Methodenartikel

Effiziente und schnelle Erzeugung von CAR-T- und zytokininduzierten Killerzellen in GMP-skalierbaren Geräten

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DOI:

10.3791/69369

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5. Dezember 2025

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1Immunology and Molecular Oncology Unit, Veneto Institute of Oncology IOV - IRCCS, 2Department of Surgery, Oncology and Gastroenterology, University of Padua, 3Department of Cardiac, Thoracic, Vascular Sciences and Public Health, University of Padua

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine skalierbare Methode zur Erweiterung von Adoptive Cell Therapies (ACT)-Produkten, nämlich Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T-Zellen und Cytokine-Induced Killer (CIK)-Zellen, mit gasdurchlässigen Rapid Expansion (G-Rex)-Geräten, die ein effizientes und robustes Wachstum in einem klinisch relevanten Kontext nachweisen.

Zusammenfassung

Adoptive Zelltherapien (ACT) haben sich in den letzten Jahren rasant entwickelt, spielen eine entscheidende Rolle in der Krebsimmuntherapie und beeinflussen die Behandlungsergebnisse erheblich. Ein entscheidender Schritt in der Entwicklung von Zelltherapien, sowohl in der präklinischen als auch in der klinischen Phase, ist der Herstellungsprozess. Konventionelle statische Kulturmethoden erfordern häufige Zellmanipulationen und sind oft durch einen reduzierten Gasaustausch und Nährstoffzufuhr eingeschränkt, was die Zellausbeute und den Phänotyp beeinträchtigen kann. Hier präsentieren wir ein schrittweises, reproduzierbares und skalierbares Protokoll für die ex-vivo-Expansion von zwei ACT-Produkten, nämlich Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T und Cytokine-Induced Killer (CIK)-Zellen, unter Verwendung gaspermeabler Rapid Expansion (G-Rex)-Geräte. G-Rex-Geräte sind speziell darauf ausgelegt, den Nährstoffaustausch zu fördern und hochdichte Kulturen mit minimalem Eingreifen des Nutzers zu unterstützen. Unter verschiedenen ACT-Ansätzen haben CAR-T-Zellen bemerkenswerte Erfolge bei der Behandlung hämatologischer Malignitäten gezeigt und so einen raschen Fortschritt von experimenteller Forschung zu klinischen Anwendungen ermöglicht. Neben CAR-T-Zellen wurden CIK-Zellen aufgrund ihres charakteristischen Phänotyps und des Fehlens von behandlungsbedingten Nebenwirkungen sowie der Graft-versus-Host-Erkrankung (GvHD) auch in klinischen Studien weit verbreitet eingesetzt. Dieses Protokoll beschreibt die wichtigsten technischen Schritte für beide Zelltypen, beginnend mit der Isolierung und Säung peripherer Blutmononuklearzellen (PBMCs). Kurz gesagt: PBMCs werden mit Anti-CD3/CD28-Antikörpern stimuliert, gefolgt von lentiviraler Transduktion zur Erweiterung der CAR-T-Zellen oder mit Interferon-γ (IFN-γ), Anti-CD3-Antikörpern und Interleukin 2 (IL-2) zur Gewinnung von CIK-Zellen. Flusszytometrie wird eingesetzt, um die Lebensfähigkeit und Phänotyp der Zellen zu überwachen, und funktionelle Assays werden durchgeführt, um das therapeutische Potenzial des Zellprodukts zu bestätigen und die Skalierbarkeit des Ansatzes zu validieren. Insgesamt bietet dieses Protokoll eine praktische Lösung zur Herstellung großer Mengen von Effektorzellen in einem präklinischen Umfeld und erleichtert so die klinische Anwendung bei mehreren Immunzellpopulationen. Schließlich bietet es eine skalierbare Lösung für die Herstellung von Hochleistungs-Effektorzellen.

Einleitung

Die adoptive Zelltherapie (ACT) ist zu einer wichtigen Säule fortschrittlicher Therapien zur Krebsbehandlung geworden. Dieser Ansatz basiert auf der Verabreichung ex-vivo erweiterter zellulärer Produkte, um eine antitumorwirksameWirksamkeit zu erreichen. Bis heute wurden viele Zelltypen im ACT eingesetzt, von antigen-aspezifischen Ansätzen, z. B. natürlicher Killer (NK)2, zytokininduzierter Killer (CIK)3,4, natürlicher Killer T (NKT)5 oder γδ T-Zellen6, bis hin zu hochspezifischen und personalisierten Methoden wie tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TILs)7 und konstruierten zellbasierten Therapien, z. B. chimerischer Antigenrezeptor (CAR)1, 8 und T-Zell-Rezeptorzellen (TCR) 9,10.

CAR-T-Zellen sind genetisch veränderte T-Zellen, die durch ex vivo virale Transduktion erzeugt werden, um einen synthetischen Immunrezeptor zu exprimieren, der ein spezifisches molekulares Ziel erkennt. Die CAR-Struktur besteht aus einem antigen-spezifischen einkettigen Fragment (scFv)-Antikörper, kombiniert mit intrazellulären Signaldomänen, einschließlich der TCRζ-Kette und kostimulatorischen Molekülen. Bei Antigen-Engagement liefert die intrazelluläre Domäne Aktivierungssignale, die die Proliferation von T-Zellen und die Antitumoraktivitätfördern 11.

CIK-Zellen sind eine heterogene Population aktiverter T-Lymphozyten, die während der ex-vivo-Expansion von peripheren mononuklearen Blutzellen (PBMCs) oder Nabelschnurblut (UCB)12 die Expression von CD56 aufnehmen. Diese Expansion beinhaltet eine Stimulation mit Interferon-γ (IFN-γ), anti-CD3 monoklonalem Antikörper und Interleukin-2 (IL-2), gefolgt von einer 14-tägigen Kultur in IL-2. CIK-Zellen ähneln funktional sowohl NK- als auch T-Zellen und üben Antitumoraktivität sowohl durch Major Histocompatibility Complex (MHC)-unabhängige als auch abhängige Mechanismenaus 13,14,15,16. Diese Eigenschaften ermöglichen den Einsatz von CIK-Zellen sowohl in allogenen als auch in autologen therapeutischen Umgebungen mit minimalem Graft-versus-Host-Erkrankungsrisiko (GvHD)17.

