Forschungsartikel

ML385 schwächt die maligne Progression von Kieselsäure-induzierten Lungenadenokarzinomzellen über den ROS/NRF2-Autophagie-Achsenweg ab

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DOI:

10.3791/69382

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31. Oktober 2025

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1School of Medicine, Anhui University of Science and Technology, 2Department of Medical Laboratory, Huaian Hospital of Huaian City, 3Department of Pathology, The Affiliated Huai'an NO.1 People's Hospital of Nanjing Medical University, 4Department of Medical Laboratory, The Affiliated Huai'an NO.1 People's Hospital of Nanjing Medical University, 5Department of Pediatrics, The Affiliated Huai'an NO.1 People's Hospital of Nanjing Medical University, 6Department of Anesthesiology, The Affiliated Huai'an NO.1 People's Hospital of Nanjing Medical University, 7Key Laboratory of Industrial Dust Deep Reduction and Occupational Health and Safety of Anhui Higher Education Institutes, 8Department of Blood Transfusion, Shanghai Pudong New Area People's Hospital

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In dieser Studie wird anhand von Tier- und Zellmodellen untersucht, ob der NRF2-Inhibitor ML385 die Siliziumdioxid-induzierte maligne Progression des Lungenadenokarzinoms über den ROS/NRF2-Autophagie-Achsenweg abschwächt.

Zusammenfassung

Die Exposition gegenüber Kieselsäure ist mit einem erhöhten Risiko für ein Lungenadenokarzinom verbunden, aber ihr molekularer Mechanismus bleibt unklar. Ziel dieser Studie ist es, ein wiederholbares experimentelles Protokoll zu etablieren, um zu untersuchen, wie der nukleare Faktor Erythroid 2-related factor 2 (NRF2)-Inhibitor ML385 die Siliziumdioxid-induzierte maligne Progression des Lungenadenokarzinoms hemmt, indem er den ROS/NRF2-Autophagie-Achsenweg reguliert. Zunächst wurde ein Silikosemodell durch intranasale Perfusion von Silica-Suspension in C57BL/6-Mäusen etabliert. Der Grad der Lungenfibrose wurde durch Masson-Färbung bestimmt, die Infiltration von Immunzellen mittels Immunfluoreszenz analysiert und die Expression von NRF2, Cyclin-abhängiger Kinase 1 (CDK1) und spannungsabhängigem Anionenkanal 1 (VDAC1) im Lungengewebe immunhistochemisch nachgewiesen. Anschließend wurde die Makrophagen-Zelllinie RAW264.7 in in vitro mit Kieselsäure behandelt. Der autophagische Fluss und der oxidative Stress wurden mit Hilfe von LC3-Lysosomen-Kolokalisations- und ROS-Sonden bewertet, und die Intervention wurde mit dem NRF2-Inhibitor ML385 durchgeführt. Schließlich wurden die Auswirkungen von ML38 auf die Migration, Invasion und Apoptose von Lungenadenokarzinomzellen mittels Scratch-Assay, Zellen, die Poren einer bestimmten Größe passieren, und Durchflusszytometrie analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass Kieselsäure bei Mäusen Lungenfibrose, Immunzellinfiltration und Hochregulierung von NRF2, CDK1 und VDAC1 (p < 0,001) induzieren und den autophagischen Fluss von Makrophagen hemmen und die ROS-Spiegel senken kann. ML385 kann diese Effekte umkehren (p < 0,05). Dieses Protokoll bietet einen vollständigen experimentellen Prozess von der In-vivo-Modellkonstruktion bis zur In-vitro-Mechanismusforschung und bietet einen operationellen technischen Weg zur Untersuchung des molekularen Mechanismus des Siliziumdioxid-bedingten Lungenadenokarzinoms und therapeutischer Strategien, die auf NRF2 abzielen.

