ML385 schwächt die maligne Progression von Kieselsäure-induzierten Lungenadenokarzinomzellen über den ROS/NRF2-Autophagie-Achsenweg ab

Das Lungenadenokarzinom ist mit schätzungsweise 2 Millionen neuen Fällen und 1,76 Millionen Todesfällen pro Jahr die häufigste krebsbedingte Todesursache weltweit¹. In den letzten Jahren ist die Inzidenz von Lungenadenokarzinomen bei Menschen, die nie geraucht haben, gestiegen, was mit Umweltfaktoren wie Luftverschmutzung zusammenhängen kann². Kieselsäure ist ein häufiger Umweltschadstoff und wurde als potenzieller pathogener Faktor für das Adenokarzinom der menschlichen Lunge^{identifiziert 3}. Kieselsäure kann anhaltende chronische Entzündungen verursachen, die zur Infiltration von Makrophagen, Lymphozyten und Neutrophilen sowie zur Freisetzung von reaktiven Sauerstoffspezies und Entzündungsfaktoren führen⁴. Dieses langanhaltende entzündliche Mikromilieu begünstigt das Auftreten von Lungenadenokarzinomen ^5,6. Obwohl der Zusammenhang zwischen Siliziumdioxidexposition und Lungenadenokarzinom bestätigt wurde, ist sein spezifischer molekularer Mechanismus nicht vollständig geklärt.

Der Transkriptionsfaktor NRF2, der vom NFE2L2-Gen kodiert wird, spielt eine entscheidende Rolle als Hauptregulator bei der Aufrechterhaltung der zellulären Redoxhomöostase als Reaktion auf oxidativen Stress ^7,8. Unter normalen Umständen wird NRF2 durch den KEAP1-CUL3-Ubiquitin-Ligase-Komplex markiert und abgebaut. Unter der Stimulation durch oxidativen Stress oder elektrophile Substanzen wird die Aktivität von KEAP1 gehemmt, so dass sich NRF2 stabil ansammeln und in den Zellkern gelangen kann, wodurch die Abwehr- und Regulationsfunktion des Kerns⁹ ausgeübt wird. Nichtsdestotrotz kann eine übermäßige NRF2-Aktivierung in der Tumormikroumgebung die Glykolyse und das Überleben der Tumorzellen verbessern, indem sie die ROS-Akkumulation stoppt und die apoptotische Resistenz erhöht^10,11. Studien haben gezeigt, dass die Exposition gegenüber Siliziumdioxid zu einer abnormalen Aktivierung des NRF2-Signalwegs führen kann^12,13. Daher kann die Ausrichtung auf NRF2 eine wirksame Strategie sein, um in das maligne Fortschreiten des durch Siliziumdioxid^induzierten Lungenadenokarzinoms einzugreifen.

Ziel dieser Studie ist es zu klären, ob der NRF2-Inhibitor ML385 die Kieselsäure-induzierte maligne Progression des Lungenadenokarzinoms hemmt, indem er den ROS/NRF2-Autophagie-Achsenweg reguliert. Wir etablierten ein Siliziumdioxid-induziertes Mausmodell, um die Schlüsselmerkmale der Krankheit zu reproduzieren, und verwendeten in vitro experimentelle Methoden, um die Interaktion zwischen Makrophagen und Tumorzellen zu untersuchen. Wir fanden heraus, dass Kieselsäure die Expression von Entzündungs- und Immunmolekülen induziert und die Tumorbildung über den ROS/NRF2-Autophagie-Achsenweg weiter fördert. Bei Verwendung des NRF2-Inhibitors (ML385) verlangsamte sich die fördernde Wirkung von Kieselsäure auf die Tumorbildung, was darauf hindeutet, dass der NRF2-Inhibitor eine Rolle bei der Behandlung von Kieselsäure-induzierten Lungentumoren spielen könnte.

Alle Spenderblöcke wurden aus pathologischen Archivproben gewonnen, die zwischen 2016 und 2018 am angeschlossenen Huai'an NO.1 People's Hospital der Nanjing Medical University gesammelt wurden. Die Proben wurden vor der Verwendung anonymisiert und in Übereinstimmung mit den genehmigten Protokollen verarbeitet. Die Ethikkommission des angeschlossenen Huai'an No.1 People's Hospital der Nanjing Medical University, KY-2024-250-01. Die Zucht, Entsorgung und Anwendung von Versuchsmäusen hält sich strikt an die Vorschriften über die Verabreichung von Versuchstieren und internationale Richtlinien.