In der klinischen Praxis erfordern sowohl CAR-T- als auch CIK-Zelltherapien die Verabreichung großer Zellmengen. CAR-T-Zellen werden mit 50–200 Millionen Dosen pro18-jähriger Patientin infundiert. Ähnlich werden CIK-Zellen typischerweise in Dosen von bis zu 10 Milliarden Zellen pro Infusion verabreicht, wobei Patienten je nach Behandlungsprotokoll19 oft mehrere Infusionen erhalten. Traditionelle Zellkulturmethoden mit Kolben oder Platten sind ineffizient, zeitaufwendig und erfordern häufiges Durchlaufen, was die großflächige Expansion unmöglich macht und das Kontaminationsrisiko erhöht. Automatisierte oder halbautomatisierte Systeme, die Beutelkulturen oder Bioreaktoren verwenden, ermöglichen eine großflächige Ausdehnung, haben jedoch Einschränkungen, z. B. Scherspannung oder die Notwendigkeit von Dichteanpassungen und häufiger Mediumperfusion20,21 sowie die Handhabung einer Charge auf einmal, was sowohl in akademischen als auch im industriellen Kontext zu hohen Kosten führt. In dieser herausfordernden Situation stellt das gasdurchlässige Schnellexpansionsgerät (G-Rex) eine Alternative dar, ein statisches Kulturverfahren mit einer Siliziummembran am Boden des Bohrlochs, die einen effizienten Sauerstoffaustausch und eine erhöhte Höhe der Behälter gewährleistet und so eine Kapazität mit großem Volumen ermöglicht. Daher unterstützt das System das Zellwachstum ohne Mittelersatz oder Dichteanpassung22,23. G-Rex-M-Systeme haben eine Skalierbarkeit bis zu 5000 mL nachgewiesen und sind mit automatisierten Erntesystemen kompatibel, wodurch eine kontaminationsfreie und geschlossene Kulturplattform bereitgestellt wird, die leicht von akademischen in klinische Einrichtungen für die Entwicklung fortschrittlicher Therapiearzneimittel (ATMPs)24 übertragbar ist.

In dem beschriebenen Verfahren nutzten wir die Vorteile und Eigenschaften von G-Rex-Geräten, um das Expansionsprotokoll sowohl der CAR-T- als auch der CIK-Zellen zu optimieren. Wir zeigten, dass beide Zelltypen effizient erweitert und skaliert werden können, wobei ein konsistenter Phänotyp und ein funktionales Profil über verschiedene Kultursysteme erhalten bleiben. Eine schematische Übersicht des Expansionsprotokolls für sowohl CIK- als auch CAR-T-Zellen ist in Abbildung 1 dargestellt.

Abbildung 1
Abbildung 1: Überblick über CAR-T- und CIK-Zellexpansionsprotokolle mit G-24- oder G-6M-Kulturgeräten. CAR-T- und CIK-Zellen werden ab Tag 0 aus isolierten PBMCs erweitert. Zur Erweiterung der CAR-T-Zellen werden PBMCs am ersten Tag mit Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern stimuliert, am zweiten Tag genetisch verändert und anschließend alle 3-4 Tage mit hIL-7- und hIL-15-Supplementierung kultiviert, mit der finalen Ernte für funktionelle Assays am Tag 9. Im G-6M-Format ist die Zytokin-Supplementierung auf Tag 2 beschränkt, ohne zusätzliche Zytokinfütterung während der Kulturperiode. Zur Erweiterung der CIK-Zellen werden PBMCs am ersten Tag mit rhIFN-γ und am zweiten Tag mit Anti-CD3-Antikörpern und rhIL-2 stimuliert, die dann alle 3–4 Tage verabreicht werden. Bei G-24 ist ein Mediumwechsel gleichzeitig mit dem Zytokinpräparat erforderlich. CIK-Zellen werden am 14. Tag für nachgelagerte funktionelle Assays entnommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Protokoll

Anonymisierte Buffy Coats von gesunden Spendern, die zuvor auf das Fehlen von Krankheitserreger-Kontaminationen getestet wurden (z. B. HIV, HCV, HBV, Syphilis), wurden vor schriftlicher informierter Einwilligung von der Blutbank des Krankenhauses Padua bezogen. Blutproben wurden in zertifizierten Biosicherheitsschränken behandelt, und das Personal trug geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA).

HINWEIS: Alle Verfahren mit lentiviralen Vektoren wurden unter BioSafety Level 2 (BSL-2)-Bedingungen gemäß den institutionellen Richtlinien durchgeführt. Die Behandlung von lentiviralen Vektoren erfordert zusätzliche Vorsichtsmaßnahmen, einschließlich doppelter Handschuhe. Biogefährlicher Abfall (einschließlich viraler Materialien, transduzierte Zellen und menschlich abgeleitete Proben) wurde vor der Entsorgung autoklaviert, während chemische Abfälle (einschließlich fluoreszierender Farbstoffe und Reagenzien) gemäß institutionellen Protokollen für gefährliche Abfälle getrennt werden mussten. Beachten Sie, dass spezifische Biosicherheitsanforderungen zwischen Institutionen variieren können und vor der Umsetzung des Protokolls überprüft werden sollten.

1. PBMC-Isolation

  1. PBMCs aus gesunden Spender-Buffycoats oder peripheren Blutproben durch Dichtegradientenzentrifugation isolieren. Verdünnen Sie das Buffy-Fell mit einem gleichen Volumen steriler 1x Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) und schichten Sie das verdünnte Blut vorsichtig über das gleiche Volumen Lymphoprep in einem 50-ml-konischen Röhrchen. Eine Verdünnung mit 1x PBS ist für peripheres Blut nicht notwendig. Zentrifugiere mit 400 x g für 20 Minuten bei Raumtemperatur ohne Bremse.
  2. Nach der Zentrifugation wird die PBMC-Schicht an der Plasma-Lymphoprep-Schnittstelle gesammelt und mit sterilem 1x PBS gewaschen. Zentrifugieren und resuspendieren Sie PBMCs im hämatopoietischen Zellkulturmedium (CM), ergänzt mit 1 % Penicillin/Streptomycin (im Folgenden cCM). Beurteile Zellanzahl und Lebensfähigkeit mit dem Trypan Blue-Ausschlussassay.