Einleitung

Das Lungenadenokarzinom ist mit schätzungsweise 2 Millionen neuen Fällen und 1,76 Millionen Todesfällen pro Jahr die häufigste krebsbedingte Todesursache weltweit1. In den letzten Jahren ist die Inzidenz von Lungenadenokarzinomen bei Menschen, die nie geraucht haben, gestiegen, was mit Umweltfaktoren wie Luftverschmutzung zusammenhängen kann2. Kieselsäure ist ein häufiger Umweltschadstoff und wurde als potenzieller pathogener Faktor für das Adenokarzinom der menschlichen Lungeidentifiziert 3. Kieselsäure kann anhaltende chronische Entzündungen verursachen, die zur Infiltration von Makrophagen, Lymphozyten und Neutrophilen sowie zur Freisetzung von reaktiven Sauerstoffspezies und Entzündungsfaktoren führen4. Dieses langanhaltende entzündliche Mikromilieu begünstigt das Auftreten von Lungenadenokarzinomen 5,6. Obwohl der Zusammenhang zwischen Siliziumdioxidexposition und Lungenadenokarzinom bestätigt wurde, ist sein spezifischer molekularer Mechanismus nicht vollständig geklärt.

Der Transkriptionsfaktor NRF2, der vom NFE2L2-Gen kodiert wird, spielt eine entscheidende Rolle als Hauptregulator bei der Aufrechterhaltung der zellulären Redoxhomöostase als Reaktion auf oxidativen Stress 7,8. Unter normalen Umständen wird NRF2 durch den KEAP1-CUL3-Ubiquitin-Ligase-Komplex markiert und abgebaut. Unter der Stimulation durch oxidativen Stress oder elektrophile Substanzen wird die Aktivität von KEAP1 gehemmt, so dass sich NRF2 stabil ansammeln und in den Zellkern gelangen kann, wodurch die Abwehr- und Regulationsfunktion des Kerns9 ausgeübt wird. Nichtsdestotrotz kann eine übermäßige NRF2-Aktivierung in der Tumormikroumgebung die Glykolyse und das Überleben der Tumorzellen verbessern, indem sie die ROS-Akkumulation stoppt und die apoptotische Resistenz erhöht10,11. Studien haben gezeigt, dass die Exposition gegenüber Siliziumdioxid zu einer abnormalen Aktivierung des NRF2-Signalwegs führen kann12,13. Daher kann die Ausrichtung auf NRF2 eine wirksame Strategie sein, um in das maligne Fortschreiten des durch Siliziumdioxidinduzierten Lungenadenokarzinoms einzugreifen.

Ziel dieser Studie ist es zu klären, ob der NRF2-Inhibitor ML385 die Kieselsäure-induzierte maligne Progression des Lungenadenokarzinoms hemmt, indem er den ROS/NRF2-Autophagie-Achsenweg reguliert. Wir etablierten ein Siliziumdioxid-induziertes Mausmodell, um die Schlüsselmerkmale der Krankheit zu reproduzieren, und verwendeten in vitro experimentelle Methoden, um die Interaktion zwischen Makrophagen und Tumorzellen zu untersuchen. Wir fanden heraus, dass Kieselsäure die Expression von Entzündungs- und Immunmolekülen induziert und die Tumorbildung über den ROS/NRF2-Autophagie-Achsenweg weiter fördert. Bei Verwendung des NRF2-Inhibitors (ML385) verlangsamte sich die fördernde Wirkung von Kieselsäure auf die Tumorbildung, was darauf hindeutet, dass der NRF2-Inhibitor eine Rolle bei der Behandlung von Kieselsäure-induzierten Lungentumoren spielen könnte.

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Protokoll

Alle Spenderblöcke wurden aus pathologischen Archivproben gewonnen, die zwischen 2016 und 2018 am angeschlossenen Huai'an NO.1 People's Hospital der Nanjing Medical University gesammelt wurden. Die Proben wurden vor der Verwendung anonymisiert und in Übereinstimmung mit den genehmigten Protokollen verarbeitet. Die Ethikkommission des angeschlossenen Huai'an No.1 People's Hospital der Nanjing Medical University, KY-2024-250-01. Die Zucht, Entsorgung und Anwendung von Versuchsmäusen hält sich strikt an die Vorschriften über die Verabreichung von Versuchstieren und internationale Richtlinien.

