Methodenartikel

Bewusste elektrophysiologische Profilierung des ventromedialen präfrontalen Kortex in einem Mausmodell von Depression und Parkinson-Krankheit

DOI:

10.3791/69366

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30. Dezember 2025

 ,  ,  , 
1Institute of Biomedical Research of Barcelona (IIBB), Spanish National Research Council (CSIC), 2August Pi i Sunyer Biomedical Research Institute (IDIBAPS), 3Biomedical Research Networking Center for Mental Health (CIBERSAM), ISCIII, 4Human Anatomy and Embryology Department, Faculty of Medicine, University of Valencia

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Mit einem Parkinson-ähnlichen Mausmodell, das die mutierte A53T-Form des humanen Alpha-Synukleins (h-α-Syn) im dorsalen Raphe-Kern (DR) überexprimiert, haben wir eine elektrophysiologische Aufzeichnungsmethode entwickelt, um die Rolle des ventromedialen präfrontalen Cortex (vmPFC)-DR-Schaltkreises bei depressiven/angstbezogenen Störungen bei PD zu untersuchen.

Zusammenfassung

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Obwohl die Parkinson-Krankheit (PD) hauptsächlich als motorische Störung bekannt ist, treten nichtmotorische Symptome oft vor motorischen Defiziten auf und beeinflussen den Krankheitsverlauf erheblich, wobei sie in allen Krankheitsstadien entscheidend sind. Darunter sind Depression und Angst die häufigsten Symptome und verursachen bei Frauen eine höhere Symptomlast als bei Männern. Veränderungen im serotonergen (5-HT) System werden häufig mit Stimmungserkrankungen in Verbindung gebracht, und Ansammlungen von α-Synuklein (α-Syn) wurden in den 5-HT-Raphe-Kernen (RN) von Patienten mit Parkinson-Krankheit (PD) und Depression beobachtet. Das Verständnis der neuronalen Schaltkreise, die diesen nichtmotorischen Symptomen zugrunde liegen, ist daher entscheidend.

Hier präsentieren wir ein verbessertes Protokoll zur Untersuchung der Rolle des ventromedialen präfrontalen Cortex (vmPFC)-dorsalen raphe nucleus (DR) in PD-assoziierten Stimmungserkrankungen mit einem weiblichen Mausmodell, das die mutierte A53T-Form des menschlichen α-syns (h-α-Syn) im DR überexprimiert. Unsere Methode ermöglicht eine hochauflösende Bewertung der neuronalen Aktivität in der infralimbischen (IL) und prelimbischen (PL) Kortex sowohl unter basalen Bedingungen als auch während aversiver Konditionierung und Extinktion. Mit einem ton-licht-sensorischen Konditionierungsparadigma bei wachen, kopffixierten Mäusen verwenden wir mehrkanalige elektrophysiologische Sonden, um neuronale Reaktionen aufzuzeichnen. Experimente wurden in Virtual-Reality-Korridoren durchgeführt, bei denen ein zylindrisches Laufband mit einer Dual-Screen-Anzeige kombiniert wurde, um die Verhaltensbeteiligung aufrechtzuerhalten und gleichzeitig eine präzise Kontrolle sensorischer Reize und die Stabilität der Aufzeichnung sicherzustellen.

Dieses Protokoll baut auf der etablierten Beteiligung der IL- und PL-Kortex an der Angstkonditionierung und -extinktion auf und bietet einen robusten Rahmen zur Untersuchung dynamischer neuronaler Aktivität in Schaltkreisen, die mit depressiven und angstähnlichen Verhaltensweisen bei PD verbunden sind. Durch die Möglichkeit gleichzeitiger Verhaltens- und elektrophysiologischer Messungen unter kontrollierten Bedingungen bietet dieser Ansatz ein leistungsstarkes Werkzeug, um die neurobiologischen Mechanismen nicht-motorischer Symptome bei PD zu klären und potenzielle Interventionen zu testen.

Einleitung

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Die Parkinson-Krankheit (PD) ist eine motorische Erkrankung, aber nicht-motorische Symptome sind bekannt, dass sie den motorischen Manifestationen vorausgehen und in allen Krankheitsstadien 1,2,3,4 kritisch sind. Darunter sind Depression und Angst die am häufigsten auftretenden neuropsychiatrischen Symptome, was die Lebensqualität von PD-Patienten stark beeinträchtigt und bei Frauen eine höhere Symptomlast verursacht alsbei Männern. Trotzdem werden sie oft unterdiagnostiziert und unzureichend behandelt6. Aus all diesen Gründen ist es unerlässlich, die Neurobiologie und die an den neuropsychiatrischen Symptomen der PD beteiligten Schaltkreise zu verstehen, um Patienten zu stratifizieren und ihnen eine individuellere Versorgung anzubieten.

Obwohl die Ätiologie von PD teilweise unklar ist, wurden mehrere wichtige neuropathologische Merkmale identifiziert. Die Erkrankung ist gekennzeichnet durch die fortschreitende Degeneration und den Verlust dopaminerger (DA) Neuronen und Fasern im nigrostriatalen System, was zu den prototypischen motorischen Defiziten führt, die mit PD 7,8 assoziiert sind. Ein weiteres Merkmal von PD ist das Vorhandensein von Lewy-Körpern (LB) und Lewy-Neuriten – intrazelluläre Einschlüsse, die durch fibrillare Proteinaggregate gebildet werden und überwiegend aus dem Protein α-Synuklein (α-Syn) bestehen. Neuroimaging-Studien zeigen außerdem, dass andere Neurotransmittersysteme betroffen sind – schon vor der Beteiligung von DA – darunter das serotonerge (5-HT) System 11,12,13. Veränderungen im serotonergen (5-HT) System sind häufig mit Stimmungserkrankungen verbunden, und Ablagerungen von α-Synuklein (α-Syn) wurden in den 5-HT-Raphe-Kernen (RN) von Personen mit Parkinson-Krankheit (PD) und Depression14 nachgewiesen.

