Biolayer-Interferometrie zur Untersuchung der Membranprotein-Inhibitor-Bindung: TACAN-Mutant und GsMTx4 als Modellsystem

Zusammenfassung

Dieses Manuskript bietet ein detailliertes Protokoll zur Optimierung und Durchführung von Bio-Layer-Interferometrie-(BLI)-Experimenten zur Untersuchung der Membranprotein-Liganden-Interaktionen bei detergent-löslichen Membranproteinen. Anhand der Wechselwirkung zwischen dem TMEM120A M207A-Mutanten und dem Peptidinhibitor GsMTx4 als Modell skizziert dieser Workflow die Proteinvorbereitung, das Laden des Biosensors und die Erfassung kinetischer Daten.

Zusammenfassung

Die Bio-Schicht-Interferometrie (BLI) ist eine effiziente biophysikalische Technik, die eine Echtzeit-quantitative Analyse biomolekularer Interaktionen ermöglicht. Obwohl sie häufig für lösliche Proteine verwendet werden, bleibt ihre Anwendung auf Membranproteine aufgrund von Hydrophobie und Abhängigkeit von Waschmitteln schwierig. Diese Studie präsentiert ein optimiertes BLI-Protokoll zur Charakterisierung von Wechselwirkungen zwischen detergent-löslichem Membranprotein und Peptidinhibitor.

Als Modellsystem wurde das Gator-Modifikator-Peptid Grammostola mechanotoxin 4 (GsMTx4) gegen das multifunktionale Membranprotein-Mutant TMEM120A M207A getestet. Die FLAG-markierte TMEM120A-Variante wurde auf Anti-FLAG-Biosensoren immobilisiert – ein tagbasiertes, aber fluoreszierend und enzymfreies Setup – und serielle Verdünnungen von GsMTx4 ausgesetzt, um Assoziations- und Dissoziationsraten zu messen.

Das Protokoll integriert Reinigungsmitteloptimierung mit Lauryl-Maltose-Neopentylglykol (LMNG) und komplementäre Charakterisierung mittels Massenphotometrie und Differential-Scanning-Fluorimetrie (DSF). Dieser Workflow ermöglicht zuverlässige kinetische Messungen und ist mit Medium-Throughput-Screening kompatibel. Der Ansatz könnte auf andere Membranprotein-Ligand-Systeme anwendbar sein, bei denen die Stabilität des Waschmittels gewährleistet ist. Insgesamt hebt die Studie wichtige Parameter hervor, die die Immobilisierungseffizienz und Analytenabgabe beeinflussen, und unterstützt so den potenziellen Nutzen von BLI bei der Inhibitorprofilierung und mechanistischen Studien zu Membranprotein-Interaktionen.

Einleitung

Membranproteine spielen zentrale Rollen in wesentlichen physiologischen Prozessen, einschließlich Signaltransduktion, Ionen- und Metabolittransport sowie Membranorganisation. Aufgrund ihrer Beteiligung an zellulärer Kommunikation und Homöostase stellen sie einen erheblichen Anteil der Arzneimittelziele in der klinischen Entwicklung dar. Das Verständnis der Membranprotein-Ligand-Interaktionen ist entscheidend, um die Funktion zu klären und das Therapiedesign zu steuern. Die amphipathische Natur dieser Proteine und ihre Abhängigkeit von Lipidumgebungen stellen jedoch erhebliche Herausforderungen für die Reinigung, Stabilisierung und biophysikalische Charakterisierung dar.

Oberflächenplasmonresonanz (SPR) und isotherme Titrationskalorimetrie (ITC) sind weit verbreitete Techniken zur Untersuchung der Kinetik und Thermodynamik von Membranprotein-Ligand-Wechselwirkungen ^1,2. Bei angemessener Optimierung können beide Methoden detaillierte quantitative Einblicke liefern, selbst für detergent-lösliche oder rekonstituierte Membranproteine. Mikroskalige Thermophorese (MST) wurde ebenfalls erfolgreich eingesetzt, um Bindungsaffinitäten unter nahezu natürlichen Bedingungen zu bewerten, insbesondere für Membranproteine³. Dennoch können diese Ansätze durch erheblichen Probenverbrauch, Schwierigkeiten bei der Aufrechterhaltung der Membranproteinstabilität oder eingeschränkte Kompatibilität mit bestimmten Waschmittelsystemen eingeschränkt sein.

Bio-Layer-Interferometrie (BLI) ist eine Echtzeit-optische Technik, die quantitative Messungen biomolekularer Interaktionen ermöglicht, einschließlich solcher, die detergentisch oder amphipollösliche Membranproteine betreffen. Neben den bereits erwähnten biophysikalischen Techniken bietet BLI eine effiziente Plattform, die die direkte Messung der Bindungskinetik ermöglicht, einschließlich Assoziation (k_on), Dissoziation (k_off) und Gleichgewichtsdissoziationskonstanten (K_D), mit niedrigeren Probenkonzentrationen und einer einfachen Anpassung an detergent- oder nanodisc-lösliche Membranproteine. Es ist auch bemerkenswert, dass BLI – wie alle biophysikalischen Technologien – eigene Einschränkungen hat, die im Abschnitt Diskussion erwähnt werden.

BLI erkennt Verschiebungen im Interferenzmuster von weißem Licht, das von einer Biosensorspitze reflektiert wird, wobei Änderungen der optischen Dicke den biomolekularen Bindungsereignissen entsprechen. Diese Verschiebungen (Δλ, in nm) werden als Sensorgramme erfasst und sind proportional zur an der Sensoroberfläche gebundenen Masse. BLI wurde weit verbreitet auf Protein-Protein- und Protein-Ligand-Interaktionen (einschließlich Peptiden und kleinen Molekülen) angewendet und eignet sich für Affinitätsbereiche von nanomolar bis mikromolar⁴. Seine Flexibilität, der geringe Probenverbrauch und die relativ einfache Einrichtung machen es zu einem potenziell vorteilhaften Werkzeug zur Untersuchung von detergent-löslichen Membranproteinen ^5,6,7.

Diese Studie präsentiert ein BLI-Protokoll zur Charakterisierung der Wechselwirkung zwischen TMEM120A M207A, einem Membranprotein, und Grammostola Mechanotoxin 4 (GsMTx4), einem Peptidinhibitor. TMEM120A wurde als mechanosensitiver Ionenkanal vorgeschlagen, der an der mechanischen Schmerzerkennung^{beteiligt ist 8}; seine Ionenkanalaktivität bleibt jedoch umstritten. Mehrere Studien haben das Fehlen mechanosensitiver Ströme berichtet, wenn TMEM120A in heterologen Systemen wie HEK293 oder CHO-Zellen 1,9,10,11 exprimiert wird. Bis heute haben mehr als vier Kryo-EM-Studien die Struktur von TMEM120A im geschlossenen Zustand aufgelöst, und es wurde keine offene Konformation^beobachtet.

Molekulardynamische Simulationen und elektrophysiologische Analysen deuten darauf hin, dass Methionin 207 (M207) im Wildtyp-TMEM120A als Sperre innerhalb des Ionenleitungswegs¹¹ wirken kann. Die Mutation dieses Rests zu Alanin (M207A) hat gezeigt, dass sie die Ionenpermeabilität erhöht, wahrscheinlich durch Veränderung der Helixpackung und das Verdrängen hydrophober Seitenketten wie Phe223. Folglich wurde der M207A-Mutant für Bindungsstudien mit GsMTx4 ausgewählt.

GsMTx4 ist ein aus Spinnengift abgeleitetes Gating-Modifierer-Peptid, das mechanosensitive Kationenkanäle hemmt. Sie besteht aus einer Aminosäuresequenz mit 32 Aminosäuren und hat ein Molekulargewicht von 4 bis 5 kDa, einschließlich Piezo- und TRP-Kanälen, hauptsächlich durch Wechselwirkung mit der Lipiddoppelschicht, anstatt die Pore^12,13 direkt zu blockieren. Frühere Studien haben gezeigt, dass GsMTx4 TMEM120A Aktivität in künstlichen Doppelschichtsystemen⁸ reduziert. In den BLI-Tests wurde der TMEM120A M207A-Mutant auf Anti-FLAG-Biosensoren immobilisiert und zunehmenden Konzentrationen von GsMTx4 ausgesetzt, was die Messung der Assoziations- (k_on) und Dissoziationsraten (k_off) ermöglichte.

Diese Arbeit bietet ein detailliertes Protokoll zur Reinigungsmitteloptimierung und kinetischen Analyse mittels Bio-Layer-Interferometrie (BLI). Obwohl BLI einige Einschränkungen aufweist, wie potenzielle Artefakte durch Sensorüberlastung oder Massentransporteffekte sowie eine geringere Eignung für schnelle Assoziationsrate-(_k-on)-Interaktionen, ist es eine nützliche Methode zur Untersuchung von Membranprotein-Ligand-Interaktionen unter kontrollierten, detergent-löslichen Bedingungen. Das Protokoll ist geeignet für Systeme mit mittleren bis niedrigen Bindungsaffinitäten (typischerweise im nanomolaren bis mikromolaren Bereich) und kann an andere hydrophobe Ziele angepasst werden, wenn geeignete Kontrollen und Pufferbedingungen angewendet werden.

