Lokalisierung der Plasmamembran und intrazellulärer neuronaler nikotinischer Acetylcholinrezeptoren mittels quantitativer Bildgebung in Säugetierzellen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Expression und Quantifizierung neuronaler nikotinischer Acetylcholinrezeptor-Untereinheiten mittels der säugetierischen Neuro-2a-Zelllinie. pH-empfindliche fluoreszierende Tags und konfokale Mikroskopie ermöglichen eine präzise Bewertung der Rezeptorlokalisierung an der Plasmamembran im Vergleich zu denen, die in pH-neutralen intrazellulären Kompartimenten exprimiert werden, was die Untersuchung des nAChR-Transports und der pharmakologischen Modulation erleichtert.

Zusammenfassung

Die Quantifizierung neuronaler nikotinischer Acetylcholinrezeptoren (nAChRs), die auf der Plasmamembran von Säugetierzellen exprimiert werden, ist wichtig für die Entwicklung neuartiger zielselektiver Therapeutika und für die Untersuchung von Chaperonproteinen, die den Rezeptortransport modulieren. Diese Studie präsentiert eine robuste Reihe von Methoden, um sowohl homomere als auch heteromere nAChRs in Säugetier-Neuro2a-(N2a)-Zellen auszudrücken und deren Oberflächen- versus intrazelluläre Lokalisierung mittels pH-empfindlicher fluoreszierender Tags zu quantifizieren. pHuji und superekliptisch pHluorin (SEP) sind pH-sensitive Proteine, die so konstruiert werden können, dass sie rekombinante Proteine markieren und so die räumliche Verteilung der nAChR-Untereinheiten visualisieren. Diese fluoreszierenden Tags emittieren einen neutralen pH-Wert, werden aber in sauren Umgebungen abgeschreckt. Um die relative interne versus plasmamembranspezifische Lokalisierung von α7, α4 und β2 nAChR-Untereinheiten zu verfolgen, wird entweder pHuji oder SEP an den C-Terminus jedes DNA-Konstrukts angehängt. Um α7-pHuji zusammen mit seinem Begleiter NACHO, oder (α4-SEP; β2-pHuji), in N2a-Zellen zu exprimieren, wird ein lipidbasiertes DNA-Transfektionsreagenz verwendet. Das Transfektionsreagenz und die Plasmid-DNA werden bei Raumtemperatur getrennt in einem reduzierten Serummedium inkubiert und anschließend kombiniert, um Lipid-DNA-Komplexe zu bilden, die die Plasmidabgabe in die Zellen erleichtern. Nach der Inkubation werden die Zellen mittels lebender Zell-Konfokalmikroskopie unter sowohl hohen als auch niedrigen pH-Bedingungen oder in Anwesenheit eines subtypselektiven fluoreszenten Liganden abbildet. Die Bilder werden mit korrigierter Gesamtzellfluoreszenz in den entsprechenden Fluorophorkanälen analysiert und liefern quantitative Informationen über die Verteilung der fluoreszenzmarkierten nAChR-Untereinheiten zwischen der Plasmamembran und den intrazellulären Kompartimenten. Lebendzell-konfokale Bildgebung ermöglicht eine Echtzeitverfolgung der nAChR-Untereinheitenlokalisierung, um Unterschiede zwischen internen und Oberflächenrezeptorpopulationen zu unterscheiden. Eine robuste Plasmamembranexpression von α7-pHuji oder (α4-SEP; β2-pHuji) wird innerhalb von 24 Stunden bei 37 °C erreicht. Diese Methode kann angepasst werden, um zusätzliche Begleiter, Hilfsuntereinheiten oder fluoreszierende Liganden für die Untersuchung des nAChR-Transports, pharmakologischen Modulationssystems und krankheitsbedingten Veränderungen in der nAChR-Expression einzubeziehen.

Einleitung

Neuronale nikotinische Acetylcholinrezeptoren (nAChRs) sind ligandgesteuerte transmembranäre Ionenkanäle, die auf der Plasmamembran vieler Zelltypen exprimiert werden, darunter Neuronen, Gliazellen und Immunzellen. Diese Rezeptoren bestehen aus α (α2-α10) oder β (β2-β4) Untereinheiten, die sich zu homomeren oder heteromeren Untertypen zusammensetzen, wobei α7 und α4β2 nAChR am häufigsten im Gehirn ^1,2 vorkommen. Die Dysregulation dieser Subtypen wurde mit Alzheimer-Krankheit, Nikotinkonsumstörung, schlafbedingter hypermotorischer Epilepsie, Parkinson und einer schweren depressiven Störung sowie anderen neurologischen und psychiatrischen Erkrankungen in Verbindung gebracht 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Schnelle und zuverlässige Methoden zur Expression und Quantifizierung von nAChRs sind unerlässlich, um Krankheitsmechanismen zu verstehen und zielselektive Therapeutika zu entwickeln. Allerdings ist es oft herausfordernd und zeitaufwendig, eine robuste Plasmamembranexpression dieser Rezeptoren zu erreichen. Die hier beschriebene Methode ermöglicht eine starke Oberflächenexpression von nAChRs innerhalb von etwa 24 Stunden nach der DNA-Transfektion und kann mit Liganden oder Chaperonproteinen kombiniert werden, die den Rezeptortransport modulieren.

