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Methodenartikel

Quantitative Fluoreszenzbildgebung von Alphavirus-Infektionen für antivirale Screenings

64 Aufrufe

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DOI:

10.3791/69384

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14. August 2026

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1LOEWE Centre for Translational Biodiversity Genomics (LOEWE-TBG), 2Department of Pest and Vector Insect Control, Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Branch of Bioresources, 3Institute for Insect Biotechnology, Justus-Liebig University, 4BMFTR Junior Research Group in Infection Research "ASCRIBE", Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Branch of Bioresources

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier wird ein robustes und anpassungsfähiges Protokoll für die kontinuierliche Visualisierung von Alphavirus-Infektionen vorgestellt. Dieses Protokoll bietet einen Ansatz zur Untersuchung der Alphavirus-Replikation und zur Bewertung der Wirksamkeit antiviraler Substanzen auf zellulärer Ebene mittels Fluoreszenzbildgebung.

Zusammenfassung

Die Fluoreszenzmikroskopie bietet einen hochsensitiven und vielseitigen Ansatz zur Untersuchung der Alphavirus-Infektion auf zellulärer Ebene. Durch die Kombination fluoreszenzmarkierter Viren mit quantitativer Bildanalyse ermöglicht diese Methode eine detaillierte räumliche und zeitliche Charakterisierung der Infektionsdynamik, einschließlich des Nachweises subtiler Unterschiede in der Replikationskinetik und der zell-zu-Zell-Ausbreitung. Ein zentrales Ziel dieses Protokolls ist dessen Anwendung in antiviralen Screening-Assays. Die bildbasierte Quantifizierung der Fluoreszenzintensität stellt ein robustes und reproduzierbares Verfahren zur Beurteilung der Wirksamkeit antiviraler Substanzen dar und erlaubt einen frühen und empfindlichen Nachweis inhibitorischer Effekte in infizierten Zellen. Dies erleichtert die Identifizierung aussichtsreicher antiviraler Kandidaten und unterstützt die Bewertung dosisabhängiger Wirkungen. Der Ansatz eignet sich zudem hervorragend für vergleichende Studien verschiedener Alphavirus-Stämme oder -Mutanten, da Unterschiede im Replikationsverhalten und in der Streuungsdynamik deutlich sichtbar werden. Aufgrund seiner Flexibilität, Kompatibilität mit verschiedenen Zelllinien und einfachen Integration in automatisierte Bildgebungssysteme ist die Methode skalierbar und für Hochdurchsatz-Screenings geeignet. Insgesamt trägt dieses Protokoll zur Entdeckung und Bewertung antiviraler Strategien bei. Da mehrere Alphaviren bedeutende Erkrankungen beim Menschen und bei Tieren verursachen, keine zugelassenen antiviralen Therapien existieren und sich geografisch weiter ausbreiten, wobei immer wieder neue Ausbrüche auftreten, bleibt die Identifizierung neuer antiviraler Wirkstoffe eine dringende Priorität. Daher stellt dieser auf Fluoreszenz basierende Arbeitsablauf einen wertvollen und aktuellen Beitrag zur modernen Alphavirus-Forschung dar.