Protokoll

1. Proteinreinigung und Probenoptimierung

1. Zellkultur und Transfektion
   1. Züchten Sie HEK293T/SF17-Suspensionszellen in serumfreiem Medium, ergänzt mit 20 mM L-Glutamin, in einem Schüttelinkubator mit 120 U/min, 37 °C, 80 % Luftfeuchtigkeit und 8 % CO��. Pflege der Zellen durch Weitergabe bis Passage fünf; ermöglichen es den Zellen, eine Dichte von etwa 5 × 10⁶ Zellen/ml zu erreichen.
   2. Transfektieren Sie die Zellen mit dem TMEM120A M207A-Plasmid (N-terminales FLAG-Linker-3C-Linker-TMEM120A M207A) im pCDNA3.1-Vektor mit einem kommerziellen Transfektionsreagenz gemäß den Herstelleranweisungen (siehe Materialtabelle).
   3. Das Pellet transfizierte die Zellen durch Zentrifugation bei 5.000 × g für 15 Minuten bei 4 °C. Lagern Sie das Zellpellet bei -80 °C bis zur Reinigung.
2. Zelllyse und Löslichkeit (Abbildung 1)
   1. Resuspendieren Sie ein 30-mL-Zellpellet in einem Löslichkeitspuffer mit 100 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-Piperazineethanesulfonsäure (HEPES), pH 7,8; 300 mM NaCl; 0,5 % (w/v) oder 4,98 mM Lauryl-Maltose-Neopentylykol (LMNG); 1x Proteaseinhibitor-Cocktail; 50 μg DNase I; 10% (v/v) Glycerol.
   2. Lyseere die Zellen durch Ultraschalluntersuchung mit 25 % Amplitude und einem 20 s Ein/20 Sekunden Aus-Pulszyklus für 15 Minuten, während die Probe auf Eis bleibt, um Überhitzung zu verhindern.
   3. Klären Sie das Lysat durch Zentrifugation bei 25.800 × g für 45 Minuten bei 4 °C.
3. Affinitätsreinigung mit Anti-FLAG-Harz
   1. Anti-FLAG M2-Harz mit einem Gleichgewichtspuffer mit 25 mM HEPES, pH 7,8 ausgleichen; 200 mM NaCl; 0,05 % (W/V) oder 0,4975 mM LMNG; 10% (v/v) Glycerol.
   2. Inkubieren Sie das geklärte Supernatant mit ausgeglichenem Harz 2 Stunden lang bei 4 °C auf einem Rocker.
   3. Waschen Sie das Harz zweimal mit einem Waschpuffer, der 25 mM HEPES, pH 7,8 enthält; 150 mM NaCl; 0,05 % (W/V) oder 0,4975 mM LMNG; 10% (v/v) Glycerol.
   4. Elutieren Sie das gebundene Protein mit einem Elutionspuffer, der 25 mM HEPES, pH 7,8 enthält; 400 mM NaCl; 0,001 % (w/v) oder 0,00995 mM LMNG; 10 % (v/v) Glycerol; 200 μg/mL FLAG-Peptid.
4. Konzentrations- und Größenausschlusschromatographie (SEC)
   1. Konzentrieren Sie das eluierte Protein auf ~500 μL mit einem Zentrifugalfilter und einem 30 kDa Cutoff.
   2. Durchführung von SEC unter Verwendung der Ausschlussspalte der referenzierten Größe, ausgeglichen mit 25 mM HEPES, pH 7,8; 200 mM NaCl; 0,00015 % (W/V) oder 0,00149 mM LMNG.
   3. Sammeln und sammeln Sie Spitzenfraktionen, die dem Zielprotein entsprechen.
   4. Konzentriere die gesammelten Fraktionen auf ~3 mg/mL Endkonzentration. Nach der Affinitätsreinigung wird bestätigt, dass das TMEM120A M207A-Proteinmonomer bei etwa 43 kDa auf SDS-PAGE (Abbildung 2A) erscheint. Für SEC bestätigen Sie, dass das gereinigte Protein in LMNG als monodisperser Peak elutiert, der etwa 150 kDa entspricht, was zusammen mit der LMNG-Waschmizelle das TMEM120A M207A-Dimer darstellt (Abbildung 2B).
      HINWEIS: Gelegentlich kann das Monomer-Proteinband bei etwa 50 kDa auftreten, was bei detergent-löslichen Membranproteinen üblich ist, da das Kochen von Membranproteinproben nicht typisch ist.

2. Thermische Stabilitätsanalyse mittels nano-differentieller Rasterfluorimetrie (NanoDSF)

1. Verdünnen Sie das gereinigte TMEM120A M207A-Protein auf 0,15 mg/mL im SEC-Puffer (25 mM HEPES, pH 7,8, 200 mM NaCl, 0,00015 % LMNG).
2. Laden Sie 10 μL jeder Probe in hochempfindliche Kapillaren.
3. Führen Sie den thermischen Verschiebungstest auf einem NanoDSF-Instrument mit einer Temperatursteigerung von 25 °C auf 90 °C durch.
4. Verwenden Sie kompatible Software, um den Test einzurichten und automatisierte Analysen durchzuführen.
5. Bestätigen Sie, dass eine einzelne thermische Übergangskurve (T_m) sichtbar ist, die auf ein kooperatives Entfaltungsereignis hinweist (Abbildung 3).

3. Massenphotometrie zur Bestimmung des oligomeren Zustands

1. Bereiten Sie eine auf 80 nM verdünnte Probe im SEC-Puffer vor (25 mM HEPES, pH 7,8, 200 mM NaCl, 0,00015 % LMNG).
2. Setzen Sie die Probe in vorgereinigte, massenphotometriekompatible Objektträger.
3. Daten werden mit Standardeinstellungen erfasst und mit Proteinstandards kalibriert.
4. Verarbeiten Sie Daten mit Analysesoftware, um Massenverteilungshistogramme zu erzeugen (Abbildung 4A-C).

4. Biolayer-Interferometrie-(BLI)-Protokoll

HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt einen BLI-kinetischen Test, der entwickelt wurde, um Wechselwirkungen zwischen FLAG-getaggten TMEM120A M207A und Liganden wie GsMTx4 unter Verwendung eines 384-Well-Mikroplattenformats zu untersuchen. Obwohl es für TMEM120A entwickelt wurde, kann der Workflow für andere Membranproteine angepasst werden. Alle Experimente wurden mit einer optischen Interferometrieplattform mit FLAG-Biosensorsonden durchgeführt, um FLAG-markierte TMEM120A M207A zu immobilisieren. Eine schwarze Mikroplatte mit 384 Bohrlöchern wurde mit einem optimierten Größenausschlusschromatographiepuffer (SEC) verwendet, der 25 mM HEPES, 200 mM NaCl, 0,00015 % (w/v) LMNG und 0,0005 % Tween-20, pH 7,8, enthielt. Tween-20 wurde integriert, um unspezifische Bindungen zu minimieren. Die Proteinkonzentration wurde bei 250 nM gehalten, und alle Tests wurden doppelt durchgeführt, um die Reproduzierbarkeit sicherzustellen.