Es existieren mehrere Ansätze zur Expression von nAChRs, darunter die transienten DNA-Transfektion oder die Erzeugung stabiler Zelllinien, die den gewünschten Subtyp exprimieren. Obwohl die Herstellung stabiler Zelllinien für Langzeitstudien mit demselben Rezeptor-Subtyp nützlich ist, ist der Prozess arbeitsintensiv und kann mehrere Monate dauern. Sobald sie etabliert sind, können solche Zelllinien variable Rezeptorexpression über Passagen hinweg zeigen, im Laufe der Zeit an Expression verlieren oder bei Klonen mit suboptimaler Rezeptorfunktion oder -dichte¹³ selektionieren. Eine Senkung der Inkubationstemperatur von 37 °C auf 30 °C, die Zugabe molekularer Begleiter wie Nikotin oder eine verlängerte Inkubationszeit kann die Oberflächenexpression^fördern 13,14,15. Diese Einschränkungen sind besonders ausgeprägt bei heteromeren nAChR, die eine ordnungsgemäße Montage und den Transport von Untereinheiten erfordern, sowie bei Studien, die sich auf die chaperonunterstützte Rezeptorregulation konzentrieren. Daher ist eine routinemäßige Validierung der Rezeptorsubtyp-Expression über Passagen hinweg notwendig, wenn man mit stabilen nAChR-exprimierenden Zelllinien arbeitet.

Oft interessieren sich Forscher für nAChR-Subunit-Varianten sowie Chaperon- oder Hilfsproteinsubunits und müssen daher eine Vielzahl von DNAs in schneller Folge exprimieren, um eine schnelle Flexibilität in ihren Assays zu ermöglichen. Die vorübergehende Expression von nAChRs ist in dieser Hinsicht vorteilhaft, da der Prozess schnell abgeschlossen werden kann, was es dem Forscher ermöglicht, mehrere Rezeptor-Subtypen oder experimentelle Bedingungen zu untersuchen, ohne monatelang auf die Erzeugung stabiler Zelllinien warten zu müssen. Ein häufiges Phänomen, selbst bei transienter Expression, ist, dass viele nAChRs 24 Stunden nach der Induktion bei 37 °C in der Zelle verbleiben, was zusätzliche Inkubationszeiten von > 48 Stunden ^16,17 erfordert. Beispielsweise werden ohne das Chaperon-Protein, das gegen Inhibitoren der Cholinesterase (RIC)-3 resistent ist, nur ~1 % der α7 nAChRs auf der Plasmamembran der säugetierischen SHE-P-Zellen¹⁸ exprimiert. Bei der Koexpression von RIC-3 werden etwa 20 % der α7 nAChR an der Oberfläche nachgewiesen. Obwohl dies eine Verbesserung darstellt, bleibt die Gesamthäufigkeit der Rezeptoren niedrig. Die Koexpression von α7 nAChRs mit NACHO kann die Oberflächenexpression weiter verbessern, obwohl immer noch weniger als 40 % der gesamten Rezeptorpopulation zur Plasmamembran¹⁹ transportieren. Ein weiterer Ansatz besteht darin, transfectierte Zellen bei 30 °C zu inkubieren, um die Plasmamembranexpression^20,21 zu verbessern. Für α4β2 nAChRs führt diese Temperaturreduktion zu einer fünffachen Hochregulierung der Oberflächenrezeptordichte, ohne entsprechende Zunahme des Gesamtsubunit-Proteins²¹. Diese Verbesserung erfordert jedoch mindestens einen zusätzlichen Tag und eine größere Nutzung von Verbrauchsmaterialien, Reagenzien und Instrumentierungen.