Die dorsalen Raphe-Kerne (DR) sind der größte 5-HT-Kern im RN15 und spielen eine entscheidende Rolle bei der emotionalen Regulation, Wahrnehmung, Belohnung, Aggression und sozialen Interaktionen. Folglich ist eine Funktionsstörung in der DR mit neuropsychiatrischen Störungen wie Stress, Angst und Depression verbunden15,16. An diesem Punkt ist es wichtig, die starke, bidirektionale funktionelle und anatomische Verbindung zwischen dem DR und dem präfrontalen Kortex (PFC) hervorzuheben, einem Hirnbereich, der für höhere Hirnfunktionen unerlässlich ist. Während die dorsaleren Bereiche des PFC mit kognitiven Funktionen zusammenhängen, spielen die ventromedialeren Bereiche (vmPFC) eine grundlegende Rolle bei der emotionalen Regulation, Handlungskontrolle, Gedächtnis und Entscheidungsfindung17,18. Daher beeinflussen vmPFC und DR zusammen die Stimmung signifikant, und veränderte Aktivität in diesem Kreislauf ist mit depressiven Symptomen18 assoziiert. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Ansammlung aggregierter Formen von α-Syn in 5-HT-Neuronen in der RN Angst und depressiv-ähnliche Phänotypen auslöst.

Mit einem PD-weiblichen Mausmodell mit einem depressiven Phänotyp, der die mutierte A53T-Form des menschlichen α-syn (h-α-Syn) im DR über einen adenoassoziierten viralen (AAV)-Vektor überexprimiert, haben wir eine elektrophysiologische Aufzeichnungsmethode entwickelt. Diese Methode zielt darauf ab, die Rolle des vmPFC-DR-Schaltkreises bei depressiven/angsthaften Störungen bei PD zu untersuchen. Dieser Ansatz beinhaltet die Bewertung der neuronalen Aktivität der infralimbischen (IL) und prelimbischen (PL) Kortex bei wachen Mäusen mittels Einzeleinheits- und lokalen Feldpotentialaufnahmen (LFPs). Dies wird mit einer Mehrkanalsonde in Verbindung mit einem Virtual-Reality-Runner erreicht. In Anerkennung der Beteiligung der PL- und IL-Kortex an der aversiven Konditionierung messen wir auch ihre Aktivität während eines solchen Paradigmas, um ihre Funktion in stressigen Situationen zu bewerten. Es ist wichtig zu verstehen, dass der PL hauptsächlich konditionierte Reaktionen antreibt, während der IL-Cortex eine Schlüsselrolle beim Aussterben dieser Reaktionen spielt 22,23.

Das folgende Protokoll beschreibt die Schritte zur Implantation einer Kopfstange und zur akuten Erfassung der elektrischen Aktivität der PL- und IL-Kortex in vivo. Dies erreichen wir mit einem Virtual-Reality-Korridor, der ein zylindrisches Laufband für kopffixierte Mäuse mit einem Doppelbildschirm kombiniert. Das Protokoll ist in vier Hauptphasen gegliedert: (1) Kopf-Bar-Implantationsoperation, (2) Habituation, (3) Aufzeichnung und Signalerfassung sowie (4) Datenanalyse: Spike-Sortierung und Datenvorverarbeitung.

Drei Wochen nach der Auslösung der H-α-Syn-Überexpression im 5-HT-System im Gehirn unterziehen sich die Mäuse der Kopfstangenimplantation, die eine anschließende Kopffixierung ermöglicht. Nach einer einwöchigen Erholungsphase gewöhnen sich die Mäuse für 4 Tage sowohl an den Experimentator als auch an das Laufband und das Kopffixierungssystem. Am Aufzeichnungstag wird dieses Setup verwendet, um neuronale Aktivität aus dem PL- und IL-Kortex unter Ausgangsbedingungen und während aversiver Konditionierung zu erfassen. Die rohen neuronalen Daten werden durch automatische Spike-Sortierung mit Kilosort4 verarbeitet, gefolgt von manueller Kuratierung in Phy2, um hochwertige Einzeleinheitscluster für weitere Analyse zu extrahieren (Abbildung 1).

Das vorgeschlagene wache, kopffixierte mehrkanalige vmPFC-Aufzeichnungsprotokoll bietet mehrere Vorteile gegenüber klassischen Alternativen wie narkosierten oder ex vivo Präparationen und drahtlosen Aufnahmen bei frei bewegenden Tieren. Im Gegensatz zu anästhesierten oder ex vivo Ansätzen ermöglicht diese Methode die Bewertung der vmPFC-Aktivität unter kontrollierter visueller und auditiver Stimulation in einer virtuellen Realität, was für die Umsetzung aversiver Konditionierungsparadigmenunerlässlich ist 24,25. Im Gegensatz zu frei bewegenden Aufnahmen bietet die kopffixierte Konfiguration eine präzise experimentelle Kontrolle über sensorische Eingaben und Aufgabeneventualitäten, wodurch die Variabilität reduziert und konsistente Versuchsstrukturen ermöglicht werden. Darüber hinaus verringert die Kopffixierung das Risiko einer Aufgabenentbindung, das in frei beweglichen Paradigmen, insbesondere unter aversiver Stimulation, beobachtet wird, während dennoch hocherträgliche, stabile Mehrkanalaufnahmen möglich sind26.