Einleitung

Alphaviren sind umhüllte, positive-sinnige, einzelsträngige Ribonukleinsäure-(RNA-)Viren der Familie Togaviridae1,2,3. Sie werden hauptsächlich durch Mücken übertragen und verursachen eine Reihe von Erkrankungen bei Menschen und Tieren. Die Gattung Alphavirus umfasst mehrere medizinisch bedeutende Viren, wie das Chikungunya-Virus (CHIKV), das Sindbis-Virus, das östliche Pferdeenzephalitis-Virus und das venezolanische Pferdeenzephalitis-Virus4,5. Diese Krankheitserreger verursachen Symptome, die von fieberhaften Erkrankungen und Hautausschlag bis hin zu schweren neurologischen Komplikationen reichen6. Besorgniserregend ist, dass CHIKV erneut zu einem bedeutenden Problem für die öffentliche Gesundheit geworden ist. Allein seit Anfang 2025 wurden über 220.000 Fälle in 14 Ländern gemeldet, die zu mindestens 80 Todesfällen führten7. Obwohl die Letalität gering ist, entwickelt ein erheblicher Teil der Infizierten chronische Gelenkschmerzen, die zu langfristigen Behinderungen und eingeschränkter Mobilität führen können8. Um gezielte antivirale Strategien zu entwickeln, ist ein umfassenderes Verständnis der Alphavirusreplikation und der Wechselwirkungen zwischen Wirt und Pathogen unerlässlich. Gleichzeitig weisen einige Alphaviren wie das Semliki-Forest-Virus (SFV) eine geringe Pathogenität beim Menschen auf, obwohl sie eine hohe genetische und strukturelle Ähnlichkeit mit virulenteren Alphaviren aufweisen. Dadurch eignet sich SFV ideal als Modell zur Untersuchung von Alphaviren, ohne ein hohes Risiko für die menschliche Gesundheit darzustellen9,10,11.

Traditionelle Assays wie Plaque-Assays, der 50 %igen Gewebekultur-infektiösen Dosis (TCID50)-Assay und die quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR)-Analyse sind wertvoll zur Quantifizierung viraler Titer und der Genexpression, beschränken sich jedoch auf Endpunkt-Messungen und erfordern die Lyse oder Fixierung von Zellen. Daher können sie die Dynamik der Infektion innerhalb derselben Zellen über die Zeit nicht direkt erfassen12,13. Um diese Einschränkungen zu überwinden, bietet die Echtzeit-Fluoreszenzbildgebung einen leistungsfähigen, nicht destruktiven Ansatz zur Überwachung der Infektionskinetik über mehrere Zeitpunkte hinweg. Die Verwendung fluoreszenzmarkierter Viren, wie des mit mCherry markierten SFV, ermöglicht die direkte Visualisierung und Quantifizierung des Reporter-Virus-Signals und dessen Ausbreitung in lebenden Zellen14,15. Für die hier beschriebenen Experimente wurden gängige Zelllinien aus der Arbovirus-Forschung verwendet. U4.4-Zellen, die aus Larven von Aedes albopictus stammen, sind Mückenzellen, die eine effiziente Replikation vieler Arboviren unterstützen und Untersuchungen zu Wechselwirkungen zwischen Vektor und Virus erleichtern16,17. Parallel dazu dienen BHK-21-Zellen, eine fibroblastenähnliche, aus Nierengewebe junger Hamster stammende Säugetierzelllinie, als permisives Wirte-System, das häufig für die virale Vermehrung und molekulare Virologie-Assays eingesetzt wird18.

Dieses Protokoll beschreibt detailliert die Überwachung der Expression viraler Reporter und die Charakterisierung antiviraler Wirkstoffe, wobei Furin-Inhibitoren als Beispiel dienen. Furin ist eine Proproteinkonvertase, die in vielen Eukaryoten vorkommt, und spielt eine Schlüsselrolle bei der Aktivierung von Vorläufern von Wachstumsfaktoren, Hormonen, Matrix-Metalloproteinasen, Plasmaproteinen und Rezeptoren19,20. Viele Alphaviren nutzen Furin, um ihre Oberflächenproteine zu spalten und zu aktivieren, ein entscheidender Schritt für eine erfolgreiche Replikation20. Furin-Inhibitoren sind synthetisch hergestellte Verbindungen, die die Furin-Aktivität hemmen und dadurch die virale Replikation verringern21,22,23. Angesichts der begrenzten Verfügbarkeit standardisierter Protokolle zur automatisierten, fluoreszenzmikroskopischen Analyse von Alphavirus-Infektionen mittels eines zellbasierten Multimode-Imaging-Readers wird ein ausführlicher Arbeitsablauf zur Charakterisierung antiviraler Wirkstoffe in Aedinen-Zellen bereitgestellt. Das Protokoll beschreibt Schritte für die Zellkultur, Virusproduktion, Infektion, Behandlung mit antiviralen Wirkstoffen (Furin-Inhibitoren), Fluoreszenzbildgebung und Bildanalyse. Die hier beschriebenen Methoden können jedoch problemlos auf andere Viren und alternative fluoreszierende Markierungen übertragen werden.

