Erstellung eines auf Prostataorganoiden basierenden Mausmodells zur Untersuchung von Wirts-Pathogen-Interaktionen

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung eines auf Maus basierenden Prostataorganoidenmodells, das in 2D gezüchtet wurde. Dazu gehören Organoid-Dissoziation, Zellaussaatung, Differenzierung, Bewertung der Epithelintegrität und In-vitro-Infektionen mit uropathogenen Escherichia coli. Das Modell bietet apikale Zugänglichkeit und eignet sich für die Untersuchung von Wirts-Pathogen-Interaktionen, wodurch die Einschränkungen traditioneller 3D-Organoidsysteme überwunden werden.

Abstract

Ältere Männer sind stark von Prostataerkrankungen wie gutartiger Prostatahyperplasie, Prostatitis und Prostatakrebs betroffen. Zusammen tragen diese Erkrankungen wesentlich zur globalen Gesundheitsbelastung bei und sind eine der Hauptursachen für Krankheiten bei Männern. Organoid-Modelle haben die Krankheitsmodellierung grundlegend verändert, indem sie die Replikation wichtiger Merkmale der epithelialen Struktur und -Funktion in vitro ermöglichten. Die geschlossene Lumenstruktur der Organoide begrenzt jedoch den experimentellen Zugang zur apikalen Oberfläche und erschwert Studien zu Wirts-Pathogen-Interaktionen. Um diese Herausforderungen zu meistern, entwickelten wir ein physiologisch relevantes Kultursystem, in dem Zellen, die von Prostataorganoiden der Maus abstammen, als zweidimensionales (2D) Modell ausgesat werden. Dieser Ansatz erhält wesentliche Epitheleigenschaften bei, während er direkten Zugang zur apikalen Oberfläche bietet. Dieses Schritt-für-Schritt-Protokoll beschreibt die Dissoziation ausgereifter Maus-Prostataorganoide und optimale Aussaatbedingungen zur Unterstützung der Zellbindung, -proliferation und -differenzierung. Die Immunfluoreszenzmikroskopie bestätigte die Expression prostataspezifischer Marker im organoidbasierten Modell und zeigte eine genaue Darstellung der zellulären Organisation des Prostatagewebes. TEER-Messungen sowie Färbung von F-Actin und Tight Junction bestätigten die Zelldifferenzierung und Barrierenbildung weiter. Die Infektion des Modells mit uropathogener Escherichia coli (UPEC) zeigte seinen Nutzen bei der Untersuchung von Wirts-Pathogen-Interaktionen. Dieses Modell bietet eine wertvolle Plattform zur Untersuchung der Prostataepithelbiologie und Krankheitsmechanismen und eignet sich besonders gut zur Untersuchung von Wirts-Pathogen-Interaktionen sowie zur Bewertung potenzieller therapeutischer Strategien.

Introduction

Die Prostata ist ein kleines Organ, das sich unterhalb der Blase befindet und die Harnröhre umgibt. Es ist ein wesentliches Organ des männlichen Fortpflanzungstrakts und seine Hauptfunktion ist die Produktion der Prostataflüssigkeit. Diese Flüssigkeit macht bis zu 30 % des Samenplasmas aus und ist entscheidend, um die Spermien während ihrer Reise durch den weiblichen Fortpflanzungstrakt^zu nähren und zu schützen. Prostataerkrankungen wie Prostatitis, gutartige Prostatahyperplasie und Prostatakrebs sind sehr verbreitet und stellen weltweit eine erhebliche Belastung für das Gesundheitswesen^dar 2,3,4,5. Während gutartige Prostatahyperplasie und Prostatakrebs intensiv untersucht werden, bleiben Prostatitis, insbesondere bakterielle Prostatitis, vergleichsweise wenig erforscht. Prostatitis betrifft weltweit bis zu 16 % der Männer ^6,7, wobei bakterielle Infektionen etwa 10 % der Fälle ausmachen. Trotz ihrer Häufigkeit ist bakterielle Prostatitis noch wenig verstanden. Escherichia coli (E. coli)-Stämme, insbesondere uropathogene E. coli (UPEC), sind die Hauptursache für bakterielle Prostatitis ^8,9.