Die vorgestellte Arbeit bietet eine Reihe optimierter Methoden zur Expression und Quantifizierung spezifischer nAChR-Subtypen innerhalb von 24 Stunden nach der Transfektion in N2a-Zellen von Säugetieren, wobei etwa 83 % für α7, 77 % für α4 und 56 % für β2-Untereinheiten erreicht werden, die auf der Plasmamembran lokalisiert sind. Im Fall von α7 nAChRs kann die Plasmamembranexpression mittels α7-selektiver, fluoreszenzmarkierter α-Bungarotoxin (αBTX) oder durch rekombinante fluoreszierende Markierung quantifiziert werden. Um jede Untereinheit zu kennzeichnen, werden die pH-sensitiven fluoreszierenden Proteine pHuji und superekliptische pHluorin (SEP)22,23,24 auf den C-Terminus einzelner nAChR-Untereinheiten ^25,26 konstruiert. pHuji und SEP sind pH-empfindliche Varianten roter bzw. grüner fluoreszierender Proteine, die bei pH 7,4 fluoreszieren, aber unter saureren Bedingungen^27,28 abgeschreckt werden. Da SEP- und pHuji-Fluoreszenz bei pH-Wert < 6 unterdrückt wird, spiegelt jedes beobachtete intrazelluläre Signal Fluorophore in neutralen Kompartimenten statt auf der Plasmamembran wider. Es sei darauf hingewiesen, dass einige Organellen, wie der Golgi-Apparat, ein saures Lumen besitzen; daher werden Fluorophore, die an den C-terminalen Bereich der nAChR-Untereinheiten gebunden sind, nicht detektiert, während Untereinheiten den sekretorischen Weg²⁹ durchlaufen. Der Unterschied zwischen der Gesamtfluoreszenz bei pH 7,5 und der bei pH < 6 entspricht dem Signal, das von nAChRs auf der Plasmamembran erzeugt wird. Die Aufnahme von Bildern mit Live-Zellen-Konfokalmikroskopie bietet eine hohe räumliche Auflösung und ermöglicht eine präzise Quantifizierung der Subunit-Lokalisierung. Zusätzlich ermöglicht die Durchführung aller Experimente an lebenden Zellen, dass jede Zelle als eigene Kontrolle dient und die Variabilität der Proteinexpression zwischen den Zellen innerhalb jeder Behandlungsgruppe³⁰ berücksichtigt. Diese Methode kann weiter angepasst werden, um zusätzliche Begleitproteine, wie NACHO oder andere, einzubeziehen, um den nAChR-Transport zu untersuchen. Weitere Anwendungen umfassen die pharmakologische Modulation, die Einbindung von Hilfsuntereinheiten und die Analyse krankheitsassoziierter Veränderungen in der nAChR-Expression.

Protokoll

HINWEIS: Das folgende Verfahren beschreibt Methoden, die erfolgreich verwendet wurden, um die N2a-Zelllinie vorübergehend mit nAChR-Untereinheiten zu transfektieren (Abbildung 1). Eine robuste Plasmamembranexpression wird innerhalb von 24 Stunden erreicht, wie sie mit der lebenden Zell-Konfokalmikroskopie erfasst wird.

Abbildung 1: Schematische Darstellung der einzelnen im Protokoll vorgestellten Methoden. Die Zellen werden gezüchtet, bis sie zu 70 % bis 80 % in Bildgebungsschalen zusammenfließen. Die Zellen werden dann mit dem Transfektionsreagenz und dem DNA-Komplex behandelt. (Oben) 24 Stunden später können die Zellen mit einem fluoreszenzmarkierten Liganden behandelt werden, um Untereinheiten zu markieren, die auf der Plasmamembran exprimiert sind, und anschließend mit einem konfokalen Mikroskop abgebildet zu werden. (Bottom) Alternativ können für nAChR-Subunit-Gene, die so modifiziert wurden, dass sie 24 Stunden nach der Transfektion mit einem pH-sensitiven Protein markiert wurden, Zellen lebendig mit einem konfokalen Mikroskop abbilden, um die gesamte Fluoreszenz der Zellen zu erfassen. Der pH-7,4-Bildgebungspuffer wird dann auf den pH-5,5-Abschreckpuffer umgestellt. Dadurch wird die Fluoreszenz der pH-sensitiven Proteine stoppen, die an die nAChR-Untereinheiten auf der Plasmamembran der Zelle befestigt sind, sodass nur die internen Untereinheiten fluoreszierend bleiben. Die gleichen Zellen werden erneut abgebildet. Die Bildanalyse wird mit ImageJ durchgeführt, um den Ausdruck von internen und externen Untereinheiten zu quantifizieren. Diese Verfahren können modifiziert werden, um Chaperon und Hilfsproteine einzubeziehen. Erstellt in BioRender. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