Aus praktischer Sicht erfordert dieses Protokoll, dass Tiere an Kopffixierung und Laufband gewöhnt sind, profitiert jedoch von kommerziell verfügbaren, relativ erschwinglichen Kopffixierungssystemen mit zylindrischen Laufbändern. Dies macht den Ansatz auch für kleinere Labore zugänglich, da Sonden mehrfach wiederverwendet werden können (bis zu ~10 Einsätze), was die Kosten im Vergleich zu chronisch frei beweglichen Implantaten deutlich senkt. Daher bietet diese Methode ein Gleichgewicht zwischen experimenteller Kontrolle, Verhaltensrelevanz und Kosteneffizienz. Ein weiterer zu berücksichtigender Faktor ist die Umsetzung des aversiven Konditionierungsparadigmas. In dieser Studie verwendeten wir ein experimentelles Design, das auf der natürlichen Lichtabneigung der Nagetiere basierte: 10 auditive Töne (konditionierte Reize) wurden jeweils von einer kurzen Exposition gegenüber intensivem Licht (unkonditionierter Reiz) gefolgt. Obwohl dieses Muster weniger belastend ist als andere klassische Konditionierungsmethoden, wie solche mit Elektroschocks, stellt es einen ähnlicheren realen Stressor dar.

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Protokoll

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Alle Experimente wurden mit altersgleichen Kontrollen durchgeführt, und Tierverfahren wurden gemäß den Regeln der 3R entwickelt; durchgeführt gemäß den ethischen Leitlinien der EU-Richtlinie 2010/63 (22. September 2010), der spanischen Gesetzgebung (RD 1201/2005, L.32/2007 und L.6/2013) und genehmigt von Generalitat Valenciana (ES462500001003; Ref. 2023-VSC-PA-0073) sowie dem lokalen Bioethikkomitee der Universität Valencia (ref. A20230214153605).

HINWEIS: Um die Sicherheit zu gewährleisten und Kontaminationen zu vermeiden, tragen Sie während des gesamten Eingriffs persönliche Schutzausrüstung, darunter Einweghandschuhe und -stiefel, einen Laborkittel, eine Maske und ein Haarnetz. Verwenden Sie Rücknahmesysteme für veterinärmedizinische Arzneimittel zur Entsorgung von Rückständen, die durch deren Anwendung entstehen, gemäß den lokalen Vorschriften und den geltenden nationalen Rücknahmeprogrammen.

1. Mausmodellgenerierung

HINWEIS: Erwachsene weibliche C57BL/6J-Mäuse (9 Wochen alt) wurden unter kontrollierten Umweltbedingungen (22 ± 1 °C; 12-Stunden-Licht/Dunkel-Zyklus) mit Ad-Libitum-Zugang zu Nahrung und Wasser untergebracht.

  1. Unter Isofluran-Anästhesie (4 % zur Induktion, 2 % zur Erhaltung) in der Mausanästhesiekammer werden die Mäuse zufällig mit stereotaxischen Mikroinjektionen in die DR (Koordinaten relativ zu Bregma: anteroposterior [AP] −4,5 mm, mittellateralt [ML] −1,0 mm, dorsoventral [DV] −3,2 mm; Injektionswinkel: 20°) mit einem automatisierten Mikroinjektor bei einer Durchflussrate von 0,4 μL/min zugeteilt, Wie zuvor beschrieben 19,27,28.
  2. Stellen Sie sicher, dass jede Maus ein Gesamtvolumen von 0,6 μL entweder eines rekombinanten, adenoassoziierten Virus-Serotyps 1/2 (AAV1/2; Konzentration: 5,16 × 1012 gp/mL) erhält, der die A53T-mutierte Form des menschlichen H-α-Syns kodiert, um eine Überexpression in 5-HT-Neuronen des DR (n = 4) oder einen leeren AAV1/2-Vektor mit nicht-kodierendem Stuffer-DNA (AAV-EV) ZU INDUZIEREN, als Kontrollgruppe verwendet (n=5).
  3. Um Reflux zu vermeiden, lassen Sie die Nadel weitere 8 Minuten an Ort und Stelle, bevor Sie sie langsam mit einer Geschwindigkeit von 320–400 μm/min herausziehen.
    HINWEIS: Zur Sicherheit sollten Sie sicherstellen, dass die Plünderungssysteme ordnungsgemäß funktionieren, um Anästhesiedämpfe vor einer stereotaxischen Operation (Abschnitte 1 und 2) aufzufangen. Im Falle eines Isofluran-Verlaufs beim Nachfüllen des Verdampfers reinigen Sie ihn sofort mit einem inerten, absorbierenden Material wie Sägemehl. Verwenden Sie Tierarzneimittelrücknahmesysteme zur Entsorgung von Isofluran-Filtern und etwaigen Rückständen, die durch deren Verwendung entstehen, gemäß den örtlichen Vorschriften.

2. Kopf-Bügel-Implantations-Operation

HINWEIS: Führen Sie die Kopf-Stab-Implantationsoperation nach den untenstehenden Schritten 3 Wochen nach der Erstellung des Mausmodells durch.

