Verwendung von Gleichungen zur Schätzung der Vitamin-A-Gesamtspeicher mit stabilen Isotopmethoden

Zusammenfassung

Das Protokoll beschreibt Gleichungen zur Schätzung der Vitamin-A-Totalkörperspeicher (TBS) mittels Retinolisotopen-Verdünnungsmethodik, und es wird ein kurzer Überblick über die Anwendung modellbasierter kompartimentaler Analyse mit einem Super-Subject-Studiendesign zur Schätzung von Gruppen- und Einzel-TBS präsentiert.

Zusammenfassung

Stabile Isotopenmethoden zur quantitativen Abschätzung der Vitamin-A-Gesamtspeicher (TBS) basieren auf dem Prinzip der Isotopenverdünnung. Kurz gesagt wird einer Person eine einzige orale Dosis ²H- oder ¹³C-markiertes Vitamin A verabreicht, und die Plasmakonzentrationen von markiertem und unmarkiertem Retinol werden mittels Massenspektrometrie zu einem vorgegebenen Zeitpunkt nach der Dosierung, üblicherweise 14–21 Tage, gemessen. TBS wird mit der Retinol-Isotopen-Verdünnungsgleichung (RID) oder der Massenbilanzgleichung berechnet. Die RID- und Massenbilanzgleichungen erfordern Informationen zur retinolspezifischen Aktivität im Plasma (SA_p; d. h. Tracer-zu-Tracee-Verhältnis), die aus Massenspektrometriemessungen gewonnen werden. Beide Gleichungen benötigen Koeffizientenwerte, um die Absorption und Speicherung der oralen Dosis stabiles, isotopenmarkierten Retinols zum Zeitpunkt der TBS-Schätzung zu berücksichtigen. Veröffentlichte Werte für die Koeffizienten können in den Gleichungen verwendet werden. Alternativ kann TBS durch modellbasierte kompartimentale Analyse von Plasma-Retinol-Kinetikdaten mit WinSAAM-Software für Simulation, Analyse und Modellierung bestimmt werden. Kurz gesagt kann ein Super-Subjekt-Studiendesign mit modellbasierter kompartimentaler Analyse der kinetischen Daten von Plasmaretinol verwendet werden, um Gruppen-TBS und populationsspezifische Werte für den zusammengesetzten Koeffizienten (FaS) zu bestimmen, der anschließend in der RID-Gleichung zur Bestimmung des einzelnen TBS verwendet wird. Das Design des Super-Subjekts erfordert eine Schätzung der durchschnittlichen Vitamin-A-Aufnahme der Ernährungsmenge für die Teilnehmergruppe sowie Blutproben zu ~11–16 Zeitpunkten über ~28–91 D, mit 5–7 Teilnehmern pro Zeitpunkt, aber jeder Teilnehmer liefert nur 2–3 Blutproben. Die Vitamin-A-Konzentration der Leber kann anhand von TBS geschätzt werden, wobei man anhand des Anteils an TBS in der Leber und einer Schätzung des Lebergewichts annimmt. Der Vitamin-A-Status wird bewertet, indem die geschätzte Vitamin-A-Konzentration der Leber mit vorgeschlagenen Grenzwerten verglichen wird, um den Status über das gesamte Kontinuum hinweg zu kategorisieren, von Mangel bis zu überschüssigen Vitamin-A-Speichern.

Einleitung

Stabile Isotopenmethoden liefern eine quantitative Schätzung der Vitamin-A-Gesamtspeicher (TBS) und können verwendet werden, um den Vitamin-A-Status von Kindern und Erwachsenen in Gemeinschaftsumgebungen zu bewerten¹. Da sie eine quantitative Schätzung der TBS über das gesamte Kontinuum des Statuses liefern, von Mangels bis Überschuss, gelten sie als die besten indirekten Methoden zur Beurteilung des Vitamin-A-Status beim Menschen¹. Im Gegensatz dazu werden Serumkonzentrationen von Retinol oder Retinolbindungsprotein häufig zur Statusbeurteilung verwendet; sie spiegeln jedoch die Vitamin-A-Körpervorräte nicht wider, es sei denn, die Vorräte sind sehr gering, da Serumretinol unter homöostatischer Kontrolle steht; Außerdem nehmen sie während der Entzündung vorübergehend ab, was die Interpretation der Ergebnisse in Populationen mit hohen Infektionsraten erschwert². Der modifizierte relative Dosis-Antwort-Test (MRDR) liefert eine Schätzung der Angemessenheit der Vitamin-A-Reserven in der Leber, liefert jedoch keine quantitative Schätzung der Vitamin-A-Konzentration² in der Leber. Im Allgemeinen werden stabile Isotopenmethoden verwendet, um den Vitamin-A-Stoffwechsel zu untersuchen und die Wirkung von Vitamin-A-Interventionen in Populationen mit Mangel zu schätzen 3,4,5,6,7,8,9,10. Sie sind auch nützlich, um das Risiko übermäßiger Vitamin-A-Vorräte in Bevölkerungsgruppen zu bewerten, die mehreren Vitamin-A-Quellen ausgesetzt sind, wie angereicherte Lebensmittel, hochdosierte Vitamin-A-Präparate und/oder Mikronährstoffpulver ^1,11. Diese Anwendungen sind wichtig, um den Vitamin-A-Stoffwechsel im gesamten Lebenszyklus besser zu verstehen, den Vitamin-A-Bedarf zu verbessern und die Wirksamkeit sowie Sicherheit von Vitamin-A-Interventionen zu bewerten, die darauf abzielen, Ernährung und Gesundheitsergebnisse bei Kindern und Frauen im gebärfähigen Alter in ressourcenarmen Gemeinschaften zu verbessern. TBS wird mittels der Retinolisotopen-Verdünnungsmethode (RID) und entweder der RID-Gleichung oder der Massenbilanzgleichung geschätzt. Alternativ kann TBS durch modellbasierte kompartimentale Analyse von Plasmaretinol-Kinetikdaten mit WinSAAM Simulation, Analysis, and Modeling Software (www.winsaam.org) mit einem Super-Subject-Design¹² geschätzt werden. Kurz gesagt erfordern diese Methoden 1) die Verabreichung einer einzigen oralen Dosis stabilen Isotop-markierten Vitamin A an die Teilnehmer, 2) die Entnahme von 1–2 Blutproben ~14–21 Tage nach der Isotop-Verabreichung für RID-Methoden (oder die Entnahme von 2–3 Blutproben pro Teilnehmer über 28–91 Tage sowie eine Schätzung der durchschnittlichen Vitamin-A-Aufnahme der Gruppe für modellbasierte kompartimentale Analysen), und 3) Zugang zu einem geeigneten Massenspektrometer (GC-C-IRMS, GC/MS, LC/MS/MS) zur Messung der Plasmakonzentrationen von markiertem und unmarkiertem Retinol.