1. N2a nAChR-Transiententransfektion

HINWEIS: Die N2a-Zelllinie wurde gewählt, weil sie einen neuronalen Phänotyp und eine geringe endogene Expression von nAChRs aufweist. Die α7-pHuji-, α4-SEP- und β2-pHuji-Untereinheitsgene sind jeweils einzeln im Säugetier-Expressionsvektor pcDNA3.1(+) enthalten. Das Chaperonprotein NACHO wird aus pREP9 exprimiert (großzügig gestiftet von Dr. R. Loring, Northeastern University). Verwenden Sie in allen Schritten sterile Techniken und arbeiten Sie in einem Biosicherheitsschrank. Tragen Sie einen sauberen Laborkittel, Schutzbrille und Handschuhe. Reinigen Sie alle Materialien, die in den Biosicherheitsschrank ein- oder austreten, mit 70 % Ethanol. Die folgenden Schritte beschreiben die Transfektion in einer 35 mm poly-D-lysin-beschichteten Glasbodenschale, die für die Bildgebung geeignet ist. Die Volumina kann je nach Bedarf für verschiedene Kulturgefäße angepasst werden.

1. Kultivieren Sie N2a-Zellen in einer T25- (oder ähnlicher) Kulturkolbe mit Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM), ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum (FBS) und, falls erforderlich, 100 U/mL Penicillin und 100 μg/mL Streptomycin. Inkubieren bei 37 °C, 5 % CO₂, bis die Zellen ~90 % Konfluenz erreichen. Visualisieren Sie mit einem 4x-Lichtmikroskopobjektiv.
2. Überwachen Sie die Konfluenz täglich mit einem Lichtmikroskop und ersetzen Sie das Wachstumsmedium alle 1-2 Tage, um optimale Bedingungen zu erhalten. Wenn die Zellen ~90 % Konfluenz erreichen, sind sie bereit, in bildgebende Schüsseln überführt zu werden.
3. Alle Reagenzien werden in einem Wasserbad auf 37 °C vorerwärmt. Reinigen Sie den Biosicherheitsschrank und alle Materialien vor Beginn des Eingriffs mit 70 % Ethanol.
   VORSICHT: 70 % Ethanol ist eine hochentzündliche Flüssigkeit und Dampf, die schwere Augenreizungen verursachen kann. Halte dich von Hitze, Funken, offenen Flammen und anderen Zündquellen fern. Bewahren Sie sie in einem gut belüfteten Bereich mit fest geschlossenen Behältern auf. Tragen Sie Schutzhandschuhe und Augen-/Gesichtschutz beim Handeln. Bei Kontakt mit Haut oder Augen spülen Sie sofort mit Wasser ab und suchen Sie medizinische Hilfe, falls die Reizung anhält. Stattdessen kann ein alternatives Desinfektionsmittel verwendet werden, wie eine 5%-10%ige Bleichlösung.
4. Aspiriere das alte Medium aus dem Kolben und wasche die Zellen mit 5 ml PBS. Gib 1 ml Trypsin in die Flasche und schwenke sie vorsichtig. Inkubieren, bis die Zellen sich heben (<5 Min.). Um Überverdauung zu vermeiden, fügen Sie sofort 4 ml EMEM-Wachstumsmedium hinzu und pipieren Sie vorsichtig, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen.
5. Mit einem Hämozytometer wird die Zellkonzentration bestimmt und das erforderliche Volumen des EMEM-Wachstumsmediums berechnet, um die Suspension so anzupassen, dass 1 ml 0,5–2 x 10⁵ Zellen enthält.
6. Platte 1 ml Zellsuspension pro 35 mm Schüssel und füge genug EMEM-Wachstumsmedium hinzu, um das Gesamtvolumen auf 2 ml zu bringen. Über Nacht bei 37 °C, 5 % CO₂ inkubieren. Die Zellen sind bereit für die Transfektion bei 70 % bis 80 % Konfluenz.
7. Am Tag der Transfektion werden die Vorwärmreagenzien auf 37 °C aufgetaut, die DNAs der nAChR-Untereinheiten vollständig aufgetaut und das Transfektionsreagenz auf Raumtemperatur gebracht. Reinigen Sie alle Reagenzien mit 70 % Ethanol, bevor Sie sie in den Biosicherheitsschrank legen.
8. Um α7 nAChRs zu exprimieren: In einer Mikrozentrifugenröhre verdünnen Sie 4 μg α7 (1 μg/μL) und 1 μg NACHO (1 μg/μL) Plasmid-DNA tropfenzweise in ein reduziertes Serummedium (ohne Antibiotikum) bis zu einem Endvolumen von 250 μL. Sanft mischen Sie durch Pipettieren nach der DNA-Addition.
   1. Um α4β2 nAChRs zu exprimieren: Verdünnen Sie 4 μg jeder Untereinheit-DNA in insgesamt 250 μL reduziertem Serummedium. Rühren Sie vorsichtig durch Pipetten. Passen Sie das Verhältnis jeder Untereinheit an, um die Expression spezifischer Rezeptorisoformen zu optimieren.
   2. Um α4β2 nAChRs mit einem zusätzlichen Plasmid zu exprimieren, fügen Sie gleiche Mengen jeder Plasmid-DNA hinzu. Das blaue fluoreszierende Protein mTagBFP2³¹ in pcDNA3.1(+) dient als Kontrollplasmid und kann durch jedes α4β2-Chaperon ersetzt werden.
9. Vor der Anwendung vorsichtig das DNA-Transfektionsreagenz mischen. In einer separaten Mikrozentrifugenröhre wird 8 μL Transfektionsreagenz tropfweise in 250 μL reduziertem Serummedium verdünnt. Inkubiere 5 Minuten bei Zimmertemperatur. Innerhalb von 25 Minuten zum nächsten Schritt übergehen.
10. Nach 5 Minuten werden die verdünnten DNAs mit dem verdünnten Transfektionsreagenz (Gesamt = 500 μL) tropfweise kombiniert. Rühren Sie vorsichtig durch Pipette und brüten Sie 20 Minuten bei Zimmertemperatur ein. DNA-Lipidkomplexe bleiben bis zu 6 Stunden stabil.
11. Während sich die Komplexe bilden, entferne Kulturschalen aus dem Inkubator und ersetze das Medium durch 1 ml serumfreies EMEM (ohne Antibiotika).
12. Fügen Sie 500 μL des DNA-Transfektionsreagenzkomplexes tropfenweise zu jeder Schale hinzu (Endvolumen = 1,5 mL). Rühren Sie den Teller sanft um, um eine gleichmäßige Verteilung auf der Schale, besonders über den Glasboden, zu gewährleisten. Inkubieren Sie bei 37 °C für 24 Stunden und ersetzen Sie das Medium nach 4-6 Stunden, um die Zellgesundheit zu fördern.