Aufbau eines Siliziumdioxid-induzierten Mausmodells
Zubereitung von Mäusen und Kieselsäuresuspension: Männchen C57BL/6 Mäuse, 6-8 Wochen alt, in einem Tierraum mit einer Raumtemperatur von 20-25 °C und einem 12 h hellen / 12 h dunklen Zyklus aufziehen. Zur Herstellung der Silikonstaubsuspension wurden 300 mg Silikonstaubpulver genau gewogen und in 10 mL steriler 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung suspendiert. Anschließend wurde das Gemisch kräftig vortext und 5 Minuten lang oszilliert und anschließend 30 Minuten lang in einem Wasserbad-Ultraschallgerät mit Ultraschall behandelt, um eine gleichmäßige Verteilung der Partikel zu gewährleisten und eine Aggregation zu verhindern. Die Endkonzentration dieser Reservesuspension beträgt 30 mg/ml. Sterilisieren Sie es durch Autoklavieren bei 121 °C für 30 Minuten. Vor jedem Gebrauch ist es notwendig, 2-3 Minuten lang zu wirbeln und erneut zu schütteln, um abgesetzte Partikel wieder zu suspendieren.

Mäuse inhalierten die Kieselsäuresuspension über die Nase. Mit der Mikropipette wurde die Lösung langsam und tropfenweise in die Nasenhöhle der Mäuse eingeführt. Die Mäuse wurden in 6 Gruppen mit jeweils 20 Mäusen eingeteilt. Das Inhalationsvolumen jeder Gruppe betrug 10 μl, 30 μl, 50 μl, 70 μl, 90 μl und 200 μl mit einer Konzentration von 30 mg/ml, einmal täglich an 40 aufeinanderfolgenden Tagen. Fassen Sie beim Peruszieren mit Daumen und Zeigefinger der linken Hand die Haut hinter dem Ohr der Maus und fixieren Sie mit den anderen Fingern den Körper und den Schwanz der Maus. Stellen Sie sicher, dass sich die Maus in Rückenlage befindet und den Kopf leicht nach hinten geneigt hat, damit die Suspension auf natürliche Weise in die Atemwege eingeatmet werden kann. Wir fanden heraus, dass es nach dem zweiten Tag der Inhalation von 10 μl, 30 μl, 50 μl und 70 μl Kieselsäuresuspension bei Mäusen kein Todesereignis gab, während es nach dem zweiten Tag der Inhalation von 90 μl und 200 μl Kieselsäuresuspension bei Mäusen ein Todesereignis gab. Daher betrug das maximale Volumen der Siliziumdioxid-Inhalation bei Mäusen 70 μl pro Tag.

Der Umgang mit kristallinem Siliziumdioxid muss in einer Biosicherheitswerkbank oder einem Abzug durchgeführt werden, und während des gesamten Prozesses müssen N95-Masken, staubdichte Schutzbrille, Nitrilhandschuhe und Schutzkleidung getragen werden. Bei der Herstellung der Suspension sollten die Bewegungen sanft sein, und es sollte eine Wiegekammer verwendet werden, um die Bildung von Aerosolen zu vermeiden. Alle Kieselsäure-Kontaktabfälle sollten in verschlossenen Behältern mit Durchstoßfestigkeit gesammelt und gemäß den Vorschriften für gefährliche chemische Abfälle entsorgt werden. Es ist strengstens verboten, es mit dem allgemeinen Müll zu vermischen oder in die Kanalisation zu werfen. Biologische Abfälle, wie z. B. Zellkulturmedium, sollten in speziellen Mülleimern mit Desinfektionsmitteln gesammelt und unter hohem Druck sterilisiert werden. Tierkadaver und Gewebe sollten in Säcke mit biologischen Abfallstoffen gelegt und unter hohem Druck sterilisiert werden, um eine unbedenkliche Behandlung zu ermöglichen.