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Protokoll

1. Biologische Sicherheit

HINWEIS: Das in diesem Protokoll verwendete rekombinante, mit mCherry markierte Semliki-Forest-Virus (SFV-mCherry) ist genetisch verändert24,25,26. Die Einfügung eines fluoreszierenden Reportergens klassifiziert es als genetisch veränderten Organismus, wodurch zusätzliche Sicherheitsmaßnahmen und behördliche Auflagen gelten. Arbeiten mit anderen Alphaviren, insbesondere mit stärker pathogenen Viren wie CHIKV, können zusätzliche Sicherheitsstufen und Genehmigungen erfordern.

  1. Reinigen Sie den Sicherheitswerkbank mit einem geeigneten Desinfektionsmittel und bestrahlen Sie sie vor und nach Virusuntersuchungen mindestens 30 Minuten lang mit UV-Licht.
  2. Entsorgen Sie gesamtes kontaminiertes Material gemäß den örtlichen Sicherheitsvorschriften. Sammeln Sie festen und flüssigen Abfall getrennt in autoklavierbaren Behältern und autoklavieren Sie diese vor der Entsorgung.

2. Herstellung von antiviralen Verbindungen

HINWEIS: Die in dieser Studie verwendeten Furin-Inhibitoren MI-113027 (trans-4-(Aminomethyl)cyclohexancarboxyl-arginin-valin-arginin-4-amidinobenzylamid), MI-113127 (trans-4-(Guanidinomethyl)cyclohexancarboxyl-arginin-valin-arginin-4-amidinobenzylamid) und MI-114822,23 (4-(Guanidinomethyl)phenylacetyl-arginin-tert.-leucin-arginin-4-amidinobenzylamid) sind Beispiele für antiviral wirkende Verbindungen, die zur Untersuchung ausgewählt wurden. Der Furin-Inhibitor MI-1148 wurde im Zytotoxizitätsassay als negativer Kontrollansatz und im antiviralen Assay als positiver Kontrollansatz verwendet.

  1. Lösen Sie antivirale Verbindungen in einem geeigneten Lösungsmittel. Verwenden Sie nach Möglichkeit steriles Wasser, um zytotoxische Effekte zu vermeiden. Dimethylsulfoxid oder Methanol können bis zu einer Konzentration von maximal 2 % (v/v) verwendet werden. Es wird empfohlen, Stammlösungen mit einer Konzentration von 10 mM in sterilem Wasser herzustellen.
  2. Bewahren Sie die Stammlösungen bei -20 °C auf, abhängig von Stabilität und Löslichkeit, sofern nicht vom Hersteller anders angegeben.

3. Zellkultur

  1. Kultivieren Sie U4.4-Zellen in Leibovitzs L-15-Medium, ergänzt mit 10 % fetalem Kälberserum (FBS), 1 % MEM nicht-essentiellen Aminosäuren, 1 % Tryptose-Phosphat-Bouillon, 1 % Glutamin und 1 % Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) (Ansiedlungsdichte: ca. 1 × 106 Zellen/T25-Flasche, Kulturvolumen: 5 mL). Halten Sie die Zellen bei 28 °C. Passagieren Sie die U4.4-Zellen einmal pro Woche im Verhältnis 1:6, passen Sie die Ansiedlungsdichten jedoch entsprechend den experimentellen Anforderungen an.
    ANMERKUNG: Zusätzliche Zelllinien, wie beispielsweise C6/36-Zellen, sind ebenfalls mit diesem Protokoll kompatibel. Alternative Medien und Zusätze können gegebenenfalls verwendet werden. Die Zugabe von Antibiotika ist optional und kann entfallen.
  2. Kultivieren Sie Baby-Hamster-Nierenzellen (BHK-21) in Dulbeccos modifiziertem Eagleschem Medium, ergänzt mit 10 % FBS, 1 % Glutamin oder Statisches Gleichgewicht, ΣFx=0, Diagramm, Kräftebilanzanalyse, mechanisches Stabilitätsdiagramm.‑alanyl‑Statisches Gleichgewicht, ΣFx=0, Diagramm, Kräftebilanzanalyse, mechanisches Stabilitätsdiagramm.‑Glutamin und 1 % Pen/Strep (Ansiedlungsdichte: ca. 1 × 106 Zellen/T75-Flasche, Kulturvolumen: 10 mL). Halten Sie die Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2. Passagieren Sie die Zellen alle 4–5 Tage im Verhältnis 1:12, wobei die Ansiedlungsdichten je nach Bedarf angepasst werden können.
  3. Stellen Sie sicher, dass die Zellen gesund bleiben und aktiv proliferieren.