Dieses Protokoll soll neuen Anwendern der RID-Methodik Orientierung geben, wie TBS entweder mit der RID-Gleichung oder der Massenbilanzgleichung berechnet werden kann. Zusätzlich wird ein kurzer Überblick über den Einsatz modellbasierter kompartimentaler Analyse mit einem Super-Subject-Studiendesign präsentiert, um die TBS für eine Gruppe von Studienteilnehmern und für einzelne Teilnehmer zu schätzen; Details zur kompartimentalen Modellierung von kinetischen Daten aus Plasmaretinol liegen jedoch außerhalb des Rahmens dieses Manuskripts (weitere Informationen zu diesem Ansatz finden Sie unter Green et ^al.12). Für einen Überblick über Vitamin-A-Methoden der stabilen Isotope siehe Lietz et ^al.1.

RID-Gleichung zur Schätzung von TBS
Die RID-Gleichung wird verwendet, wenn einer Person eine orale Dosis stabiles, isotop-markiertes Vitamin A verabreicht wird, und LC/MS/MS oder GC/MS zur Messung von markiertem und unmarkiertem Retinol im Plasma zur Bestimmung der retinolspezifischen Aktivität im Plasma (SA_p) (d. h. Tracer-zu-Tracer-Verhältnis im ^{Plasma) zu ermitteln.} Eine einzelne Blutprobe ist ~14–21 Tage nach der Isotopendosierung erforderlich, um TBS mit der RID-Gleichung abzuschätzen. Die unten gezeigte RID-Gleichung wird verwendet, um TBS bei Erwachsenen und Kindern ¹⁵ zu schätzen:

TBS = Fa × S × (1/SA_p)

wobei TBS μmol Vitamin A ist, Fa der Anteil der oralen Tracer-Dosis von Vitamin A, der zum Zeitpunkt t in den Körperspeichern aufgenommen und gefunden wird, und S das Verhältnis der retinolspezifischen Aktivität im Plasma (SA_p) zu der in den Speichern (SA_s) zum Zeitpunkt t ist. SA_p ist die spezifische Aktivität des Plasmaretinols, ausgedrückt als Bruchteil der Dosis im Plasma: (etikettiert Retinol / unlabeled + labeled Retinol) im Plasma / orale Dosis des markierten Retinols (μmol))¹². Beachten Sie, dass der Beitrag von unmarkiertem Retinol zum Gesamtretinol im Nenner 14–21 Tage nach der Isotopendosierung vernachlässigbar ist, wenn TBS üblicherweise geschätzt wird. Für eine ausführliche Diskussion der RID-Gleichung siehe Green et ^al.12.

Da die Koeffizienten Fa und S in der RID-Gleichung multipliziert werden, werden sie üblicherweise als zusammengesetzter Koeffizient FaS bezeichnet. Veröffentlichte Werte für den zusammengesetzten Koeffizienten FaS, basierend auf theoretischen Erwachsenen und Kindern mit einem breiten Spektrum an TBS, sind nach der Isotopendosierung mehrfach verfügbar (Tabelle 1; adaptiert von Green und Green¹⁵). Diese Werte können in der RID-Gleichung verwendet werden, um das TBS von Individuen aus ähnlichen Populationen^zu berechnen. Alternativ kann modellbasierte kompartimentale Analyse der kinetischen Daten von Plasmaretinol verwendet werden, um populationsspezifische Werte für den zusammengesetzten Koeffizienten FaS ^12,16 zu bestimmen.