Evaluierung des Erfolgs des Siliziumdioxid-induzierten Mausmodells. Beurteilen Sie die Tiere zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Inhalation von Kieselsäure, nämlich am 3., 14. und 40. Tag. Die Mäuse wurden in professionelle Tiereuthanasiegeräte gelegt, und Kohlendioxid wurde mit einer Füllrate von 30 bis 50 Vol.-Min. eingeführt. Sie waren ununterbrochen exponiert, bis sie aufhörten zu atmen. Nach Bestätigung des Todes wurden weitere Operationen durchgeführt. Das Lungengewebe wurde entfernt. Das Lungengewebe wurde 48 h lang in 4%iger Paraformaldehydlösung bei Raumtemperatur fixiert. Nach der Fixierung wurde das Gewebe mit Gradientenalkohol dehydriert, mit Xylol transparent gemacht und anschließend in Paraffin eingebettet. Die kontinuierlichen Schnitte wurden mit einer Paraffin-Trennmaschine mit einer Dicke von 4-5 μm für die anschließende histologische Färbung und immunhistochemische Analyse hergestellt. Das Lungengewebe benötigt keine Entkalkungsbehandlung. Es wurde eine pathologische Untersuchung des Lungengewebes durchgeführt, um die erfolgreiche Modellgenerierung zu evaluieren. Die Erfolgskriterien für die Konstruktion von Silikosemodellen waren wie folgt: signifikante Lungenentzündung, Fibrose und das Auftreten von Silikoseknötchen.

Analyse der Immunzellinfiltration im Kieselsäure-induzierten Mausmodell
Das Lungengewebe von Mäusen am Tag 14 nach der Inhalation von Siliziumdioxid wurde mit fluoreszierenden Markern gefärbt, die CD3e (Verdünnungsverhältnis 1:200), CD8a (Verdünnungsverhältnis 1:200), CD86 (Verdünnungsverhältnis 1:200), F4/80 (Verdünnungsverhältnis 1:200) und Nk1.1 (Verdünnungsverhältnis 1:200) enthielten, um Immunzellen sichtbar zu machen. Fixieren Sie Zell- oder Gewebeschnitte und blockieren Sie sie 1 h lang mit 5 % Rinderserumalbumin (BSA), um unspezifische Bindungen zu reduzieren. Verwenden Sie normales Serum aus der gleichen Spezies wie der blockierende Antikörper, verdünnen Sie das Serum mit PBS im Verhältnis 1:10 und geben Sie 100 μl verdünntes Serum in die Probe. Dann 30 Minuten lang bei Raumtemperatur blockieren, damit das Serum endogene Antikörper blockieren kann. Nach dem Versiegeln 2x vorsichtig mit PBS spülen. Die Primärantikörper, die CD3e (Verdünnungsverhältnis 1:200), CD8a (Verdünnungsverhältnis 1:200), CD86 (Verdünnungsverhältnis 1:200), F4/80 (Verdünnungsverhältnis 1:200) und Nk1.1 (Verdünnungsverhältnis 1:200) enthielten, wurden über Nacht bei 4 °C oder bei Raumtemperatur für 1-2 h inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS wurde der fluoreszierende Sekundärantikörper zugegeben und 1 h im Dunkeln inkubiert.

Masson-Färbung und immunhistochemische Analyse
Paraffinschnitte wurden mit Xylol entwachst und mit Gradientenalkohol hydratisiert, und dann wurde die Antigengewinnung in Natriumcitratpuffer mit einem pH-Wert von 6,0 durch thermische Hochdrucksanierung durchgeführt. Für die thermische Hochdrucksanierung legen Sie die in Reparaturpuffer getränkten Gewebescheiben für 8-12 min in die Mikrowelle bei mittlerer Hitze. Die endogene Peroxidaseaktivität wurde mit 3% Wasserstoffperoxidlösung für 20 min blockiert, und dann wurde die unspezifische Bindungsstelle mit 5% BSA bei Raumtemperatur für 30 min blockiert. Fügen Sie die primären Antikörper NRF2 (1:200), CDK1 (1:400) und VDAC1 (1:500) hinzu und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 °C. Nach 3x Waschen mit PBS den HRP-markierten Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (1:500) zugeben und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Paraffinschnitte wurden einer DAB-Färbung, einer Hämatoxylin-Gegenfärbung, einer Dehydratisierungstransparenz und einer neutralen Gelversiegelung unterzogen, um die entsprechenden molekularen immunhistochemischen Ergebnisse zu erhalten. Wenn DAB für die Farbentwicklung verwendet wird, sollte die moderate Farbentwicklung bräunlichgelb bis bräunlichbraun sein, und der Hintergrund sollte klar sein. Sowohl eine übermäßige (dunkelbraune) als auch eine unzureichende (hellgelbe) Farbentwicklung erfordern eine Optimierung der Farbentwicklungszeit.

Der Grad der Lungenfibrose wurde semi-quantitativ mit der Ashcroft-Scoring-Methode¹⁵ analysiert: Masson-gefärbte Schnitte wurden unter einem Mikroskop mit 100-facher Vergrößerung beobachtet und das Lungengewebe nach dem Zufallsprinzip in 8 Regionen unterteilt. Jede Region wurde nach dem Grad der Fibrose (0-8 Punkte) bewertet, wobei die Endnote der Durchschnitt aller Regionen ist: 0 Punkte (normales Lungengewebe), 1-2 Punkte (leichte Fibrose), 3-4 Punkte (moderate Fibrose), 5-8 Punkte (schwere Fibrose).