Die Forschung zu den molekularen Mechanismen der Prostatainfektion bleibt durch das Fehlen physiologisch relevanter In-vitro-Modelle begrenzt. Die meisten Studien zur Prostataerkrankung basieren traditionell auf Zelllinien oder Tiermodellen. Insbesondere wurden krebsartige oder transformierte Zelllinien wie LNCaP oder RWPE-1 weit verbreitet eingesetzt, um Prostataerkrankungen und die Reaktion auf die Behandlung zu modellieren 10,11,12,13. Diesen Modellen fehlt jedoch die Zellzusammensetzung und die Komplexität eines gesunden oder krebsartigen Prostataepithels. Darüber hinaus haben viele andere Studien Tiermodelle (meist Mausmodelle) verwendet, um verschiedene Hypothesen bezüglich Prostatainfektion, Immunantwort, Prostatatumorwachstum und Metastasen^{zu untersuchen.} Obwohl diese Modelle bisher am fortschrittlichsten und informativsten sind, werfen sie typischerweise ethische Bedenken auf, erfordern erhebliche Zeit und Ressourcen und können teuer sein. Alternativ wurden ex vivo Gewebeexplantierungen und primäre Zellkulturen auch für kurzfristige Studien zu Gewebereaktionen auf Medikamente oder Krebsentwicklung^{verwendet 18,19,20}. Dennoch haben diese Modelle eine begrenzte Lebensdauer und die Verfügbarkeit von frischem menschlichem Gewebe ist oft eingeschränkt.

Dreidimensionale (3D) Organoidkulturen, die aus adulten Stammzellen gewonnen wurden, haben sich als vielversprechende Alternative zur Modellierung von Epithelgeweben in vitro erwiesen. Im Gegensatz zu herkömmlichen Zelllinien behalten Organoide wichtige Merkmale des ursprünglichen Epithels bei, wie zelluläre Heterogenität, gewebespezifische Architektur und funktionelle Eigenschaften 21,22,23. Im Gegensatz zu den primären Zellkulturen oder ex vivo Explanten können organoide Kulturen über einen langen Zeitraum expandiert und durchgeführt werden, ohne seneszent zu werden. Diese Eigenschaften machen organoide Systeme besonders geeignet für die Untersuchung von Krankheiten und Wirts-Pathogen-Interaktionen in einem physiologisch relevanten Kontext. Prostataorganoide wurden aus gesundem und krebsartigem menschlichem Gewebe sowie aus Mausmodellen erzeugt und hauptsächlich in der Prostatakrebsforschung^eingesetzt 24,25,26. Dennoch stellt für Infektionsstudien die 3D-Struktur von Organoiden eine erhebliche Herausforderung dar, hauptsächlich aufgrund des begrenzten Zugangs zur luminalen Zelloberfläche. Traditionell wurden intakte 3D-Organoide entweder durch Mikroinjektion des pathogenen Wirkstoffs infiziert oder indem das Organoid zunächst in Fragmente oder Einzelzellen dissoziiert wurde, bevor es mit dem Erreger²³ inkubiert wurde. Hier können Variabilität in Größe und 3D-Struktur Reproduzierbarkeit und Durchsatz beeinflussen. Alternativ bieten apikale Organoide eine Möglichkeit, die Einschränkung der Lumen-Unzugänglichkeit zu überwinden. Das Kultivieren von Organoiden in Suspension, entweder in ultraniedrigen Gewebekulturplatten oder auf mit nicht-adhäsiven Tensiden beschichteten Oberflächen, führt zu einer Umkehrung der Organoidpolarität. Dadurch zeigt die apikale Oberfläche nach außen, was direkten Zugang für Pathogeninfektionsstudien^ermöglicht. Diese Kulturen können jedoch nicht langfristig aufrechterhalten werden, und Variabilität in Organoidgröße und Zellanzahl erschwert die Bestimmung der Multiplizität der Infektion (MOI). Darüber hinaus sind die Mechanismen hinter der Polaritätsumkehrung und deren Auswirkungen auf die organoiden Zellen noch nicht vollständig verstanden. Um die Einschränkungen von Organoiden als In-vitro-Infektionsmodelle zu überwinden, wurden apikal zugängliche, organoidbasierte Modelle entwickelt, die Organoide aus Organen wie Magen, Darm oder Lunge 29,30,31 verwenden. Solche Systeme bewahren die wichtigsten Epithelmerkmale und ermöglichen eine einfachere Manipulation, Bildgebung sowie kontrollierte Exposition gegenüber Krankheitserregern und/oder Medikamenten. Die Kulturbedingungen, die die Zelldifferenzierung ermöglichen, lassen sich jedoch nicht immer von den Organoidkulturen auf die 2D-Kulturmodelle^31,32 übertragen.