2. Expansion der CAR-T-Zellen durch PBMCs in G-24-Kulturgefäßen

  1. PBMC-Aktivierung (Tag 0)
    1. Suspendiere 2 x 106 frisch isolierte PBMCs in 2 ml cCM, ergänzt mit 5 % fetalem Rinderserum (FBS) (im Folgenden cCM-F), was zu einer endgültigen Saatdichte von 1 x 106 PBMCs/cm2/ml führt, und übertrage in einen Brunnen eines 24-Brunnen-G-Rex-(G-24)-Kulturgefäßes. Säe so viele Brunnen wie die Anzahl der verschiedenen Transduktionsbedingungen, die am ersten Tag (Schritt 2.2 – Tag 1) durchgeführt werden sollen.
    2. Fügen Sie 4 μl Anti-CD3 (rein funktionelle Qualität, Endkonzentration: 0,2 μg/mL) und 20 μl Anti-CD28 (rein funktionelle Qualität, Endkonzentration: 1 μg/mL) Antikörper direkt zu jedem Brunnen hinzu, um T-Zellen zu aktivieren. Kulturzellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C, 5 %CO2.
  2. T-Zell-Transduktion mit lentiviralen Vektoren (Tag 1)
    1. Nach nächtlicher Stimulation entnehmen und zählen Sie die aktivierten T-Zellen mit dem Trypan Blue-Ausschlussassay zur Bewertung der Lebensfähigkeit. Berechnen Sie 1 x 106 lebensfähige aktivierte Zellen für jede G-24-Welle (Bohrlochfläche von 2 cm²), entsprechend einer Aussaatdichte von 0,5 x 106 Zellen /cm². Zellzellen in einem Röhrchen übertragen und 5 Minuten lang bei 300 x g zentrifugieren.
    2. Bereiten Sie das Transduktionsmedium für jedes Bohrloch vor, indem Sie das entsprechende lentivirale Vektorvolumen, basierend auf der Konzentration (TU/mL) der lentiviralen Vektorpräparation (hier CD19-CAR-BBζ Lentivirus aus dem St. Jude Children's Research Hospital25; Multiplicity of Infection (MOI) 20), mit 5 μl des Transduktionsverstärkers Protaminsulfat (8 mg/mL Lagerlösung wird durch Auflösung von Protaminsulfat in 1x PBS gewonnen und steril mit 0,2 μm Filter gefiltert; Endkonzentration von 50 μg/mL). Verwenden Sie ein CM-Medium ergänzt mit 5 % FBS ohne die Zugabe von Penicillin/Streptomycin, um ein Endvolumen von 0,8 mL/Well (0,4 mL/cm²) zu erreichen. Für die untransduzierte (UTD) Kontrolle bereiten Sie das beschriebene Transduktionsmedium vor, um die Zugabe eines lentiviralen Vektors zu vermeiden.
    3. Pelletierte Zellen (Schritt 2.2.1) in 0,8 mL/Brunnen Transduktionsmedium wieder suspendieren und sie in einem neuen G-24-Bohrloch plattieren. Inkubiere über Nacht bei 37 °C, 5 %CO2.
      HINWEIS: Wenn die Transduktion mehrerer Brunnen mit demselben lentiviralen Vektor geplant ist, bereiten Sie eine Hauptmischung aus dem Transduktionsmedium vor, das das Virus und Protaminsulfat in der gewünschten Konzentration enthält. Gründlich mischen, um Homogenität zu gewährleisten. Anschließend wird 0,8 ml dieses Master-Misch in jedes Rohr der pelletierten Zellen gegeben, um konsistente Transduktionsbedingungen über alle Proben hinweg zu gewährleisten.
  3. CAR-T-Zellkultur und -expansion (Tag 2 bis Tag 9)
    1. Am zweiten Tag erhöhen Sie das Kulturvolumen auf ein Endvolumen von 8 mL/Bohrloch, indem Sie 7,2 mL frisches cCM-F hinzufügen, ergänzt mit humanem Interleukin-7 (hIL-7) und humanem Interleukin-15 (hIL-15) bei einer Endkonzentration von jeweils 10 ng/mL (berechnetes Volumen der Zytokine unter Berücksichtigung eines Gesamtvolumens von 8 mL pro Bohrloch).
    2. Am 5. Tag erfrischen Sie das Kulturmedium, indem Sie vorsichtig 6 ml konditioniertes Medium aus jedem Bohrloch entfernen, ohne die Zellen am Boden des Bohrlochs zu stören, und es durch 6 ml frisches cCM-F ersetzt, ergänzt mit hIL-7 und hIL-15 (Endkonzentration: 10 ng/mL, berechnet unter einem Gesamtvolumen von 8 mL pro Bohrloch). Bei der Arbeit mit mehreren Brunnen bereiten Sie eine Mastermischung aus cCM-F-Medien vor, ergänzt mit hIL-7- und hIL-15-Zytokinen, um eine gleichmäßige Verteilung der Zytokine sicherzustellen.
    3. Am 9. Tag werden die CAR-T-Zellen effizient erweitert und für nachgelagerte Anwendungen bereit. Um die CAR-T-Zellen zu entnehmen, entfernen und entsorgen Sie vorsichtig 5 ml konditioniertes Medium. Mit einer 1000-μL-Pipette werden die CAR-T-Zellen in den verbleibenden 3 mL Medium wieder suspendiert und in ein 15-mL-Rohr umgebefördert. Zählen Sie CAR-T-Zellen und prüfen Sie ihre Lebensfähigkeit mit dem Trypan Blue Ausschlussassay. Typischerweise werden etwa 3 x 10 7 CAR-T-Zellen (3,24 ± 1,67 x 107 Zellen) aus jedem G-24-Brunnen gewonnen (Ergänzende Tabelle 1).

3. CIK-Erweiterung in G-24-Kulturgefäßen

  1. PBMC-Aktivierung (Tag 0)
    1. Samen 1 x 106 frisch isolierte PBMCs pro Bohrloch eines G-24-Kulturgefäßes, was einer Dichte von 0,5 x 106/cm² entspricht, in 8 mL cCM, ergänzt mit rekombinantem menschlichem Interferon-γ (rhIFN-γ, Endkonzentration: 1000 IU/mL). Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, 5 %CO2.
  2. CIK-Zellstimulation und -expansion (Tag 1 bis Tag 14)
    1. Am ersten Tag, 22–24 Stunden nach rhIFNγ-Stimulation, geben Sie jedem Brunnen direkt 4 μL Anti-CD3-Antikörper (Endkonzentration: 50 ng/mL) und 4 μL rekombinantes humanes Interleukin-2 (rhIL-2, Endkonzentration: 500 IU/mL) zu. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, 5 %CO2.
    2. Alle 3 bis 4 Tage (an Tag 5, 9 und 12 der Zellkultur) wird 6 ml konditioniertes Medium durch frisches cCM und rhIL-2 (Endkonzentration: 500 IU/mL) ersetzt und die Endkonzentration von rhIL-2 relativ zum vollen 8 mL Volumen berechnet.
    3. Am Tag 14 entnehmen Sie CIK-Zellen, indem Sie 5 ml konditioniertes Medium entsorgen und in den verbleibenden 3 ml konditioniertem Medium wieder suspendieren. Stellen Sie Zellen in ein 15-ml-Rohr und bewerten Sie die Gesamtzellanzahl und Zelllebensfähigkeit mit dem Trypan Blue-Ausschlusstest. Typischerweise werden aus jedem Bohrloch etwa 8 x 107 Bulk-CIK-Zellen (8,6 ± 4,58 x 107 Zellen) gewonnen (ergänzende Tabelle 2).
      HINWEIS: Während der Mediumwechsel sollte das Überlagermittel vorsichtig aspiriert werden, wobei darauf geachtet wird, die Zellschichtpopulation nicht zu stören oder die gasdurchlässige Membran zu berühren. Schäden an der Membran können den Gasaustausch beeinträchtigen und die Lebensfähigkeit der Zellen negativ beeinflussen.