Die immunhistochemischen Ergebnisse wurden mit Hilfe der Bildsoftware quantitativ analysiert. Fünf Felder mit hoher Vergrößerung wurden nach dem Zufallsprinzip ausgewählt, und der durchschnittliche optische Dichtewert (MOD) jedes Feldes wurde als Indikator für das Proteinexpressionsniveau gemessen.

Untersuchung des Einflusses von Kieselsäure und ML385 auf Autophagie und ROS in RAW264.7-Zellen
Sowohl RAW264.7- als auch A549-Zellen (zur Verfügung gestellt von der Anhui University of Science and Technology) wurden mit DMEM-Medium mit hohem Glukosegehalt kultiviert, das mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % bispezifischer Penicillin-Streptomycin-Antikörperlösung ergänzt wurde. Die 1 x 10⁷ Zellen wurden gleichmäßig in einem Inkubator mit konstanter Temperatur bei 37 °C und 5 % CO₂ kultiviert. 5 μl 30 mg/ml Kieselsäuresuspension wurden zu 1 x 10⁵ Zellen/ml RAW264,7-Zellen gegeben. Nach einer Inkubation von 24 Stunden wurden die Zellen mit PBS 3x gespült, und die Autophagie und der oxidative Stress wurden mit ROS-, LC3- und Lysosomensonden nachgewiesen. Gleichzeitig wurde ML385¹⁶, ein Inhibitor von NRF2, verwendet, um die Expression von NRF2 zu hemmen (Endkonzentration von ML385: 5 mM/L). Autophagie und oxidativer Stress wurden gemäß den oben genannten experimentellen Schritten nachgewiesen. Der oxidative Stress und der Autophagiefluss der beiden Gruppen wurden statistisch analysiert.

Immunhistochemische Analyse von VDAC1-, CDK1-, p62 - und NRF2-Expressionen in Lungenadenokarzinomgewebe
Die Expression von VDAC1, CDK1, p62 und NRF2 wurde bei 30 Patienten überprüft. Gewebe mit Lungenadenokarzinom und angrenzenden gesunden Geweben wurden aus dem angeschlossenen Huai'an NO.1 People's Hospital der Nanjing Medical University gewonnen und durch Immunhistochemie (IHC) analysiert. Die Ergebnisse der IHC und der Lungenfibrose wurden statistisch ausgewertet. Sammeln Sie Patientendaten anhand von Patienteninformationen im Krankenhaussystem. Die spezifischen Versuchsschritte sind wie folgt: Paraffinschnitte wurden mit Xylol entwachst und mit Gradientenalkohol hydratisiert, und dann wurde die Antigensanierung in Natriumcitratpuffer mit pH 6,0 durch thermische Hochdrucksanierung durchgeführt. Die endogene Peroxidaseaktivität wurde mit 3% Wasserstoffperoxidlösung für 20 min blockiert, und dann wurde die unspezifische Bindungsstelle mit 5% BSA bei Raumtemperatur für 30 min blockiert. Fügen Sie die primären Antikörper NRF2 (1:200), CDK1 (1:400), p62 (1:500) und VDAC1 (1:500) hinzu und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 °C. Nach 3x Waschen mit PBS HRP-markierten Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (1:500) zugeben und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. DAB-Farbentwicklung, Hämatoxylin-Gegenfärbung, dehydrierte transparente, neutrale Zahnfleischversiegelung. Wenn DAB für die Farbentwicklung verwendet wird, sollte die moderate Farbentwicklung bräunlichgelb bis bräunlichbraun sein, und der Hintergrund sollte klar sein. Sowohl eine übermäßige (dunkelbraune) als auch eine unzureichende (hellgelbe) Farbentwicklung erfordern eine Optimierung der Farbentwicklungszeit.