1. Überlegungen zum Assay-Design
   1. Temperaturgleichgewicht
      1. Vor Beginn des BLI-Tests werden alle Prüfkomponenten – einschließlich Puffer, Proben und Biosensorsonden – auf Raumtemperatur (ca. 20–25 °C) ausgeglichen. Während der Datenerhebung wird die Testtemperatur bei 30 °C gehalten, was für kinetische Analysen empfohlen wird, um die Proteinstabilität, Ligandenbindung und Reproduzierbarkeit zu optimieren.
         HINWEIS: Dieser Gleichgewichtsschritt sorgt für konsistente kinetische Profile und minimiert Artefakte, die durch Temperaturschwankungen während des Experiments verursacht werden. Planen Sie genügend Zeit (mindestens 10–15 Minuten) ein, damit alle Reagenzien und Biosensoren das thermische Gleichgewicht erreichen, bevor der Test beginnt.
   2. Sensorhydration und Regeneration
      1. Hydrieren Sie neue FLAG-Biosensoren mit 250 μL BLI-kompatiblem Puffer (SEC-Puffer mit 25 mM HEPES, 200 mM NaCl, 0,00015 % mit LMNG und 0,0005 % Tween-20, pH 7,8) mindestens 10 Minuten vor der Nutzung in die Max-Platte.
         HINWEIS: Führen Sie Biosensoren vorsichtig mit sauberen, staubfreien Pinzetten, um Kontaminationen zu vermeiden, die die Signalerfassung beeinträchtigen und zu inkonsistenten Ergebnissen führen können. Für die Wiederverwendung des Sensors wird die Regeneration mit Q-Puffer (0,3 M Glycin, pH 3,8) durchgeführt. Eine richtige Hydration und Regeneration sind entscheidend, um die Sensorleistung und Reproduzierbarkeit aufrechtzuerhalten, insbesondere bei der Arbeit mit detergent-löslichen Membranproteinen, die empfindlich auf Umweltbedingungen reagieren.
   3. Pufferbehandlung
      1. Vermeiden Sie Luftblasen beim Abgeben von Flüssigkeiten, da diese die Erfassung optischer Signale beeinträchtigen können.
   4. Pufferzusammensetzung und Konsistenz
      1. Verwenden Sie einen Puffer, der unspezifische Wechselwirkungen minimiert und gleichzeitig die Proteinfunktion bewahrt. Für TMEM120A M207A bereiten Sie den Puffer vor, der 25 mM HEPES, 200 mM NaCl, 0,000015 % (w/v) LMNG, 0,0005 % (w/v) Tween 20, pH 7,8 enthält.
   5. Proteinimmobilisierung
      1. Optimieren Sie die Ligandbelastung, um eine Sensorsättigung von 50–80 % zu erreichen. Verwenden Sie eine feste Proteinkonzentration bei 250 nM, mit einer typischen Ladezeit von etwa 120 s. Laden Sie FLAG-tagged TMEM120A M207A (250 nM) für 120 Sekunden auf den Biosensor, um eine 50-80%ige Sättigung zu erreichen.
      2. Bestätigen Sie, dass das Biosensorsignal während der Ladephase 50 bis 80 % der maximalen Bindungskapazität erreicht.
         HINWEIS: Signale unter 50 % können auf eine unzureichende Proteinimmobilisierung hinweisen, während Signale über 80 % Massentransportbeschränkungen oder sterische Hindernisse verursachen können, was kinetische Messungen potenziell beeinträchtigt.
      3. Um potenzielle Massentransporteffekte zu bewerten, führen Sie ein Kontrollexperiment durch, bei dem die Analytkonzentration (z. B. 100 nM GsMTx4) konstant gehalten wird, während die Belastungsstufen von TMEM120A-M207A auf FLAG-Biosensoren variiert werden (Ergänzende Abbildung S1).
         HINWEIS: Nachfolgende kinetische Messungen – einschließlich Assoziation, Dissoziation, globale Bindungsanfälle und Bestimmung von k_on und k_off – unterschieden sich nicht signifikant von denen im Hauptassay. Dieses Ergebnis zeigt, dass TMEM120A Belastung im Bereich von 50–80 % keine signifikanten Massentransportartefakte einführt, was bestätigt, dass das Biosensor-Belastungsniveau für eine zuverlässige kinetische Analyse geeignet ist.
   6. _{K-D-Schätzung}
      1. Bestimmen Sie die Bindungsaffinität (K_D) durch Tests von Analytkonzentrationen (GsMTx4) von 0 μM, 5 μM, 10 μM, 20 μM, 30 μM, 50 μM und 100 μM.
   7. Hintergrundsignalsteuerung
      1. Fügen Sie geeignete Steuerungen hinzu, um Hintergrundsignale genau abzuziehen und zuverlässige kinetische Messungen sicherzustellen.
      2. Verwenden Sie eine Referenz-FLAG-Sonde, um unspezifische Bindungen oder Drift zu berücksichtigen, die während des Tests auftreten können.
         HINWEIS: Diese Referenzsonde sollte das Zielprotein nicht immobilisieren und dient als Basislinie zur Korrektur des Signals, das von den probenhaltigen Sonden erhalten wird.
      3. Subtrahieren Sie das Referenzsignal vom Abtastsignal, um nur spezifische Wechselwirkungen zwischen FLAG-getaggten TMEM120A M207A und Analyten zu analysieren.
         HINWEIS: Überprüfen Sie, dass die Referenz-FLAG-Sonde während des gesamten Tests minimales Signal zeigt. Eine stabile, niedrige Basislinie deutet auf eine vernachlässigbare unspezifische Bindung hin. Wenn das Referenzsignal schwankt oder zunimmt, sollten Sie die Pufferzusammensetzung, die Handhabung der Sonde oder die Probenvorbereitung neu bewerten, um unspezifische Wechselwirkungen zu reduzieren, bevor Sie mit der kinetischen Analyse fortfahren.
2. Konfiguration grundlegender Assay-Parameter für die Kinetikanalyse
   1. Stellen Sie die Datenerfassungsfrequenz auf 5 Hz ein, um 5 Datenpunkte pro Sekunde zu sammeln (empfohlen für alle kinetischen Assays).
   2. Wählen Sie die 384-Well-Platte als Plattenformat.
   3. Stellen Sie die Schüttelgeschwindigkeit auf 1.000 U/min und die Temperatur zwischen Umgebungstemperatur und 30 °C ein (30 °C werden in diesem Experiment für optimale kinetische Ergebnisse verwendet).
3. Konfigurieren Sie die Plattenkonfiguration.
   1. Navigieren Sie zum Tab Plattenaufbau und definieren Sie Brunnenzuweisungen sowohl für die 384-Bohrloch-Platte als auch für die Max-Platte.
   2. Weisen Sie Brunnenfunktionen auf der 384-Well-Platte zu.
      HINWEIS: Die Symbole und Anmerkungen, die sowohl für die 384-Well-Platte als auch für die Max-Platte verwendet werden, sind in der ergänzenden Tabelle S1 zusammengefasst.
      1. Kennzeichnung der Brunnen nach Rolle: Puffer, Protein (Laden), Ligand (Probe).
      2. Annotieren Sie Proteinladebrunnen mit einer Konzentration (z. B. 250 nM) für kinetische Tests.
         HINWEIS: Eine genaue Kennzeichnung ist unerlässlich, um k_auf und K_D zu berechnen (siehe ergänzende Abbildung S2A).
   3. Konfigurieren Sie die maximale Plattenkarte (Probe-Platte).
      1. Weisen Sie Biosensorsonden geeigneten Brunnen zu.
      2. Wenn eine Probe-Regeneration geplant ist, weisen Sie Brunnen für Regenerations- und Neutralisierungspuffer zu. Beschriften Sie diese Brunnen deutlich in der Software, um eine ordnungsgemäße Automatisierung während der Regeneration sicherzustellen (siehe Ergänzende Tabelle S2).
         HINWEIS: Der Prüfpuffer bestand aus 25 mM HEPES (pH 7,8), 200 mM NaCl, 0,00015 % (w/v) LMNG und 0,0005 % (v/v) Tween-20. Der Regenerationsschritt der Anti-FLAG-Biosensorsonden wurde mit einem Q-Puffer durchgeführt, der 0,3 % Glycin (pH 3,8) enthielt, gefolgt von einem Neutralisierungsschritt mit dem Assaypuffer (25 mM HEPES, 200 mM NaCl, 0,00015 % LMNG und 0,0005 % Tween-20, pH 7,8).
4. Wählen Sie den Reiter Assay Steps .
   1. Navigieren Sie zum Reiter Assay Steps, um den kinetischen Assay-Workflow zu konfigurieren. Spezifizieren Sie für jede Testphase die Brunnenpositionen, einschließlich Ausgangswert, Proteinbelastung, Assoziation und Dissoziation (siehe Ergänzungsabbildung S3).
   2. Wählen Sie den passenden Schritttyp im Dropdown-Menü aus. Stellen Sie sicher, dass die Assoziations- und Dissoziationsschritte korrekt gekennzeichnet sind, um eine genaue kinetische Analyse zu gewährleisten.
   3. Geben Sie die Dauer jedes Schrittes in Sekunden ein, um die Belichtungszeiten für alle Interaktionsphasen zu definieren.
      1. Stellen Sie die Basisschrittdauer so ein, dass der Sensor vor der Proteinbelastung (60 s) ausgeglichener wird.
      2. Stellen Sie die Dauer des Protein-Ladeschritts so ein, dass die gewünschten Ligandenimmobilisierungswerte von (60 s) erreicht werden (Abbildung 5).
      3. Stellen Sie die Dauer des Assoziationsschritts so ein, dass eine ausreichende Analytbindung ermöglicht (300 s) (Abbildung 5).
      4. Stellen Sie die Dauer des Dissoziationsschritts so ein, dass sie die Kinetik der Analyt-Entbindung angemessen erfasst (600 s) (Abbildung 5).
   4. Stellen Sie für jeden Schritt die Shaker-Geschwindigkeit (RPM) ein, um eine konstante Mischung und eine optimale Datenqualität (1.000 U/min) zu gewährleisten.
5. Ausrichtungs- und Filterschritt (siehe ergänzende Abbildung S4 und ergänzende Abbildung S5)
   1. Rohdatenkorrektur wird durchgeführt, indem man den Datenbereich bei Bedarf anpasst, um Artefakte aus kinetischen Schritten zu entfernen.
   2. Um die Y-Achse auszurichten, richten Sie die Daten zu Beginn des Assoziationsschritts aus, indem Sie die Assoziation unter Ausrichtungsschritt auswählen und die Option Beginnen aktivieren.
   3. Aktivieren Sie die Interstep-Korrektur-Option , um die Kontinuität zwischen den Schritten während der Standard-kinetischen Assays aufrechtzuerhalten.
   4. Filterung: Übertragen Sie Datenglättung, um Signalrauschen zu reduzieren, ohne Trends zu verzerren. Wählen Sie Verarbeitet , um geglättete Daten mit Rohsignalen zu vergleichen.
6. Setzen Sie einen Referenz-Schritt ein (siehe ergänzende Abbildung S6).
   1. Bestimmen Sie eine Referenzsonde, indem Sie die Referenzsonde auswählen und auf die Schaltfläche Ref. Probe klicken.
   2. Wählen Sie die Beispielsonden aus, indem Sie auf die entsprechenden Spaltennummern der Stichproben klicken.
   3. Um die Subtraktionsfunktion zu definieren, öffnen Sie den Formeleditor, klicken Sie auf Formel bearbeiten und definieren Sie die Subtraktionsfunktion , um den Hintergrund zu entfernen.
   4. Überprüfen Sie die Tabellenansicht, um zu bestätigen, dass die Referenzsubtraktion korrekt angewendet wurde.
7. Bindungsanschlussschritt
   1. Navigieren Sie zum Reiter Fitting und definieren Sie Analyseparameter (ergänzende Abbildung S7).
   2. Datenauswahl: Beziehen Sie sowohl die Assoziations- als auch die Dissoziationsphasen für lokale kinetische Anpassung ein. Schließen Sie Ausreißer manuell aus, wenn sie eine schlechte Kurvenanpassung oder ein unregelmäßiges Signal zeigen.
   3. Auswahl des Bindungsmodells: Wählen Sie das 1:1-Bindungsmodell, um die Daten anzupassen, sofern kein komplexes Verhalten festgestellt wird. Überprüfen Sie Kurvenüberlagerungen und Residuen, um die Modelleignung zu validieren.
   4. Passstrategie: Wählen Sie eine der folgenden Anpassungsstrategien basierend auf Datenqualität und experimentellen Zielen:
      1. Lokal: Passt jede Analytenkonzentration individuell an und ermöglicht eine unabhängige Bewertung der Assoziations- und Dissoziationskinetik.
      2. Global: Passt alle Analytenkonzentrationen gleichzeitig mit einem einzigen Satz kinetischer Parameter an und liefert so ein Gesamtmodell für den Datensatz.
      3. Vollständig: Passt weltweit sowohl zu Assoziations- als auch zur Dissoziationsphase über alle Konzentrationen hinweg.
      4. Partial: Passt nur auf die Assoziationsphase, ohne Dissoziation zu berücksichtigen.
         HINWEIS: BLI-Daten wurden mit einem 1:1-Langmuir-Bindungsmodell mit lokaler, vollständiger Anpassung analysiert. Lokale Anpassung stellt sicher, dass jede Analytenkonzentration unabhängig behandelt wird, was eine genaue Darstellung der Assoziationskinetik liefert und Artefakte aus Heterogenität in der Dissoziationsphase minimiert. Dieser Ansatz vermeidet Overfitting in Regionen mit variablen oder instabilen Signalen und ermöglicht eine zuverlässigere Schätzung kinetischer Parameter (k_an und k_aus) (Tabelle 1 und Tabelle 2).
8. Kinetische Analyse
   1. Überprüfung der angepassten Kurven und Residuen: Untersuchen Sie die angepassten Kurven und die entsprechenden Residuen, um die Qualität und Validität des Modells zu beurteilen. Bestätigen Sie, dass die Residuen zufällig um Null verteilt sind, ohne systematische Abweichungen (siehe Abbildung 4E für repräsentative Residuen).
   2. Ausschluss schlecht passender Daten: Entfernen von Analytenkonzentrationen, die flache, rauschige oder anderweitig unzuverlässige Signale zeigen, um die Gesamtgenauigkeit des Modells zu verbessern.
      HINWEIS: Zum Beispiel wurde die 10 μM-Konzentration aus der Anpassung ausgeschlossen, da sie sich mit dem 5-μM-Datensatz überlappte, was die Schätzung kinetischer Parameter verzerren konnte (siehe Abbildung 6A,B).