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erstellung eines apikal zugänglichen Prostataepithelmodells unter Verwendung von Maus-Prostataorganoiden. Dieses Modell wurde zuvor in unserem Labor entwickelt und validiert, wo wir seine starke Ähnlichkeit mit nativem Prostatagewebe und seine Relevanz für infektionsbiologische Studien mit UPEC³² nachwiesen. Das System ahmt die zelluläre Zusammensetzung und Polarität des Prostataepithels genau nach und bietet gleichzeitig eine verbesserte Zugänglichkeit für experimentelle Manipulationen. Darüber hinaus zeigen wir ihre Anwendbarkeit für die Untersuchung von Wirts-Pathogen-Interaktionen in der Prostata, was eine besser handhabbare Alternative zu In-vivo-Modellen und ein physiologisch relevanteres System als herkömmliche Zelllinien oder 3D-Organoidmodelle bietet.

Protocol

Ethische Erklärung: Alle Tierverfahren entsprachen den Richtlinien zur Tierpflege und Nutzung der Universität Würzburg und wurden gemäß den entsprechenden institutionellen und staatlichen Vorschriften genehmigt. In dieser Studie wurden nur WT-Mäuse verwendet, die in unserem Institut von anderen Forschungsgruppen für unabhängige Zwecke eingeschläfert worden waren. Für diese Arbeit wurden keine Tiere speziell geopfert, gemäß den 3R-Prinzipien (Ersatz, Reduktion und Verfeinerung).

HINWEIS: Das hier vorgestellte Protokoll basiert auf einer früheren Studie der^{Autoren 32}. Alle hier beschriebenen Schritte müssen in einem sterilen Biosicherheitsschrank unter Verwendung der entsprechenden aseptischen Techniken und mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung durchgeführt werden. Mausprostataorganoide wurden aus C57BL/6-Mäusen erzeugt und in einer 3D-Kultur erhalten, wie zuvor^{beschrieben 25,26}. Um den 3R-Prinzipien zu folgen, wurden die Mausprostata von der Tiereinrichtung von unbehandelten, naiven WT-Mäusen (mindestens 6 Monate alt) gespendet, die aus anderen Gründen geopfert wurden. Kurz gesagt, die Mausprostata wurden in zwei Schritten mit Kollagenase und TrypLE Express Enzyme zerkleinert und verdaut. Anschließend wurden die Zellen in Tropfen extrazellulärer Matrix (ECM) eingesät, um die 3D-Organoide zu erzeugen. Kulturmedium wurde der Kultur hinzugefügt und alle 3 Tage wieder aufgefüllt. 3D-Organoidkulturen wurden einmal pro Woche durchgeführt und ab Passage 3 für die 2D-Aussaatung verwendet. Eine Woche alte Prostataorganoide der Maus wurden verwendet, um das organoidbasierte Modell nach dem aktuellen Protokoll auf eine 2D-Oberfläche zu säen. Die Beschichtung von Gewebekulturplatten mit ECM-Proteinen ist für dieses Protokoll nicht erforderlich.