  1. Präoperative Vorbereitung und Anästhesie
    1. Betäuben Sie das Tier mit Isofluran (4 % zur Einleitung, 1,5–2 % zur Erhaltung), das über einen Isofluran-Verdampfer verabreicht wird.
    2. Positionieren Sie die Maus in der stereotaxischen Vorrichtung auf einer Wärmeplatte, um die Körpertemperatur während des gesamten Eingriffs aufrechtzuerhalten.
    3. Öffnen Sie vorsichtig den Mund der Maus, um ihre Zähne auf die Bissstange zu setzen, und befestigen Sie die Maske, die an ein stereotaxisches Gerät angeschlossen ist, um eine kontinuierliche Isofluran-Abgabe zur Anästhesie-Erhaltung sicherzustellen.
    4. Tragen Sie Augentropfen auf, um Augenulzerationen zu verhindern.
    5. Verabreichen Sie Analgesie mindestens 10 Minuten vor dem Skalpellschnitt mittels subkutaner Injektion von Butorphanol (5 mg/kg in Kochsalzlösung).
    6. Tragen Sie regionales Lidocain (0,03 ml in jedem Ohr, 4 mg/kg, nicht über 7 mg/kg oder Lidocain/Prilocain-Creme [25 mg/g Lidocain und 25 mg/g Prilocain]) auf das Innenohr auf, um das Unwohlsein durch die Ohrstäbe zu verringern.
  2. Stereotaktische Positionierung und Schädelvorbereitung
    1. Positionieren Sie die Ohrstangen so, dass sie den Kopf sicher halten, um Symmetrie und minimale Bewegung zu gewährleisten.
    2. Stellen Sie den Schneidezahn so ein, dass Bregma und Lambda auf dieselbe horizontale Höhe kommen, und achten Sie darauf, dass sie auf der Mittellinie liegen.
    3. Bestätigen Sie die Anästheseinleitung, indem Sie den Verlust des Pedalrückzugs, die palpebralen Reflexe, die verringerte Atemfrequenz und das Fehlen der Schnurrhautbewegung überprüfen.
    4. Stellen Sie sicher, dass die Maus korrekt im stereotaxischen Rahmen mit sorgfältig eingestellten Ohrbügeln positioniert ist.
    5. Rasieren Sie den Operationsbereich und desinfizieren Sie ihn mit einer antiseptischen Lösung (Povidon-Jod gefolgt von 70 % Ethanol), um das Infektionsrisiko zu minimieren.
    6. Machen Sie einen Schnitt auf der Kopfhaut in der Mitte und ziehen Sie das darunterliegende Gewebe vorsichtig zurück, um den Schädel freizulegen und dabei die Hämostase aufrechtzuerhalten. Stellen Sie sicher, dass die Haut ausreichend geöffnet ist, um die parietotemporalen Rillen sichtbar zu machen. Um dies zu erreichen, setzen Sie vier feine Bulldoggenklemmen auf die Faszie unter der Haut, um die Sichtbarkeit zu maximieren.
    7. Reinigen und trocknen Sie den freiliegenden Schädel gründlich, um einen klaren Blick auf anatomische Orientierungspunkte (Bregma und Lambda) zu haben.
    8. Den Schädel in der anteroposterioren Achse ausrichten, indem Bregma und Lambda in derselben horizontalen Ebene ausgerichtet werden.
    9. Nivellieren Sie den Schädel in der mittellateralen Achse, indem Sie die Tiefe beider parietotemporalen Rillen angleichen.
  3. Bohren und Einsetzen von Implantaten
    1. Bohren Sie ein Loch mit 1 mm Durchmesser oberhalb des vmPFC an den Koordinaten AP: +1,75; ML: −0,4; DV: +3,1 (Abbildung 2). Verwenden Sie den stereotaxischen Arm, um die vier Ecken mit Tinte zu markieren, um das Einfügen der Siliziumsonde am Aufnahmetag zu leiten. Zeichnen Sie zusätzlich ein Kreuz, indem Sie die zuvor beschriebenen Punkte mit einem Skalpell verbinden und eine Menge Tinte auftragen, sodass sie die Einschnitte durchdringt und die Spuren stabil bleibt. Entfernen Sie überschüssige Tinte mit einem Wattestäbchen, das mit 70 % Alkohol befeuchtet ist.
    2. Bohren Sie zwei zusätzliche Löcher in den hinteren Schädelbereich oberhalb des Kleinhirns. Stecken Sie manuell einen Draht in jedes Loch für zukünftige Referenz bzw. Erdung (Abbildung 2).
      1. Alternativ können Edelstahlschrauben verwendet werden (A2-Edelstahl, M1 × Größe 2 oder 18-8 Edelstahlschrauben, 0,061" Durchmesser × 3/16" Länge) oder männliche Edelstahlschrauben. Unabhängig von der Wahl sollte sichergestellt werden, dass das Element, das elektrischen Kontakt liefert, direkten Kontakt zur Gehirnoberfläche hält, ohne Druck auszuüben, um Gewebeschäden zu vermeiden, das Tierwohl zu gefährden oder die Aufnahmequalität negativ zu beeinträchtigen.
    3. Mache mit einem Skalpell flache Rillen auf den freiliegenden Schädel, um die Oberfläche zu erhöhen und eine bessere Implantatverwachsung zu gewährleisten.
    4. Tragen Sie in zwei aufeinanderfolgenden Schichten ein Zwischen-Zahnhaftharz auf den gereinigten und getrockneten Schädel auf: zuerst mit der Basiskatalysatormischung, um sie vollständig trocknen zu lassen, und dann mit der pulverhaltigen Mischung, um die gesamte Oberfläche und die Schädelkanten zu bedecken. Überprüfen Sie mit einer Pinzette, ob die Klebstoff zwischen Schädel und dem zukünftigen Implantatkement vollständig fest ist, bevor Sie fortfahren.
    5. Platziere eine Edelstahl-Kopfstange zwischen dem PFC-Aufnahmeloch und den Referenz-/Masselöchern (Abbildung 2). Richten Sie die Kopfstange mit dem stereotaxischen Arm aus, um sicherzustellen, dass sie vollständig auf Höhe des Schädels ist, und behalten Sie so genaue stereotaxische Koordinaten während der Kopffixierung und dem anschließenden Einführen der Siliziumsonde aufrecht.
    6. Klebe alle Metallteile mit Zahnkleber an den Schädel und vermeide dabei sorgfältig, dass Zement in das Aufnahmeloch eindringt.
    7. Decken Sie die Kraniotomie mit einem zweikomponentigen chirurgischen Silikon ab.
      HINWEIS: Wenn alle Schritte sorgfältig befolgt werden, wird erwartet, dass die Einnistung und die anschließende Funktionalität der Kopfstange ohne Komplikationen verlaufen, mit einer geschätzten Erfolgsquote von über 95 %.
  4. Postoperative Pflege
    1. Überwachen Sie sorgfältig die Erholung der Maus nach einer Gehirnoperation, um sicherzustellen, dass das Tier wieder zu Bewusstsein kommt, die Körpertemperatur erhält und Schmerzlinderung erfährt.
    2. Hausmäuse einzeln in Käfigen und überwachen sie bis zur vollständigen Genesung.
    3. Verabreichen Sie alle 12 Stunden für 3 Tage nach der Operation subkutanes Butorphanol (5 mg/kg in Kochsalzlösung).
      HINWEIS: (KRITISCH) Während des gesamten chirurgischen Eingriffs sollten die Vitalwerte kontinuierlich überwacht werden (Herz- und Atemfrequenz, Sauerstoffsättigung und Blutdruck). Tragen Sie bei Bedarf Augentropfen auf, um Hornhauttrockenheit oder -schäden zu vermeiden.