2. Lebende Zellkennzeichnung von plasmamembranexprimierten α7 nAChRs unter Verwendung von αBTX Alexa Fluor 647

HINWEIS: Das folgende Verfahren wird in der Regel 24 Stunden nach der Transfektion durchgeführt. Schützen Sie αBTX Alexa Fluor 647 (αBTX-AF647) vor Licht, um die Photozerstörung des Fluorophors zu verhindern.

1. Alle Reagenzien auf 37 °C vorerwärmen und die αBTX-AF647-Lagerlösung (2,3 μM) auftauen. Reinigen Sie mit 70 % Ethanol und stellen Sie sie in den Biosicherheitsschrank.
2. Holen Sie die Schale mit den mit α7- und NACHO-DNA transfektierten Zellen aus dem Inkubator, reinigen Sie die Außenseite mit 70 % Ethanol und legen Sie sie in den Biosicherheitsschrank.
3. Entsorge das alte Medium durch Vakuumabsaugung. Um die Zellen zu waschen, geben Sie 2 ml frisches EMEM-Wachstumsmedium dazu.
4. Entfernen Sie das Waschmedium durch Vakuumabsaugung. Gib 2 ml EMEM-Wachstumsmedium zu den Schüsseln hinzu.
5. Ersetzen Sie die passende Menge des Mediums durch αBTX-AF647, um eine Endkonzentration von 80 nM zu erreichen. Über Nacht bei 37 °C inkubieren.
6. Morgens vorwarme PBS oder ein bevorzugtes Bildgebungsmedium und reinigen Sie mit 70 % Ethanol. Übertrage es in den Biosicherheitsschrank.
7. Entferne transfizierte Zellen aus dem Inkubator, reinigen Sie sie und setzen Sie sie in den Biosicherheitsschrank.
8. Entferne das alte Medium mit αBTX-AF647 und lege es in einen geeigneten Abfallbehälter.
9. Wasche die Zellen mit 2 ml PBS 3x, jeweils 10 Minuten bei Raumtemperatur. Die Spülungen entfernen ungebundene Liganden und Ablagerungen, und die Zeit kann angepasst werden, um den Bedürfnissen des Forschers gerecht zu werden. Entfernen Sie PBS nach jeder Wäsche.
10. Fügen Sie 2 ml PBS oder ein bevorzugtes Bildgebungsmedium hinzu und nehmen Sie die Zellen mit einem konfokalen Mikroskop ab.