1. Erzeugung des prostataorganoidbasierten Modells

1. 3D-Organoid-Isolation
   1. Aspiratiere das Medium aus der gewünschten Anzahl von Brunnen mit 3D-Organoiden aus einer 24-Well-Platte. Ersetzen Sie es durch 500 μL adDMEM/F12+/+ pro Bohrloch (siehe Materialtabelle).
   2. Benutze eine P1000-Pipette, um den ECM-Abfall mechanisch zu stören. Sammeln Sie die Federung in einem 15-mL konischen Rohr. Sammeln Sie maximal zwei Brunnen pro Rohr.
   3. Fülle mit adDMEM/F12+/+ bis zu 10 mL auf. Lenke das Rohr vorsichtig 3-4 Mal um, um zu mischen. Zentrifugiere bei 450 x g für 5 Minuten bei 4 °C.
2. 3D-Organoid-Zerstörung in Einzelzellen
   1. Aspiriere das Supernatant. Das Pellet wird in 2 mL vorgewärmtes (37 °C) TrypLE-Expressenzym mit 10 μM RHOKi neu suspendiert.
   2. Inkubieren Sie 15 Minuten in einem Wasserbad bei 37 °C. Verwende alle 5 Minuten eine P1000-Pipette, um die Zellsuspension zu mischen.
      HINWEIS: Überprüfen Sie die Zellsuspension unter einem umgekehrten Mikroskop mit einem 4x-Objektiv, um sicherzustellen, dass die Zellen größtenteils einzeln sind. Kleine Klumpen von 2-3 Zellen sind akzeptabel. In der Regel reichen 15 Minuten Inkubation aus, können aber bei Bedarf verlängert werden.
   3. Lade mit 10 mL adDMEM/F12+/+ nach. Lenke das Rohr vorsichtig 3-4 Mal um, um zu mischen. Zentrifugiere bei 450 x g für 5 Minuten bei 4 °C.
3. Beschichtung der Einzellensuspension
   1. Saugen Sie das Supernatant ab, ohne das Pellet zu stören. Die Zellpellets werden in einem Kulturmedium mit 10 μM RHOKi (300 μL Kulturmedium pro Brunnen aus 3D-Organoiden, wie in Schritt 1.1.1 verwendet) wieder suspendiert.
      HINWEIS: Das Kulturmedium besteht aus: Advance Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium/F12, 10 mmol L⁻¹ HEPES, 1x GlutaMAX, 1x B27, 1 mM N-Acetylcystein, 10 % Noggin-konditioniertem Medium, 10 % R-Spondin 1-konditioniertem Medium, 50 ng·^mL-1 EGF, 1 nM 5α-Dihydrotestosteron (DHT), 0,2 μM TGFβi und 100 ng·^mL-1 Primocin (siehe Materialtabelle). Für Infektionsexperimente verwenden Sie Kulturmedium ohne Primocin.
   2. Zähle die Anzahl der Zellen in der Suspension mit einer Neubauer-Zählkammer.
   3. Verdünnen Sie die Zellsuspension in einem Kulturmedium, ergänzt mit 10 μM RHOKi, auf eine Konzentration von 62.500 Zellen·^mL-1. Verwenden Sie 200 μL der Zellsuspension pro Bohrloch, um auf 48-Well-Platten (vom Hersteller behandelte Gewebekultur, siehe Materialtabelle) oder 300 μL pro Bohrloch auf kammerierten μ-Slides (siehe Materialtabelle) zu säen. Stellen Sie die Platte in einen Zellkultur-Inkubator bei 37 °C und 5 %_CO2.
      HINWEIS: Jeder Brunnen mit 3D-Organoiden, verwendet in Schritt 1.1.1. typischerweise ergibt er etwa 200.000 Zellen.
   4. Nach einem Tag sind die meisten einzelnen Zellen an der 2D-Oberfläche befestigt. Wechsle das Kulturmedium alle 2-3 Tage. Die Konfluenz wird innerhalb von 7 Tagen erreicht.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass RHOKi nur für die anfängliche Aussaatung hinzugefügt wird und nicht für spätere Medienwechsel.
4. Differenzierung des organoidbasierten Modells.
   HINWEIS: Folgen Sie den nächsten Schritten, um ein differenziertes, organoidbasiertes Modell zu erhalten, das mit luminalen Zellen angereichert ist.
   1. Füge 10 nM DHT zur Zellsuspension hinzu (Schritt 1.3.3). Verwenden Sie für die späteren Mediumwechsel (alle 2-3 Tage) ein Kulturmedium ergänzt mit 10 nM DHT.
      HINWEIS: Wenn kein DHT zur Zellsuspension (und den daraus resultierenden Mediumwechseln) hinzugefügt wird, wird das organoidbasierte Modell mit Basalzellen angereichert.

2. Transepitheliale elektrische Widerstandsmessungen (TEER)

1. Säen Sie die Organoid-Zellsuspension bei einer Konzentration von 62.500 Zellen·^mL-1 mit 300 μL (erhalten in Schritt 1.3.3) auf einem 8-Well-PET-μ-Objektträger mit 40 Elektroden pro Bohrloch (siehe Materialtabelle). Fügen Sie 300 μL Kulturmedium, beschrieben in 1.3.1, zu einem der zelllosen Brunnen hinzu.
   HINWEIS: Der zellfreie Brunnen wird als Rohling für Messungen verwendet.
2. Verbinden Sie den μ-Slide mit dem impedanzbasierten Zellanalysesystem (siehe Materialtabelle) mit der 16-Well-Station, die in einem Gewebekulturinkubator platziert ist. Messen Sie den TEER 7 Tage lang bei 400 Hz. Wechsle das Kulturmedium alle 2-3 Tage.

3. Immunfluoreszenzfärbung

HINWEIS: Für diese Methode sollte sichergestellt werden, dass die Zellen in kammerierten μ-Objektträgern (siehe Materialtabelle), die mit hochauflösenden Mikroskopieanwendungen kompatibel sind, ausgesat werden.