Analyse der Zellmigration und -invasion
Es wurde untersucht, wie sich ML385 und der Überstand aus der Co-Inkubation von Kieselsäure mit RAW264.7-Zellen auf die Zellmigration und -invasion nach der Inkubation mit der Lungenadenokarzinom-Zelllinie A549 auswirken. Der Überstand von RAW264.7-Zellen, die 24 h lang mit Siliziumdioxid kokultiviert wurden, wurde den A549-Zellen zugesetzt. Die Zellen wurden in die Kieselsäuregruppe, die Kieselsäure+ML385-Gruppe und die PBS-Gruppe unterteilt. Die Kieselgelgruppe: 5 μl 30 mg/ml Kieselsäuresuspension wurden zu 1 x 10⁵ Zellen/ml von RAW264,7-Zellen gegeben. Nach einer Inkubation von 24 Stunden ist der Zellüberstand für die spätere Verwendung zu entfernen. Die Silica+ML385-Gruppe: 5 μl 30 mg/ml Kieselsäuresuspension und eine Endkonzentration von 5 mM/l ML385 wurden zu 1 x 10⁵ Zellen/ml RAW264.7-Zellen gegeben. Nach einer Inkubation von 24 Stunden ist der Zellüberstand für die spätere Verwendung zu entfernen. PBS-Gruppe: 5 μl PBS wurden zu 1 x 10⁵ Zellen/ml RAW264.7 Zellen hinzugefügt. Nach einer Inkubation von 24 Stunden ist der Zellüberstand für die spätere Verwendung zu entfernen. Während des Scratch-Assays wurden A549-Zellen zunächst in 12-Well-Platten mit einer Dichte von 5 x 10⁵ pro Well ausgesät. Nachdem die Zellen zu 95 % bis 100 % fusioniert waren, wurden die Monolayer-Zellen mit der Spitze einer sterilen 200-μl-Pipette verkratzt. Die exfolierten Zellen wurden schonend mit PBS abgewaschen. Anschließend wurden die Kulturbedingungen so geändert, dass sie 1 % FBS-Basismedium und die Überstände jeder Behandlungsgruppe umfassten, um die Lebensfähigkeit der Zellen während des 7-tägigen Versuchszeitraums zu erhalten. Bilder der gleichen Position wurden unter einem inversen Mikroskop um 0 h (Tag 0) bzw. am 7. Tag (Tag 7) nach dem Kratzer aufgenommen. Schließlich wurde der Scratch-Bereich quantitativ analysiert und die Scratch-Closure-Rate mit Hilfe der ImageJ-Software berechnet, um die Wirkung des Überstands aus verschiedenen Behandlungsgruppen auf die Migrationsfähigkeit von A549-Zellen zu bewerten.

In den Zellen, die durch Poren spezifischer Größe gehen, wurde eine 8 μm Polycarbonat-Membrankammer verwendet, wobei die obere Kammermembran mit Gel vorbeschichtet war, das die extrazelluläre Umgebung simulierte und im Verhältnis 1:8 verdünnt wurde, um eine Basalmembranbarriere zu konstruieren. A549-Zellen wurden in einer Suspension resuspendiert, die durch Mischen von serumfreiem Medium mit den Überständen jeder Behandlungsgruppe im Verhältnis 1:1 hergestellt wurde, und dann in der oberen Kammer (2 x 10,⁴ Zellen pro Kammer) inokuliert. In der unteren Kammer wurde eine Lösung, die durch Mischen eines Mediums, das 20 % FBS enthielt, mit den Überständen der entsprechenden Behandlungsgruppen (Silica+ML385-Gruppe, Silica-Gruppe und PBS-Gruppe) im gleichen Verhältnis hergestellt wurde, als chemischer Lockstoff zugegeben. Die Überstände der entsprechenden Behandlungsgruppen wurden durch Absaugen durch eine Pipettierpistole in RAW264.7 Zellphagozytose von Kieselsäure entnommen. Nachdem die Zellen 7 Tage lang kontinuierlich bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubiert wurden, wurden die nicht-invasiven Zellen in der oberen Kammer mit Wattestäbchen entfernt, und die Zellen, die die Membran durchdrungen und die untere Kammer erreicht hatten, wurden mit 4 % Paraformaldehyd fixiert und mit 0,1 % Kristallviolett gefärbt. Schließlich wurde die Anzahl der invasiven Zellen zufällig aus 5 Gesichtsfeldern mit einem Lichtmikroskop ausgewählt.