Massenbilanzgleichung zur Schätzung von TBS:
Die Massenbilanzgleichung wird verwendet, um TBS zu berechnen, wenn einer Person eine orale Dosis von ¹³C-markierten Vitamin A verabreicht wird, und GC-C-IRMS wird verwendet, um ^{eine 13}C-Anreicherung (¹³C/Gesamt-C) im Serum^10,17 zu messen. Die Massenbilanzgleichung erfordert zwei Blutproben: eine Basisprobe zur Messung der natürlichen Menge von ¹³°C im Serum und eine zweite Probe 14 Tage nach der Dosierung zur Messung der ¹³°C-Anreicherung im Serum. Wenn ein Forscher jedoch daran interessiert ist, die mittlere TBS für eine Gruppe von Personen zu schätzen, kann eine Ausgangsblutungsprobe bei 5–6 Teilnehmern durchgeführt werden, und die mittlere ¹³C-Häufigkeit für diese Personen kann als Schätzung der Ausgangs-13-C-Häufigkeit im Serum für Individuen in der Gruppe verwendet werden. Die natürliche Häufigkeit von ¹³°C beträgt ~1,1 %, aber da dies je nach Ernährung variieren kann, sollte sie zu Beginn genau im Serum gemessen werden, um die ¹³C-Häufigkeit nach der Dosis zu korrigieren, wie in einem Beispiel unter¹⁰ gezeigt. Die Massenbilanzgleichung erfordert Messungen der Isotopenhäufigkeit (¹³C/Gesamt-C) für: 1^{) die Dosis von 13}C-markierten Vitamin A (F_a), 2) Basis-Serumretinol (F_b) und 3) Nachdosis-Serumretinol (F_c). Die Messungen der Isotopenhäufigkeit werden verwendet, um das Verhältnis von Tracer zu Tracere und anschließend TBS zu berechnen. Zusätzliche Faktoren werden in die Gleichung einbezogen, um die Absorption und Speicherung der Dosis von ¹³C-markierten Vitamin A zum Zeitpunkt der TBS-Bewertung zu berücksichtigen. Für eine ausführliche Diskussion der Massenbilanzgleichung siehe Gannon und Tanumihardjo¹⁰.

Die unten gezeigte Massenbilanzgleichung wird verwendet, um TBS bei Erwachsenen oder Kindern zu schätzen:

TBS = a x (1/TTR) x (Faktor für Absorption x Faktor für Speicher)

wobei TTR das Serum-Tracer-zu-Tracee-Verhältnis ist. Der Faktor a berücksichtigt den ^{Verlust des 13}C-markierten Vitamin-A-Tracers zwischen der Dosierung und der Blutentnahme und wird als ^e-kt berechnet, wobei k = ln(2)/Halbwertszeit von Retinol und t = Tage seit^{der Dosierung 10} gilt. Der Absorptionsfaktor der Tracer-Dosis wird bei 0,8–1,0 (80 %–100 %) bei Erwachsenen angenommen, bei 0,75–0,9 (75 %–90 %) bei^{Kindern ab 10} Jahren. Der Speicherfaktor (das Verhältnis von TTR im Serum zu Vorräten) wird mit 0,8 angenommen, wenn die Vitamin-A-Aufnahme in der Ernährung während der 14-tägigen Zeit zwischen Dosierung und Blutentnahme nicht kontrolliert wird, oder 1,0, wenn die Vitamin-A-Aufnahme niedrig und kontrolliert¹⁰ ist.

Schätzung der Vitamin-A-Konzentration der Leber
Die gesamte Leberreserve von Vitamin A kann anhand des in der Leber vorhandenen TBS-Anteils geschätzt werden. Es wird angenommen, dass ~50 % der TBS in der Leber sind, wenn der Vitamin-A-Wert niedrig ist, und ~80 %, wenn der A-Status ausreichend ist; Diese Annahmen basieren auf begrenzten Daten, die zeigen, dass Vitamin A in der Leber als Prozentsatz des gesamten Körpervitamins A vom Vitamin-A-Status abhängt und zwischen ~40 % und 90 % liegen kann^. Weitere Daten werden benötigt, um zu bestimmen, wie man Vitamin A in der Leber als Prozentsatz des gesamten Körpervitamins A besser schätzen kann. Bis dahin können die Informationen in Tabelle 2 nützlich sein, um den Vitamin-A-Status einer Studienpopulation zu schätzen und zu bestimmen, ob ein Wert von 50 % oder 80 % angenommen werden sollte. Wenn die Prävalenz der Serumretinolkonzentrationen <0,7 μmol/L bei Kindern im Alter von 6 bis 59 Monaten ≤10 % beträgt, gilt der Vitamin-A-Status der Bevölkerung als ausreichend; beachten Sie, dass diese Grenze mit der WHO-Kategorie des Vitamin-A-Mangels als leichtes Gesundheitsproblem überschneidet (Tabelle 2)^20,21. Die Vitamin-A-Konzentration der Leber wird anhand der gesamten Leberreserven auf Basis des Lebergewichts berechnet, das auf 3 % des Körpergewichts bei Kindern und 2,4 % des Körpergewichts bei Erwachsenen²² geschätzt werden kann. Alternativ kann das Lebergewicht anhand der Körperoberfläche (BSA) und einer Vorhersagegleichung²³ geschätzt werden.