3. Gewöhnung

HINWEIS: Sobald Mäuse ihr voroperatives Gewicht (ca. 5 bis 7 Tage nach der Operation) wiederhergestellt haben, beginnen Sie mit einem 4-tägigen Gewöhnungsprotokoll, um die Tiere schrittweise an das experimentelle Setting zu gewöhnen.

  1. Tag 1: Führen Sie zwei 10-minütige Handhabungssitzungen durch, mit einer 1-stündigen Ruhepause zwischen den Sitzungen, um die Mäuse mit dem Versuchsleiter vertraut zu machen. Berühren Sie die Maus sanft, während sie auf dem Unterarm ist, um sie mit dem Experimentator vertraut zu machen.
  2. Tag 2: Führen Sie zwei 5-minütige Handhabungssitzungen durch. Nach jeder Sitzung halten Sie die Mäuse vorsichtig am Kopfstab in 10-Sekunden-Intervallen für insgesamt 5 Minuten.
  3. Tag 3: Nach einer kurzen Handhabung lassen Sie die Mäuse 7 Minuten lang frei auf dem Laufband laufen. Dann fixiere den Kopf und halte die Mäuse 5 Minuten lang in der kopffixierten Position.
  4. Tag 4: Führen Sie eine 15-minütige kopffixierte Laufeinheit auf dem Laufband durch.
    HINWEIS: (KRITISCH) Tiere mit übermäßigem Gewichtsverlust, Barbierverhalten, vermindertem Erkundungsverhalten oder verminderter Beweglichkeit gemäß festgelegten Tierschutzrichtlinien müssen aus der Studie ausgeschlossen werden. Das Implantat muss vollständig stabil bleiben. Jede Verschiebung erfordert den Ausschluss des Tieres aus der Studie, da dies die Mehrkanalsonde während der Aufnahme beschädigen und/oder zu instabilen, verrauschten Signalen führen kann.

4. Sondenvorbereitung

HINWEIS: Um die Sonde mit den Adaptern (Abbildung 3A) anzuschließen, folgen Sie diesen Schritten:

  1. Schließe den Sondenadapter/-stecker an den Adapter für den stereotaxischen Arm an.
  2. Koppeln Sie zwei Head-Stage-Adapter (jeweils Om32) mit dem Probe-Adapter (Abbildung 3A), um sicherzustellen, dass die Ausrichtung stimmt und übermäßige Kraft vermieden wird.
  3. Verbinden Sie die Sonde mit dem Adapter (Abbildung 3B). Um gleichzeitige Aufnahmen aus IL- und PL-Regionen bei 64 verschiedenen Tiefen zu ermöglichen, verwenden Sie eine Siliziumsonde mit einem Schaft und 64 Kanälen (Schaftlänge: 8 mm; Schaftdicke: 15 μm) (Abbildung 4A).
  4. Um die anschließende Lokalisierung der Sonde zu erleichtern, wird die Sonde mit einem histologisch kompatiblen fluoreszierenden Farbstoff oder ferromagnetischen Partikeln beschichtet, was eine nachträgliche Überprüfung der Aufzeichnungsstelle ermöglicht.
  5. Tragen Sie den Farbstoff mit einer der folgenden Methoden auf:
    1. Tauchen Sie den gesamten Schaft in die Lösung.
    2. Geben Sie einen kleinen Tropfen der Lösung aus einer Mikropipette auf die Sonde ab und verteilen Sie ihn entlang der Skanche.
    3. Verwenden Sie einen feinen Pinsel, der in die Lösung getaucht ist, um die Rückseite der Sonde zu bemalen.
    4. Für die Schritte 4.5.2 und 4.5.3 sollten Sie mindestens drei Striche anwenden, um eine korrekte Beschichtung des Schafts sicherzustellen.
      HINWEIS: Die Schritte 4.1 bis 4.3 sind nur beim ersten Einsatz der Sonde erforderlich, da sie über mehrere Aufnahmesitzungen hinweg wiederverwendet werden kann. Nach den Aufnahmen werden die Kabel der seriellen Peripherie-Schnittstelle (SPI) getrennt, während die Sonde weiterhin mit dem Adapter und den am stereotaxischen Armadapter montierten Adaptern verbunden bleibt.