Aufbau eines Siliziumdioxid-induzierten Mausmodells
Zubereitung von Mäusen und Kieselsäuresuspension: Männchen C57BL/6 Mäuse, 6-8 Wochen alt, in einem Tierraum mit einer Raumtemperatur von 20-25 °C und einem 12 h hellen / 12 h dunklen Zyklus aufziehen. Zur Herstellung der Silikonstaubsuspension wurden 300 mg Silikonstaubpulver genau gewogen und in 10 mL steriler 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung suspendiert. Anschließend wurde das Gemisch kräftig vortext und 5 Minuten lang oszilliert und anschließend 30 Minuten lang in einem Wasserbad-Ultraschallgerät mit Ultraschall behandelt, um eine gleichmäßige Verteilung der Partikel zu gewährleisten und eine Aggregation zu verhindern. Die Endkonzentration dieser Reservesuspension beträgt 30 mg/ml. Sterilisieren Sie es durch Autoklavieren bei 121 °C für 30 Minuten. Vor jedem Gebrauch ist es notwendig, 2-3 Minuten lang zu wirbeln und erneut zu schütteln, um abgesetzte Partikel wieder zu suspendieren.

Mäuse inhalierten die Kieselsäuresuspension über die Nase. Mit der Mikropipette wurde die Lösung langsam und tropfenweise in die Nasenhöhle der Mäuse eingeführt. Die Mäuse wurden in 6 Gruppen mit jeweils 20 Mäusen eingeteilt. Das Inhalationsvolumen jeder Gruppe betrug 10 μl, 30 μl, 50 μl, 70 μl, 90 μl und 200 μl mit einer Konzentration von 30 mg/ml, einmal täglich an 40 aufeinanderfolgenden Tagen. Fassen Sie beim Peruszieren mit Daumen und Zeigefinger der linken Hand die Haut hinter dem Ohr der Maus und fixieren Sie mit den anderen Fingern den Körper und den Schwanz der Maus. Stellen Sie sicher, dass sich die Maus in Rückenlage befindet und den Kopf leicht nach hinten geneigt hat, damit die Suspension auf natürliche Weise in die Atemwege eingeatmet werden kann. Wir fanden heraus, dass es nach dem zweiten Tag der Inhalation von 10 μl, 30 μl, 50 μl und 70 μl Kieselsäuresuspension bei Mäusen kein Todesereignis gab, während es nach dem zweiten Tag der Inhalation von 90 μl und 200 μl Kieselsäuresuspension bei Mäusen ein Todesereignis gab. Daher betrug das maximale Volumen der Siliziumdioxid-Inhalation bei Mäusen 70 μl pro Tag.

Der Umgang mit kristallinem Siliziumdioxid muss in einer Biosicherheitswerkbank oder einem Abzug durchgeführt werden, und während des gesamten Prozesses müssen N95-Masken, staubdichte Schutzbrille, Nitrilhandschuhe und Schutzkleidung getragen werden. Bei der Herstellung der Suspension sollten die Bewegungen sanft sein, und es sollte eine Wiegekammer verwendet werden, um die Bildung von Aerosolen zu vermeiden. Alle Kieselsäure-Kontaktabfälle sollten in verschlossenen Behältern mit Durchstoßfestigkeit gesammelt und gemäß den Vorschriften für gefährliche chemische Abfälle entsorgt werden. Es ist strengstens verboten, es mit dem allgemeinen Müll zu vermischen oder in die Kanalisation zu werfen. Biologische Abfälle, wie z. B. Zellkulturmedium, sollten in speziellen Mülleimern mit Desinfektionsmitteln gesammelt und unter hohem Druck sterilisiert werden. Tierkadaver und Gewebe sollten in Säcke mit biologischen Abfallstoffen gelegt und unter hohem Druck sterilisiert werden, um eine unbedenkliche Behandlung zu ermöglichen.