Ergebnisse

Die TMEM120 M207A-Mutante wurde in HEK293SF-17-Suspensionszellen mit einem pCDNA3.1-Vektor exprimiert, der ein N-terminales FLAG-Tag codiert, Abbildung 1. Transiente Transfektion ermöglichte die rekombinante Proteinexpression. Nach der Zellernte wurden die Membranproteine in 0,5 % Laurylmaltose-Neopentylglykol (LMNG), einem nicht-ionischen Reinigungsmittel, das zur Aufrechterhaltung der Membranproteinlöslichkeit geeignet ist, gelöst.

Die lösliche Fraktion wurde einer Affinitätsreinigung mit Anti-FLAG M2-Harz unterzogen. Das Harz wurde mit einem Puffer mit 0,01 % LMNG gewaschen, um nicht speziell gebundene Proteine zu entfernen, und TMEM120 M207A wurde in einen Puffer mit 0,001 % LMNG eluiert. Die Elution wurde mit Zentrifugalfiltern konzentriert, deren Molekulargewichtsabgrenzungen je nach Probenausbeute entweder 30 kDa oder 100 kDa betragen. Die weitere Reinigung erfolgte durch Größenausschlusschromatographie (SEC). Der letzte SEC-Schritt wurde in einem Puffer durchgeführt, der 0,00015 % LMNG enthielt, wodurch ein monodisperses Eluationsprofil entsteht, das mit einer homogenen und stabilen Proteinpräparation übereinstimmt, die für spätere strukturelle und funktionelle Analysen geeignet ist (Abbildung 2B).

Die Optimierung und biophysikalische Charakterisierung von FLAG-getaggten TMEM120 M207A sind in Abbildung 2 zusammengefasst. Expression und Reinigung wurden durch SDS-PAGE bestätigt, das ein einzelnes Band von etwa 50 kDa zeigte. Die beobachtete Migration lag leicht über dem erwarteten Molekulargewicht der monomeren Form (Abbildung 2A), wahrscheinlich aufgrund der nicht gekochten Probe vor der Elektrophorese. Das SEC-Chromatogramm zeigte einen einzigen, symmetrischen Peak, der bei einem Volumen eluierte, das einer scheinbaren Molekularmasse von etwa 150 kDa in 0,00015 % (w/v) LMNG entspricht (Abbildung 2B), was mit dem TMEM120A M207A-Dimer in LMNG-Detergentmicellen übereinstimmt. Dieses Elutionsverhalten weist eine homogene und monodisperse Proteinpopulation auf, was es für eine nachgelagerte biophysikalische Charakterisierung geeignet macht.

Die Eigenschaften von LMNG im Reinigungsmittel wurden unter den experimentellen Pufferbedingungen mittels Massenphotometrie analysiert. Messungen wurden in SEC-Puffern mit unterschiedlichen LMNG-Konzentrationen in Abwesenheit von Protein durchgeführt, um den Beitrag der Waschmittelmizellen zur klaren Molekularmasse zu bewerten. Bei 0,001 % (w/v) LMNG, einer Konzentration über der kritischen Mizellenkonzentration (CMC), wurde der vorherrschende Peak bei etwa 69 kDa nachgewiesen, was nur LMNG-Micellen ohne zugehöriges Protein entspricht (Abbildung 4A). Als die LMNG-Konzentration auf 0,0001 % (w/v) unterhalb des CMC reduziert wurde, verlagerte sich die Hauptart auf ~48 kDa, was auf das Vorhandensein kleinerer Rest-LMNG-Aggregate oder submizellärer Assemblierungen ohne Protein hinweist (Abbildung 4B). Weiter in (Abbildung 4C) wurde TMEM120A M207A in einem SEC-Puffer mit unterschiedlichen LMNG-Konzentrationen verdünnt, um seinen oligomeren Zustand mittels Massenphotometrie zu bestimmen. Bei 0,00001 % LMNG (~20x unter dem CMC, magenta) wurde bei etwa 42 kDa ein vorherrschender Peak beobachtet, der dem Monomer von TMEM120A M207A entspricht. Bei 0,00015 % LMNG (~10x unter dem CMC, blau) zeigte die Hauptpopulation bei ~86 kDa das Vorhandensein von Dimeren. Eine Erhöhung der LMNG-Konzentration auf 0,001 % (~2x über dem CMC, orange) ergab eine Hauptart von ~150 kDa, was mit Protein-Detergent-Komplexen übereinstimmt. Bei 0,002 % LMNG (~4x über dem CMC, grün) wurde eine breite Verteilung nahe 180 kDa detektiert, die größere, micelleassoziierte Assemblies oder höherordnungige Oligomere repräsentiert. Diese Ergebnisse zeigen, dass die LMNG-Konzentration im SEC-Puffer den klaren oligomeren Zustand von TMEM120A M207A stark beeinflusst, wobei das Monomer-Dimer-Gleichgewicht unterhalb des CMC beobachtet wird und die Bildung eines Waschmittel-Protein-Komplexes oberhalb des CMC dominiert.

Die thermodynamische Stabilität von TMEM120A M207A, die vom Haupt-SEC-Peak gewonnen und im SEC-Puffer aufbewahrt wurde (25 mM HEPES, 200 mM NaCl, 0,00015 % (w/v) LMNG, pH 7,8) aufbewahrt wurde, wurde mittels thermischer Denaturierungsanalyse bewertet. Das Protein zeigte einen Wendepunkt bei etwa 46 °C, entsprechend seiner Schmelztemperatur (T_m) unter diesen detergentisch gelösten Bedingungen. Dieser_T-m-Wert weist auf eine moderate thermische Stabilität hin, was darauf hindeutet, dass TMEM120A M207A eine korrekt gefaltete Konformation innerhalb der LMNG-Micellen behält, aber bei höheren Temperaturen beginnen kann, sich zu entfalten oder zu aggregieren.

Biolayer-Interferometrie (BLI) zeigt die μM-Bindungsaffinität von TMEM120A M207A zu GsMTx4T. Die Spuren in Abbildung 5 veranschaulichen fünf experimentelle Schritte: (1) Baseline, (2) TMEM120A M207A-Probenbelastung, (3) Ausgangslinie zur Entfernung von unspezifischer Bindung und Überschuss TMEM120A M207A, (4) Assoziation und (5) Dissoziation. Die Wellenlängenverschiebung (nm) wird über die Zeit für zunehmende Konzentrationen von GsMTx4 (0, 5, 10, 20, 30, 50 und 100 μM) dargestellt, die mit immobilisierten TMEM120A M207A interagieren.