Überblick über die modellbasierte kompartimentale Analyse mit einem Super-Subjekt-Design zur Schätzung von Gruppen und individuellen TBS
Modellbasierte kompartimentale Analyse kann verwendet werden, um individuelle Retinolkinetik mit häufiger Stichprobe zu untersuchen, hat sich aber besonders in Populationen erwiesen, in denen häufige Stichproben nicht möglich sind, wie etwa bei jungen und vorschulischen Kindern sowie potenziell bei schwangeren und stillenden Frauen in ressourcenarmen Gemeinschaftsumgebungen 11,24,25,26,27 . Die modellbasierte kompartimentale Analyse wird mit einem Super-Subjekt-Studiendesign verwendet, um TBS für die Gruppe der Studienteilnehmer vorherzusagen und populationsspezifische Werte für den zusammengesetzten FaS-Koeffizienten zu schätzen, der dann zur Bestimmung des TBS einzelner Studienteilnehmer mit der RID-Gleichung^12,24 verwendet werden kann. Das Super-Subjekt-Design wird in Gemeinschaftsumgebungen verwendet, um die Anzahl der von jedem Einzelnen entnommenen Blutproben zu minimieren:^{12, 24, 26}. Ein Beispiel für das Design ist in Tabelle 3 für eine 91-tägige Studie mit 105 Probanden und 16 Blutprobenzeiten dargestellt. In diesem Beispiel nimmt jeder Versuchsperson eine einzige orale Dosis des stabilen Isotops mit Vitamin A zu sich und liefert 14 Tage nach der Dosierung eine Blutprobe zur Schätzung des TBS jedes Individuums mittels der RID-Gleichung mit dem modellabgeleiteten FaS-Wert nach 14 Tagen; und eine zweite Blutprobe bei einem der verbleibenden 15 Male, um die für die modellbasierten kompartimentalen Analyse erforderlichen Plasma-Retinol-Kinetikdaten zu erhalten. In diesem Design sind jeweils 7 Personen für jede der 15 zusätzlichen Blutentnahmezeiten zuständig. Im Allgemeinen gelten 5 Teilnehmer pro Zeit als ausreichend, aber da einige Teilnehmer eine festgelegte Blutentnahmezeit verpassen, werden ~7 Personen pro Zeit empfohlen. Plasma wird mittels Massenspektrometrie analysiert, um Messungen von markiertem und nicht-markiertem Retinol zu erhalten, und der Anteil der Vitamin-A-Isotop-Dosis im Plasma (FD_p) wird berechnet. Kurz gesagt wird der geometrische Mittelwert FD_p gegenüber der Zeit mit WinSAAM-Software 12,24,26 grafiert und in ein Kompartimentmodell angepasst. Ein Beispiel für ein 8-Kompartiment-Modell für den Vitamin-A-Stoffwechsel im ganzen Körper ist in Abbildung 1¹⁵ dargestellt. Das Modell umfasst Kompartimente, die das Plasma-Vitamin A (Kompartiment 5) repräsentieren, sowie zwei austauschbare Vitamin-A-Speicherbecken (Kompartimente 6 (groß) und 7 (klein)). Die Summe der Masse von Vitamin A in den beiden austauschbaren Speicherkompartimenten wird als Schätzung von TBS verwendet:

TBS (μmol) = M(6) + M(7)

wobei M(I) μmol Vitamin A im Kompartiment I ist

Populationsspezifische Werte für die Koeffizienten Fa und S können zu jedem Zeitpunkt (t) über die Dauer einer Super-Subject-Studie mit den folgenden Gleichungen berechnet werden:^12,24:

Fa_t = F(6)_t + F(7)_t

S_t = SA_pt / SA_st = [F(5)_t / M(5)] / {[F(6)_t + F(7)_t] / [M(6) + M(7)]}

wobei Fa_t der Anteil der aufgenommenen Tracer-Dosis ist, die zum Zeitpunkt t in den Speichern aufgenommen und gefunden wird; F(I)_t ist ein Anteil der Tracer-Dosis, die zum Zeitpunkt t im Kompartiment I vorhanden ist; S_t ist eine spezifische Aktivität im Plasma im Vergleich zu den Speichern zum Zeitpunkt t; SA ist retinolspezifische Aktivität entweder im Plasma (p) oder in Speichern (s) zum Zeitpunkt t; und M(I) ist μmol Vitamin A in Kompartiment I. Siehe Green et ^al.12 für eine detaillierte Diskussion der modellbasierten kompartimentalen Analyse.

Protokoll

Die Daten sind hypothetisch; An dieser Studie waren keine menschlichen Teilnehmer beteiligt.

1. TBS-Schätzung mit der RID-Gleichung

1. Um TBS mit der RID-Gleichung zu schätzen, verwenden Sie folgende hypothetische Teilnehmerdaten:
   Alter: 25 Jahre
   Markierte Retinolkonzentration im Plasma: 0,0163 μmol/L
   Unmarkierte Retinolkonzentration im Plasma: 1,154 μmol/L
   Orale Vitamin-A-Dosis: 6,838 μmol RE
   Veröffentlichter zusammengesetzter Koeffizient FaS an 14 Tagen¹⁵: 0,727
   HINWEIS: Die Menge der Vitamin-A-Isotop-Dosis basiert auf der Vitamin-A-Aktivität der markierten Vitamin-A-Verbindung (üblicherweise ²H- oder 13-C-markiertes Retinylacetat) und wird als μmol-Retinol-Äquivalent (RE) angegeben. Wenn ^{beispielsweise 2}H6-Retinylacetat für die orale Dosierung verwendet wird und eine Dosis von 2000 μg RE gewünscht wird, wird die Dosis ^{von 2}H_{6-Retinylacetat} anhand der Molekulargewichte von ²H_{6-Retinylacetat} (328,49 μg/μmol) und ²H_6-Retinol (292,49 μg/μmol) berechnet: 2000 x (328,49/292,49) = 2246 μg ²H₆-Retinylacetat. Die Dosis von 2000 μg RE, ausgedrückt in μmol, wird berechnet, indem die Dosis (μg RE) durch das Molekulargewicht von ²H6-Retinol geteilt wird: 2000/292,49 = 6,838 μmol.
2. Berechnen Sie SA_p mit der untenstehenden Gleichung:
   SA_p = [etikettiert Retinol / (etikettiert Retinol + unetikettiertes Retinol) im Plasma] / Dosis (μmol)
   Verwenden Sie die oben genannten Teilnehmerdaten, um die Gleichung zu lösen:
   SA_p = [0,0163 / (0,0163 + 1,154)] / 6,838 = 0,0020 μmol
3. Berechnen Sie TBS mit der unten gezeigten RID-Gleichung:
   TBS = FaS x (1/SA_p)
   Verwenden Sie die oben genannten Teilnehmerdaten, um den FaS-Wert und den berechneten_SA-p-Wert aus Schritt 2 zu erhalten:
   TBS = 0,727 x (1/ 0,0020) = 364 μmol