4. Großangelegte Herstellung von CAR-T- und CIK-Zellen

HINWEIS: Die in den Abschnitten 2 und 3 beschriebenen CAR-T- und CIK-Zellexpansionsprotokolle können leicht auf größere G-Rex-Kulturgeräte, insbesondere das G-6M-Format, skaliert werden. Beim Übergang vom G-24-Format (Oberfläche: 2 cm2) auf das G-6M-Gerät (Oberfläche: 10 cm²) bleiben alle Konzentrationen und Dichten konstant, während alle Volumina und absoluten Größen proportional um einen 5-fachen Faktor erhöht werden, um der erhöhten Oberfläche gerecht zu werden. Das bedeutet, dass die Zellsamendichte, die Konzentrationen der Mediensupplementierung und die Zytokinkonzentrationen unverändert bleiben, während die Gesamtmengen der Medien, die Anzahl der ausgesäten Zellen und die absoluten Mengen der zugesetzten Zytokine proportional skaliert werden. Diese Skalierbarkeitsfunktion ermöglicht einen reibungslosen Übergang von kleinmaßstäblichen Forschungsprotokollen zu präklinischen oder frühen klinischen Fertigungen, ohne erhebliche Protokolländerungen zu benötigen, wodurch konsistente Eigenschaften der Effektorzellen erhalten bleiben.

  1. CAR-T-Zellenerweiterung in Geräten im G-6M-Format
    1. Durchführung der Aktivierung von PBMCs am Tag 0 und lentivirale Transduktion am Tag 1, wie in Abschnitt 1 beschrieben, wobei alle Konzentrationen und Dichten erhalten bleiben und Volumen und absolute Mengen um einen fünffachen Faktor skaliert werden.
    2. Am zweiten Tag wird das Kulturvolumen mit cCM-F-Medium auf insgesamt 100 ml erhöht. Berechnen und fügen Sie hIL-7 und hIL-15 hinzu, um die Endkonzentration von 10 ng/mL entsprechend zu erreichen.
      HINWEIS: Im Gegensatz zum G-24-Format ermöglicht das höhere Design des G-6M-Geräts ein größeres mittleres Volumen, was eine konstante Nährstoff- und Zytokinversorgung während der gesamten Kulturperiode ohne Medienaustausch ermöglicht ("Fill and Forget"- Ansatz). Daher sind am fünften Tag keine zusätzlichen Zytokine erforderlich.
    3. Um CAR-T-Zellen am Tag 9 zu entnehmen, entsorgen Sie etwa 90 ml Medium aus jedem Brunnen mit einer serologischen Pipette und suspendieren Sie die Zellen in den verbleibenden 10 ml erneut. Zellen in ein 15-ml-Röhrchen übertragen und sie für weitere Tests verwenden.
  2. CIK-Zellenerweiterung in Geräten des G-6M-Formats
    1. Führen Sie das PBMCs-Seeding am Tag 0 nach dem in Abschnitt 3 beschriebenen Protokoll durch und skalieren Sie alle Volumina und Reagenzien um das Fünffache, um zum größeren Geräteformat (G-6M) zu passen.
    2. Am ersten Tag sollte man das Kulturvolumen mit cCM-Medien auf insgesamt 100 ml anpassen. Fügen Sie jedem Bohrloch eine Endkonzentration von 500 IU/mL rhIL-2 und 50 ng/mL Anti-CD3 hinzu.
    3. Fügen Sie alle 3-4 Tage (Tag 5, 9 und 13) 500 IU/ml rhIL-2 pro Brunnen hinzu, ohne mittlere Veränderung.
    4. Entnehmen Sie CIK-Zellen am Tag 14, indem Sie etwa 90 ml Medium aus jedem Brunnen mit einer serologischen Pipette entfernen. Suspendiere die Zellen in den verbleibenden 10 ml erneut, verlagere sie in ein 15-ml-Rohr und nutze sie für weitere Tests.

5. Charakterisierung des Effektorzell-Phänotyps mittels Durchflusszytometrie

HINWEIS: Am Ende des Expansionsprotokolls wird eine Oberflächenmarkeranalyse mittels Durchflusszytometrie an CAR-T- und CIK-Zellen durchgeführt, um deren Phänotyp zu bewerten, einschließlich unterschiedlicher Differenzierungszustände, d. h. Naïve (CD45RA+CD62L+), Zentralgedächtnis (CM, CD45RA-CD62L+), Effektorspeicher (EM, CD45RA-CD62L-) und Effektorspeicher CD45RA-positiv (EMRA, CD45RA+CD62L-; Ergänzende Abbildung 1A-B).

  1. Sammle 3 x 10 Zellen mit5 Zellen pro Färberohr. Waschen Sie die Zellen in 1x PBS mit 1 % FBS (PBS-F), zentrifugieren Sie bei 300 x g für 5 Minuten und suspendieren Sie das Zellpellet in 50 μL Antikörpermischungslösung, die in einem Färbepuffer (1 Teil Brilliant Farbpuffer und 1 Teil PBS-F) hergestellt wird, entsprechend dem gewünschten Färbepanel (Tabelle 1 und Tabelle 2).
  2. Inkubieren Sie die Zellen 20 Minuten bei 4 °C vor Licht geschützt, reinigen Sie dann die gefärbten Zellen und zentrifugieren. Wenn ein zweiter Färbungsschritt erforderlich ist, führen Sie die Färbung mit der spezifischen Antikörpermischung durch, wie zuvor beschrieben (Schritt 5.1).
  3. Abschließend werden Zellen gewaschen und mit einem Viability-Farbstoff, hier Fixable Viability Stain 780 (FVS780), in 50 μL 1x PBS, 15 Minuten bei 4 °C vor Licht inkubiert. Ein Waschschritt ist nach der Viabilitätsfarbung nicht erforderlich. Nach der Inkubation werden 200 μL 1x PBS zu jeder Probe hinzugefügt und mit der Flowzytometrie aufgenommen. Eine detaillierte Gating Strategie ist in der ergänzenden Abbildung 1A-B dargestellt.
ZielKlonenFluorochromKonzentration/VerdünnungZweck
Erster BeichtschrittrhCD19-His//2 μg/mLCAR-Moleküldetektion
Brutzeit bei 4 °C für 20 Minuten
Waschstufe
Zweiter BeichtschrittSeineGG11-8F3.5.1PE1/50CAR-Moleküldetektion
CD3UCHT1BV5101/40Abstammung
CD4SK3BV6501/40Abstammung
CD8RPA-T8BV4211/20Abstammung
CD45RAHI100PerCP-Cy5.51/83Reifung
CD62LDREG-56FITC1/10Homing, Aktivierung
Brutzeit bei 4 °C für 20 Minuten
Waschstufe
Dritter BeichtschrittFVS780//1/5000Diskriminierung von lebenden/toten Zellen
Inkubation bei 4 °C für 15 Minuten

Tabelle 1: Antikörperpanel zur Färbung von CAR-T-Zellen. Färbepanel zur Bewertung der CAR-Expression, des T-Zell-Phänotyps und des Differenzierungsstatus. Antikörperklon, Konzentration und konjugiertes Fluorochrom für jedes interessierte Ziel werden gemeldet.