Analyse des Einflusses von Siliziumdioxid und ML385 auf die Apoptose von A549-Zellen mittels Durchflusszytometrie
Zellvorbereitung und -gruppierung: Es wurden A549-Zellen gesammelt, die mit den Überständen jeder Behandlungsgruppe (PBS-Gruppe, Kieselsäuregruppe, Kieselsäure + ML385-Gruppe) behandelt wurden. Die Zellen wurden 2x schonend mit vorgekühltem PBS gewaschen, dann in 1x Bindungspuffer resuspendiert und die Zelldichte auf 1 x 10⁶ Zellen pro Röhrchen/100 μl eingestellt. Dann wurden 5 μl Annexin V-FITC und 5 μl PI-Färbelösung in die Zellsuspension gegeben, zum Mischen vorsichtig vortexed und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Nach der Inkubation wurden 400 μl 1x Bindungspuffer in jedes Röhrchen gegeben und sofort auf der Maschine getestet. Der Nachweis erfolgte mit einem Durchflusszytometer. Angeregt durch einen 488-nm-Laser wurde das Fluoreszenzsignal von Annexin V-FITC über den FITC-Kanal und das Fluoreszenzsignal von PI über den PE-Kanal gesammelt. Vor dem Experiment wurden Einzelfärbeproben für die Anpassung der Fluoreszenzkompensation verwendet, um spektrale Überlappungen zu eliminieren. Bei der Datenanalyse wird zunächst die Zielzellpopulation im FSC-A/SSC-A-Streudiagramm abgegrenzt und Fragmente eliminiert. Anschließend wurden Zelladhäsionen mit Hilfe des FSC-H/FSC-A-Streudiagramms ausgeschlossen; Schließlich wurde ein Gate zur Unterscheidung zwischen lebenden Zellen, frühen apoptotischen Zellen, späten apoptotischen/nekrotischen Zellen und mechanisch geschädigten Zellen eingerichtet. Die Daten wurden mit der FlowJo V10-Software erfasst und analysiert.

Modell einer Kieselsäure-Maus
In Abbildung 1 wurde den Mäusen intranasal Kieselsäure in einer Dosierung von 30 mg/ml und 70 μl an 40 aufeinanderfolgenden Tagen verabreicht, was sicherstellte, dass bei den Mäusen keine Todesfälle auftraten und das Kieselsäure-Mausmodell erfolgreich etabliert werden konnte. In der Zwischenzeit wurden Mäusesonden mit PBS als Negativkontrollen verwendet. Ziel war es, den Einfluss des Vorgangs und des Lösungsmittels selbst zu eliminieren und sicherzustellen, dass der Phänotyp spezifisch durch Kieselsäure induziert wird. Die erfolgreiche Replikation dieses Siliziumdioxid-induzierten Lungenverletzungsmodells bietet eine notwendige in vivo Grundlage für die nachfolgende Erforschung des Mechanismus der malignen Progression und der medikamentösen Intervention.

Analyse der Immunzellinfiltration in den Knötchen von Siliziumdioxid-induzierten Mäusen
In Abbildung 2 wurde durch den Nachweis der Immunzellinfiltration in den Knötchen von Kieselsäuremäusen festgestellt, dass es eine große Anzahl von Immunzellinfiltration (CD3e+, CD8a+, CD86+, F4/80+ und Nk1.1+ Zellen) in den Knötchen gab, die an der Bildung und Entwicklung der Kieselsäure-Lungenkrankheit beteiligt waren. Dies deutet darauf hin, dass Kieselsäure eine persistierende entzündliche Tumormikroumgebung induziert, die ein wichtiger Förderfaktor für das Auftreten und die Entwicklung von Tumoren und auch die pathophysiologische Grundlage für die Beteiligung des ROS/NRF2-Signalwegs ist.

Zusammenhang zwischen Siliziumdioxid-induzierter Lungenfibrose und NRF2, CDK1 und VDAC1 bei Mäusen
Durch den Nachweis der Expression von Immunmolekülen in Knöllchen wurde festgestellt, dass NRF2 (ML385-inhibitorisches Ziel), CDK1 (zellzyklusbezogen) und VDAC1 (beteiligt an mitochondrialem oxidativem Stress) stark um und in den Knötchen exprimiert wurden und mit Lungenfibrose in Verbindung standen (Abbildung 3).

Einfluss von Kieselsäure und ML385 auf Autophagie und ROS in RAW264.7-Zellen
Durch die Co-Kultur von Kieselsäure und RAW264.7-Zellen wurde festgestellt, dass Kieselsäure die Produktion von Autophagosomen induzieren kann. Nach 24 h Kultur war die Kolokalisation von Autophagosom und Lysosom reduziert, der Autophagiefluss wurde gehemmt und die Produktion von ROS wurde ebenfalls reduziert. Bei Zugabe von ML385 (NRF2-Inhibitor ) wurde die Kolokalisation von Autophagosom und Lysosom verstärkt, der Autophagiefluss wurde ebenfalls verstärkt und die ROS wurde ebenfalls entsprechend erhöht (Abbildung 4).