5. Aufzeichnung und Signalaufnahme

  1. Überwachen Sie den Östruszyklus mit einem nicht-invasiven Protokoll, das auf Zelltypologie bei vaginalen Abstrichen basiert, um sicherzustellen, dass die Weibchen sich in der Diestrus-Phase29,30 befinden.
  2. Sichern Sie das Tier in einer kopffixierten Position auf einem zylindrischen Laufband, das mit einem stereotaxischen Rahmen integriert ist (Abbildung 4B). Stellen Sie sicher, dass das Laufband und der Rahmen richtig ausgerichtet sind, um Stabilität und Vergleichbarkeit zwischen den Motiven zu gewährleisten.
  3. Um Signale aufzuzeichnen und zu empfangen, folgen Sie den Schritten 5.3.1-5.3.15.
    1. Verwenden Sie eine Lupe, um sicherzustellen, dass das Implantat völlig unbeweglich bleibt.
    2. Montiere die Sondenbaugruppe – bestehend aus Sonde, Adaptern und Headstage-Adaptern – am Adapterarm des stereotaxischen Rahmens.
    3. Verbinden Sie die SPI-Kabel, die zuvor mit der Erfassungsplatine verbunden waren, mit den Kopfstufen (Abbildung 3B). Führen Sie Aufzeichnungen, welches SPI-Kabel an jeder Headstage angeschlossen ist, da diese Korrespondenz unerlässlich ist, um das Elektrodenlayout während der späteren automatischen Spike-Sortierung zu erhalten.
    4. Verbinden Sie den Erdungsdraht vom Sondenadapter mit der männlichen Brücke ipsilateral zur aufgenommenen Hemisphäre und den Referenzdraht an die kontralaterale Seite. Trage eine kleine Menge Lötzinn auf den im Gehirn eingebetteten Draht auf und wende dann kurz Wärme an, um die Verbindung zu sichern. Vermeiden Sie übermäßige Hitze, um Schäden am darunterliegenden Gewebe oder an der Adapterelektronik zu vermeiden.
    5. Positionieren Sie eine Vergrößerungslinse, um das Loch zu visualisieren, das für die Sondeneinführung in die PL- und IL-Kortex geschaffen ist. Stellen Sie sicher, dass die Tintenmarken jederzeit klar sichtbar sind, um während des Eingriffs präzise stereotaktische Koordinaten aufrechtzuerhalten.
    6. Führen Sie die Sonde mit dem stereotaxischen Arm und den vordefinierten Orientierungspunkten zur Mitte des vmPFC-Lochs.
    7. Positioniere die Sonde vorsichtig im Zentrum der Kraniotomie und berühre vorsichtig die Gehirnoberfläche. Tragen Sie warme Kochsalzlösung auf das freiliegende Gewebe auf, um ein Austrocknen zu verhindern.
    8. Beginnen Sie, die Sonde mit einer Geschwindigkeit von 50 μm/min für 4-5 Minuten zu senken, um Gewebeentzündungen zu minimieren. Stellen Sie sicher, dass der Sondenschaft bei diesem ersten Einsetzen nicht verbiegt wird.
    9. Messen Sie die Impedanz der Aufnahmestellen und vergleichen Sie die Werte mit denen des Herstellers. Diese erste Untersuchung stellt sicher, dass die ersten Kanäle, die zum Gehirn führen, während des Einführens nicht beschädigt oder blockiert wurden.
      HINWEIS: (KRITISCH) Elektrodenimpedanzen sollten mit den Basiswerten des Herstellers verglichen werden. Abweichungen von bis zu ~30 % sind im Allgemeinen akzeptabel und beeinträchtigen die Aufnahmen nicht. Erhöhungen zwischen 30 und 100 % können weiterhin nutzbar sein, erfordern aber Vorsicht und genauere Überwachung. Änderungen, die über 100 % hinausgehen, deuten oft auf Schäden oder Blockaden hin, und die betroffenen Standorte sollten als unzuverlässig angesehen werden. In solchen Fällen sollte die Probe gereinigt werden, um die Impedanz wie zuvor beschrieben zu verringern. Wenn die Impedanzen nicht in einen akzeptablen Bereich zurückgesetzt werden können, muss die Sonde verworfen werden. Letztlich ist es jedoch die Überlegung des Experimentators, wie viele unzuverlässige Kanäle toleriert werden können, bevor die Sonde verworfen wird; Ein häufig angewandter Standard ist, dass nicht mehr als ~10 % der Kanäle kompromittiert werden sollten.
    10. Senken Sie die Sonde weiterhin mit einer Geschwindigkeit von 50 μm/min, während Sie das Live-Signal der Kanäle, die ins Gehirn gelangen, überwachen. Überprüfen Sie, ob diese Signale denen der zuvor bewerteten Kanäle ähneln, um eine ordnungsgemäße Einfügung zu gewährleisten.
    11. Schieben Sie die Sonde vor, bis sie eine Tiefe von +3,1 mm DV erreicht, und halten Sie die Kraniotomie durch warmes Kochsalzwasser während der gesamten Senkung feucht.
    12. Entfernen Sie die Lupe und entfernen Sie alle anderen elektrischen Störquellen aus dem Raum.