Während der anfänglichen Basislinie (Schritt 1) blieb das Signal stabil, was die Sensor-Gleichgewichtsregelung im Puffer bestätigte. TMEM120A M207A-Belastung (Schritt 2) führte zu einer charakteristischen Zunahme des Signals, die einer Sättigung von ~50–80 % der Sonde über die Sensoren entsprach. Die Ladephase zeigte eine leicht gekrümmte Antwort statt eines scharfen Plateaus, was möglicherweise eine partielle Einschränkung des Massentransports widerspiegelt, bei der TMEM120A M207A-Diffusion zur Sensoroberfläche langsamer ist als die Bindungsrate – ein Effekt, der bei Membran- oder detergentlöslichen Proteinen häufig ist und die scheinbare Oberflächenabdeckung beeinflussen kann.

Der anschließende Basisschritt (Schritt 3) entfernte effektiv ungebundene oder lose befestigte TMEM120A M207A. Während der Assoziationsphase (Schritt 4) führten steigende GsMTx4-Konzentrationen zu klaren, konzentrationsabhängigen Zunahmen der Wellenlängenverschiebung. Während der Dissoziation (Schritt 5) wurde der Biosensor in einen SEC-Puffer mit LMNG platziert, der sich ~10x unter dem CMC befindet. Die ersten 5–10 Sekunden der Dissoziation zeigten einen schnellen Signalabbruch, was wahrscheinlich eine schnelle Freisetzung von GsMTx4 aus leicht zugänglichen Stellen darstellt, gefolgt von einem langsameren Zerfall, der möglicherweise stabiler TMEM120A M207A-GsMTx4-Komplexe mit langsamer Dissoziationskinetik widerspiegelt. Die Referenzsondensignale blieben während des gesamten Experiments flach, was auf minimale unspezifische Bindung hinweist. Insgesamt zeigen diese Daten spezifische TMEM120A M207A-GsMTx4-Interaktionen; Die beobachteten Kinetiken sollten jedoch aufgrund der Waschmittelumgebung und möglicher Massentransporteffekte mit Vorsicht interpretiert werden.

Die Assoziations- und Dissoziationssensorgramme der verarbeiteten Daten nach der Subtraktion der Referenzsonde (Abbildung 6A) zeigten konzentrationsabhängige Reaktionen für GsMTx4 im Bereich von 5–100 μM. Zunehmende Ligandkonzentrationen führten zu progressiv höheren Wellenlängenverschiebungen, gefolgt von einem allmählichen, langsamen Abnehmen während der Dissoziationsphase der 200-Sekunden. Der 10-μM-Datensatz wurde aufgrund von Überlappungen mit der 5-μM-Spur ausgeschlossen, was die Gesamtmodellqualität verbesserte.

Die kinetische Analyse wurde mit einem 1:1-Langmuir-Assoziations-Dissoziationsmodell mit einer lokalen Full-Fitting-Strategie durchgeführt, bei der einzelne Analytkonzentrationen unabhängig innerhalb eines gemeinsamen kinetischen Rahmens angepasst wurden (Abbildung 6B). Die angepassten Kurven (rot) stimmten gut mit den experimentellen Spuren überein und ergaben eine geschätzte Dissoziationskonstante (K_D) im niedrigen mikromolaren Bereich. Die residuale Analyse (Abbildung 6C) zeigte keine wesentlichen systematischen Abweichungen, was darauf hindeutet, dass das angewandte Modell für den Datensatz geeignet war. Kleinere Unterschiede, die während der frühen Assoziationsphase beobachtet werden, können auf Einschränkungen im Massentransport oder die Auswirkungen der Umgebung des Waschmittels und Mizellen zurückzuführen sein. Weitere Beispiele für angepasste Assoziations- und Dissoziationskurven, Restdiagramme und Anpassungsstatistiken über mehrere Assay-Replikaten und Sondenpositionen hinweg sind in der ergänzenden Abbildung S8 dargestellt.

In den Rohdaten (Abbildung 5) zeigten die ersten 5–10 Sekunden der Dissoziation einen schnellen Signalabbau, was wahrscheinlich die schnelle Freisetzung von GsMTx4 an leicht zugänglichen Stellen darstellt, gefolgt von einem langsameren Zerfall, der möglicherweise stabilere TMEM120A M207A-GsMTx4-Komplexe mit langsamer Dissoziationskinetik widerspiegelt. Daher wurden in Tabelle 2 die ersten 100 Sekunden der Dissoziation aus der Anpassung entfernt. Das Fehlen systematischer Abweichungen deutet auf eine gute Passung des lokalen vollpassenden Langmuir-1-1-Modells für TMEM120A M207A bei allen getesteten Konzentrationen hin (Abbildung 7).

Die kinetische Analyse der GsMTx4-Bindung an TMEM120A M207A zeigte konzentrationsabhängige Assoziations- und Dissoziationsverhalten über den Ligandbereich von 5–100 μM (Tabelle 1). Die beobachteten Assoziationsratenkonstanten (k_on) stiegen moderat mit steigender GsMTx4-Konzentration an, von etwa 1,0 × 10⁻⁶ bis 3,2 × 10^–6 1/M·s, während die geschätzten Dissoziationsratenkonstanten (k_off) innerhalb des experimentellen Fehlers nahe null blieben, was auf eine langsame oder vernachlässigbare Dissoziationsphase unter den getesteten Bedingungen hindeutet. Die berechneten Gleichgewichtsdissoziationskonstanten (K_d) lagen im niedrigen bis mittleren mikromolaren Bereich (~0,8–3,3 μM), was mit einer moderaten Affinitätswechselwirkung übereinstimmt. Local Full Fitting mit einem Langmuir-1:1-Bindungsmodell ergab hochwertige Anpassungen über alle GsMTx4-Konzentrationen, mit Korrelationskoeffizienten über 0,99 und niedrigen relativen^χ-2-Werten sowohl für Assoziations- als auch für Dissoziationsphasen (Tabelle 1). Die berechneten Gleichgewichtsdissoziationskonstanten waren über Konzentrationen und Replikationen hinweg konsistent, wobei_K-D-Werte im niedrigen mikromolaren Bereich (~1–2 μM) eine moderate aber spezifische Bindung zwischen TMEM120A M207A und GsMTx4 anzeigten.

Replizierte Datensätze bei jeder Konzentration zeigten Reproduzierbarkeit, was durch hohe Korrelationskoeffizienten (R² > 0,99) sowohl für Assoziations- als auch Dissoziationsanpassungen angezeigt wird. Die vollständigen und relativen χ²-Werte waren niedrig und über Replikate hinweg vergleichbar, was die Robustheit des in der Analyse angewandten 1:1-Langmuir-Bindungsmodells weiter unterstützte. Bei höheren Ligandkonzentrationen (≥50 μM) wurden leicht erhöhte_k-on - und_k-D-Werte beobachtet, die geringfügige Massentransporteffekte oder lokale Oberflächenheterogenität widerspiegeln und nicht auf echte Affinitätsänderungen. Die kinetische Konsistenz über mehrere Replikate und Sondenpositionen hinweg wird in der ergänzenden Abbildung S9 weiter dargestellt.

Die kinetischen Profile zeigen, dass GsMTx4 spezifisch und stabil mit TMEM120A M207A interagiert und relativ stabile Komplexe bildet, die durch langsame Dissoziation und mikromolare Bindungsaffinität gekennzeichnet sind.