2. TBS-Schätzung mit der Massenbilanzgleichung

1. Um die TBS mit der Massenbilanzgleichung zu schätzen, verwenden Sie folgende hypothetische Teilnehmerdaten:
   Alter: 4 Jahre
   F_a (2 Kohlenstoffe gekennzeichnet plus natürliche Häufigkeit): 0,11
   F_b: 0,010745
   F_c: 0,0110476
   Aufgetragene Tracer-Dosis: 1,0 μmol RE
   Faktoren für Absorption und Speicherung:
   Absorption: 0,8
   Speicherung: Verhältnis von TTR im Serum zu Leber (Ernährung nicht kontrolliert): 0,8
   HINWEIS: Für die Dosierung werden ¹³C₂ markiertes Vitamin A verwendet, und die Isotopenhäufigkeit der Dosis (F_a) wird berechnet als: ([¹³C₂] in der Synthese markiert + natürliche Häufigkeit (^{insgesamt 13}C/20C)¹⁰. Der angenommene Absorptionswert in diesem Beispiel beträgt 0,8; Ein Wert zwischen 0,8 und 1,0 kann anhand von Faktoren ausgewählt werden, die die Vitamin-A-Aufnahme in der Studienpopulation beeinflussen können (d. h. Entzündungs-/Infektionsraten können die Aufnahme¹ verringern). Beachten Sie, dass F_{, a} hier nicht dasselbe ist wie der Koeffizient Fa in der RID-Gleichung.
2. Berechnen Sie das Tracer-zu-Tracee-Verhältnis (TTR) mit der unten gezeigten Gleichung:
   TTR = (F_{c-F b})/(F_{a-F c})
   wobei F_a = ¹³C Isotopenhäufigkeit in der 13-C-markierten Vitamin-A-Dosis; F_b = ¹³C Isotopen-Häufigkeit von Serumretinol am Ausgangspunkt; F_c = ¹³C Isotopenhäufigkeit von Serumretinol nach der Dosierung
   Verwenden Sie die Werte für F_a, F_b und F_c aus den obigen Teilnehmerdaten, um TTR zu berechnen:
   TTR = (0,0110476 - 0,010745) / (0,11 - 0,0110476) = 0,003058035
3. Berechnen Sie dann 1/TTR
   1/TTR = 1 / 0,003058035 = 327,01
4. Berechnen Sie anschließend den Faktor a mit der untenstehenden Gleichung:
   Faktor a = ¹³C-markierte Vitamin-A-Dosis (μmol) x ^e-kt
   1. Berechnen Sie zunächst k mit der unten gezeigten Gleichung:
      k=ln(2)/Halbwertszeit von Retinol
      Der natürliche Log von 2 (ln(2)) entspricht 0,693147181; Die Halbwertszeit von Retinol wird bei Kindern auf 32 Tage* geschätzt; Berechnen Sie mit diesen Informationen k
      k= 0,693147181 / 32 = 0,021660849
      *Geschätzte Werte werden für die Halbwertszeit von Retinol verwendet (32 bis 136 d bei Kindern; 140 d bei Erwachsenen); Oder Werte können anhand der Geschwindigkeit des Abfalls der Tracer-Dosis bei Personen in einer Kontrollgruppe während der Studie^{geschätzt werden.}
   2. Als Nächstes berechnen wir ^e-kt, wobei t die Zeit ist (Tage seit der Isotopendosierung; t = 14 Tage für die Massenbilanzgleichung). Verwenden Sie diese Informationen mit dem berechneten Wert für k aus Schritt 4.1:
      ^e-kt = ^{e-0,02166 x 14} = 0,738413073
   3. Berechnen Sie schließlich den Faktor a mit der unten gezeigten Gleichung die Menge der Isotopendosis aus den obigen Teilnehmerdaten (1,0 μmol) und den berechneten Wert für ^e-kt
      Faktor a = ¹³C-markierte Vitamin-A-Dosis (μmol) x ^e-kt
      Faktor A = 1,0 x 0,738413073 = 0,738413073
5. Berechne TBS mit der unten gezeigten Massenbilanzgleichung:
   TBS = x (1/TTR) x Faktor für Absorption x Faktor für Speicher
   Verwenden Sie den berechneten Faktor a (0,738413073) und den berechneten Wert 1/TTR (327) aus den obigen Schritten sowie die festen Werte für Absorption (0,8) und Speicher (0,8):
   TBS = 0,738413073 x 327 x 0,8 x 0,8 = 155 μmol