4. Virusproduktion

  1. Herstellung von SFV-mCherry (SFV6-2SG-mCherry)-Vorratslösungen in BHK-21-Zellen.
    1. Kultivieren Sie BHK-21-Zellen (Ansiededichte: ca. 1 × 105 Zellen/Vertiefung, Kulturvolumen: 500 µL) in einer klaren 24-Loch-Zellkulturplatte unter den oben beschriebenen Bedingungen.
    2. Transfizieren Sie die BHK-21-Zellen bei etwa 90 % Konfluenz (Zielkonfluenz: ca. 2 × 105 Zellen) mit dem SFV6-2SG-mCherry-Plasmid unter Verwendung eines Transfektionsreagenzes in Infektionsmedium (DMEM ergänzt mit 1 % Pen/Strep und 0,2 % Rinderserumalbumin). Verdünnen Sie hierzu 1 µL Transfektionsreagenz in 25 µL Medium mit reduziertem Serumgehalt.
    3. Verdünnen Sie in einem separaten Reaktionsgefäß 0,5 µg Plasmid-DNA und 1 µL eines proprietären Additivs in 25 µL Medium mit reduziertem Serumgehalt. Geben Sie die verdünnte DNA-Lösung zu der Lösung mit dem verdünnten Transfektionsreagenz und inkubieren Sie 15 Minuten bei Raumtemperatur. Anschließend 50 µL des resultierenden Komplexes zu den Zellen hinzufügen.
      HINWEIS: Andere Transfektionsreagenzien können verwendet werden, sofern sie mit der spezifischen Zelllinie kompatibel sind; die Anweisungen können je nach verwendetem Reagenz variieren.
    4. 48 Stunden nach der Transfektion das virushaltige Überstandmedium mit einer Pipette sammeln, je 250 µL in DNA/RNA-freie Röhrchen portionieren und bei -80 °C lagern.
  2. Titration mittels TCID50-Assay.
    1. Kultivieren Sie BHK-21-Zellen (Ansiededichte: ca. 2 × 104 Zellen/Vertiefung, Kulturvolumen: 100 µL) in einer schwarzen bildgebenden 96-Loch-Platte unter den oben beschriebenen Bedingungen.
    2. Eine Virusportion auftauen, zehnfache serielle Verdünnungen der Virusprobe in Infektionsmedium herstellen (15 µL Virusprobe + 135 µL Infektionsmedium), das alte Medium verwerfen und 100 µL der Verdünnungen zu den Zellen geben.
    3. Die Zellen 1 Stunde bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂ inkubieren und anschließend das Inokulum durch 100 µL frisches Infektionsmedium ersetzen.
    4. 48 Stunden nach der Infektion (hpi) die virale Replikation durch Fluoreszenzmessung mit einem Multimode-Imaging-Plattenreader bewerten (genaue Beschreibung in Abschnitt 7) und den durch die Virusinfektion verursachten zytopathischen Effekt bestimmen. Berechnen Sie den TCID50-Wert nach der Methode von Reed-Muench28 und wandeln Sie diesen mithilfe der standardmäßigen Poisson-basierten Näherung, bei der 1 TCID50 etwa 0,7 PFU entspricht, in geschätzte virale Titer (PFU/mL) um.