ZielKlonenFluorochromVerdünnungZweck
Erster BeichtschrittCD56HCD56PE1/40Abstammung
NKG2D1D11APC1/83Aktivierung
CD3UCHT1BV5101/40Abstammung
CD4SK3BV6501/40Abstammung
CD8RPA-T8BV4211/20Abstammung
CD45RAHI100PerCP-Cy5.51/83Reifung
CD62LDREG-56FITC1/10Homing, Aktivierung
Brutzeit bei 4 °C für 20 Minuten
Waschstufe
Zweiter BeichtschrittFVS780//1/5000Diskriminierung von lebenden/toten Zellen
Inkubation bei 4 °C für 15 Minuten

Tabelle 2: Antikörperpanel zur Färbung von CIK-Zellen. Färbepanel zur Bewertung von CIK-Subpopulationen, Phänotyp und Differenzierungsstatus. Antikörperklon, Konzentration und konjugiertes Fluorochrom für jedes interessierte Ziel werden gemeldet.

6. Bewertung der spezifischen zytotoxischen Aktivität von CAR-T- und CIK-Zellen.

HINWEIS: Die zytotoxische Aktivität von CAR-T- und CIK-Zellen wird gemessen, indem sie mit Zielzellen im gewünschten Effektor-Ziel-Verhältnis (E:T) kokultiviert werden. Die Art des Tests hängt vom Typ der Zielzellen ab, ob sie aus soliden Tumoren oder hämatologischen Malignitäten stammen. In diesem Protokoll beschreiben wir einen fluoreszierenden, farbstoffbasierten Durchflusszytometrie-Test für Suspensionszellen und einen impedanzbasierten Real-Time Cell Analysis (RTCA)-Test für adhärente Zellen.

  1. Fluoreszierende Zellfarbstoff-basierte Durchflusszytometrie-Prüfung
    HINWEIS: Antigenspezifische Zytotoxizität gegenüber hämatologischen Malignitäten kann mit einem fluoreszierenden Zellstoff-basierten Durchflusszytometrie-Test untersucht werden. Vor der Kokultivierung werden Zielzellen mit einem fluoreszierenden Farbstoff markiert, um ihre Identifikation zu ermöglichen. Nach Kokultivierung mit Effektorzellen wird der Ziel-Zelltod durch Färbung mit einem Viabilitätsfarbstoff beurteilt. Die Flowzytometrie ermöglicht die Quantifizierung des antigenspezifischen Killings basierend auf dem Anteil nicht lebensfähiger fluoreszierender Farbstoff-positiver Zellen.
    1. Für jede Kokulturbedingung werden 2 x 105 Zielzellen gesammelt und in 400 μL vollständigen Kulturmedium neu suspendiert, um eine Endkonzentration von 5 x 105 Zellen/ml zu erreichen. Fluoreszierende Farbstoffe mit einer Endkonzentration von 5 μM hinzufügen (hier Cell Trace Violet Farbstoff, CTV). Inkubieren Sie 30 Minuten bei 37 °C, geschützt vor Licht. Nach der Inkubation werden die Zellen einmal mit vollständigem Medium gewaschen und das Pellet mit einer Endkonzentration von 4 x 105 Zellen /ml wieder suspendiert.
    2. Dosieren Sie 500 μL der gefärbten Zielzellsuspension (hier 2 x 10mm Raji-Zellen als CD19+ -Suspensionszielzellmodell) in saubere 5-mL-Röhren gemäß dem experimentellen Aufbau. Erfolgreiche Färbung durch Durchflusszytometrie bestätigen, indem Zielzellen als Zellen identifiziert werden, die positiv auf den fluoreszierenden Farbstoff sind (SSC-A versus CTV). Etwa 98 % der fluoreszierenden Farbstoff-positiven Zellen werden empfohlen.
    3. Parallel zählen und bereiten Sie Effektorzellen (hier 5 x 106 CD19 CAR-T-Zellen) für jede Kokulturbedingung vor. Waschen Sie die Zellen und suspendieren Sie sie in einem vollständigen Kulturmedium in der passenden Konzentration, um das gewünschte Effektor-Ziel-Verhältnis (E:T) zu erreichen. Fügen Sie 500 μL der Effektorzellsuspension zu jedem entsprechenden Rohr mit Zielzellen hinzu.
      1. Um ein Verhältnis von 25:1 E:T zu erreichen, fügen Sie 5 x 106 Effektor CD19 CAR-T-Zellen zu 2 x 10 Raji Zielzellen in jede Röhre hinzu und bereiten so viele Röhren vor, wie es das experimentelle Design benötigt.
    4. Inkubieren Sie die Kokulturen 6 Stunden lang bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 %CO2. Fügen Sie eine Kontrollbedingung ein, die nur Zielzellen enthält, um den spontanen Zelltod zu messen. Diese Kontrolle ist wichtig, um Hintergrundtod von effektorzellspezifischer Zytotoxizität zu unterscheiden.
    5. Waschen Sie die kokultivierten Zellen und färben Sie sie mit FVS780 Vitalitätsfarbe, verdünnt in 1x PBS (Endverdünnung 1:5000). Inkubieren Sie 15 Minuten bei 4 °C, geschützt vor Licht. Waschen Sie die Zellen und suspendieren Sie das Endzellpellet in 600 μL PBS-F-Puffer. Fahren Sie mit der Durchflusszytometrie fort, um die Zytotoxizität der Effektorzelle zu bewerten.
      1. Führen Sie die Durchflusszytometer-Gating-Strategie wie folgt durch: Identifizieren Sie Zielzellen als Zellen, die positiv auf den fluoreszierenden Farbstoff stehen (SSC-A versus CTV), und berechnen Sie dann innerhalb dieser Population den Prozentsatz der toten Zielzellen (SSC-A vs. FVS780, ergänzende Abbildung 1C). Berechnen Sie die spezifische Lysis, indem Sie den spontanen Zielzelltod (%FVS780+ innerhalb CTV+ in der Ziel-only-Bedingung) von der effektorzellspezifischen Zytotoxizität (%FVS780+ innerhalb von CTV+ in der Effektor-Ziel-Kokultur-Bedingung) subtrahieren.
  2. Echtzeit-Zellanalyse-(RTCA)-Assay
    HINWEIS: Der RTCA-Test ist eine Methode zur Bewertung der zytotoxischen Aktivität von Effektorzellen gegenüber adhärenten Zielzellen26. Der Tod der Zielzelle wird als Unterschied im Impedanzsignal erkannt, da Zellen von der E-Platte, die im xCELLigence-Gerät eingeschaltet ist, abgelöst werden. Führen Sie den RTCA-Test nach dem vom Hersteller empfohlenen Protokoll durch, um optimale Testleistung und Reproduzierbarkeit sicherzustellen.
    1. Die Subkultur zielt auf die Zellen einen Tag vor dem Assay (Tag -1), um sicherzustellen, dass sie bis Tag 0 eine Konfluenz von 60%-80% erreichen. Dieser Schritt ist entscheidend, um die Zellen zu Beginn des Experiments in aktiver Proliferation aufrechtzuerhalten. Es wird bevorzugt, Zielzellen zwischen Passagen 5 und 20 zu verwenden, mit mindestens einer Woche (3-4 Passagen) nach dem Tauwetter, um eine optimale Zellleistung zu gewährleisten.
    2. Am Tag 0 fügen Sie vorsichtig 50 μL Kulturmedium in jede Welle der E-Platte hinzu, aktivieren Sie die Platte im Gerät und nehmen Sie das Hintergrundsignal auf. Dann wird die Platte für den Aussaatschritt der Zelle zurück in die Haube übertragen.
    3. Zählen Sie Zielzellen und übertragen Sie die erforderliche Gesamtzahl in ein sauberes Rohr. Cellen werden in einem geeigneten Volumen des Kulturmediums wieder suspendiert, um die gewünschte Konzentration für die Aussäung in die E-Platte zu erreichen, und 100 μL Zielzellen in jedes Bohrloch übertragen (hier 4 x 104 MCF-7-Zellen als adhärentes Tumorzelllinienmodell). Bewahren Sie die Platte im Inneren der Haube mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur auf, um eine gleichmäßige Anhaftung der Zielzellen sicherzustellen. Die Platte im Inneren des Geräts wird bei 37 °C in einem CO2-Inkubator aktiviert und mit der Echtzeitaufnahme begonnen (Aufnahmeintervall von 15 Minuten für 22 Stunden).
      HINWEIS: Führen Sie die Titration der Zielzelle vor der Verwendung einer neuen Zielzelllinie vor, wie vom Hersteller empfohlen.
    4. Am ersten Tag (etwa 20–22 Stunden nach der Aussaatung der Zielzelle) werden die Effektorzellen gezählt und in frischem Kulturmedium wieder suspendiert, wobei die Zellkonzentration angepasst wird, um das gewünschte Effektor-Ziel-Verhältnis (E:T) zu erreichen. Um beispielsweise ein 10:1 E:T-Verhältnis zu erreichen, fügen Sie 4 x 105 Effektor-CIK-Zellen zu 4 x 104 MCF-7 Zielzellen pro Bohrloch hinzu.
    5. Bereiten Sie jede Behandlungsbedingung in technischen Duplikaten mit einer sterilen 96-Well-U-Bodenplatte vor und gleichen Sie sie 15 Minuten lang bei 37°C aus. Dosieren Sie 50 μL der Effektorzellensuspension für jede Bedingung mit einer Mehrkanalpipette. Setzen Sie die E-Platte zurück ins Instrument und setzen Sie die Echtzeitaufnahme fort (Aufnahmeintervall von 15 Minuten für 24 Stunden). Berechnen Sie die spezifische Lysis mit folgender Gleichung:
      Gleichung 1