3. Schätzung von Vitamin-A in der Leber

1. Um die gesamten Vitamin-A-Reserven der Leber und die Vitamin-A-Konzentration der Leber zu berechnen, verwenden Sie die folgenden Teilnehmerdaten:
   Alter: 25 Jahre
   Gewicht: 61,0 kg
   Höhe: 156,8 cm
   TBS: 364 μmol (geschätzt durch RID)
   Die Prävalenz der Plasmaretinolkonzentrationen <0,7 μmol/L in der Studienpopulation beträgt <2 %.
2. Berechnen Sie zunächst das Lebergewicht basierend auf der Körperoberfläche (BSA) mit der unten gezeigten Gleichung:
   BSA (m²) = sqrt [Körpergewicht (kg) x Größe (cm)/3600]
   Verwenden Sie die oben genannten Teilnehmerdaten, um BSA zu berechnen:
   BSA (m²) = sqrt [61,0 x 156,8/3600] = 1,63 m²
3. Berechnen Sie anschließend das Lebergewicht mit der unten gezeigten entsprechenden Gleichung und dem oben berechneten BSA-Wert:
   Wenn die Körperoberfläche (BSA) <1 ist:
   Lebergewicht (g) = 772 (g/m²) x Körperoberfläche (BSA) - 38
   Wenn die Körperoberfläche (BSA) ≥1 beträgt:
   Lebergewicht (g) = 772 (g/m²) x Körperoberfläche (BSA)
   Berechnen Sie die BSA mit der unten gezeigten Gleichung; (beachte, dass BSA ≥1 aus Schritt 2 oben ist):
   Lebergewicht (g) = 772 (g/m²) x Körperoberfläche (BSA)
   Lebergewicht (g) = 772 (g/m²) x 1,63 m² = 1258 g
4. Schließlich berechnen Sie die Vitamin-A-Konzentration der Leber mit der unten gezeigten Gleichung:
   Vitamin-A-Konzentration der Leber = TBS (μmol) * Anteil der TBS im Leber-/Lebergewicht (g)
   Verwenden Sie den TBS-Wert aus den obigen Teilnehmerdaten (364 μmol) und einen angenommenen Wert von 0,8 für den Anteil an TBS in der Leber (der Vitamin-A-Status der Studienpopulation wird aufgrund der Prävalenz von niedrigem Serumretinol <2%) und dem berechneten Lebergewichtswert (1258 g) oben als ausreichend angenommen:
   Vitamin-A-Konzentration in der Leber = 364 μmol * 0,8 / 1258 = 0,232 μmol/g Leber

4. Modellvorhergesagte TBS für die Gruppe

1. Um modellvorhergesagte TBS für die Gruppe (Studienpopulation) mit einem Super-Subjekt-Studiendesign zu berechnen, verwenden Sie die folgenden hypothetischen Modellierungsergebnisse einer Super-Subjekt-Studie bei Frauen im gebärfähigen Alter (Details zu diesem Ansatz siehe Green et ^al.15):
   Hypothetische Modellausgabe:
   M(6) = 973,281 μmol
   M(7) = 55,7646 μmol
2. Berechne TBS für die Gruppe anhand des bereitgestellten Super-Subjekt-Modells und der untenstehenden Gleichung:
   TBS = M(6) + M(7)
   Verwenden Sie die Masse von Vitamin A in den Kompartimenten 6 und 7 (aus Modellausgabe):
   TBS = 973,281 + 55,7646 = 1029 μmol
   HINWEIS: Ein Beispiel für die Berechnung von Werten für den zusammengesetzten FaS basierend auf Modellausgaben liegt außerhalb des Rahmens dieser Übersicht. Weitere Informationen finden Sie unter Green et ^al.12,15.

Ergebnisse

Dieses Protokoll präsentiert Beispiele, wie TBS quantitativ bei Erwachsenen oder Kindern mittels der Retinolisotopen-Verdünnungsmethode und entweder der RID-Gleichung oder der Massenbilanz geschätzt werden kann. Die RID-Gleichung wird verwendet, wenn ²H- oder ¹³C-markiertes Vitamin A zur Dosierung verwendet wird, und LC/MS/MS oder GC/MS zur Messung der Plasmakonzentrationen von markiertem und unmarkiertem Retinol. Die RID-Gleichung benötigt Informationen zur spezifischen Aktivität des Plasmaretinols (Tracer-zu-Tracer-Verhältnis) anhand der Massenspektrometriemessungen, der oralen Dosis des markierten Vitamin A (μmol RE) und einem Wert für den zusammengesetzten Koeffizienten FaS. Veröffentlichte Werte für den zusammengesetzten FaS sind verfügbar; Alternativ können populationsspezifische Werte durch modellbasierte kompartimentale Modellierung von Plasma-Retinol-Kinetikdaten geschätzt werden. Die RID-Gleichung wird üblicherweise ~14 bis 21 Tage nach der Dosierung angewendet, kann aber zu einem späteren Zeitpunkt angewendet werden, wenn ein entsprechender Wert für den zusammengesetzten FaS verfügbar ist. Der Wert von TBS für das hier gezeigte Beispiel betrug 364 μmol.

Die Massenbilanzgleichung wird verwendet, wenn ¹³C-markiertes Vitamin A zur Dosierung verwendet wird, und GC-C-IRMS wird verwendet, um die Isotopenhäufigkeit von ¹³C im Plasma zu messen. Die Massenbilanzgleichung erfordert das Verhältnis von Tracer zu Tracere (gemessen ¹³C-Isotopenhäufigkeit im Plasma) und Werte für Faktoren (Koeffizienten), um die Absorption und Speicherung der ^{Dosis von 13}C-markierten Vitamin A zum Zeitpunkt der TBS-Bewertung zu berücksichtigen. Veröffentlichte Werte für die Koeffizienten stehen zur Verwendung in der Gleichung vor. Die Massenbilanzgleichung wird 14 Tage nach der Dosierung angewendet. Der Wert von TBS für das hier gezeigte Beispiel betrug 155 μmol.