Evaluierung des Erfolgs des Siliziumdioxid-induzierten Mausmodells. Beurteilen Sie die Tiere zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Inhalation von Kieselsäure, nämlich am 3., 14. und 40. Tag. Die Mäuse wurden in professionelle Tiereuthanasiegeräte gelegt, und Kohlendioxid wurde mit einer Füllrate von 30 bis 50 Vol.-Min. eingeführt. Sie waren ununterbrochen exponiert, bis sie aufhörten zu atmen. Nach Bestätigung des Todes wurden weitere Operationen durchgeführt. Das Lungengewebe wurde entfernt. Das Lungengewebe wurde 48 h lang in 4%iger Paraformaldehydlösung bei Raumtemperatur fixiert. Nach der Fixierung wurde das Gewebe mit Gradientenalkohol dehydriert, mit Xylol transparent gemacht und anschließend in Paraffin eingebettet. Die kontinuierlichen Schnitte wurden mit einer Paraffin-Trennmaschine mit einer Dicke von 4-5 μm für die anschließende histologische Färbung und immunhistochemische Analyse hergestellt. Das Lungengewebe benötigt keine Entkalkungsbehandlung. Es wurde eine pathologische Untersuchung des Lungengewebes durchgeführt, um die erfolgreiche Modellgenerierung zu evaluieren. Die Erfolgskriterien für die Konstruktion von Silikosemodellen waren wie folgt: signifikante Lungenentzündung, Fibrose und das Auftreten von Silikoseknötchen.

Analyse der Immunzellinfiltration im Kieselsäure-induzierten Mausmodell
Das Lungengewebe von Mäusen am Tag 14 nach der Inhalation von Siliziumdioxid wurde mit fluoreszierenden Markern gefärbt, die CD3e (Verdünnungsverhältnis 1:200), CD8a (Verdünnungsverhältnis 1:200), CD86 (Verdünnungsverhältnis 1:200), F4/80 (Verdünnungsverhältnis 1:200) und Nk1.1 (Verdünnungsverhältnis 1:200) enthielten, um Immunzellen sichtbar zu machen. Fixieren Sie Zell- oder Gewebeschnitte und blockieren Sie sie 1 h lang mit 5 % Rinderserumalbumin (BSA), um unspezifische Bindungen zu reduzieren. Verwenden Sie normales Serum aus der gleichen Spezies wie der blockierende Antikörper, verdünnen Sie das Serum mit PBS im Verhältnis 1:10 und geben Sie 100 μl verdünntes Serum in die Probe. Dann 30 Minuten lang bei Raumtemperatur blockieren, damit das Serum endogene Antikörper blockieren kann. Nach dem Versiegeln 2x vorsichtig mit PBS spülen. Die Primärantikörper, die CD3e (Verdünnungsverhältnis 1:200), CD8a (Verdünnungsverhältnis 1:200), CD86 (Verdünnungsverhältnis 1:200), F4/80 (Verdünnungsverhältnis 1:200) und Nk1.1 (Verdünnungsverhältnis 1:200) enthielten, wurden über Nacht bei 4 °C oder bei Raumtemperatur für 1-2 h inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS wurde der fluoreszierende Sekundärantikörper zugegeben und 1 h im Dunkeln inkubiert.