Ergebnisse

Das hier beschriebene Protokoll bietet einen effizienten und robusten Arbeitsablauf für die ex vivo Expansion und Entwicklung von Effektorzellen aus isolierten PBMCs, nämlich CAR-T- und CIK-Zellen. Diese Methode erfordert nur minimale Zellmanipulation und nutzt die Gasaustauschkapazität von G-Rex-Geräten, wodurch sie eine überlegene Nährstoffverfügbarkeit und Sauerstoffversorgung im Vergleich zu herkömmlichen statischen Kultursystemenbietet 23,24. Ein wesentlicher Vorteil dieses Protokolls ist seine inhärente Skalierbarkeit von kleinen 24-Well-Geräten (G-24), geeignet für präklinische Studien, bis hin zu größeren 6M-Geräten (G-6M), die mit translationalen oder klinischen Fertigungsanforderungen kompatibel sind und ohne Änderungen am Protokoll außer proportionaler Skalierung erforderlich sind.

Mit diesem Protokoll wurden sowohl CAR-T- als auch CIK-Zellen erfolgreich parallel aus gesunden Spender-PBMCs in den Formaten G-24 und G-6M erweitert, wie in den Abschnitten 2-4 beschrieben. Am Ende der Kulturperiode zeigten beide Zelltypen eine hohe Faltenerweiterung und -lebensfähigkeit mit vergleichbarer Proliferation zwischen den beiden Geräteformaten (Abbildung 2, Ergänzende Tabelle 1, Ergänzende Tabelle 2), was die Reproduzierbarkeit des Protokolls über verschiedene Kulturskalen hinweg unterstreicht.

Um die Skalierbarkeit der Kulturgeräte zu validieren, wurden die Effektorzellen phenotypisch und funktional weiter charakterisiert. Für die CD19 CAR-T-Zellen quantifizierten wir die CAR-Expression und bewerteten die CD4+- und CD8+-Teilmengen, wobei wir eine Überwiegung von CD19 CAR+ CD8+ T-Zellen feststellten (Abbildung 3A-B, ergänzende Tabelle 1). Für CIK-Zellen bewerteten wir die Häufigkeit der T-Populationen (CD3+CD56-), NK (CD3-CD56+) und CIK (CD3+CD56+) (Abbildung 3D) sowie die Expression des aktivierenden Rezeptors NKG2D (Abbildung 3E, ergänzende Tabelle 2). Darüber hinaus beobachteten wir insgesamt vergleichbare Phänotypen und Expression spezifischer Populationsmarker zwischen den G-24- und G-6M-Kulturformaten für sowohl CAR-T- als auch CIK-Zellen. Der Differenzierungsstatus sowohl der CD19 CAR-T- als auch der CIK-Zellprodukte wurde mittels CD62L- und CD45RA-Färbung analysiert (Abbildung 3C-F, Ergänzungstabelle 1, Ergänzende Tabelle 2), die ähnliche Gedächtnis- und Effektorphänotypen zwischen Zellen zeigte, die in G-24- und G-6M-Formaten kultiviert wurden. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Skalierung des Prozesses weder die phänotypische Integrität noch den Differenzierungsstatus der erweiterten Effektorzellpopulationen beeinträchtigt.

Schließlich haben wir zur Bewertung der funktionellen Potenz zielspezifische Zytotoxizitätstests eingesetzt. Sowohl CD19 CAR-T- als auch CIK-Zellen, die in einem der beiden Geräte expandierten, zeigten eine starke zytolytische Aktivität, was die Erhaltung funktioneller Eigenschaften über die gesamte Skala hinweg bestätigt (Abbildung 4). Insgesamt unterstützen diese Ergebnisse die Eignung der erweiterten Produkte für nachgelagerte Anwendungen in präklinischen Modellen und möglicherweise klinische Tests.