Eine modellbasierte kompartimentale Analyse von kinetischen Daten aus Plasmaretinol mit einem Super-Probanden-Design wird verwendet, um TBS für eine Gruppe von Studienteilnehmern zu schätzen und Werte für den Koeffizienten FaS für die spätere Bestimmung des TBS bei einzelnen Teilnehmern zu bestimmen. TBS für die Gruppe wird als Masse von Vitamin A in den austauschbaren Vitamin-A-Speicherbecken des Körpers berechnet; und TBS für einzelne Studienteilnehmer wird 14 Tage nach der Dosierung und/oder zu späteren Zeitpunkten berechnet, wobei der spezifische Plasma-Retinol-Aktivitätswert (SA_p) und der entsprechende modellabgeleitete Wert für den FaS-Koeffizienten zu den gewählten Zeitpunkten mit der RID-Gleichung verwendet wird. Der Wert von TBS für das hier gezeigte Beispiel betrug 1029 μmol.

TBS-Ergebnisse können interpretiert werden, indem TBS in die Vitamin-A-Konzentration der Leber umgewandelt und die Vitamin-A-Konzentrationen der Leber mit Cutoff-Werten verglichen werden, um den Vitamin-A-Status über das gesamte Kontinuum hinweg zu kategorisieren; Beachten Sie, dass die 2015 vorgeschlagenen Grenzwerte von mangelhaft zu giftigen Speichern voraussichtlich verbessert^{werden, sobald} mehr Daten verfügbar sind. Die Vitamin-A-Konzentration der Leber im hier gezeigten Beispiel betrug 0,232 μmol/g Leber

Abbildung 1: Kompartimentmodell für den Vitamin-A-Stoffwechsel im ganzen Körper beim Menschen. Kreise stellen Kompartimente dar; Die Rechtecke sind Verzögerungselemente; Pfeile zwischen den Komponenten sind fraktionelle Transferkoeffizienten [L(I,J)s, also der Anteil des Retinols im Kompartiment J, der täglich in Kompartiment I übertragen wird] und Verzögerungszeiten [DT(I)s, also Tage im Verzögerungselement I]. Kompartiment 1 ist der Ort der Einführung des aufgenommenen Tracers (*) und des Nahrungsvitamins A [U(1)]. Die Komponenten 1–4 stehen für die Verdauung, Aufnahme und Chylomikron-Verarbeitung bis zur Aufnahme durch Hepatozyten (Kompartiment 4), mit anschließender Sekretion von Retinol, gebunden an das retinolbindende Protein, in Plasmakompartiment 5, dem Prüfort (Dreieck). Komponente 8 ermöglicht eine irreversible Aufnahme von Plasmaretinol durch Gewebe, aus denen Retinol nicht recycelt wird. Retinol im Plasma kann auch mit Vitamin A in zwei extravaskulären Pools (einem größeren Kompartiment 6 und einem kleineren Kompartiment 7) austauschen, wobei die Kompartimente 6 und 8 die Stellen irreversiblen Verlusts aus dem System sind. VA = vitamin A. Diese Zahl wurde von¹⁵ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Tabelle 1: Geschätzte Werte für den zusammengesetzten Koeffizienten FaS für theoretische Erwachsene und Kinder zu ausgewählten Zeiten. 14 Tage oder später wird empfohlen, um die RID-Gleichung zur Schätzung von TBS bei Erwachsenen anzuwenden. Abkürzungen: GM = geometrischer Mittelwert; NA = nicht anwendbar. Diese Tabelle wurde von¹⁵ geändert. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Populationsprävalenzgrenzen für Vitamin-A-Mangel. Abkürzungen: VAD = Vitamin-A-Mangel; MRDR = modifizierter relativer Dosis-Response-Test; WHO = Weltgesundheitsorganisation. Diese Tabelle wurde von²¹ geändert. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 3: Anzahl der Teilnehmer pro Zeit für eine 91-tägige Super-Subject-Studie. Am 14. Tag werden bei allen Teilnehmern (n=105) Blutproben genommen, und jeder Teilnehmer wird während der 91-tägigen Studie zufällig einem zweiten Zeitpunkt zugeteilt, sodass jeweils mindestens 7 Teilnehmer vorhanden sind und jeder Teilnehmer insgesamt 2 Blutproben liefert. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Diskussion

Zusammenfassend liefern stabile Isotopenmethoden quantitative Schätzungen von TBS bei Erwachsenen und Kindern und können in^{Gemeinschaftsumgebungen} angewandt werden. TBS von Erwachsenen und Kindern kann mit der Retinolisotopen-Verdünnungsmethodik entweder mit der RID-Gleichung oder der Massenbilanzgleichung geschätzt werden. Obwohl beide Gleichungen auf dem Prinzip der Isotopenverdünnung basieren, gibt es einige Unterschiede. Kurz gesagt, die RID-Gleichung erfordert eine einzelne Blutprobe und wird nach ~14–21 Tagen angewendet, kann aber auch später angewendet werden, wenn ein entsprechender Wert für den zusammengesetzten FaS verfügbar ist. Veröffentlichte Werte für den zusammengesetzten Koeffizienten FaS sind zu unterschiedlichen Zeiten nach der Dosierung für die Verwendung in der RID-Gleichung¹⁵ verfügbar; Alternativ können populationsspezifische Werte mittels modellbasierter kompartimentaler Analyse bestimmt werden. Die Massenbilanzgleichung erfordert zwei Blutproben, eine am Ausgangspunkt und die andere 14 Tage nach der Dosierung. Wie bereits erwähnt, kann jedoch, wenn das mittlere TBS für eine Gruppe geschätzt wird, eine Ausgangsblutungsprobe bei 5–6 Teilnehmern durchgeführt werden, und die mittlere ^{Häufigkeit von 13}C für diese Individuen kann als Schätzung der Ausgangshäufigkeit ^{von 13}C im Serum verwendet werden.