3. Live-Zell-Bildgebung von totalen und internen α7-pHuji nAChRs

HINWEIS: Das folgende Verfahren verwendet ein hausgemachtes α7-pHuji pcDNA3.1-Plasmid, das mit dem Nacho-Chaperon ko-transfektiert wird. Ein ähnliches Protokoll wurde verwendet, um α4-SEP und β2-pHuji in pcDNA3.1 mit dem Kontrollplasmid mTagBFP2 pcDNA3.1 zu exprimieren, wie im Abschnitt Results beschrieben. Schützen Sie die Proben während des gesamten Verfahrens vor Licht, um eine Photozerstörung des Fluorophors zu verhindern.

1. Bereiten Sie einen pH-7,4-Bildpuffer (Tabelle 1) und einen pH-5,5-Abschreckpuffer (Tabelle 2) wie beschrieben²³ vor.
2. Reagenzien auf 37 °C vorerwärmen, mit 70 % Ethanol reinigen und in den Biosicherheitsschrank übergeben. Entferne die transfizierten Zellen aus dem Inkubator, reinigen sie mit 70 % Ethanol und lege sie in den Biosicherheitsschrank.
3. Entfernen Sie das alte Medium durch Absaugung. Spüle die Schüssel mit 2 ml PBS 3x, jeweils 10 Minuten bei Raumtemperatur. Fügen Sie 2 ml pH-7,4-Bildpuffer hinzu.
4. Bringen Sie die Schale zum Konfokalmikroskop. Setzen Sie die Bildgeschale mit pH-7,4-Bildpuffer in den Objektträgerhalter ein und setzen Sie den Halter in die vorgewärmte Umweltkammer auf dem Konfokalmikroskop.
5. Schließen Sie den Schlauch der peristaltischen Pumpe an den Behälter für die Bildgebungsschüssel an und schließen Sie die Kammer.
6. Öffnen Sie die Bildgebungssoftware und wählen Sie Laser für die interessierten Fluorophore aus (pHuji 566/598 nm, α4-SEP 499/520 nm, β2-pHuji 568/603 nm und mTagBFP2 359/461 nm).
7. Scanne die Schüssel, um Zellen für die Bildgebung mit einem 10x-60x-Objektiv zu lokalisieren. Erhöhen Sie bei Bedarf die Vergrößerung und passen Sie die Fokustiefe bei Bedarf an.
8. Laserintensität und Detektorempfindlichkeit werden angepasst, um die Fluoreszenz ohne Hintergrundsignal zu visualisieren. Passen Sie die Blende an, um das Fluoreszenzsignal zu erhöhen, falls erforderlich.
9. Wählen Sie die bevorzugte Auflösung und nehmen Sie das einzelne Bild mit dem gewünschten Objektiv auf (z. B. 60x).
10. Notieren Sie den Ort auf der Schüsselkarte, um dieselben Zellen nach der Pufferänderung auf den pH-5,5-Quench-Puffer neu zu lokalisieren.
11. Wiederholen Sie den Bildgebungsprozess für mehrere Bereiche der Schüssel und zeichnen Sie jede neue Stelle auf. Verwenden Sie dieselben Aufnahmeeinstellungen für alle Bilder (experimentelle und Kontrollgruppen), um gültige Vergleiche zu ermöglichen.
12. Wenn nur die Auslassleitung mit der Peristaltikpumpe verbunden bleibt, saugt man langsam den pH-7,4-Puffer aus der Schale in einen Abfallbehälter ab.
13. Wenn der Großteil des Puffers entfernt ist (ohne Zellen zu trocknen), wird die Einlassleitung auf den pH-5,5-Abschreckpuffer übertragen.
14. Schalten Sie die peristaltische Pumpe ein, um langsam den pH-5,5-Puffer (1,5 mL/min) an die Schale zu geben, damit die Zellen weiterhin verbunden bleiben.
15. Lass die Pumpe 20 Minuten laufen und beobachte, dass der Puffer korrekt in und aus der Schale fließt.
16. Schalten Sie die Pumpe aus und inkubieren Sie die Zellen mit dem pH-5,5-Abschreckpuffer für weitere 20 Minuten, um ein Gleichgewicht zu ermöglichen.
17. Um die Abbildung zu wiederholen, laden Sie die gespeicherten Orte der vorherigen Sitzung, um zu denselben Regionen zurückzugehen.
18. Bestätigen Sie, dass Brenntiefe und Position korrekt sind, da sie sich nach dem Pufferaustausch verschieben können.
19. Wiederholen Sie die Bildgebung an allen gespeicherten Orten unter Verwendung der pH-Quenchhed-Bedingung.

