 5–10 mW), um unnötiges Photobleaching und Fotoschäden während der Flugzeugposition zu vermeiden.
      2. Mit dem Z-Achsenantrieb des Zwei-Photonen-Mikroskops wird das Objektiv langsam in Mikrometerschritten bewegt. Beginnen Sie an der Oberfläche des Schädelfensters und gehen Sie tiefer ins Gehirngewebe vor.
      3. Im Live-Vorschaumodus identifizieren Sie die Brennebene anhand dieser visuellen Indikatoren, wie in den Schritten 3.2.1.4 und 3.2.1.5 beschrieben.
      4. Für die korrekte Fokalebene auf einer neuronalen Somaschicht: Bestätigen Sie, dass das Bild klare, helle, punktierte Strukturen (neuronale Somata) zeigt, die rund oder oval erscheinen und guten Hintergrundkontrast bieten. Stellen Sie sicher, dass die Zellgrenzen scharf sind und ein ausgeprägtes "Salz-und-Pfeffer"-Aussehen zeigen.
      5. Bei einer falschen Brennebene: Wenn das Bild verschwommen oder homogen ohne klar definierte Punktstrukturen erscheint, erkennen Sie, dass der Fokus in einem Bereich ohne Somata liegt. Wenn große, dunkle, unstrukturierte Gefäßschatten sichtbar sind, identifizieren Sie dies als Blutgefäßschicht.
    2. Verifizierung der geeigneten Fluoreszenz-Baseline
      1. Bestätigen Sie vor Anwendung eines experimentellen Reizes eine gesunde und stabile Fluoreszenzbasislinie, um eine gültige Interpretation der nachfolgenden Kalziumsignale (ΔF/F) sicherzustellen. Führen Sie die Schritte 3.2.2.2-3.2.2.4 aus.
      2. Stellen Sie die Laserleistung auf das formelle Bildgebungsniveau ein (z. B. 30–50 mW).
      3. Nehmen Sie Bilder für ein paar Sekunden in einem schnellen, niedrigauflösenden Vorschaumodus auf.
      4. Beobachten Sie die in Echtzeit angezeigte mittlere Fluoreszenzintensität (oder überwachen Sie direkt die Bildhelligkeit). Überprüfen Sie, dass das Signal stabil bleibt und keine Anzeichen einer schnellen Photobleaching zeigt, bevor Sie mit der experimentellen Datenerfassung fortfahren.
    3. Zentriert das Bildfeld im Schädelfenster.
      1. Tragen Sie Ultraschallgel oder destilliertes Wasser zwischen Objektiv und Deckglitze für die Immersionskopplung auf. Mit Infrarot-Dodt-Gradientenkontrast oder Epifluoreszenzbeleuchtung identifizieren Sie die Oberflächengefäße und richten Sie das Gesichtsfeld (FOV) aus, um große Oberflächengefäße (>20 μm Durchmesser) zu vermeiden.
      2. Wechsel zum Zwei-Photonen-Anregungsmodus mit einem abstellbaren femtosekundengepulsten Ti:Saphir-Laser. Stellen Sie die Anregungswellenlänge auf 920 nm ein – optimal zur Anregung von GCaMP6f (Spitze ~920 nm), während grüne Autofluoreszenz und Photoschäden im Vergleich zu kürzeren Wellenlängen minimiert werden.
      3. Steigern Sie die Laserleistung allmählich (typischerweise 20–50 mW gemessen an der Probe), während Sie durch die transparente Dura auf die kortikale Oberfläche (pia mater) fokussieren. Stellen Sie die Z-Position des Objektivs mit einem piezoelektrischen Nanofokusgerät an, um eine Tiefe von 200 ± 10 μm unter der Pialoberfläche zu erreichen, entsprechend der kortikalen Schicht II/III.
      4. Bestätigen Sie die Tiefe anhand charakteristischer neuronaler Dichte und Morphologie: eine dichte Population von kleinen bis mittleren pyramidalen Neuronensomaten (10–15 μm Durchmesser) mit sichtbaren apikalen Dendriten.
      5. Optimieren Sie die Laserleistung und die Photomultiplier-Röhren-(PMT)-Verstärkungseinstellungen, um eine starke Basis-GCaMP6f-Fluoreszenz (F0) ohne Sättigung (Pixelintensität ~50-70 % des Detektormaximums) und minimalenHintergrund 30,31 zu erreichen.