1. Zur festgelegten Zeit entferne das Medium und wasche die Zellen dreimal mit 1x PBS. Fixieren Sie die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) für 15 Minuten bei Raumtemperatur (Lichteinsetzung vermeiden).
   VORSICHT: 4 % Paraformaldehyd können eine allergische Hautreaktion, schwere Augenschäden verursachen und werden vermutet, Krebs zu verursachen. Verwenden Sie stets geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA). Vermeiden Sie das Einatmen von Staub, Dämpfen, Gasen, Nebeln, Dämpfen oder Sprays. Tragen Sie Schutzhandschuhe und stellen Sie sicher, dass kontaminierte Kleidung bis zur ordnungsgemäßen Dekontamination im Labor bleibt. Entsorgen Sie den Inhalt und die Behälter über eine zugelassene Abfallentsorgungsanlage.
2. Nach der Fixierung wasche du die Zellen dreimal mit 1x PBS (jeweils 5 Minuten). Permeabilisieren Sie die Zellen mit 0,5 % Triton X-100 (siehe Materialtabelle) für 15 Minuten bei Raumtemperatur.
   VORSICHT: Triton X-100 verursacht Hautreizungen und schwere Augenschäden. Es ist sehr giftig für das Wasserleben, hat langanhaltende Auswirkungen und kann endokrine Störungen in der Umwelt verursachen. Tragen Sie beim Handling Schutzhandschuhe, Augen- und Gesichtsschutz. Entsorgen Sie den Inhalt und die Behälter über eine zugelassene Abfallentsorgungsanlage. Vermeiden Sie eine Freisetzung in die Umwelt.
3. Wasche die Zellen zweimal mit 1x PBS (jeweils 5 Minuten). Blockieren Sie die Zellen mit einem Blockpuffer (1 % BSA in PBS, siehe Materialtabelle) bei Raumtemperatur für 30 Minuten.
4. Verdünnen Sie die primären Antikörper im Blockpuffer (1 % BSA in 1x PBS) und inkubieren Sie mit den Zellen über Nacht bei 4 °C auf einer Schaukelplattform. Am folgenden Tag brütet man 1 Stunde bei Zimmertemperatur aus. (siehe Materialübersicht für Antikörperverdünnungen).
   HINWEIS: Für die Färbung von F-Actin mit Phalloidin oder Plasmamembran mit CellMask (siehe Materialtabelle) überspringen Sie Schritt 3.4.
5. Wasche die Zellen dreimal mit 1x PBS (jeweils 5 Minuten). Verdünnen Sie die sekundären Antikörper, Phalloidin oder CellMask (siehe Materialtabelle), im Blockpuffer (1 % BSA bei 1x PBS) und inkubieren Sie mit den Zellen 1 Stunde bei Raumtemperatur.
6. Wasche die Zellen dreimal mit 1x PBS (jeweils 5 Minuten). Inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten bei Raumtemperatur mit Hoechst (siehe Materialtabelle), verdünnt in 1x PBS, um die Kerne zu färben.
7. Wasche die Zellen dreimal mit 1x PBS (jeweils 5 Minuten) und lasse die Zellen mit 1x PBS zurück. Lagern Sie bei 4 °C.
8. Bilden Sie die gekammerten μ-Objektträger-Objektträger (siehe Materialtabelle) in einer Laser-Scanning-Konfokalmikroskopie oder Fluoreszenzmikroskop.
   HINWEIS: Übersichtsbilder können mit einem 20x-Objektiv auf einem Fluoreszenzmikroskop aufgenommen werden, um die Gesamteffizienz und Verbreitung der Infektion zu bewerten. Höher aufgelöste Bilder wurden mit einem konfokalen Mikroskop mit einem 40-fachen Wasserimmersionsobjektiv erstellt, um einzelne Bakterien, die an Epithelzellen gebunden oder innerlich verinnerlicht wurden, zu visualisieren. Fluorophore wurden mit Laserlinien bei 405, 499, 590 und 653 nm angeregt, abhängig von den verwendeten Fluorophoren. Die Emission wurde mit Emissionsfenstern auf 415 bis 516 nm für Hoechst, 509 bis 573 nm für GFP oder Alexa 488, 600 bis 651 nm für McCherry oder Alexa 594 und 663 bis 720 nm für Alexa 647 festgestellt. Z-Stacks wurden mit einer Schrittweite von 0,5 μm aufgenommen und bedeckten die gesamte Dicke der Epithelschicht. Die Bilder wurden mit einer Auflösung von 1024 mal 1024 Pixeln aufgenommen, mit einer Scanfrequenz von 400 Hz und einem Bilddurchschnitt auf 4, was eine gute Bildqualität bietet. Laserleistung und Detektorverstärkung wurden unter allen Bedingungen innerhalb desselben Experiments konstant gehalten. Alle Bildparameter, einschließlich Laserleistung, Detektorverstärkung, Scangeschwindigkeit und Mittelwertung, sollten je nach verwendetem Konfokalmikroskop optimiert und angepasst werden.