    13. Missen Sie die Impedanz erneut, um sicherzustellen, dass beim Absenken der Sonde keine Messstellen blockiert wurden.
    14. Überwachen Sie das Signal von 4-5 aufeinanderfolgenden Kanälen als Referenz und warten Sie 90-120 Minuten auf die Stabilisierung des Sondensignals. Nach dieser Stabilisierungsphase wird sichergestellt, dass die Signaldrift minimal ist, um sicherzustellen, dass die anschließende automatische Spike-Sortierung zuverlässig Einzeleinheitscluster isolieren kann.
    15. Missen Sie die Impedanz vor Beginn der Datenerfassung erneut, um die richtigen Bedingungen des Aufzeichnungsstandorts zu bestätigen und eine Basisimpedanzmessung zu etablieren. Tragen Sie regelmäßig warme Kochsalzlösung auf, um ein Austrocknen des Gewebes zu verhindern. Speichere die Aufzeichnung als Binärdatei (z. B. .dat oder .bin), um die spätere Vorverarbeitung der Daten zu erleichtern.
  4. Sobald sie stabil sind, folgen Sie den Schritten 5.4.1-5.4.6.
    1. Zeichnen Sie die neuronale Aktivität der Ausgangslinie für 30 Minuten auf (Abbildung 4C).
    2. Starte das aversive Konditionierungsprotokoll mit Arduino, 30 Minuten nach der Basisaufnahme. Dies besteht aus 10 Hörtönen (10 Sekunden/Ton), die einmal pro Minute für 10 Minuten vorgetragen werden. Jeder Ton wird unmittelbar von einem 10-Sekunden-Lichtreiz gefolgt, der über die Virtual-Reality-Labyrinthbildschirme präsentiert wird (Abbildung 4C).
    3. Zeige die neuronale Aktivität 10 Minuten lang auf, ohne jegliche Konditionierungsreize.
    4. Erfassen Sie die kortikale Aktivität von PL und IL während des Extinktionsprotokolls, bei dem 10 auditive Töne ohne den anschließenden Lichtreiz präsentiert werden.
    5. Registriere die neuronale Aktivität weitere 10 Minuten ohne jegliche Reize.
    6. Stoppt die Aufnahme.
  5. Verfahren nach der Aufnahme: Nach Abschluss der Aufnahmesitzung folgen Sie Schritt 5.5.1.
    1. Sondenentzug: Verwenden Sie warme Kochsalzlösung und ziehen Sie die Sonde vorsichtig mit einer Geschwindigkeit von 100–150 μm/min heraus, während die Elektrodensignale kontinuierlich überwacht werden, um mechanische Schäden an der Sonde und eine Dehnung des Gewebes zu vermeiden, was die anschließende histologische Rekonstruktion beeinträchtigen könnte.
    2. Sobald die Sonde aus dem Gehirn entfernt wurde, weichen Sie den Schaft sofort 10 Minuten lang in destilliertem Wasser ein, um das Austrocknen des angehafteten Gewebes zu verhindern.
    3. Betäuben Sie das Tier mit Natriumpentobarbital (100 mg/kg). Anschließend wird die Maus in einer chemischen Dampfhaube transkard mit 80 ml Kochsalzlösung (0,9 %) perfundiert, gefolgt von 80 ml Paraformaldehyd 4 %, verdünnt in PB (0,1 M, pH 7,6).
      1. Um Paraformaldehyd bei Kontakt und Einatmen zu vermeiden, verwenden Sie Augen-/Gesichtsschutzausrüstung, chemisch schützende Handschuhe und eine Staubmaske. Am Ende der Perfusion wird das verbleibende Paraformaldehyd in einem Behälter für nicht-halogenierte Lösungsmittel abgegeben.
      2. Im Falle eines Verfalls befeuchten Sie das Material, um eine Staubabspaltung zu verhindern, und lagern Sie es in verschlossenen Behältern. Reinigen Sie kontaminierte Bereiche und Arbeitsflächen mit Bleichmittel, um das Paraformaldehyd zu neutralisieren.
    4. Entfernen Sie das Gehirn, legen Sie die Fixierung über Nacht bei 4 °C auf und lagern Sie 30 % Saccharose in PB (0,1 M, pH 7,6) bei 4 °C zur Kryoschutz. Erfassen Sie 30 μm große koronale Schnitte mit einem gefrierenden Mikrotom und montieren Sie die Scheiben auf gelatinierte Glasobjektträger.
      HINWEIS: Diese Abschnitte werden verwendet, um die DR α-Syn-Überexpression mittels Immunhistochemie wie zuvor 19,20,21 und Sondenposition zu bestätigen.
    5. Sondenreinigung: Tauchen Sie den implantierbaren Bereich der Sonde 1 Stunde lang in eine 1%ige enzymatische Reinigungslösung in destilliertes Wasser.
    6. Weichen Sie die Sondenschaft weitere 10 Minuten in destilliertem Wasser, um Reinigungsrückstände zu entfernen.
    7. Trocken 20-30 Minuten in aufrechter Position. Nach dem Trocknen wird die Sonde unter dem Mikroskop untersucht, um sicherzustellen, dass kein Gewebe oder Schmutz an den Messstellen zurückbleibt. Wenn die Sonde völlig sauber ist, tauche sie 1 Minute lang in hochwertigen Isopropylalkohol und lagere sie in der ursprünglichen antistatischen Box.