Abbildung 2
Abbildung 2: Proliferation und Lebensfähigkeit von CD19 CAR-T- und CIK-Zellen. CAR-T-Zellen (n = 5) und CIK-Zellen (n = 6), die aus PBMCs in G-24- und G-6M-Platten expandiert wurden, wurden an Tag 9 bzw. Tag 14 der Expansion entnommen, um die Zellzählung durchzuführen und den (A-C)-Faltenzuwachs sowie den (B-D) Anteil lebensfähiger Zellen zu bewerten. Histogramme stellen den Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dar, und Punkte zeigen einzelne Spender an (siehe Ergänzende Tabelle 1 und Ergänzende Tabelle 2 für einzelne Werte). Die Daten wurden mit einem zweiseitigen, mehrfachpaarigen t-Test (A-C) oder einem mehrseitigen Wilcoxon-Matched-Pairs-Rank-Test (B-D) analysiert, mit Holm-Sidak-Korrektur für mehrere Vergleiche (*p < 0,05). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3
Abbildung 3: Bewertung des Phänotyps von CD19 CAR-T- und CIK-Zellen, die in G-24- und G-6M-Geräten erweitert wurden. Die Expression von CAR-Molekülen auf CD19 CAR-T-Zellen (n = 5) wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert, um (A) die Transduktionseffizienz in den G-24- und G-6M-Expansionsprotokollen sowie die Expression von (B) CD4+/CD8+ und (C) naiven/Gedächtnissubpopulationen in der CD3+CAR+-Subgruppe zu bewerten. Der Phänotyp von Bulk-CIK-Zellen (n = 6) wurde mittels Flusszytometrie analysiert, um (D) den Prozentsatz von CIK (CD3+CD56+), NK (CD3-CD56+) und T (CD3+CD56-) sowie die Expression von (E) NKG2D und (F) naiver/Speicher-Subpopulation in der CD3+CD56+-Teilmenge (G-24 n=5, G-6M n=6) zu untersuchen. Naïve (CD45RA+CD62L+), Zentralspeicher (CM, CD45RA-CD62L+), Effektorspeicher (EM, CD45RA-CD62L-) und Effektorspeicher CD45RA-positiv (EMRA, CD45RA+CD62L-). Histogramme stellen die mittlere Expression ± SD dar, und Punkte zeigen einzelne Spender an (siehe Ergänzende Tabelle 1 und Ergänzende Tabelle 2 für einzelne Werte). Die Daten wurden mit einem zweiseitigen multiplen gepaarten t-Test (B-C-D-F) oder einem zweiseitigen Wilcoxon-Matched-Rank-Test (A-E) analysiert, mit Holm-Sidak-Korrektur für Mehrfachvergleiche (*p < 0,05). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4
Abbildung 4: Bewertung der Zytotoxizität von CD19 CAR-T und CIK-Zellen. (A) Die spezifische Lyse von CD19-CAR-T-Zellen (orange, n = 5) oder untransducierten (UTD) Zellen (grau, n = 5) gegen die Burkitt-Lymphom-Raji-Zelllinie (als Suspensionszelllinienmodell) wurde durch einen 6-Stunden-Durchflusszytometrie-basierten Killing-Test durchgeführt. Die Ergebnisse werden als mittlere spezifische Lyse ± SD dargestellt. (B) Die Zytotoxizität von CIK-Zellen, die entweder in G-24 (hellblau, n = 7) oder G-6M (dunkelblau, n=6) gegen die Brustkrebs-MCF-7-Zelllinie (als adhärentes Zelllinienmodell) kultiviert wurden, wurde alle 15 Minuten über 24 Stunden mit einem Echtzeit-Zellanalysator überwacht. Die Ergebnisse werden als mittlere spezifische Lyse ± SEM dargestellt. Die Daten wurden mit dem Mann-Whitney-Test analysiert, Holm-Sidak-Korrektur für Mehrfachvergleiche (*p < 0,05). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergänzende Abbildung 1: Gating-Strategie für Flowzytometrie-Analysen. Repräsentative Diagramme, die die Gating-Strategien für (A) die phänotypische Charakterisierung von CAR-T-Zellen und (B) CIK-Zellphänotypisierung sowie (C) fluoreszierende, farbstoffbasierte Zytotoxizitätstests veranschaulichen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 1: Wachstum, Lebensfähigkeit und Phänotyp von CD19 CAR-T-Zellkulturen von einzelnen Spendern. Gesamtzellanzahl, Faltenzunahme, Lebensfähigkeit und phänotypische Charakterisierung der CD19-CAR-T-Zellen, die am 9. Tag der Kultur in G-24- und G-6M-Geräten entnommen wurden, werden für jeden Spender gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 2: Wachstum, Lebensfähigkeit und Phänotyp von CIK-Zellkulturen von einzelnen Spendern. Gesamtzellanzahl, Faltenzuwachs, Viabilität und phänotypische Charakterisierung der am Tag 14 der Kultur in G-24- und G-6M-Geräten entnommenen CIK-Zellen werden für jeden Spender gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt die Implementierung einer effizienten und skalierbaren Plattform zur Erzeugung von zwei verschiedenen ACT-Produkten, nämlich CAR-T und CIK-Zellen, aus PBMCs mit G-Rex-Kultursystemen. Wir haben funktionale und phänotypische Proof-of-Concept-Tests implementiert, um die Skalierbarkeit des Ansatzes zu validieren. Wir zeigten, dass sowohl der Phänotyp als auch die Aktivität der erweiterten Zellen während der Skalierung erhalten bleiben, was die Systemtauglichkeit für Forschungsanwendungen und direkte klinische Translation sicherstellt. Tatsächlich konnten wir erfolgreich demonstrieren, dass sowohl CAR-T- als auch CIK-Zellen effizient mit hoher Zellausbeute expandiert werden können, während ein funktioneller Effektor-Phänotyp und eine starke antigenspezifische Zytotoxizität über verschiedene Kulturgeräte erhalten bleiben.

In Kombination mit der gasdurchlässigen Membrantechnologie der Kulturvorrichtungen führt dieses Expansionsprotokoll zu einer schnelleren Expansionskinetik, reduziert die manuelle Handhabung und ermöglicht konstant hohe Erträge zwischen den Spendern. Diese Merkmale machen das Protokoll im Vergleich zu Standardkultursystemen hochreproduzierbar und weniger arbeitsintensiv, was oft mehrere Medienaustausche und ein erhöhtes Risiko für Zellverlust und Kontamination beinhaltet.

Darüber hinaus ermöglicht dieses Protokoll einen nahtlosen Übergang über Fertigungsmaßstäbe hinweg: von kleinmaßstäblichen offenen Systemen (G-24, geeignet für präklinische Forschung und Screening, zum Beispiel von CAR-Konstrukten, Zytokinkombinationen oder Spendervariabilität) über größere offene Systeme (G-6M, für die Pre-GMP-Validierung) und schließlich zu größeren geschlossenen Systemen (für GMP-Produktion). Wie in dieser Studie beschrieben, erfordert der Übergang von kleinen zu großräumigen offenen Systemen nur proportionale Anpassungen von Volumen und Zelleingaben in Bezug auf die Gerätegröße, was einen erheblichen praktischen Vorteil darstellt. Ebenso ist die einzige Implementierung, die für den Übergang von offenen zu geschlossenen Systemen für die GMP-Herstellung und damit zur Anpassung des G-6M-Protokolls an die großflächige GMP-Produktion erforderlich ist, die Verwendung geeigneter GMP-Qualitätsreagenzien und geschlossener Systembauelemente (G-10M-CS mit einer Oberfläche von 10 cm², entsprechend einem einzelnen G-6M-Bohrloch, oder G-100M-CS mit einer Oberfläche von 100 cm², entsprechend dem offenen Gegenstück G-100M) ohne weitere Änderungen am Protokoll selbst. Diese geschlossenen Geräte unterscheiden sich von ihren offenen Gegenstücken durch die Integration steriler Rohranschlüsse für die automatisierte Medienhandhabung, die zusammen mit einer Flüssigkeitshandhabungspumpe (GatheRex) eine vollständig geschlossene Umgebung schaffen. Dieser geschlossene Systemansatz eliminiert manuelle Medienaustausche und reduziert das Kontaminationsrisiko, wodurch er ideal für GMP-konforme Fertigungsumgebungen geeignet ist, in denen Sterilität und Reproduzierbarkeit von größter Bedeutung sind. Bemerkenswert ist, dass Skalierbarkeit ein entscheidendes Merkmal darstellt, um die Lücke zwischen Frühphasenentdeckung und klinischer Übersetzung zu überbrücken, insbesondere in akademischen oder frühen Biotech-Bereichen mit begrenzten Ressourcen.