Masson-Färbung und immunhistochemische Analyse
Paraffinschnitte wurden mit Xylol entwachst und mit Gradientenalkohol hydratisiert, und dann wurde die Antigengewinnung in Natriumcitratpuffer mit einem pH-Wert von 6,0 durch thermische Hochdrucksanierung durchgeführt. Für die thermische Hochdrucksanierung legen Sie die in Reparaturpuffer getränkten Gewebescheiben für 8-12 min in die Mikrowelle bei mittlerer Hitze. Die endogene Peroxidaseaktivität wurde mit 3% Wasserstoffperoxidlösung für 20 min blockiert, und dann wurde die unspezifische Bindungsstelle mit 5% BSA bei Raumtemperatur für 30 min blockiert. Fügen Sie die primären Antikörper NRF2 (1:200), CDK1 (1:400) und VDAC1 (1:500) hinzu und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 °C. Nach 3x Waschen mit PBS den HRP-markierten Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (1:500) zugeben und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Paraffinschnitte wurden einer DAB-Färbung, einer Hämatoxylin-Gegenfärbung, einer Dehydratisierungstransparenz und einer neutralen Gelversiegelung unterzogen, um die entsprechenden molekularen immunhistochemischen Ergebnisse zu erhalten. Wenn DAB für die Farbentwicklung verwendet wird, sollte die moderate Farbentwicklung bräunlichgelb bis bräunlichbraun sein, und der Hintergrund sollte klar sein. Sowohl eine übermäßige (dunkelbraune) als auch eine unzureichende (hellgelbe) Farbentwicklung erfordern eine Optimierung der Farbentwicklungszeit.

Der Grad der Lungenfibrose wurde semi-quantitativ mit der Ashcroft-Scoring-Methode15 analysiert: Masson-gefärbte Schnitte wurden unter einem Mikroskop mit 100-facher Vergrößerung beobachtet und das Lungengewebe nach dem Zufallsprinzip in 8 Regionen unterteilt. Jede Region wurde nach dem Grad der Fibrose (0-8 Punkte) bewertet, wobei die Endnote der Durchschnitt aller Regionen ist: 0 Punkte (normales Lungengewebe), 1-2 Punkte (leichte Fibrose), 3-4 Punkte (moderate Fibrose), 5-8 Punkte (schwere Fibrose).

Die immunhistochemischen Ergebnisse wurden mit Hilfe der Bildsoftware quantitativ analysiert. Fünf Felder mit hoher Vergrößerung wurden nach dem Zufallsprinzip ausgewählt, und der durchschnittliche optische Dichtewert (MOD) jedes Feldes wurde als Indikator für das Proteinexpressionsniveau gemessen.

Untersuchung des Einflusses von Kieselsäure und ML385 auf Autophagie und ROS in RAW264.7-Zellen
Sowohl RAW264.7- als auch A549-Zellen (zur Verfügung gestellt von der Anhui University of Science and Technology) wurden mit DMEM-Medium mit hohem Glukosegehalt kultiviert, das mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % bispezifischer Penicillin-Streptomycin-Antikörperlösung ergänzt wurde. Die 1 x 107 Zellen wurden gleichmäßig in einem Inkubator mit konstanter Temperatur bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert. 5 μl 30 mg/ml Kieselsäuresuspension wurden zu 1 x 105 Zellen/ml RAW264,7-Zellen gegeben. Nach einer Inkubation von 24 Stunden wurden die Zellen mit PBS 3x gespült, und die Autophagie und der oxidative Stress wurden mit ROS-, LC3- und Lysosomensonden nachgewiesen. Gleichzeitig wurde ML38516, ein Inhibitor von NRF2, verwendet, um die Expression von NRF2 zu hemmen (Endkonzentration von ML385: 5 mM/L). Autophagie und oxidativer Stress wurden gemäß den oben genannten experimentellen Schritten nachgewiesen. Der oxidative Stress und der Autophagiefluss der beiden Gruppen wurden statistisch analysiert.