Analyse der VDAC1-, CDK1-, p62- und NRF2-Expression in Lungenadenokarzinomgewebe mittels IHC
Wie in Abbildung 5 gezeigt, werden NRF2 (ein inhibitorisches Ziel von ML385), CDK1 (bezogen auf den Zellzyklus), VDAC1 (beteiligt an mitochondrialem oxidativem Stress) und p62 (beteiligt an der Autophagie) in Lungenadenokarzinomgeweben stark exprimiert und weisen signifikante Unterschiede im Vergleich zu benachbarten Geweben auf.

Einfluss von ML385 und Überstand aus der Co-Inkubation von Kieselsäure mit RAW264.7-Zellen auf die Migration und Invasion von A549-Zellen
Der Überstand von Kieselsäure und RAW264.7 kann die Migration und Proliferation von A549-Zellen fördern, während ML385 diese Prozesse signifikant hemmen kann (siehe Abbildung 6). Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die tumorfördernde Wirkung der durch Kieselsäure induzierten Makrophagen-Mikroumgebung vom NRF2-Signalweg abhängt. Durch die Hemmung von NRF2 kann diese tumorfördernde Wirkung effektiv blockiert und dadurch das bösartige Fortschreiten der Tumorzellen reduziert werden.

Einfluss von Siliziumdioxid und ML385 auf die Apoptose von A549-Zellen
Abbildung 7 zeigt, dass Kieselsäure und RAW264.7-Zellkulturüberstand eine gewisse hemmende Wirkung auf die Apoptose von A549-Zellen haben und ML385 die Apoptose von A549-Zellen fördern kann.

Diese Studie enthüllte den mechanistischen Weg, über den die Exposition gegenüber Kieselsäure das maligne Fortschreiten des Lungenadenokarzinoms durch die ROS/NRF2/Autophagie-Achse fördert, sowohl unter Verwendung von in vivo - als auch von in vitro-Methoden . Tierversuche haben bestätigt, dass Schlüsselmoleküle des NRF2-Signalwegs in der Mikroumgebung der durch Kieselsäure induzierten Lungenfibrose signifikant aktiviert sind. Zellexperimente haben gezeigt, dass Kieselsäure den autophagischen Fluss in Makrophagen direkt hemmt und die ROS-Spiegel senkt, und dieser Effekt kann durch den NRF2-Inhibitor ML385 spezifisch umgekehrt werden. Mechanismusstudien haben gezeigt, dass mit Kieselsäure behandelte Makrophagen die Migration, Invasion und Hemmung der Apoptose von Lungenadenokarzinomzellen durch Sekretion von Faktoren fördern, und diese tumorfördernde Wirkung hängt vollständig von der Aktivierung des NRF2-Signalwegs ab.

Datenverfügbarkeit:
Die Datensätze, die die Schlussfolgerung dieses Artikels unterstützen, sind in diesem Artikel enthalten.