4. Bakterielle Infektion mit uropathogenem E. coli (UPEC)

HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie ein organoidbasiertes Modell verwenden, das 7 Tage lang ohne Primocin gepflegt wird (siehe Materialtabelle) für die folgenden Schritte.

Der uropathogene E. coli-Stamm UTI89, der konstitutiv ein mCherry-Protein aus dem Plasmid pFPV-mCherry (ampicillinresistent) exprimiert, wurde in dieser Studie verwendet.

VORSICHT: Tragen Sie beim Umgang mit infektiösen Krankheitserregern (Biosicherheitsstufe 2) Handschuhe sowie geeigneten Augen- und Gesichtsschutz. Trage immer einen komplett zugeknöpften Laborkittel. Führen Sie alle Verfahren in einem zertifizierten biologischen Sicherheitsschrank durch. Dekontaminieren Sie Arbeitsflächen und waschen Sie die Hände gründlich nach der Handhabung biologischer Materialien. Sammeln Sie BSL-2-Abfälle in ausgewiesenen Biohazard-Behältern, die für die Autoklavierung geeignet sind. Dekontaminieren Sie Abfallstoffe vor der Entsorgung mittels Autoklavierung oder einer anderen geeigneten Dekontaminationsmethode.

1. Drei Tage vor dem Infektionsexperiment wird der UPEC-Stamm auf einer LB-Agarplatte mit dem entsprechenden Antibiotikum ergänzt (Ampicillin 100 μg·^mL-1 wurde in diesem Protokoll verwendet) ausgebracht und 16–24 Stunden bei 37 °C inkubiert.
   VORSICHT: Einige Antibiotika können bei Kontakt allergische Reaktionen oder Reizungen auslösen und zu einer antimikrobiellen Resistenz beitragen, wenn sie unsachgemäß entsorgt werden. Bereiten Sie immer Antibiotika vor und fügen Sie sie in einem biologischen Sicherheitsschrank ein, während Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (Handschuhe und Augenschutz) tragen. Entsorgen antibiotikahaltige Lösungen als chemische Abfälle über eine zugelassene Entsorgungsanlage.
2. Zwei Tage vor dem Infektionsexperiment inokulieren Sie 3 ml LB-Brühe, ergänzt mit dem entsprechenden Antibiotikum (Ampicillin 100 μg·^mL-1) mit einer einzelnen UPEC-Kolonie aus der Agarplatte (Schritt 4.1). Inkubieren Sie statisch bei 37 °C für 12–16 Stunden.
3. Einen Tag vor dem Infektionsexperiment wird die Bakterienkultur aus Schritt 4.2 vortexiert und ihr OD₆₀₀ misst. Berechnen Sie das Volumen dieser Kultur, das benötigt wird, um 3 mL LB-Brühe mit Ampicillin (100 μg·^mL-1) auf einen Anfangs-OD₆₀₀ von 0,05 zu inokulieren, mit folgender Formel: Volumen (μL) = (0,05 * 3.000 μL) / gemessen OD₆₀₀. Addiere das berechnete Volumen der Kultur aus Schritt 4.2. in die frische LB-Brühe und 24 Stunden lang statisch bei 37 °C inkubieren.
   HINWEIS: Der OD₆₀₀ der Übernachtkultur aus Schritt 4.2 sollte zwischen 1.7 und 2.2 liegen.
4. Am Tag der Infektion wirbeln Sie die Bakterienkultur aus Schritt 4.3 vortex und missen Sie ihren OD₆₀₀. Ernte OD₆₀₀ 1 aus der Kultur und zentrifugiere dann bei 12.000 x g für 2 Minuten bei Raumtemperatur. Entferne das Überwasser.
5. Resuspendieren in 1 ml Primocin-freiem organoidem Kulturmedium ohne DHT. Verdünnen auf einen MOI von 100.
   HINWEIS: Jeder Brunnen in einer 48-Bohrloch-Platte wird am 7. Tag etwa 150.000 Zellen enthalten. Diese Schätzung wurde durch das Zählen von Zellen in einem Brunnen vor der Infektion über mehrere Experimente hinweg ermittelt. Um den MOI genau anzupassen, wird empfohlen, vor der Infektion eine zusätzliche Bohrung für die Zellzählung zu säen. Um das benötigte Volumen der bakteriellen Suspension (Schritt 4.4) zu bestimmen, multiplizieren Sie die Anzahl der Zellen pro Bohrloch mit dem MOI, um die Gesamtzahl der benötigten Bakterien pro Bohrloch zu erhalten, und teilen Sie diese Zahl dann durch die Bakterienkonzentration (8 × 10⁵ Bakterien/μL), um das Volumen in μL zu erhalten.
6. Ersetzen Sie das Kulturmedium des organoidbasierten Modells durch ein Kulturmedium, das Bakterien enthält. Stellen Sie das Volumen entsprechend der Kulturoberfläche an: Verwenden Sie 200 μL pro Bohrloch für 48-Bohrlochplatten und 300 μL pro Bohrloch für μ-Slides. Inkubieren Sie 1 Stunde in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 °C und 5 %_CO2.
7. Nach der Inkubationszeit wird das bakterienhaltige Medium aus dem organoidbasierten Modell aspiriert. Wasche den Brunnen dreimal mit adDMEM/F12+/+, um extrazelluläre Bakterien zu entfernen.
8. Fügen Sie Kulturmedium mit 50 μg^·mL-1 Gentamicin hinzu, um extrazelluläre Bakterien abzutöten. Inkubiere es 30 Minuten.
   HINWEIS: Die Gentamicinkonzentration muss je nach verwendetem Bakterienstamm angepasst werden. Bei Verwendung einer Konzentration über 50 μg·^mL-1 wird empfohlen, auf zelluläre Zytotoxizität zu prüfen.
9. Entfernen Sie das Medium und ersetzen Sie es durch frisches Medium, ergänzt durch 10 μg^·mL-1 Gentamicin für die verbleibende Infektionszeit.
   Verarbeiten Sie die infizierten Zellen zur Fluoreszenzfärbung nach Abschnitt 3 oder zur Quantifizierung durch Durchflusszytometrie nach Abschnitt 5.