Immunhistochemische Analyse von VDAC1-, CDK1-, p62 - und NRF2-Expressionen in Lungenadenokarzinomgewebe
Die Expression von VDAC1, CDK1, p62 und NRF2 wurde bei 30 Patienten überprüft. Gewebe mit Lungenadenokarzinom und angrenzenden gesunden Geweben wurden aus dem angeschlossenen Huai'an NO.1 People's Hospital der Nanjing Medical University gewonnen und durch Immunhistochemie (IHC) analysiert. Die Ergebnisse der IHC und der Lungenfibrose wurden statistisch ausgewertet. Sammeln Sie Patientendaten anhand von Patienteninformationen im Krankenhaussystem. Die spezifischen Versuchsschritte sind wie folgt: Paraffinschnitte wurden mit Xylol entwachst und mit Gradientenalkohol hydratisiert, und dann wurde die Antigensanierung in Natriumcitratpuffer mit pH 6,0 durch thermische Hochdrucksanierung durchgeführt. Die endogene Peroxidaseaktivität wurde mit 3% Wasserstoffperoxidlösung für 20 min blockiert, und dann wurde die unspezifische Bindungsstelle mit 5% BSA bei Raumtemperatur für 30 min blockiert. Fügen Sie die primären Antikörper NRF2 (1:200), CDK1 (1:400), p62 (1:500) und VDAC1 (1:500) hinzu und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 °C. Nach 3x Waschen mit PBS HRP-markierten Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (1:500) zugeben und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. DAB-Farbentwicklung, Hämatoxylin-Gegenfärbung, dehydrierte transparente, neutrale Zahnfleischversiegelung. Wenn DAB für die Farbentwicklung verwendet wird, sollte die moderate Farbentwicklung bräunlichgelb bis bräunlichbraun sein, und der Hintergrund sollte klar sein. Sowohl eine übermäßige (dunkelbraune) als auch eine unzureichende (hellgelbe) Farbentwicklung erfordern eine Optimierung der Farbentwicklungszeit.

Analyse der Zellmigration und -invasion
Es wurde untersucht, wie sich ML385 und der Überstand aus der Co-Inkubation von Kieselsäure mit RAW264.7-Zellen auf die Zellmigration und -invasion nach der Inkubation mit der Lungenadenokarzinom-Zelllinie A549 auswirken. Der Überstand von RAW264.7-Zellen, die 24 h lang mit Siliziumdioxid kokultiviert wurden, wurde den A549-Zellen zugesetzt. Die Zellen wurden in die Kieselsäuregruppe, die Kieselsäure+ML385-Gruppe und die PBS-Gruppe unterteilt. Die Kieselgelgruppe: 5 μl 30 mg/ml Kieselsäuresuspension wurden zu 1 x 105 Zellen/ml von RAW264,7-Zellen gegeben. Nach einer Inkubation von 24 Stunden ist der Zellüberstand für die spätere Verwendung zu entfernen. Die Silica+ML385-Gruppe: 5 μl 30 mg/ml Kieselsäuresuspension und eine Endkonzentration von 5 mM/l ML385 wurden zu 1 x 105 Zellen/ml RAW264.7-Zellen gegeben. Nach einer Inkubation von 24 Stunden ist der Zellüberstand für die spätere Verwendung zu entfernen. PBS-Gruppe: 5 μl PBS wurden zu 1 x 105 Zellen/ml RAW264.7 Zellen hinzugefügt. Nach einer Inkubation von 24 Stunden ist der Zellüberstand für die spätere Verwendung zu entfernen. Während des Scratch-Assays wurden A549-Zellen zunächst in 12-Well-Platten mit einer Dichte von 5 x 105 pro Well ausgesät. Nachdem die Zellen zu 95 % bis 100 % fusioniert waren, wurden die Monolayer-Zellen mit der Spitze einer sterilen 200-μl-Pipette verkratzt. Die exfolierten Zellen wurden schonend mit PBS abgewaschen. Anschließend wurden die Kulturbedingungen so geändert, dass sie 1 % FBS-Basismedium und die Überstände jeder Behandlungsgruppe umfassten, um die Lebensfähigkeit der Zellen während des 7-tägigen Versuchszeitraums zu erhalten. Bilder der gleichen Position wurden unter einem inversen Mikroskop um 0 h (Tag 0) bzw. am 7. Tag (Tag 7) nach dem Kratzer aufgenommen. Schließlich wurde der Scratch-Bereich quantitativ analysiert und die Scratch-Closure-Rate mit Hilfe der ImageJ-Software berechnet, um die Wirkung des Überstands aus verschiedenen Behandlungsgruppen auf die Migrationsfähigkeit von A549-Zellen zu bewerten.