5. Bestimmung der Zytotoxizität

  1. Kultivieren Sie U4.4-Zellen (Ansiedlungsdichte: ca. 3 × 104 Zellen/Vertiefung, Kulturvolumen: 100 µL) in einer klaren 96-Loch-Zellkulturplatte unter den oben beschriebenen Bedingungen.
    ANMERKUNG: Äußere Vertiefungen (Reihen A und H; Spalten 1 und 12) wurden mit Zellen beimpft, aber von der experimentellen Analyse ausgeschlossen, um Randeffekte wie erhöhte Verdunstung zu vermeiden.
  2. Behandeln Sie die Zellen bei 90 % Konfluenz (Zielkonfluenz: ca. 6 × 104 Zellen) mit 100, 50, 25 und 12,5 µM der Furin-Inhibitoren MI-1130 und MI-1131 in einem Gesamtvolumen von 100 µL. Fügen Sie MI-1148 (gleiche Konzentrationen wie MI-1130 und MI-1131), unbehandelte Zellen und mit Wasser behandelte Zellen als negative Kontrollen sowie Ionomycin (100 µM im Assay) als positive Kontrolle für Zytotoxizität hinzu.
  3. 48 Stunden nach der Behandlung (hpt) bewerten Sie die Zellviabilität mittels eines lumineszenten Assays zur ATP-Quantifizierung. Geben Sie ein gleiches Volumen des lumineszenten Assayreagenz zu jeder Vertiefung hinzu (1:1 im Verhältnis zum Kulturmedium), schütteln Sie die Platte 2 Minuten lang, um eine vollständige Zelllyse sicherzustellen, und inkubieren Sie 10 Minuten im Dunkeln, bevor die Lumineszenz gemessen wird.
    ANMERKUNG: Andere Zellviabilitätsassays, die auf unterschiedlichen Nachweisprinzipien basieren, können ebenfalls verwendet werden.
  4. Messen Sie die Lumineszenz in einer schwarzen oder weißen 96-Loch-Platte mit einem Multimode-Reader.

6. Virale Infektion und Behandlung mit einer antiviralen Verbindung

  1. Kultivieren Sie U4.4-Zellen (Ansiedlungsdichte: ca. 3 × 104 Zellen/Vertiefung, Kulturvolumen: 100 µL) in einer schwarzen bildgebenden 96-Loch-Platte unter den oben beschriebenen Bedingungen.
    ANMERKUNG: Äußere Vertiefungen (Reihen A und H; Spalten 1 und 12) wurden mit Zellen beimpft, aber von der experimentellen Analyse ausgeschlossen, um Randeffekte wie eine erhöhte Verdunstung zu vermeiden.
  2. Infizieren Sie die Zellen (Zielkonfluenz: ca. 6 × 104 Zellen) mit SFV-mCherry bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 0,01 in nicht-supplementiertem L-15-Medium unter Verwendung eines Inokulationsvolumens von 100 µL und inkubieren Sie 1 h bei 28 °C.
    ANMERKUNG: Es sollten nur Virusstämme mit niedriger Passage verwendet werden, insbesondere bei sehr niedrigen MOIs und mehrtägigen Infektionen.
  3. Verdünnen Sie die Furin-Inhibitoren MI-1130, MI-1131 und MI-1148 in einem separaten 96-Loch-V-Boden-Plättchen in supplementiertem L-15-Medium auf Endkonzentrationen von 100, 50, 25 und 12,5 µM. Bereiten Sie 110 µL pro Vertiefung vor, um einen 10 %igen Überschuss zu ermöglichen, und übertragen Sie 100 µL (Endvolumen) auf die Zellen. Als Kontrollen verwenden Sie infizierte Zellen, die mit dem Lösungsmittel der antiviralen Substanzen behandelt wurden, sowie infizierte Zellen ohne Wirkstoff als negative Kontrolle. Uninfizierte, unbehandelte Zellen müssen ebenfalls hinzugefügt werden, um die Hintergrundfluoreszenz zu messen.
  4. Nach der 1-stündigen Infektionsphase entfernen Sie das Inokulum und übertragen 100 µL der verdünnten Furin-Inhibitoren von den V-Boden-Plättchen auf die schwarzen bildgebenden Platten.
  5. Inkubieren Sie die Zellen bei 28 °C.