Abbildung 1: Aufbau eines Siliziumdioxidmodells in Mäusen. (A) Behandlung von Mäusen mit nasaler Inhalation von Siliziumdioxid (30 mg/ml) in verschiedenen Volumina (10 μl, 30 μl, 50 μl, 70 μl, 90 μl und 200 μl). 20 Mäuse pro Inhalationsdosis. (B) Überlebenskurve der Maus. Die maximale Inhalationsmenge beträgt 70 μL/Tag. (C) Beobachtungsergebnisse der histopathologischen HE-Färbung der Lunge bei Mäusen der Kieselsäuregruppe und der PBS-Gruppe an Tag 3, Tag 14 und Tag 40. (D) Statistische Ergebnisse der Anzahl der Lungenknötchen, die bei Mäusen unter geringer Vergrößerung beobachtet wurden, t-Test, ***p <0,001, p= 0,004, t = 10,61 (Tag 14), p = 0,0006, t = 10,02 (Tag 40). N = 9. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Beobachtung der Infiltration von Immunzellen in knotigem Gewebe von Mäusen durch Fluoreszenzfärbung. Hohe Infiltration von Immunzellen (CD3e+, CD8a+, CD86+, F4/80+ und NK1.1+) in Knötchen von Siliziumdioxid-induzierten Lungenknötchen bei Mäusen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Analyse der Beziehung zwischen den Expressionen von NRF2, CDK1, VDAC1 und Kieselsäure-induzierter Fibrose durch Immunhistochemie (IHC) und Masson-Färbung. (A) Die Expression von NRF2, CDK1 und VDAC1 und die Ergebnisse der Masson-Färbung. (B) Die Ergebnisse der IHC. (C) Die statistische Analyse der Lungenfibrose wurde zwischen der Kieselsäuregruppe und der PBS-Gruppe von Mäusen durchgeführt. t-Test, ***p <0,001, p = 0,0002, t = 13,42 (NRF2), p = 0,0008, t = 9,247 (CDK1), p = 0,0009, t = 8,944 (VDAC1), p = 0,0003, t = 11,76 (Lungenfibrose). N = 9. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Einfluss von Kieselsäure auf die Autophagie in RAW264.7-Zellen und die autophagie-regulierende Wirkung des NRF2-Inhibitors ML385. (A) Nach 24-stündiger Co-Inkubation von Siliziumdioxid mit RAW264.7-Zellen nahm die Kolokalisation von Autophagosomen (LC3) und Lysosomen ab (Grün). Nach Zugabe von ML385 nahm jedoch die Kolokalisation von Autophagosomen und Lysosomen zu (Gelb). (B) Nach 24-stündiger Co-Inkubation von Kieselsäure mit RAW264.7-Zellen nahm die von der Kieselsäuregruppe erzeugte ROS ab, stieg jedoch nach Zugabe von ML385 an. (C) Statistische Analyse des ROS und des Autophagieflusses der beiden Gruppen, t-Test, ***p <0,001, p = 0,0005, t = 10,59 (ROS), p <0,0001, t = 17,08 (Autophagolysosom). N = 6. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Immunhistochemische Analyse von VDAC1-, CDK1-, p62- und NRF2-Expressionen in humanem Lungenadenokarzinomgewebe. (A) Differentielle Expressionen (VDAC1, CDK1, p62 und NRF2) zwischen humanem Lungenadenokarzinomgewebe und benachbartem nicht-krebsartigem Gewebe. (B) Statistische Analyse der differentiellen Expression zwischen 30 Krebsfällen und angrenzenden nicht-krebsartigen Geweben aus dem angeschlossenen Huai'an NO.1 People's Hospital der Nanjing Medical University, t-Test, ***p <0,001, p <0,0001, t = 8,322 (CDK1), p <0,0001, t = 16,4 (NRF2), p <0,0001, t = 15,47 (p62), p <0,0001, t = 17,75 (VDAC1). N = 30. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler an. (C) Statistische Analyse der Fibrose in Lungenadenokarzinomgewebe und angrenzenden nicht-krebsartigen Geweben, t-Test, ***p <0,001, p = 0,0009, t = 8,854 (Fibrose). N = 30. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Einfluss von ML385 und Überstand aus der Co-Inkubation von Kieselsäure mit RAW264.7-Zellen auf die Zellmigration und -invasion nach Inkubation mit der Lungenadenokarzinom-Zelllinie A549. (A) Die Ergebnisse des Zellscratchs an Tag 0 und Tag 7 nach Co-Inkubation von Überstand und ML385 mit A549-Zellen. (B) Die zellinvasiven Ergebnisse am Tag 7 nach Co-Inkubation von Überstand und ML385 mit A549-Zellen. (C) Durchführung statistischer Analysen der Ergebnisse des Zell-Scratch-Assays. *p <0,05, **p <0,01. t-Test, p = 0,0020, t = 22,43 (Siliziumdioxid + ML385 im Vergleich zu Siliziumdioxid), p = 0,0135, t = 8,510 (Siliziumdioxid + ML385 vs. PBS), p = 0,0143, t = 8,281 (Siliziumdioxid vs. PBS). N = 6. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler an. (D) Durchführung statistischer Analysen der zellinvasiven Assay-Ergebnisse. *p <0,05, **p <0,01, t-Test, p = 0,0097, t = 10,06 (Siliziumdioxid+ML385 versus Siliziumdioxid), p = 0,0472, t = 4,437 (Siliziumdioxid+ML385 versus PBS), p = 0,0125, t = 8,857 (Siliziumdioxid versus PBS). N = 6. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Analyse des Einflusses von Siliziumdioxid und ML385 auf die Apoptose von A549-Zellen mittels Durchflusszytometrie. (A) Nachweis der Apoptoseergebnisse von A549-Zellen durch Durchflusszytometrie. (B) Durchführung statistischer Analysen über den Prozentsatz apoptotischer Zellen. *p <0,05, **p <0,01, t-Test, p = 0,0013, t = 27,29 (Siliziumdioxid+ML385 versus Siliziumdioxid), p = 0,0022, t = 6,973 (Siliziumdioxid+ML385 vs. PBS), p = 0,0048, t = 5,649 (Siliziumdioxid vs. PBS). N = 6. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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