In den Zellen, die durch Poren spezifischer Größe gehen, wurde eine 8 μm Polycarbonat-Membrankammer verwendet, wobei die obere Kammermembran mit Gel vorbeschichtet war, das die extrazelluläre Umgebung simulierte und im Verhältnis 1:8 verdünnt wurde, um eine Basalmembranbarriere zu konstruieren. A549-Zellen wurden in einer Suspension resuspendiert, die durch Mischen von serumfreiem Medium mit den Überständen jeder Behandlungsgruppe im Verhältnis 1:1 hergestellt wurde, und dann in der oberen Kammer (2 x 10,4 Zellen pro Kammer) inokuliert. In der unteren Kammer wurde eine Lösung, die durch Mischen eines Mediums, das 20 % FBS enthielt, mit den Überständen der entsprechenden Behandlungsgruppen (Silica+ML385-Gruppe, Silica-Gruppe und PBS-Gruppe) im gleichen Verhältnis hergestellt wurde, als chemischer Lockstoff zugegeben. Die Überstände der entsprechenden Behandlungsgruppen wurden durch Absaugen durch eine Pipettierpistole in RAW264.7 Zellphagozytose von Kieselsäure entnommen. Nachdem die Zellen 7 Tage lang kontinuierlich bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert wurden, wurden die nicht-invasiven Zellen in der oberen Kammer mit Wattestäbchen entfernt, und die Zellen, die die Membran durchdrungen und die untere Kammer erreicht hatten, wurden mit 4 % Paraformaldehyd fixiert und mit 0,1 % Kristallviolett gefärbt. Schließlich wurde die Anzahl der invasiven Zellen zufällig aus 5 Gesichtsfeldern mit einem Lichtmikroskop ausgewählt.

Analyse des Einflusses von Siliziumdioxid und ML385 auf die Apoptose von A549-Zellen mittels Durchflusszytometrie
Zellvorbereitung und -gruppierung: Es wurden A549-Zellen gesammelt, die mit den Überständen jeder Behandlungsgruppe (PBS-Gruppe, Kieselsäuregruppe, Kieselsäure + ML385-Gruppe) behandelt wurden. Die Zellen wurden 2x schonend mit vorgekühltem PBS gewaschen, dann in 1x Bindungspuffer resuspendiert und die Zelldichte auf 1 x 106 Zellen pro Röhrchen/100 μl eingestellt. Dann wurden 5 μl Annexin V-FITC und 5 μl PI-Färbelösung in die Zellsuspension gegeben, zum Mischen vorsichtig vortexed und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Nach der Inkubation wurden 400 μl 1x Bindungspuffer in jedes Röhrchen gegeben und sofort auf der Maschine getestet. Der Nachweis erfolgte mit einem Durchflusszytometer. Angeregt durch einen 488-nm-Laser wurde das Fluoreszenzsignal von Annexin V-FITC über den FITC-Kanal und das Fluoreszenzsignal von PI über den PE-Kanal gesammelt. Vor dem Experiment wurden Einzelfärbeproben für die Anpassung der Fluoreszenzkompensation verwendet, um spektrale Überlappungen zu eliminieren. Bei der Datenanalyse wird zunächst die Zielzellpopulation im FSC-A/SSC-A-Streudiagramm abgegrenzt und Fragmente eliminiert. Anschließend wurden Zelladhäsionen mit Hilfe des FSC-H/FSC-A-Streudiagramms ausgeschlossen; Schließlich wurde ein Gate zur Unterscheidung zwischen lebenden Zellen, frühen apoptotischen Zellen, späten apoptotischen/nekrotischen Zellen und mechanisch geschädigten Zellen eingerichtet. Die Daten wurden mit der FlowJo V10-Software erfasst und analysiert.