5. Quantifizierung der Infektion mittels Durchflusszytometrie

1. Aspiriere das Kulturmedium und wasche die Zellen dreimal mit 1x PBS. Verwenden Sie 100 μL TrypLE Express Enzyme, um die Zellen abzukoppeln. Inkubiere 5–10 Minuten, bis alle Zellen abgetrennt sind.
   HINWEIS: Ein Brunnen aus einer 48-Bohrloch-Platte ist gemäß Zustand ausreichend.
2. Sammeln Sie die Zellsuspension auf und übertragen Sie sie in einen Brunnen einer 96-Well-Platte (konischer Boden). Fügen Sie 100 μL Durchflusszytometerpuffer (1x PBS, 10% FBS, 5 mM EDTA) obendrauf hin, um das TrypLE-Expressenzym zu inaktivieren.
3. Zentrifugieren Sie die 96-Well-Platte bei 450 x g für 5 Minuten bei 4 °C. Entfernen Sie den Supernatant und lassen Sie das Pellet in 150 μL Durchflusszytometerpuffer wieder suspendieren.
4. Erfassen und quantifizieren Sie infizierte Zellen mit dem Durchflusszytometer (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Die Durchflusszytometrie wurde mit einem 488-nm-Exzitationslaser und einem 615/20-nm-Emissionsfilter zur Detektion von mCherry-positiven Zellen durchgeführt. Die Daten wurden bei hoher Durchflussrate (66 μL·min⁻¹) erhoben, wobei mindestens 10.000 Ereignisse pro Probe erfasst wurden und nur Ereignisse mit Vorwärtsstreuhöhenwerten größer als 80.000 einbezogen wurden. Infizierte Zellen wurden anhand der mCherry-Fluoreszenz im Vergleich zu einer nicht infizierten (naiven) Kontrollgruppe identifiziert, nachdem Trümmer und Wamlett ausgeschlossen wurden. Ein Viabilitätsmarker (z. B. Propidiumiodid oder andere lebende/tote Färbungen) kann in die Gating-Strategie zur Beurteilung der Zellviabilität einbezogen werden. Dies kann besonders nützlich sein, wenn man erstmals mit dem Modell arbeitet, um sicherzustellen, dass die Zelldissoziation die Zellen nicht negativ beeinflusst.