Abbildung 1: Reinigungsablauf von TMEM120A M207A-Mutanten, exprimiert in HEK293SF-17-Suspensionszellen. Schematische Übersicht des Proteinreinigungsverfahrens. TMEM120A M207A wurde aus pCDNA3.1-Plasmiden in HEK293SF-17 Zellen exprimiert. Die Zellen wurden in 0,5 % LMNG gelöst, gefolgt von Affinitätsreinigung mit Anti-FLAG M2-Harz. Das Harz wurde mit einem Puffer mit 0,01 % LMNG gewaschen, um nicht spezifisch gebundene Proteine zu entfernen. TMEM120A M207A wurde in einen Puffer mit 0,001 % LMNG eluiert. Das Eluat wurde mit entweder 100 kDa- oder 30 kDa-Molekulargewichts-Cutoff-Filtern konzentriert und durch Größenausschlusschromatographie in einem Puffer mit 0,00015 % LMNG weiter gereinigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Größenausschlusschromatographie und SDS-SEITE von gereinigten TMEM120A M207A In LMNG-Waschmittel (A) SDS-PAGE von FLAG-tagged TMEM120A M207A, gereinigt durch Größenausschlusschromatographie. Das Proteinband erscheint bei ~50 kDa in Bahn 1, entsprechend dem erwarteten Monomer. (B) SEC-Profil der gereinigten TMEM120A M207A auf einer SEC-Säule im SEC-Puffer (25 mM HEPES, 200 mM NaCl, 0,00015 % LMNG, pH 7,8). Die Proteinelution weist auf eine vorherrschende monodisperse Art hin, die für nachgelagerte biophysikalische Tests geeignet ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Differential-Scanning-Fluorimetrie von gereinigter TMEM120A M207A in LMNG. DSF zeigt einen thermodynamischen Wendepunkt bei 46 °C, der auf die thermische Stabilität des Proteins unter den getesteten Pufferbedingungen hinweist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4: Charakterisierung von gereinigtem TMEM120A M207A im LMNG-Waschmittel mittels Massenphotometrie. (A,B) Massenphotometrie des SEC-Puffers mit unterschiedlichen LMNG-Konzentrationen. Bei 0,001 % LMNG (über der kritischen Mizellenkonzentration, CMC) beträgt das scheinbare Molekulargewicht ~69 kDa, was hauptsächlich den LMNG-Micellen entspricht. Bei 0,0001 % LMNG (zehnfach unter dem CMC) erscheint der Peak bei ~48 kDa. (C) Massenphotometrie-Analyse der konzentrationsabhängigen LMNG-Effekte auf TMEM120A Oligomerisierung. TMEM120A in 0,00001 % LMNG (~20x unter dem CMC, Magenta) weist eine Hauptpopulation bei etwa 42 kDa (Monomer) auf. Bei 0,00015 % LMNG (~10x unter CMC, blau) wird eine Population bei ~86 kDa beobachtet, was mit dem Dimer übereinstimmt. Bei 0,001 % LMNG (~2x über CMC, orange) entspricht eine Hauptart mit ~150 kDa Protein-Waschmittel-Komplexen. Bei 0,002 % LMNG (~4x über CMC, grün) weist eine breite Verteilung mit Zentrie bei ~180 kDa auf größere, micelleassoziierte Assemblierungen oder höherordnungige Oligomere hin. Diese Ergebnisse zeigen, dass die LMNG-Konzentration den scheinbaren oligomeren Zustand von TMEM120A stark beeinflusst, wobei das Monomer-Dimer-Gleichgewicht unterhalb des CMC beobachtet wird und die Protein-Detergent-Komplexbildung oberhalb des CMC dominiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 5: Rohdaten von Software, die TMEM120A M207A-GsMTx4-Interaktionen zeigen. Biolayer-Interferometrie zeigt, dass TMEM120A (M207A) den mechanosensitiven Kanalinhibitor GsMTx4 mit mikromolarer Affinität bindet. Die Abbildung zeigt die rohen BLI-Antwortdaten, die von der Gator Prime Software gewonnen wurden, und legt die fünf wichtigsten Assay-Phasen dar: (1) Anfangsbasis, während der das Signal stabil blieb; (2) Proteinimmobilisierung (Loading), was zu einer Zunahme der Wellenlängenverschiebung um etwa 1,5 nm führt; (3) Zweiter Baseline, der die Entfernung von ungebundenem oder locker assoziiertem Protein ermöglicht; (4) Assoziationsphase (Ligandenbindung), bei der steigende GsMTx4-Konzentrationen einen Reaktionsanstieg von bis zu ~5,5 nm innerhalb von 300 Sekunden hervorriefen; und (5) Dissoziationsphase (Ligandfreisetzung), die einen allmählichen Signalabfall über 600 Sekunden zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 6: Bindungskinetik von TMEM120A M207A mit GsMTx4-Peptid. (A) Assoziations- und Dissoziationssensorgramme von TMEM120A M207A, die mit GsMTx4 bei fünf Konzentrationen interagieren: 5 μM, 20 μM, 30 μM, 50 μM und 100 μM. Der 10-μM-Datensatz wurde aufgrund von Überlappungen mit der 5-μM-Kurve ausgeschlossen, was die Gesamtanpassung des Modells verbesserte. Vertikal gestrichelte rote Linien zeigen den Beginn und das Ende der Dissoziationsphase an. (B) Die Anpassung der Sensorgramme erfolgte mit einem Local Full Fitting Langmuir 1:1 Assoziations-Dissoziationsmodell. Rote Kurven stellen das angepasste Modell dar, während experimentelle Spuren den gemessenen Assoziations- und Dissoziationsdaten für jede GsMTx4-Konzentration entsprechen (zwei Replikationen pro Bedingung). (C) Residuendiagramme, die die Abweichung zwischen experimentellen Daten und dem angepassten Modell sowohl für Assoziations- als auch für Dissoziationsphasen zeigen und die Gutheit der Passung bestätigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 7: Restdiagramme, die den abgestimmten Bindungskurven entsprechen. Jeder Plot stellt die Residuen (Differenz zwischen den experimentellen Daten und dem angepassten Modell) für eine einzelne GsMTx4-Konzentration dar: 5 μM, 20 μM, 30 μM, 50 μM und 100 μM. Die Residuen werden als Verschiebungsabweichung (nm) versus Zeit (s) dargestellt und zeigen eine Zufallsverteilung um Null über sowohl die Assoziations- als auch die Dissoziationsphase. Das Fehlen systematischer Abweichungen deutet auf eine gute Passung des Local Full Fitting Langmuir 1:1-Modells für TMEM120A M207A bei allen getesteten Konzentrationen hin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Tabelle 1: Zusammenfassung der kinetischen Parameter für TMEM120A M207A-Bindung an GsMTx4. Kinetische Parameter wurden durch Local Full Fitting mit einem Langmuir-1:1-Bindungsmodell gewonnen. Assoziation (k_on), Dissoziation (k_off), beobachtete Geschwindigkeitskonstanten (k_obs) und Gleichgewichtsdissoziationskonstanten (K_D) werden für jede GsMTx4-Konzentration und Replikation berichtet. Die Passformqualität wurde mit R²- und χ²-Werten für die vollständigen, assoziativen und dissoziativen Phasen bewertet. Über alle Konzentrationen hinweg zeigten Anpassungen hohe Korrelationskoeffizienten (R² > 0,99) und niedrige relative χ²-Werte, was auf eine zuverlässige Modellleistung hinweist. Anmerkungen: M Conc. zeigt die Konzentration von GsMTx4 (μM) an. k_obs repräsentiert die beobachtete Geschwindigkeitskonstante, die kombinierte Assoziations- und Dissoziationsprozesse widerspiegelt. Die für k_obs,_{k on} und k_off gemeldeten Fehler spiegeln passende Unsicherheit wider. R²-Werte zeigen die Gut-of-Fit für Vollzeit-, Assoziations- und Dissoziationsphasen an. Relative χ²-Werte stellen normalisierte Goodness-of-fit-Metriken dar, während absolute χ²-Werte eine Restabweichung zwischen beobachteten und angepassten Daten anzeigen. Abkürzungen: k_on = Assoziationsratenkonstante (1/M·s); k_off = Dissoziationsratekonstante (1/s); k_obs = beobachtete Geschwindigkeitskonstante (1/s); K_D = Gleichgewichtsdissoziationskonstante; R_max = maximale Antwort; R_eq = Gleichgewichtsantwort. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Verarbeitungsparameter und Residuen des Kinetik-Fittings. Verarbeitungsparameter: Assoziationsstart, 0 s; Verbandsende, 300 S; Dissoziationsbeginn, 100 Sekunden; Dissoziationsende, 300 s. Mindestwert R², 0,9; maximaler χ²-Wert 8. Ausrichtungsschritt: Ein-Schritt-Ende (Index = 1, Durchschnitt = 0). Während der Assoziationsphase wurde die Inter-Step-Korrektur angewendet. Vereinsdurchschnitt 50; Dissoziationsdurchschnitt: 0. Die Savitzky-Golay-Glättung wurde deaktiviert. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S1: Optimierungsexperiment zum Laden unterschiedlicher Konzentrationen von TMEM120A M207A-Protein auf Anti-FLAG-Sonden mit einer festen Konzentration (100 nM) von GsMTx4-Peptid. (A) Roh-BLI-Sensorgramme, die die fünf Schritte der kinetischen Messung zeigen: (1) Ausgangslinie im SEC-Puffer oder Assaypuffer (25 mM HEPES, pH 7,8; 200 mM NaCl; 0,00015 % (w/v) LMNG; 0,0005 % (v/v) Tween-20); (2) Laden von vier verschiedenen Konzentrationen von TMEM120A M207A auf die FLAG-Sonde, wobei die Referenzsonde (orange) als Negativsteuerung verwendet wird, um das Fehlen einer unspezifischen Bindung zu bestätigen; (3) bei der zweiten Baseline-Step; (4) die Assoziationsphase und (5) die Dissoziationsphase. (B) Das globale 1:1-Bindungsmodell passt zu den vier TMEM120A M207A-Konzentrationen, die mit dem 100 nM GsMTx4-Peptid interagieren. (C) Residuendiagramme sowohl für die Assoziations- als auch für die Dissoziationsphase, die minimale Abweichungen vom angepassten Modell zeigen (<0,05 nm). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S2: Plattenaufbau und Assay-Konfiguration. (A) Plattendesign für eine 384-Well-Platte, bei der verschiedene Parameter zugewiesen werden können. Die Proben entsprechen dem Liganden (GsMTx4) in verschiedenen Konzentrationen. Orange Wells zeigen TMEM120 M207A-Protein bei 250 nM. Wells stellen Proteinreplikate bei 250 nM dar, und derselbe Puffer wurde für Baseline-, Assoziations- und Dissoziationsschritte verwendet. (B) Max-Plattenansicht mit vier Anti-FLAG-Biosensor-Sonden: eine Referenzsonde und drei Sonden für Proteinreplikate. Alle Sonden wurden im Assay-Puffer vorbenetzt, im Q-Puffer regeneriert und im Assay-Puffer neutralisiert. Der gleiche Puffer wurde während der Basis-, Assoziations- und Dissoziationsschritte verwendet. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S3: Assay-Setup-Zyklen, einschließlich Ausgangswert, Proteinbelastung, Zweitbasis, Assoziation und Dissoziation. Abkürzungen: B = Puffer; L = Last; 0, 5, 10, 20, 30, 50 und 100 = GsMTx4-Konzentrationen in μM. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S4: Neuer Workflow zur Kinetik-(K)-Analyse. Wählen Sie das Experiment-Icon , das einen Überblick über alle innerhalb eines einzelnen Experiments durchgeführten Tests bietet. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S5: Neuer Workflow zur Kinetik-(K)-Analyse.Ausrichtung und Filter-Icon , in dem Rohdaten sowohl für die Assoziations- als auch für die Dissoziationsphasen überprüft und analysiert werden können. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S6: Neuer Workflow zur Kinetik-(K)-Analyse.Set Reference Icon , das verwendet wird, um den passenden Referenzsensor für Hintergrundsubtraktion und genaue Dateninterpretation auszuwählen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S7: Bindungsanpassungsschritte im kinetischen Analyse-Workflow. Kinetische Anpassungsparametereinstellungen zur Analyse von Bindungsinteraktionsdaten. Das Modell geht von einer 1:1-Wechselwirkung mit einer einzelnen Ligandbindungsstelle aus. Der Fitting-Typ ist auf Lokal gesetzt, wobei jede Konzentrationskurve unabhängig statt global angepasst wird. Die vollständige Anpassungsoption mit aktiviertem Full Stitch umfasst die gesamte kontinuierliche Assoziations- und Dissoziationskurven. Zeitfenster für Assoziations- und Dissoziationsphasen sind von 0 bis 300 s bzw. 0 bis 200 s gesetzt. Im Hintergrund zeigen der Bindungs-Fitting-Graph, der Residuengraph und die einzelnen Assay-Kurven die Passqualität und die experimentelle Variabilität. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S8: Bindungsanpassungsschritte im kinetischen Analyse-Workflow. Bindungs-Fitting-Graph, das Assoziations- und Dissoziationsphasen über mehrere Assay-Replikationen und Sondenpositionen (C1 und D1) hinweg zeigt. Das untenstehende Residuendiagramm bewertet die Fit-Qualität, wobei Residuen Unterschiede zwischen den experimentellen Daten und dem angepassten Modell anzeigen; Werte nahe null spiegeln eine gute Passung wider. Die beigefügte Tabelle fasst Fitting-Statistiken zusammen, einschließlich Full R², Association R², Dissociation R² und Chi-Quadrat-(X²)-Werte für jede Replikation. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S9: Bindungsanpassungsschritte im kinetischen Analyse-Workflow. Kinetische Analyse von Bindungsinteraktionen aus mehreren Replikaten und Sondenpositionen (C1 und D1). Die Sensorreaktionsverschiebung (nm) über die Zeit (s) zeigt Assoziations- und Dissoziationsphasen, wobei jede Kurve farblich durch Assay und Sondenposition codiert ist. Die vertikal gestrichelte rote Linie markiert den Übergang zwischen Assoziationsphasen (0-300 Sekunden) und Dissoziation. Im Folgenden zeigt die Tabelle kinetische Parameter, die aus der 1:1-Bindungsmodellanpassung abgeleitet sind, darunter die Analytenkonzentration (M Conc.), die Assoziationsratekonstante (k_on), die Dissoziationsratenkonstante (k_off), Fehler und die Gleichgewichtsdissoziationskonstante (K_D). Die gleichbleibende Passgenauigkeit unterstützt die Robustheit der kinetischen Messungen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungstabelle S1: Tabelle, die die Symbole sowohl in der 384-Well-Platte als auch in der Max-Platte veranschaulicht. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungstabelle S2: Kinetische Parameter für die vier Konzentrationen von TMEM120A M207A, die auf FLAG-Biosensoren geladen sind, die mit 100 nM GsMTx4-Peptid interagieren, unter Verwendung fester Kon- und Koff-Werte. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Die Charakterisierung von Membranprotein-Interaktionen bleibt schwierig, da eine sorgfältige Proteinreinigung, eine sorgfältige Optimierung der Reinigungsmittelkonzentration und ein präzises Assay-Design erforderlich sind. Diese Studie präsentiert einen detaillierten Arbeitsablauf für TMEM120A M207A, der sowohl Reinigung als auch kinetische Analyse mit GsMTx4 mit Biolayer-Interferometrie (BLI) illustriert.