7. Fluoreszenzbildgebung an lebenden Zellen, quantitative Bildanalyse und Datenaufbereitung

  1. Messung der Virusreporter-Expression mittels Fluoreszenzmikroskopie (siehe Supplementary Figure 1, Supplementary Figure 2, Supplementary Figure 3, Supplementary Figure 4, Supplementary Figure 5, Supplementary Figure 6 und Supplementary Figure 7 für die Programmkonfiguration).
    1. Färben Sie 24 und 48 Stunden post Infektion (hpi) die Zellkerne, indem Sie 8 µL einer zellpermeablen nuklearen Gegenfärbung pro Vertiefung hinzufügen. Inkubieren Sie 30 Minuten bei 28 °C.
      HINWEIS: Die Infektion kann zu mehreren Zeitpunkten überwacht werden. Messungen 48 Stunden nach der Infektion liefern jedoch das stärkste Signal (siehe Supplementary Figure 8) und ermöglichen die zuverlässigste Beurteilung antiviraler Effekte. Messungen nach 24 Stunden oder zu Zwischenzeitpunkten sind möglich, aber eine Verlängerung der Inkubation über 48 Stunden hinaus erhöht das Risiko einer Überwucherung der Zellen. Wählen Sie eine geeignete Zellkonfluenz zu Versuchsbeginn, um sicherzustellen, dass die Zellen zum gewählten Messzeitpunkt nicht überwuchert sind. Dies verhindert eine Beeinträchtigung der genauen Zellzählung.
    2. Nach der Inkubation (und zusätzlich zum klaren Deckel) zur Sicherheit eine klare Sichtfolie über die Plattenoberseite legen.
      HINWEIS: Bei Verwendung eines Bildgebungssystems ist es entscheidend, den richtigen Plattentyp auszuwählen. Beleuchtung, Integrationszeit und Verstärkungseinstellungen variieren je nach Reportergen. Es wird dringend empfohlen, Vorversuche durchzuführen, um die optimalen Parameter zu bestimmen. Die anfänglichen Beleuchtungs-, Integrations- und Verstärkungseinstellungen, die zur Etablierung des Protokolls unter den gegebenen Bedingungen verwendet wurden, sind in Supplementary Figure 2 angegeben, wo die Programmkonfiguration detailliert beschrieben ist.
    3. Nehmen Sie Ganzfeldbilder mittels Bild-Stitching (vier Felder pro Vertiefung bei 4facher Vergrößerung) mit dem Multimode-Reader auf.
    4. Messen Sie die rote Fluoreszenzintensität mit einem Texas-Red-Filterblock (Anregung: 586/15 nm; Emission: 647/57 nm).
    5. Bestimmen Sie die Gesamtzellzahl unter Verwendung des DAPI-Kanals mit folgenden Einstellungen (Anregung: 377/50 nm; Emission: 447/60 nm).
  2. Quantitative Bildanalyse (siehe Supplementary Table 1 für Rohdaten).
    HINWEIS: Für die Fluoreszenzmessungen wurde ein Mikroplatten-Bildleser verwendet. Detaillierte Parameter für diesen Assay finden sich in Supplementary Figure 2.
    1. Verarbeiten Sie die Bilder mit geeigneter Bildverarbeitungssoftware.
    2. Wählen Sie im Datenreduktionsfenster „Image Stitching“ für die DAPI- und Texas-Red-Kanäle, um aus den Vertiefungen ein einzelnes Bild zu erstellen.
    3. Fügen Sie „Image Statistics“ hinzu und wählen Sie „Total intensity“ im Texas-Red-Stitched-Kanal. Wenden Sie eine Bildvorverarbeitung an, um Hintergrundrauschen aus dem DAPI-Stitched-Kanal zu entfernen.
    4. Führen Sie eine zelluläre Analyse auf dem vorverarbeiteten DAPI-Stitched-Kanal durch.
    5. Berechnen Sie die mittlere rote Fluoreszenzintensität pro Zelle, indem Sie die mittlere Fluoreszenz der nicht infizierten, unbehandelten Kontrollvertiefungen von jeder behandelten Vertiefung subtrahieren und das Ergebnis durch die Gesamtzellzahl in der entsprechenden Vertiefung dividieren.
  3. Fehlerbehebung
    1. Überwachen Sie die Fokusstabilität während der Messung, insbesondere bei langen Bildaufnahmen oder bei temperatursensitiven Platten.
    2. Aktivieren Sie den Autofokus und erhöhen Sie die Autofokusfrequenz, wenn Fokusdrift beobachtet wird. Verringern Sie die Aufnahmegeschwindigkeit oder lassen Sie die Platten vor der Bildaufnahme auf die Temperatur des Geräts einstellen, falls die Drift anhält.
    3. Verwenden Sie plattentaugliche Mikrotiterplatten, um eine konsistente Signalqualität während der Aufnahme sicherzustellen. Vermeiden Sie Übersprechen und Überbelichtung, indem Sie übermäßige Beleuchtung und lange Integrationszeiten vermeiden.
    4. Verringern Sie die Anregungsintensität, verkürzen Sie die Integrationszeit oder reduzieren Sie die Verstärkung, bis Signalüberlastung vermieden wird. Stellen Sie sicher, dass die Fluorophorkanäle gut getrennt sind, und passen Sie die Filtereinstellungen bei Bedarf an.
      HINWEIS: Übersprechen zwischen DAPI und mCherry ist im Allgemeinen gering, hängt aber von dem verwendeten Reporterkonstrukt ab (z. B. GFP).
    5. Vermeiden Sie eine zu hohe Zellkonfluenz, um die Infektionskinetik und die Empfindlichkeit des Assays aufrechtzuerhalten. Verringern Sie gegebenenfalls die Inkubationszeit vor der Messung.
    6. Überwachen Sie dyebedingte Effekte auf die Zellviabilität und Signalqualität, insbesondere bei hohen Konzentrationen. Verringern Sie die Farbstoffkonzentration oder verkürzen Sie die Inkubationszeiten, wenn dyebedingte Toxizität oder überbelichteter Hintergrund beobachtet werden.
    7. Bereiten Sie die Farbstoffe gemäß den Herstellerempfehlungen zu und lagern Sie sie entsprechend, um die Signalstabilität zu gewährleisten.