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Ergebnisse

Modell einer Kieselsäure-Maus
In Abbildung 1 wurde den Mäusen intranasal Kieselsäure in einer Dosierung von 30 mg/ml und 70 μl an 40 aufeinanderfolgenden Tagen verabreicht, was sicherstellte, dass bei den Mäusen keine Todesfälle auftraten und das Kieselsäure-Mausmodell erfolgreich etabliert werden konnte. In der Zwischenzeit wurden Mäusesonden mit PBS als Negativkontrollen verwendet. Ziel war es, den Einfluss des Vorgangs und des Lösungsmittels selbst zu eliminieren und s...

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Diskussion

Das Lungenadenokarzinom ist weltweit eine der Hauptursachen für krebsbedingte Todesfälle, und seine Inzidenz- und Mortalitätsraten steigen von Jahrzu Jahr 17. Kieselsäure wird von der Internationalen Agentur für Krebsforschung als krebserregend der Klasse 1 für den Menschen eingestuft, und das Risiko eines Lungenadenokarzinoms steigt mit der kumulativen beruflichen Exposition 18,19,20,21.

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Vielen Dank an die Teammitglieder für ihre Unterstützung und ihren Beitrag zu dieser Studie. Diese Studie wurde vom Key Laboratory of Industrial Dust Deep Reduction and Occupational Health and Safety der Anhui Higher Education Institutes (NO. AYZJSGXLK202202006), Shanghai Pudong New Area People's Hospital Talent Introduction Start-up Fund (NO. PRYYH202501) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
BeyoGold TranswellBeyotime Biotechnologie FTW067-48lnsTranswell
CD3eBD Bioscience561827FITC Hamster Anti-Maus CD3e(145-2C11)
CD86BD Bioscience105013CD86
CD8aBD Bioscience100713CD8a
CDK1Abcamab133327Anti-CDK1
Zell-Apoptose-Detektions-KitBeyotime Biotechnologie C1062LApoptose-Detektion
DAPIBeyotime Biotechnologie P0131-25mlDAPI
EinbettmaschineP.S.J MEDIZINISCHBM450AEinbettmaschine
F4/80BD Bioscience123109F4/80
Vollautomatischer GewebedehydratorLeica BiosystemsASP3005Vollautomatischer Gewebedehydrator
Glasmikroskop-ObjektträgerCitotest250124A1Glasmikroskop-Objektträger
H& E-FarbstoffBeyotime Biotechnologie C0105MH& E-Farbstoff
IHC-KitAbsin-Biotechnologieabs996-5mlIHC-Kit
LC3-SondeBeyotime Biotechnologie C3018MLC3-Sonde
Niedrigprofil-Mikrotom-KlingenThermo Fisher3052835Niedrigprofil-Mikrotom-Klingen
LysosomsondeBeyotime Biotechnologie C1046Lysosomsonde
TextmarkerDeliSK109Textmarker
Masson-FarbstoffBeyotime Biotechnologie C0189MMasson-Farbstoff
Matrix-GelBeyotime Biotechnologie C0371-5mlMatrizenklebstoff
MikrotomLeica BiosystemsHistoCore BIOCUTMikrotom
ML385Abcamab287109NRF2-Inhibitor
NK1.1BD Bioscience561117NK1.1
NRF2Abcamab 1809YAnti-NRF2
S. 62Abcamab20735Anti-p62
ParaffinSolarbioYA0012Paraffin
Testkit für reaktive SauerstoffspeziesBeyotime Biotechnologie S0033MROS-Sonde
KieselerdeSigma AldrichS5631Kristallines Siliziumdioxid
VDAC1Abcamab34726Anti-VDAC1

Referenzen

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