Bei der Anwendung der RID-Gleichung sind wichtige Überlegungen, die Dosis als Vitamin-A-Aktivität (μmol RE) statt μmol des markierten Retinylesters auszudrücken, und wenn veröffentlichte Werte für den Koeffizienten FaS verwendet werden, ist es wichtig, FaS-Werte auszuwählen, die aus einer ähnlichen Population (Kinder oder Erwachsene) stammen und der Zeit (Studientag) entsprechen, an der SA_p wurde gemessen, um TBS zu schätzen. Bei der Anwendung der Massenbilanzgleichung ist es entscheidend, die natürliche Häufigkeit ^{von 13}C in der Dosis ^{von 13}C-markierten Vitamin A zu berücksichtigen und die Nachdosis-Serum-Häufigkeit ^{von 13}C für die natürliche Menge von ¹³C im Serum zu Beginn zu korrigieren, um genaue Schätzungen von TBS¹⁰ zu erhalten.

Modellbasierte kompartimentale Modellierung wird zusammen mit einem Super-Subjekt-Studiendesign in Gemeinschaftsumgebungen verwendet, um Gruppen-TBS und populationsspezifische Werte für den zusammengesetzten Koeffizienten FaS über die Dauer der Studie^{abzuschätzen 12,24}. Ein Vorteil dieses Ansatzes ist, dass die modellabgeleiteten Werte für den zusammengesetzten Koeffizienten FaS wahrscheinlich eine genauere Schätzung der TBS für Individuen in der Gruppe liefern als ein veröffentlichter Wert aus einer anderen Population. Dieser Ansatz bietet auch mehr Flexibilität beim Zeitpunkt der Blutentnahme in Feldstudien. Wenn beispielsweise ein Teilnehmer zum zugewiesenen Zeitpunkt für die RID-Blutentnahme nicht verfügbar ist, könnte die Blutprobe zu einem späteren Zeitpunkt entnommen werden, und der entsprechende modellabgeleitete Wert für den zusammengesetzten Koeffizienten FaS könnte in der RID-Gleichung verwendet werden, um deren TBS^12,24 zu schätzen.

TBS-Ergebnisse können interpretiert werden, indem TBS in die Vitamin-A-Konzentration der Leber umgewandelt und Werte mit vorgeschlagenen Grenzwerten für die Vitamin-A-Konzentration der Leber verglichen werden, um den Vitamin-A-Status über das gesamte Kontinuum hinweg zu kategorisieren, von defizitierend bis zu toxischen Speichern². Obwohl die vorgeschlagenen Grenzwerte darauf hindeuteten, dass >1 μmol/g Leber auf Hypervitaminose A hinweist, zeigten neuere Studien keine Nebenwirkungen zwischen 1 und 3 μmol/g und dass histopathologische Veränderungen bei >3 μmol/g^11,28 auftreten. Es werden weitere Daten zu den Vitamin-A-Konzentrationen der Leber und deren physiologischen Auswirkungen beim Menschen benötigt, um die Grenzwerte für subtoxische und toxische Statuskategorien zu verfeinern.

Obwohl stabile Isotopenmethoden zur Beurteilung des Vitamin-A-Status quantitative Schätzungen des TBS liefern und als die besten Methoden zur Statusbeurteilung gelten, werden sie aufgrund der relativ hohen Kosten im Vergleich zu anderen Bewertungsmethoden und des begrenzten Zugangs zu: stabilem Isotop-markiertem Vitamin A und Fachwissen zur Herstellung und Verabreichung von Dosen noch nicht weit verbreitet eingesetzt; Massenspektrometrie und Fachwissen zur Durchführung von Plasmaanalysen; Expertise im Studiendesign und der Anwendung von Gleichungen zur Schätzung von TBS; und Fachwissen in der modellbasierten kompartimentalen Analyse von kinetischen Daten aus Plasmaretinol. Für neue Nutzer ist die Beratung und Zusammenarbeit mit Experten während der Planung, Umsetzung und Analyse einer Studie entscheidend, um den Erfolg sicherzustellen.

Trotz Herausforderungen gab es in den letzten Jahren Fortschritte in der stabilen Isotopenmethodik, die ihre Anwendung in Gemeinschaftsumgebungen erleichtert haben^12,29. Zukünftige Studien mit dieser Methodik werden voraussichtlich wichtige neue Informationen über den Vitamin-A-Stoffwechsel und -Bedarf im gesamten Lebenszyklus, die Biowirksamkeit von ernährungsbedingten Provitamin-A-Carotinoiden sowie die Wirksamkeit und Sicherheit von Interventionen zur Verbesserung des Vitamin-A-Status in Bevölkerungsgruppen mit Mangel liefern.

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