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Ergebnisse

In dieser Arbeit wird ein ausführliches Protokoll zur Beobachtung der Ausbreitung von Alphaviren und zur Bewertung von antiviralen Substanzen (z. B. Furin-Inhibitoren) mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie in einem Mehrlochplattenformat vorgestellt. Um die Hemmwirkung auf die virale Reporterexpression bildlich darzustellen, wurden drei zuvor synthetisierte Furin-Inhibitoren zur Prüfung in der Aedine-Zelllinie U4.4 ausgewählt: MI-1148, MI-1130 und MI-1131. Ein Überblick über den experimentellen Arbeitsablauf ist in

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Diskussion

Die Möglichkeit, die Replikation von Alphaviren in Echtzeit zu beobachten, bietet eine sequenzielle und kumulative Perspektive auf herkömmliche Endpunktanalysen. Dieses Multizeitpunkt-Verfahren für die Live-Cell-Bildgebung stellt ein nützliches Modell zur Untersuchung von Alphaviren dar, da es eine dynamische Plattform zur Beobachtung der viralen Ausbreitung bereitstellt.

Der Erfolg dieses Protokolls hängt von mehreren Parametern ab. Zunächst ist es wichtig, die Zytotoxizität der Verbindungen ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben kein Interessenkonflikt.