6. Datenanalyse: Spike-Sortierung und Datenvorverarbeitung

HINWEIS: Um extrazelluläre neuronale Aufzeichnungen zu analysieren und einzelne Spitzen bestimmten Neuronen zuzuordnen, verwenden Sie den Kilosort431 Spike-Sortieralgorithmus.

  1. Führen Sie automatische Spike-Sortierung mit Kilosort431 durch. In der Kilosort4-GUI wählen Sie die binäre Aufzeichnungsdatei aus und geben Sie das Probe-Layout gemäß dem Konfigurationsblatt des Herstellers an. Führe die Spike-Sortierung mit den Standardparametern durch, die ideal sind, um die in IL und PL aufgenommenen Wellenformen ohne weitere Anpassungen zu erfassen.
  2. Untersuchen Sie die Kilosort-Ausgabe mit Phy2 (Kwikteam/phy) für zusätzliche manuelle Kuratierung. Integration von von der Community entwickelten Plugins (petersenpeter/phy2-plugins; jiumao2/PhyWaveformPlugin), um zusätzliche Funktionen zu Phy2 hinzuzufügen und die Qualität der kuratierten Daten zu verbessern.
  3. Kennzeichnen Sie als Rauschen und verwerfen Sie alle Cluster mit einer Frequenz <0,05 Hz oder mit weniger als 500 Spitzen.
  4. Markiere außerdem die folgenden Cluster als Rauschen:
    1. Markiere diejenigen, die dreieckige Auto-Correlogramme anzeigen, als Rauschen.
    2. Markiere diese mit Wellenformformen, die nicht wie Spitzen aussehen, als Rauschen.
    3. Markiere diese auf einem einzelnen Aufnahmekanal oder über alle Kanäle mit unterschiedlicher Amplitude hinweg als Rauschen.
    4. Markiere diejenigen, die in ihren Auto-Korrelogrammen eine starke Periodizität zeigen, als Rauschen.
  5. Wählen Sie nur Cluster aus, die physiologisch angemessene Wellenformen aufweisen, Hinweise auf ein refraktäres Tal im Autokorrelator, plausible Amplitudenvariationen und klar getrennte Hauptkomponenten.
  6. Reinigen Sie jeden Cluster manuell, indem Sie die Mahalanobis-Entfernung mit Entfernung von Ausreißern anwenden.
  7. Überprüfen Sie weiterhin Wellenformformen und Amplitudenänderungen als wichtige Indikatoren für die Gültigkeit der manuellen Reinigung.
    HINWEIS: Sobald die Spike-Sortierung abgeschlossen ist, können die neuronalen Aktivitätsmuster des vmPFC mithilfe der in Python implementierten Routinen analysiert werden.

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Ergebnisse

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Die jüngsten Nachweise der kortikalen Aktivität von PL und IL, unter Verwendung des detaillierten experimentellen Protokolls, zeigen bedeutende Befunde: eine Überexpression von h-α-Syn im DR, die bei weiblichen Mäusen einen angstähnlichen Phänotyp induziert, verändert auch die ventromediale vmPFC-Aktivität. Durch eine Python-basierte Analyse zeigten wir, dass die α-Syn-Überexpression in 5-HT-Neuronen des DR-Kerns die Feuerdynamik und funktionelle Organisation des vmPFC-DR-Schaltkreises veränderte und so die elektrophysio...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll bietet eine robuste Methodik für die in vivo elektrophysiologische Bewertung der PL- und IL-Kortexe in wachen, kopffixierten Mäusen unter Verwendung eines Virtual-Reality-Korridorsystems. Die Bedeutung dieser Methode liegt in ihrer Fähigkeit, den vmPFC-DR-Schaltkreis direkt in wachen, sich verhaltenden Mäusen innerhalb eines PD-Modells zu untersuchen. Auch wenn die Kopffixierung Tierbewegungen einschränkt und stressig sein kann, bietet sie eine präzise Stimulusk...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde durch den BBRF Young Investigator Grant 31547 (MSA) 2023 sowie den MCIU/AEI/FEDER EU-Förderantrag PID2022-141700OB-I00, MCIN/AEI/10, finanziert. 13039/501100011033 (AB), AGAUR 2021-SGR-01358, Regierung von Katalonien (AB), und PID2022-141733NB-I00 (VT). Wir möchten auch dem Spanish Network for Research on Stress, MCIN/AEI/10.13039/501100011033 und dem CB/07.09.0034 Centre for Biomedical Research in Mental Health Network (CIBERSAM) danken. MSA verfügt über ein Margarita-Salas-Stipendium (MS21-132) von der Universität Valencia (Umklassifizierung des spanischen Universitätssystems des Universitätsministeriums der spanischen Regierung, finanziert von der Europäischen Union, Next Generation EU).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AAV1/2-CMV/CBA-Human A53T aSyn-WPRE-BGH-polyACharles RiverGD1001-RVMenschlicher A53T aSyn
AAV1/2-CMV/CBA-Null/Leer-WPRE-BGH-polyACharles RiverGD1004-RVLeere Vektorsteuerung
ADPT A64-Om32x2Cambridge NeuroTechOmnetics 2228Adapter
bi-komponenten chirurgisches Silikon & NBSP;WeltpräzisionsinstrumenteKWIK-SIL
Butorphanol Torbugesic Vet / Cymit quí Mica67753-31-5
DuraLayReliance Dental Manufacturing / Kalma43640Zahnbeton & NBSP;
H9-Multikanal-SondeCambridge NeuroTechASSY-77 H9
EMLA-Creme (Lidocain / Pricolain) Lirios Vañ &oakut; Sempere Apotheke679290
Mikroinjektor Welt-PräzisionsinstrumentKDS-310-PLUS
MSS Isofluran-Verdampfer Medical Supplies and Services, GroßbritannienMSSVAP02 
Open Ephys Acquisition BoardOpen EphysOEPS-9029Übernahmeausschuss; Das Open Ephys Acquisition Board kann bis zu 512 Kanäle neuronaler Daten per USB an einen Computer übertragen
C& B MetaBond ParkellS380-RDSchnellklebezement
Pentobarbital Dolethal Vetoquinol /Merck Life Science, S.L.U.P-010-1MLBarbiturat
RHD 32-Kanal  HeadstageIntan Technologies#C3314Kopfbühnenadapter&NBSP;
SiccafluidThea S.A. Laboratories / Lirios Vañ &oakut; Sempere Apotheke6515167Ophthalmisches Gel 
stereotaxische Apparate&NBSP;Stoelting51730U
Stereotaxischer RahmenNarishigeSR-6N/SM-15R
Terg-a-zymeSigma AldrichZ273287Sondenreinigungslösung

Referenzen

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