Eine weitere Umsetzung dieses Protokolls zur vollständigen GMP-Konformität sollte den Übergang von FBS-haltigen Medien zu serumfreien/xeno-freien Formulierungen in Betracht ziehen, im Einklang mit den aktuellen regulatorischen Trends von FDA und EMA, um Batch-zu-Charge-Variabilität zu eliminieren, potenzielle xenogene Kontaminationsrisiken zu beseitigen und die regulatorische Einhaltungzu verbessern 27.

Darüber hinaus bietet die minimale Intervention, die durch das vorgeschlagene Expansionssystem erforderlich ist, eine ideale Grundlage, um multidimensionales phänotypisches Profiling28 umzusetzen, indem prozedurinduzierte Artefakte reduziert werden, die die phänotypische Analyse während der Herstellungsprozesse erschweren könnten. Darüber hinaus könnte das System über CAR-T- und CIK-Zellen hinaus sehr anpassungsfähig an andere Lymphozytenpopulationen und manipulierte Immunzellen sein, was seine Nützlichkeit inder Entwicklung von Immuntherapien erweitert.

Obwohl das Protokoll robust ist und keine Änderungen erfordert, sind einige Schritte besonders entscheidend für den Erfolg. Für die Expansion von CIK-Zellen ist der Zeitpunkt der Zytokinzugabe entscheidend, um eine optimale Differenzierung und Expansion zu gewährleisten. Bei CAR-T-Zellen sollte die Transduktion 24 Stunden nach der Aktivierung erfolgen, um die Effizienz zu maximieren, und lentivirale Aliquoten sollten nur einmal aufgetaut werden, da wiederholte Gefrier-Tau-Zyklen die Transduktionseffizienzsignifikant um 31 reduzieren.

Die biologische Variabilität zwischen primären Zellpräparaten trägt natürlich zu Unterschieden in Expansionsraten und funktioneller Aktivität bei und spiegelt die Vielfalt der Spender wider. Diese unvermeidliche und intrinsische Variabilität kann effektiv durch parallele Erweiterungen mehrerer Spender gesteuert werden, um robuste und reproduzierbare Ergebnisse über Experimente hinweg zu gewährleisten.

Zusammenfassend ermöglicht dieses Protokoll eine schnelle, skalierbare und zuverlässige Expansion funktioneller Effektorlymphozyten direkt aus PBMCs und bietet Flexibilität sowohl für die Forschung in der Frühphase als auch für groß angelegte klinische Übersetzungen. Dieses System lässt sich leicht an verschiedene Zelltypen und genetische Modifikationen anpassen und bietet eine vielseitige Plattform für die Entwicklung von Immuntherapien.

Danksagungen

Der CAR-Bau wurde im Rahmen der MTA vom St. Jude Children's Research Hospital bereitgestellt. Diese Arbeit wurde durch den ScaleReady G-Rex Grant 2025 unterstützt; Universität Padua – SOMMAGGIO_BIRD24_01; AIRC Foundation unter 5x1000 2019 - ID. 22759 Programm; Alleanza Contro il Cancro, Progetto CAR-T_2 RCR-2023-23684268. Diese Forschung erhielt eine "Ricerca Corrente"-Förderung vom italienischen Gesundheitsministerium zur Deckung der Publikationskosten. Die Figuren wurden mit der GraphPad Prism 9 Software und BioRender.com erstellt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Brilliant Stain BufferBD Biosciences566349
CD28 Antikörper, anti-menschlichMiltenyi Biotech130-093-375Klon 15E8
CD3-Antikörper, anti-menschlichMiltenyi Biotech130-093-387Klon OKT3
CD3 BV510BD Biosciences740147Klon UCHT1
CD314 APC (NKG2D)Biolegende320808Klon 1D11
CD4 BV650BD Biosciences563875Klon SK3
CD45RA PerCP-Cy5.5BD Biosciences563429Klon HI100
CD56 PEBiolegende318306Klon HCD56
CD62L FITCBD Biosciences555543Klon FREG-56
CD8 BV450BD Biosciences562428Klon RPA-T8
CellTrace Violett Zellproliferations-KitThermoFisher wissenschaftlichC34557
Dimethylsulfoxidid (DMSO)ThermoFisher wissenschaftlichD2650
Dulbecco′ s phosphatgepufferte Kochsalzlösung (D-PBS)Sigma AldrichD5652
E-Kennzeichen 16Agilent5469813001
Fetales Rinderserum (FBS), WertThermoFisher ScientificA5256701
Fixable Viability Stain 780 (FVS780)BD Biosciences565388
G-Rex 24 Brunnenplatten Wilson Wolf80192M
G-Rex 6M Bohrlochplatten Wilson Wolf80660M
HEPES-PufferlösungLonzaECM0180D
Sein AntikörperMiltenyi Biotech130-120-718
Menschliches Albumin 20 %CSL Behring
Humanes IL-15 Rekombinantes ProteinPeproTech200-15
Humanes rekombinantes IL-7-ProteinPeproTech200-07
LSRFortessa X-20BD Biosciences
LymphoprepSTEMCELL-Technologien18060
MCF-7ATCCHTB-22Brustkrebszelllinie 
Penicillin und StreptomycinLonzaECB3001D
Physiologische Lösung (0,9 % Natriumchlorid)Monico
ProtaminsulfatSigma AldrichP3369
RajiATCCCCL-86Burkitt-Lymphomzelllinie 
Rekombinantes menschliches IFN-gammaR& D-Systeme285-IF-100/CF
Rekombinant IL-2 (Proleukin)Novartis
rhCD19-HisInvitrogenA42607
Roswell Park Gedenkinstitut 1640 (RPMI-1640)EurocloneECB9006L
Stabiles L-GlutaminLonzaECB3004D
Trypan-Blau-LösungSigma AldrichT8154
xCELLigence Echtzeit-ZellanalyseAgilent
X-VIVO 15 Serumfreies hämatopoietisches ZellmediumLonza02-053Q

Referenzen

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