Danksagungen

Wir danken Prof. Dr. Andres Merits, Universität Tartu, Estland, und Prof. Dr. Andreas Pichlmair, Technische Universität München, Deutschland, für die Bereitstellung von pCMV-SFV6-2SG-mCherry. Wir danken Prof. Dr. Stefanie Becker, Tierärztliche Hochschule Hannover, Deutschland, für die C6/36-Zellen. Wir danken Prof. Dr. Torsten Steinmetzer, Philipps-Universität Marburg, Marburg, Deutschland, für die Bereitstellung der Furin-Inhibitoren. Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Programm Landes-Offensive zur Entwicklung Wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz des hessischen Ministeriums für Hochschule, Forschung und Kunst über das LOEWE-Zentrum für Translational Biodiversity Genomics (LOEWE-TBG) mit der Förderkennung: LOEWE/1/10/519/03/03.001(0014)/52 sowie durch das BMFTR (Projekt ASCRIBE-Förderkennzeichen 01KI2024).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Rinder-Albumin, Fraktion V, pH 7,0SERVA Electrophoresis11930.03
BenchStable DMEMThermo Fisher ScientificA4192101
BHK-21-ZellenCLS Cell Lines Service GmbH, Eppelheim, Deutschland603126
ZELLKULTURFLASCHE, 50 ml, 25 cm2, PS, roter Schraubverschluss mit Filter, klar, CELLSTAR, TC, sterilGreiner Bio-One690175
Zellkultur-Mikroplatte, 24 Vertiefungen, PS, F-Boden (Chimney-Vertiefung), klar, CELLSTAR, TC, Deckel mit Kondensringen, sterilGreiner Bio-One662160
Zellkultur-Mikroplatte, 96 Vertiefungen, PS, F-Boden (Chimney-Vertiefung), µCLEAR, schwarz, CELLSTAR, TC, Deckel mit Kondensringen, sterilGreiner Bio-One655090
Zellkultur-Mikroplatte, 96 Vertiefungen, PS, F-Boden (Chimney-Vertiefung), klar, CELLSTAR, TC, Deckel mit Kondensringen, sterilGreiner Bio-One655180
Zellkultur-Mikroplatte, 96 Vertiefungen, PS, V-Boden, klarGreiner Bio-One651101
ZellabstreiferVWR734-2602
CellTiter-Glo Lumineszenz-Assay zur Bestimmung der ZellviabilitätPromegaG7573
Cytation 5 Cell Imaging Multimode ReaderBiotek
DAPI-Filterwürfel 1225100Biotekex: 377/50 nm; em: 447/60 nm
Dulbeccos modifiziertes Eagles Medium (DMEM GlutaMAX)Thermo Fisher ScientificA4192102
Fötales RinderserumFisher Scientific11550356
Furin-Inhibitor MI-1130Diese Studie
Furin-Inhibitor MI-1131Diese Studie
Furin-Inhibitor MI-1148Hardes et al. 2015.  https://doi.org/10.1002/cmdc.201500103 
Gen5 Prime SoftwareBiotek
Ionomycin-Calciumsalz, 99 %Thermo Fisher ScientificJ60628
Leibovitzs L-15 Medium, GlutaMAX-Zusatz Thermo Fisher Scientific31415029
Lipofectamine 3000 TransfektionsreagenzThermo Fisher ScientificL3000001
MEM nicht-essentielle Aminosäuren (100x)Thermo Fisher Scientific11140050
Mikroplatte, PS, 96 Vertiefungen, F-Boden (Chimney-Vertiefung), schwarz, Fluotrac, mittlere BindungGreiner Bio-One655076
NucBlue Live ReadyProbes Reagenz (Hoechst 33342)Thermo Fisher ScientificR37605
Opti-MEMThermo Fisher Scientific31985062
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
SFV6–2SG-mCherryProf. Dr. Andres Merits (Universität Tartu, Estland) und Prof. Dr. Andreas Pichlmair (Technische Universität München, Deutschland)
Texas Red-Filterwürfel 1225102 Biotekex: 586/15 nm; em: 647/57 nm
Tryptose-Phosphat-Brühe Thermo Fisher Scientific18050039
U4.4-ZellenFriedrich-Loeffler-Institut, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit, Greifswald, Deutschland
Viewseal Verschlussfolie, klarGreiner Bio-One676070

Referenzen

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