Reagenz	Schwerpunkt (mM)
NaCl	135
KCl	5
MgCl2	1.8
HEPES	20
d-Glukose	1
Lösung auf pH 7,4 anpassen

Tabelle 1: Bildpuffer-Rezept. Die folgenden Reagenzien wurden hinzugefügt und die Lösung auf pH 7,4 angepasst.

Reagenz	Schwerpunkt (mM)
NaCl	135
KCl	5
MgCl2	0.4
CaCl2	1.8
MES	20
d-Glukose	1
Lösung auf pH 5,5 anpassen

Tabelle 2: Rezept für Abschreckpuffer. Die folgenden Reagenzien wurden miteinander vermischt, und die resultierende Lösung wurde auf einen pH-Wert von 5,5 eingestellt.

4. Bildquantifizierung

HINWEIS: Dieses Verfahren erklärt, wie Zellbilder mit ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD) und der korrigierten totalen Zellfluoreszenzmethode (CTCF)³² analysiert werden.

1. Öffnen Sie ImageJ und öffnen Sie das zu analysierende Bild. Das Bild erscheint als Stapel, wobei jeder aufgenommene Kanal innerhalb desselben Bildes getrennt ist.
2. Navigiere zum Phasenkanal. Wenn das Bild zu hell ist (häufig bei leeren oder Hintergrundbereichen), wählen Sie Kontrast > Kontrast verbessern und klicken Sie dann auf OK.
3. Mit dem Lupenwerkzeug zoomen Sie auf ein Feld (+). Mit dem Freihand-Auswahlwerkzeug zeichnen Sie die Umrisse der Zelle im Phasenkanal nach.
4. Wechseln Sie zum fluoreszierenden Kanal, der dem interessierenden Fluorophor entspricht. Richten Sie die gewünschten Messungen ein, indem Sie Analysieren > Set Measurements auswählen. Stellen Sie sicher, dass Fläche, mittlerer Grauwert und integrierte Dichte überprüft werden.
5. Um den ausgewählten Bereich zu messen, wählen Sie Analysieren > Messen oder drücken Sie Befehl + M (Mac) / Strg + M (Windows).
6. Führen Sie drei Hintergrundmessungen durch, indem Sie leere Bereiche in der Nähe der Zelle nachzeichnen. Wiederholen Sie Schritte für die gewünschte Anzahl von Zellen.
7. Messdaten erscheinen in einem separaten Ergebnisfenster in ImageJ. Kopieren und fügen Sie diese Daten zur Analyse in Excel ein.
8. Berechnen Sie den durchschnittlichen Hintergrundmittelwert aus den drei Hintergrundmessungen.
9. Berechnen Sie den CTCF-Wert für jede Zelle mit folgender Formel:
   CTCF=Integrierte Dichte− (Fläche der Zelle x Mittlere Hintergrundfluoreszenz)
10. Wiederholen Sie diesen Vorgang für mehrere Zellen und Bilder für jede Versuchsgruppe (und gegebenenfalls für pH-Bedingungen). Exportieren Sie alle Ergebnisse in eine Datenanalysesoftware zur statistischen Verarbeitung.

Ergebnisse

Nach den oben genannten Transfektionsverfahren wurden α7 nAChRs und das Nacho-Chaperon-Protein in N2a-Zellen ko-exprimiert. Sowohl nicht-transfektierte als auch transfektierte Zellen wurden 24 Stunden nach der DNA-Transfektion mit αBTX-AF647 markiert. Da αBTX nicht membrandurchlässig ist, stammt alle detektierten Fluoreszenz von Rezeptoren, die auf der Plasmamembran vorhanden sind. In Abbildung 2A,A′ wurde wie erwartet eine schwache αBTX-AF6...