Kritische Schritte und Optimierung:
Einer der wichtigen kritischen Schritte war die Konzentration von Waschmitteln, die als wesentlicher Faktor für die Proteinstabilität identifiziert wurde. Der Reinigungsprozess umfasste die Zelllösung mit einem Puffer mit 0,5 % LMNG, gefolgt von sequentiellem Waschen mit 0,005 % LMNG, Elution mit 0,001 % LMNG und einer finalen Größenausschlusschromatographie (SEC) in einem Puffer mit 0,00015 % LMNG. Diese Waschmittelstrategie, basierend auf der niedrigen kritischen Mizellenkonzentration (CMC) von LMNG und der langsamen Abschaltrate, ermöglichte während der Reinigung eine verbesserte Stabilität des Proteins in den Mizellen. Der SEC-Puffer enthielt Waschmittel in einer Konzentration, die zehnmal unter dem CMC von LMNG lag (0,001 %), was seine Auswirkungen auf nachgelagerte biophysikalische Tests effektiv minimierte. Proteinhomogenität und das Fehlen von Aggregation wurden mittels Massenspektrometrie und thermischer Stabilitätsanalyse bestätigt. Abbildung 2, Abbildung 3 und Abbildung 4 veranschaulichen die erfolgreiche Optimierung der Reinigung und Proteinstabilisierung in sub-CMC-Waschmittelkonzentrationen.

Die Proteinimmobilisierung am Biosensor wurde sorgfältig kontrolliert, um eine Sättigung von 50–80 % der Sonde zu erreichen. Ein Belastungsniveau von 50–80 % kann eine gewisse Begrenzung des Massentransports verursachen; dieser Bereich wurde jedoch gewählt, um eine ausreichende Signalstärke im BLI-System zu gewährleisten, wobei die Sonden während des Tests zwischen den Bohrlöchern bewegt wurden. Das Erreichen dieses Liganden-Immobilisierungsniveaus half, eine konsistente Signalqualität zu gewährleisten, obwohl solche Belastungsstufen sowohl Vorteile als auch potenzielle Einschränkungen haben. Die Einbindung einer Referenzsonde war für BLI-Experimente entscheidend.

Ein weiteres Kontrollexperiment, bei dem vier verschiedene Stufen immobilisierter TMEM120A mit einer einzigen Peptidkonzentration (100 nM) getestet wurden. Diese Daten sind nun im überarbeiteten Manuskript (Ergänzende Abbildung S1) enthalten. Die Erhöhung der Menge des immobilisierten Proteins erzeugte höhere Belastungssignale, aber in allen Fällen blieb die Verschiebung unter 1 nm vom Ausgangspunkt (Ergänzende Abbildung S1A). Wir berichteten die angepassten Assoziations- und Dissoziationskurven mit einem globalen 1:1-Bindungsmodell und bezogen außerdem die Restdiagramme ein, die kleine, nicht signifikante Unterschiede zwischen den angepassten und experimentellen Daten zeigen.

In den wichtigsten kinetischen Assays (5–100 μM Analyt) zeigten die angepassten Ratenkonstanten die erwarteten konzentrationsabhängigen Trends. Die _k-off-Werte reichten von etwa 1,48 × 10⁻⁴ bis 1,43× 10⁻³ s⁻¹, während die _k-on-Werte von 1,12 × 10² bis 1,26 × 10¹ M⁻¹s⁻¹ reichten. Diese allmählichen Veränderungen in der Konzentrationsreihe entsprechen dem normalen analytenabhängigen Assoziations- und Dissoziationsverhalten.

Im Kontrollexperiment, bei dem unterschiedliche Sondenlastwerte bei einer einzigen Analytenkonzentration (100 nM) getestet wurden, ergaben alle vier Spuren sehr ähnliche kinetische Konstanten. Die _k-off-Werte lagen konstant bei 1,42 × 10⁻¹ s⁻¹, und die _k-on-Werte bei 2,76 × 10³ M⁻¹s⁻¹ über alle Laststufen. Dieses Fehlen von Variation deutet darauf hin, dass weder die Assoziations- noch die Dissoziationsphase durch Sondendichte, Massentransportbeschränkungen oder Analyten-Rebindungen beeinflusst wurden.

Es wird außerdem erwartet, dass die Dissoziation bei 100 nM im Kontrollexperiment schneller auftritt. Die 100 nM-Analytkonzentration liegt ungefähr eine Größenordnung unter dem K_D, und bei Konzentrationen weit unter K_D ist der Komplex weniger stabil und die effektive Auslastung niedrig. Unter solchen Bedingungen verläuft die Dissoziation schneller, da die Bindungsaffinität bei niedrigen Analytenkonzentrationen schwächer ist und die Resoziation während der Dissoziationsphase minimal ist. Dieses Verhalten entspricht dem, was typischerweise beobachtet wird, wenn die Analytenkonzentration deutlich niedriger als K_D ist.

Insgesamt stützen die Konsistenz der kinetischen Parameter über Sondenlasten hinweg und das erwartete Verhalten bei niedrigen Analytenkonzentrationen die Annahme, dass die beobachteten Geschwindigkeitskonstanten echte Bindungseigenschaften widerspiegeln und nicht Artefakte aus Oberflächenbelastung oder Massentransporteffekten.