        HINWEIS: Während der Bildgebung wurde die durchschnittliche Leistung des 920-nm-Anregungslichts genau bei 30–50 mW am Ziel gehalten. Dieses Leistungsniveau wurde durch Pilotversuche an Tiergewebe validiert, das identischen chirurgischen Eingriffen unterzogen wurde, wodurch eine effektive Signalaufnahme für Scan-Dauern von bis zu 25 Minuten gewährleistet wurde, während Fotoschäden und Fluoreszenz-Photobleaching minimiert wurden.
  3. Hochgeschwindigkeits-Kalziumbildaufnahmeprotokoll
    1. Konfigurieren Sie den Resonanzscanner für Hochgeschwindigkeitsbildaufnahme:
      Bildgröße: 512 × 512 Pixel (typisches Sichtfeld: ~450 × 450 μm, Pixelgröße: ~0,88 μm)
      Bildrate: 7 Bilder pro Sekunde (fps), erreicht durch bidirektionales Scannen (~14 kHz Zeilenrate). Diese Geschwindigkeit sampelt die GCaMP6f-Zerfallskinetik (τ~500 ms) ausreichend, gleicht das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) aus und minimiert das Photobleaching.
      Pixel-Dwell-Zeit: ~0,8 μs (optimiert für SNR bei 7 Hz).
    2. Starten Sie kontinuierliche Zeitrafferaufnahme mit Aufnahmesoftware (z. B. ScanImage, Prairie View). Zeichnen Sie eine 5-minütige Ausgangsphase vor Beginn der EA-Stimulation auf, um die neuronale Aktivitätsdynamik vor dem Reiz festzustellen (F₀).
    3. Bei genau t = 5 Minuten beginnen Sie die EA-Stimulation bei ST36, während die Bildgebung ununterbrochen fortgesetzt wird. Sammeln Sie kontinuierlich Daten während der 20-minütigen EA-Stimulationsphase. Gesamtscan-Dauer = 25 Minuten (1500 Sekunden, ~10.500 Bilder).
    4. Speichert Daten als Multi-TIFF-Stack oder proprietäres Binärformat mit eingebetteten Zeitstempeln, die über einen TTL-Eingangskanal auf EA-Triggerimpulse synchronisiert sind.
    5. Überwachen Sie die Leistungsstabilität und den Fokusdrift der Laser (<2 μm) in Echtzeit; Kurze Pause zum Neufokussieren nur bei signifikanter Drift (z. B. >5 μm) und den Zeitpunkt32,33 notieren.
  4. Rigorose Bewegungskorrektur und räumliche Registrierung
    1. Nach der Aufnahme wird der Rohbildstapel mit NoRMCorre (Non-Rigid Motion Correction) in MATLAB verarbeitet, um räumliche Artefakte aus verbleibenden Mikrobewegungen (z. B. Atmung, Puls) zu eliminieren.
    2. Zunächst wird der Stack in überlappende räumliche Flächen aufgeteilt (z. B. 64 × 64 Pixel, 50 % Überlappung). Für jeden Patch berechnet man eine Referenzvorlage, indem man High-SNR-Frames aus dem Basiszeitraum mittelt.
    3. Mit Fourier-basierter Kreuzkorrelation berechnet man X-Y-Translationsverschiebungen für jeden Frame relativ zur Vorlage. Wenden Sie diese Verschiebungen über Subpixel-Interpolation an.
    4. Als Nächstes werden nichtstarre Deformationen behandelt: Lokale Verzerrungen innerhalb von Patches mit stückweise affinen Transformationen (Translation + Scherung) modelliert. Aktualisieren Sie die Vorlage iterativ, um die Registrierungsgenauigkeit zu verbessern. Wichtige Parameter:
      max_shift: 20 Pixel (Übersetzungsgrenze)
      max_dev: 3 Pixel (maximale nicht-starre Abweichung)
      bin_width: 50 Frames (temporäres Binning für Vorlagen-Updates)
    5. Visualisieren Sie die Wirksamkeit der Korrektur, indem Sie das Frame-zu-Frame-Korrelationsdiagramm inspizieren (sollte sich nach der Korrektur bei etwa 1,0 stabilisieren) und eine Mittelwert-Projektionsdifferenzkarte (vor vs. nach der Korrektur) erstellen. Speichere den bewegungskorrigierten Stack für die nachgeschaltete Analyse. Dieser Schritt ist entscheidend für eine genaue pixelweise Analyse von Kalziumtransients, insbesondere bei durch EA induzierten subtilen Gliedmaßenbewegungen.