Diskussion

Die vorgestellten Methoden zur Expression und Quantifizierung von nAChR-Untereinheiten in N2a-Zellen von Säugetieren adressieren langjährige Herausforderungen bei der Erreichung einer schnellen (~24 H) und reichlich vorhandenen nAChR-Membranexpression (> 60 %) der Plasmamembran für Arzneimittelentwicklung, Lokalisierung und Handelsstudien. Eine zentrale Stärke dieses Protokollsets ist seine Anpassungsfähigkeit sowohl für homomere (α7) als auch heteromere (α4β2) nAChR, und er ist wahrsche...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,25 % Trypsin-EDTA (1X)	Gibco	25200-056	Zellabtrennungsreagenz
Alpha-Bungarotoxin Alexa Fluor 647	Invitrogen	B35450	Alpha-Bungarotoxin-Konjugat
BSL-Level 1 Biosicherheitskabinett	Nuaire	NU-425-400	Arbeitsbereich für sterile Zellkulturen
Calciumchlorid	Aventor/VWR	BDH9224	Pufferkomponente
D-(+)-Glukose	MilliPore Sigma	G8270	Pufferkomponente
EMEM mit L-Glutamin	ATCC	30-2003	Zellmedium
Endotoxinfreie DNA	Hergestellt im Haus mit Zymo-Bausätzen	Nicht anwendbar	nAChR-DNAs, die für zelltransienten Transfektionen verwendet werden sollen
Endotoxinfreie Mikrozentrifugenröhren, 0,5 mL&nbl;	Aventor/VWR	89000-010	DNA- und Transfektionsvorbereitung
Endotoxinfreie Mikrozentrifugenröhren, 1,5 mL&nbl;	Aventor/VWR	20170-038	DNA- und Transfektionsvorbereitung
Fetales Rinderserum	Aventor/VWR	97068-085	Serumpräparat
Fluoview FV10i	Olympus	FV10i	Konfokalmikroskop
MatTek-Schüsseln mit Glasboden	MatTek	P35GC-0-10-C	Bildgeräte
GraphPad Prism v. 10	GraphPad-Prisma	https://www.graphpad.com/features	Datenanalyse-Software
HEPES	MilliPore Sigma	H3375	Pufferkomponente
Lipofectamin 2000	Invitrogen	11668019	Transfektionsreagenz
Magnesiumchloridhexahydrat	Thermowissenschaftlich	413410025	Pufferkomponente
MES-Hydrat	MilliPore Sigma	M5287	Pufferkomponente
mTagBFP2-pBAD	AddGene	54572	Kontroll-DNA soll für zelltransienten Transfektion verwendet werden
Neuro 2 a (N2a) Zellen	Sammlung der amerikanischen Typkultur	CCL-131	Zellen, die für DNA-Transfektionen und nAChR-Expression verwendet werden
Opti-MEM	Gibco	31985-070	Reduziertes Serummedium
Penicillin/Streptomycin	Aventor/VWR	K952-100mL	Antibiotikum
Peristaltikpumpe	Gilson	MiniPuls3	Pufferänderungen beim Imaging
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Qualitätsbiologisch	119-069-131	Kochsalzpuffer
Pipethilfe	Drummond	140084	Präziser Flüssigkeitstransfer
Pipetspitzen (steril und endotoxinfrei, 1000 μL)	Rainin	30389216	Präziser Flüssigkeitstransfer
Pipetspitzen (steril und endotoxinfrei, 20 μL)	Rainin	30389229	Präziser Flüssigkeitstransfer
Pipetspitzen (steril und endotoxinfrei, 250 μL)	Rainin	30389246	Präziser Flüssigkeitstransfer
Pipetten, P10	Rainin	L-10XLS	Präziser Flüssigkeitstransfer
Pipetten, P100	Rainin	L-100XLS	Präziser Flüssigkeitstransfer
Pipetten, 1000 Pesos	Rainin	L-1000XLS	Präziser Flüssigkeitstransfer
Kaliumchlorid	MilliPore Sigma	P3911	Pufferkomponente
Serologische Pipeten (steril und endotoxinfrei, 10 ML)	Aventor/VWR	89130-898	Präziser Flüssigkeitstransfer
Serologische Pipeten (steril und endotoxinfrei, 25 ml)	Aventor/VWR	89130-900	Präziser Flüssigkeitstransfer
Serologische Pipets (steril und endotoxinfrei, 5 ml)	Aventor/VWR	76201-710	Präziser Flüssigkeitstransfer
Serologische Pipeten (steril und endotoxinfrei, 50 ml)	Aventor/VWR	75816-088	Präziser Flüssigkeitstransfer
Natriumchlorid	Aventor/VWR	BDH9286	Pufferkomponente
Tissue Culture Flask	Falcon	353109	Gerichte anbauen
ZymoPure II Plasmid Maxiprep Kit	ZYMO-FORSCHUNG	D4203-A + D4203-B	Produktion endotoxinfreier DNA
α 4-SEP	ThermoFisher Scientific GeneArt Gensynthese Services	https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/c-misc/geneart.html	Individuelle Gensynthesedienste
α 7-pHuji	Twist Bioscience	https://www.twistbioscience.com/	Individuelle Gensynthesedienste
Β 2-pHuji	ThermoFisher Scientific GeneArt Gensynthese Services	https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/c-misc/geneart.html	Individuelle Gensynthesedienste