Bindungskinetik und Interpretation:
Die kinetische Analyse wurde mit einem 1:1-Langmuir-Assoziations-Dissoziationsmodell mit einer lokalen Full-Fitting-Strategie durchgeführt, bei der einzelne Analytkonzentrationen unabhängig innerhalb eines gemeinsamen kinetischen Rahmens angepasst wurden (Abbildung 6B). Dieser Ansatz wurde der traditionellen globalen Anpassung vorgezogen, da bestimmte Datensätze, insbesondere bei niedrigeren Ligandenkonzentrationen, geringe Überlappungen oder frühphasenbedingte Abweichungen zeigten, die wahrscheinlich durch Massentransportbeschränkungen und die Effekte von Detergent-Mizellen auf die Proteindiffusion verursacht wurden. Globale Anpassung geht davon aus, dass alle Spuren streng dem gleichen kinetischen Verhalten folgen, was beeinträchtigt werden kann, wenn die Oberflächenzugänglichkeit oder die lokale Mikroumgebung zwischen den Konzentrationen leicht variiert. Lokale vollständige Anpassung ermöglichte es, jede Analytenkonzentration unabhängig zu modellieren, während dennoch ein konsistenter kinetischer Rahmen erhalten blieb, sodass die abgeleiteten Parameter das Verhalten jeder Konzentration genau widerspiegelten. Die angepassten Kurven (rot) entsprachen den experimentellen Spuren eng und ergaben eine geschätzte Dissoziationskonstante (K_D) im niedrigen mikromolaren Bereich. Die Residuenanalyse (Abbildung 6C) zeigte keine wesentlichen systematischen Abweichungen, was die Eignung des Modells für diese detergent-löslichen Membranprotein-Interaktionen unterstützt.

TMEM120A M207A und GsMTx4 zeigten_KD-Werte im niedrigen mikromolaren Bereich (∼0,8–3,3 μM). Die Assoziationsrate (k_on) nahm mit der Ligandenkonzentration moderat zu, während die Dissoziationsrate (k_off) sehr langsam blieb, was auf stabile Komplexbildung hinweist. Der anfängliche schnelle Signalabfall in den ersten 5-10 Sekunden der Dissoziation spiegelte wahrscheinlich leicht zugängliche Bindungsstellen wider, während die langsamere Phase stabilere Wechselwirkungen darstellte (Abbildung 6A). Diese Beobachtungen unterstreichen die Bedeutung sorgfältiger Auswahl von Dissoziationsfenstern und der Berücksichtigung von Massentransportbeschränkungen bei der Analyse von detergent-löslichen Membranproteinen (Tabelle 2).

Einschränkungen und Fehlerbehebung:
Für detergent-lösliche Membranproteine wie TMEM120A M207A sollten mehrere Einschränkungen berücksichtigt werden. Massentransporteffekte können bereits in der frühen Assoziationsphase auftreten, da das Protein langsam auf die Biosensoroberfläche diffundiert, was die kinetischen Messungen leicht verzerren kann. Eine Sensorüberlastung ist möglich, wenn die Sondensättigung den empfohlenen Bereich von 50–80 % überschreitet, was die Genauigkeit der globalen kinetischen Analyse einschränken und Kon- und Koff-Werte beeinflussen kann. Detergentabhängige Effekte können die Proteinstabilität, den oligomeren Zustand oder die Oberflächenzugänglichkeit beeinflussen, insbesondere bei Konzentrationen über oder nahe dem CMC. Weitere Faktoren sind leichte Basisdrift, unspezifische Bindung und Herausforderungen bei der Erfassung der Kinetik sehr langsamer Dissoziation.

Viele dieser Probleme können durch einfache Anpassungen gemildert werden: Reduzierung der Proteinbelastung zur Vermeidung von Übersättigung, Optimierung der Pufferzusammensetzung und Einbindung von Referenzproben zur Korrektur von Basisdrift oder unspezifischen Signalen. In dieser Studie minimierte der SEC-Puffer mit 0,00015 % LMNG und niedrigen Konzentrationen von Tween-20 die unspezifische Bindung effektiv, während die Proteinstabilität aufrechterhalten wurde. Die sorgfältige Auswahl des Dissoziationsfensters für kinetische Anpassungen sowie Replikationsmessungen und Restanalysen war ebenfalls wichtig, um die Zuverlässigkeit kinetischer Parameter zu bestätigen. Diese Strategien verbessern in der Regel die Reproduzierbarkeit und helfen dabei, robustere und interpretierbarere Daten zu erzeugen. Lokale Vollanpassung wurde anstelle globaler Anpassung eingesetzt, um geringfügige Unterschiede zwischen Spuren bei einzelnen Ligandkonzentrationen zu berücksichtigen und sicherzustellen, dass kinetische Parameter das Verhalten jedes Datensatzes genau widerspiegeln.

BLI und andere biophysikalische Techniken:
Im Vergleich zur Oberflächenplasmonresonanz (SPR) und der isothermen Titrationskalorimetrie (ITC) bietet die Biolayer-Interferometrie (BLI) mehrere praktische Vorteile bei der Analyse von Membranprotein-Liganden-Interaktionen. Wie SPR und ITC kann BLI detaillierte Einblicke in Bindungsinteraktionen liefern, einschließlich Assoziationsraten (k_on), Dissoziationsraten (k_off) und Gleichgewichtsdissoziationskonstanten (K_D), ohne komplexe mikrofluidische Systeme oder eine hohe Proteinkonzentration¹⁴ zu benötigen. Das Open-Well-Dip-and-Read-Format ermöglicht einen schnellen Pufferaustausch und parallele Verarbeitung mehrerer Proben und unterstützt einen höheren experimentellen Durchsatz. Im Gegensatz zu ITC, das große Mengen hochreines Proteins benötigt und thermodynamische Daten liefert, kann BLI sowohl die Raten der Komplexbildung als auch Dissoziation aus minimaler Probenkonzentration in nanomolaren Mengen messen. BLI ist außerdem kompatibel mit detergent- oder lipidhaltigen Puffern, was es für ertragsschwache oder instabile Membranproteine geeignet macht, die mit anderen biophysikalischen Methoden schwer zu untersuchen sind. Trotz dieser Vorteile bleiben komplementäre Techniken wie SPR oder ITC nützlich, um thermodynamische Konsistenz zu bestätigen und Bindungsparameter unter detergent- und detergentfreien Bedingungen zu überprüfen, benötigen jedoch eine hohe Proteinkonzentration³.

Zukünftige Richtungen:
Dieser Workflow kann erweitert werden, um andere Membranproteine, Protein-Lipid-Interaktionen oder das Screening von Kleinmolekülmodulatoren zu untersuchen. Die Kombination von BLI mit orthogonalen Ansätzen wie Massenphotometrie, struktureller Charakterisierung oder Kryo-EM könnte detailliertere Einblicke in Oligomerisierung, Stöchiometrie und Bindungsmechanismen liefern. Weitere Optimierung kann auch die Analyse von hochaffinitätsigen Liganden, multivalenten Wechselwirkungen oder Komplexen in eher nativähnlichen Lipidumgebungen ermöglichen.

Abschließend lässt sich sagen, dass die sorgfältige Kontrolle der Proteinimmobilisierung, der Reinigungskonzentration und der Pufferbedingungen BLI zuverlässige, reproduzierbare kinetische Daten für TMEM120A M207A und ähnliche anspruchsvolle Membranproteine erzeugt. Obwohl inhärente Einschränkungen bestehen, bietet die Methode eine robuste Grundlage, um spezifische, moderat-affine Protein-Liganden-Interaktionen unter gut definierten experimentellen Bedingungen zu untersuchen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
384-well black microplate	Greiner Bio-One	781906	BLI
Amicon Ultra Zentrifugenfilter, 30 kDa MWCO	Sigma-Aldrich	UFC903008	Reinigung
Anti-FLAG-Sonde	Gator Bio	160036	BLI
ANTI-FLAG M2 Affinitätsgel	Sigma-Aldrich	A2220-10ML	Reinigung
BioRender	BioRender	https://biorender.com	Abbildung 1 Erstellung
Bovines Serumalbumin	Sigma-Aldrich	9048-46-8	Massenphotometrie
CD 293 Medium (1x)	Thermofisher	11913019	Zellkultur
Zentrifuge 5920 R: Große Kapazität und hohe Leistung	Eppendorf	N/A	Reinigung
cOmplete, Mini, EDTA-freier Proteasehemmer-Cocktail	Merck	11836170001	Reinigung
Desoxyribonuklease I aus Rinderpankreas	Sigma-Aldrich	9003-98-9	Reinigung
ExpiFectamine 293 Transfektionskit	Thermofisher	A14524	Transfektion
Gator Bio Software	Gator Bio	N/A	BLI
Gator Plus	Gator Bio	N/A	BLI
GlutaMAX-Supplement	Thermofisher	35050061	Zellkultur
GsMTx4-Trifluoracetat	Sigma-Aldrich	SML3140-1MG	BLI
HEK293T/SF17-Zellen, adaptiert für Suspensionswachstum	ATCC	ATCC CRL11268	Zellkultur
LMNG (Laurylmaltose-Neopentylglycol)	Thermofisher	A50940	Reinigung
Max Plate	Gator Bio	130062	BLI
Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)	Sigma-Aldrich	11359061001	Reinigung
Prometheus High Sensitivity Capillaries	Nano Temper	PR-C006	Thermodynamische Stabilität
Prometheus Panta	Nano Temper	N/A	Thermodynamische Stabilität
Q-Puffer (0,3% Glycin pH 3,8)	Gator Bio	120010	BLI
Qsonica Q500-Sonikatror, Ultraschall-Zelldisruptor	Qsonica	N/A	Reinigung
Superdex 200 Increase 10/300 GL	Cytiva	GE28-9909-44	Reinigung
Synthesiertes TMEM120A (M207A)-Gen, kloniert in pCDNA 3.1 Plasmid mit FLAG-3C-Linker	GenScript Biotech	N/A	Plasmid
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P1379-25ML	BLI
Two MP	Refeyn	N/A	Massenphotometrie