4. Spatiotemporale Dynamikanalyse

Der bewegungskorrigierte Bildgebungsstack durchläuft automatisierte neuronale Segmentierung und Signalextraktion mithilfe der Suite2p-Pipeline (v0.12.3) in Python. Wichtige Verarbeitungsphasen sind:

  1. Räumliche Fußabdrucksidentifikation
    1. Wenden Sie die eingeschränkte nichtnegative Matrixfaktorisierung (CNMF) an, um den Stapel in räumliche Komponenten zu zerlegen.
    2. Initialisieren Sie Interessensgebiete (ROIs) mit einem korrelationsbasierten Ansatz: Pixel mit räumlicher Kreuzkorrelation > 0,7 und lokalem SNR > 4 zu Kandidaten-ROIs zusammenführen. Unterscheide somatische ROIs von Dendriten/Axonen nach Größe (8–15 μm Durchmesser) und Zirkularität (Kompaktheitsschwelle >0,6).
  2. Korrektur der Neuropil-Kontamination
    1. Für jeden ROI definiert man einen konzentrischen Neuropil-Annulus (innerer Radius: 1,5× ROI-Radius, äußerer Radius: 2,5× ROI-Radius).
    2. Berechnen Sie den Neuropil-Koeffizienten (r_neuropil) mittels Least-Squares-Regression:
      F_corrected(t) = F_raw(t) - 0,7 × F_neuropil(t)
      (Koeffizient empirisch validiert für Thy1-GCaMP6f-Mäuse).
  3. Signal-Dekonvolution
    1. Schließen Sie Spitzenaktivität mit OASIS (l₁-regularisierter Dekonvolution) mit AR(2)-Rauschmodell ab, um die Spitzenwahrscheinlichkeit S(t) aus ΔF/F-Spuren zu schätzen:
      ΔF/F(t) = k ⋅ S(t) + b + ε
      wobei 'k' der Calcium-Transientkern und ε das Gaußsche Rauschen ist.
  4. Qualitätskontrolle
    1. ROIs mit SNR <3, räumlicher Überlappung >30 % oder Neuropil-Korrelation >0,3 werden ausgeschlossen. Die visuelle Überprüfung erfolgt über die Suite2p GUI34.
      Spezifische Operationen und Schnittstellenelemente sind in Supplementary File 1 bereitgestellt. Die oben generierte bewegungskorrigierte TIFF-Datei wurde direkt in die Suite2p-Pipeline eingespeist. Während die integrierte Umgebung von Suite2p eine eigene starre Bewegungskorrektur enthält, wurde dieser redundante interne Schritt deaktiviert, da bereits eine präzisere nicht-starre Korrektur angewendet wurde. Automatisch extrahierte neuronale ROIs finden Sie in Supplementary File 2.

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Results

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Strukturelle Charakterisierung des S1-Kortex und der neuronalen Basisaktivität
Wir begannen damit, eine hochpräzise strukturelle und funktionale Basis für unsere Bildgebungsexperimente zu etablieren. Die Gewebemorphologieanalyse zeigte erkennbare strukturelle Unterschiede zwischen nicht aufgetragenen (Abbildung 2A) und mit Deckung aufgetragenen (Abbildung 2B) Schädelfenstervorbereitungen. Während die Anwendun...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um die kritische Lücke bei der Echtzeitbeobachtung der kortikalen Effekte der Elektroakupunktur (EA) zu schließen, präsentieren wir ein umfassendes integriertes Protokoll, das chronische kranielle Fensterimplantation für optischen Zugang, standardisierte EA-Stimulation und longitudinale Zweiphotonen-Kalziumbildgebung kombiniert, die auf den primären somatosensorischen (S1)-Kortex abzielt.

Dieses integrierte Protokoll bietet mehrere deutliche Vorteile gegenüber...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss der National Natural Science Foundation of China (Nr. 82405550) unterstützt. Wir danken den Mitgliedern des Zhang-Labors für hilfreiche Diskussionen.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CarprofenMCEN/A5 mg/kg bei Analgesie
Digitaler stereotaxischer RahmenHeckantriebKopf Modell 1900
ElektroakupunkturstimulatorHANS LH202 (2/100 Hz biphasische Impulse)N/AHANS LH202 (2/100 Hz biphasische Impulse)
IsofluraneHeckantriebR510-22-10Medizinische Qualität, 100 % Sauerstoffträger
MikrobohrsystemHeckantrieb0,5 mm Hartmetallmahl, salzhaltig gekühlt
Povidon-JodMCEHY-B223410%-Lösung
ScanImageScanImagehttps://scanimage.org/
Sterile KochsalzlösungBeyuntianST341-500ml0,9 % NaCl
Chirurgisches MikroskopZeisshttps://www.zeiss.com/meditec/en/products/surgical-microscopes.html10-40 Mal; Vergrößerung
Thy1-GCaMP6f transgene MäuseCygen55239788-12 Wochen alt, männlich/weiblich
Zwei-Photonen-MikroskopNikon A1MPNikon A1MPTi:Saphir-Laser (920 nm Anregung)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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