Results

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung eines organoidbasierten Modells des Prostataepithels der Maus, das den Zelltyp und die transkriptionelle Expression des epithelialen Kompartments des nativen Gewebes repapituliert. Dieses Modell wird mit 3D-Organoiden adulter Stammzellen erzeugt, die aus adultem Mausprostatagewebe entstehen. Diese organoiden Kulturen werden dann in der Kultur erhalten und wöchentlich durchgeführt. Für das organoidbasierte Modell beginnt der erste Schritt im Workflow (Abbildung 1A) mit der Verwendung von 7 Tage alten 3D-Organoiden. Dieser Zeitraum ist notwendig, damit sie eine angemessene Größe und Zelldichte für die spätere Aussäung auf einer 2D-Oberfläche erreichen. Nach dem Durchlaufen wurden kleine Fragmente von Organoiden (Abbildung 1B, Tag 0) in ECM ausgesät und durften wachsen. Im Laufe der Zeit wachsen sie bis Tag 7 zu großen, kugelförmigen Strukturen mit einem definierten inneren Lumen heran (Abbildung 1B). Nach der Dissoziation der sieben Tage alten Organoide in Einzelzellen wurden die Zellen auf eine mit Gewebekulturen behandelte Platte (Abbildung 1C, Tag 0) mit demselben Kulturmedium wie die 3D-Organoidkulturen (1nM DHT) ausgesaat, um eine Monoschicht zu bilden. Am ersten Tag begannen die angehefteten Zellen zu vermehren. In den folgenden Tagen dehnte sich die Monoschicht aus und erreichte den Zusammenfluss zwischen Tag 3 und Tag 5, wie durch die Hellfeldmikroskopie beobachtet wurde (Abbildung 1C). Um die morphologischen Veränderungen im Laufe der Zeit zu charakterisieren und den Zeitpunkt zu überwachen, zu dem das organoidbasierte Modell zur Konfluenz kommt, haben wir die Plasmamembran mit CellMask gefärbt und an mehreren Zeitpunkten eine Fluoreszenzbildgebung durchgeführt (Abbildung 1D).

Da die Androgenrezeptor-(AR)-Signalübertragung ein wichtiger Regulator der Zelldifferenzierung in der Prostata ist und die Modulation der Testosteronkonzentration (DHT) im Organoidkulturmedium die gezielte Differenzierung von Stammzellen in Basal- oder Luminalzellen³² ermöglichte, passten wir die DHT-Werte im Kulturmedium an, um die Anreicherung entweder von luminalen Zellen (DHT 10 nM) oder Basalzellen (ohne DHT, Kontrolle; Methode1, Abbildung 2A). Wie in Abbildung 2 (B-F) dargestellt, wurden keine wesentlichen Unterschiede im Zellwachstum oder bei der Konfluenz beobachtet. Wie erwartet exprimierten die meisten Zellen im Kontrollzustand (organoides Kulturmedium ohne DHT) Cytokeratin 5 (KRT5), einen Marker der prostatabasalen Stammzellen (Abbildung 2B,E). Im Gegensatz dazu zeigten nur wenige Zellen niedrige CD24a-Werte, einen Marker differenzierter luminaler Prostatazellen (Abbildung 2B,F).

Die Supplementierung mit 1 nM DHT, wie zuvor^{beschrieben 32}, führte zu einer gemischten Population mit sowohl Basal- als auch Luminalzellen. Die Expression von CD24a blieb jedoch niedrig, was auf eine unvollständige Differenzierung in luminale Zellen hinweist (Abbildung 2C, F³²). Die Erhöhung des DHT auf 10 nM förderte die vollständige Differenzierung der luminalen Zellen, während einige Basalzellen nach 7 Tagen Kultur erhalten blieben (Abbildung 2D-F). Die Differenzierung der organoidbasierten Modelle kann ebenfalls mittels Brightfield-Mikroskopie bewertet werden. Obwohl die Unterschiede zwischen den Bedingungen bei spärlicher Zelle nicht sehr klar sind (Tag 0 - 5, Abbildung 1C, ergänzende Abbildung 1A), werden die Zellmorphologie und das Aussehen zwischen den drei Kulturbedingungen ab Tag 7 durch die Brightfield-Mikroskopie deutlich und deutlich sichtbar (Abbildung 1C, ergänzende Abbildung 1A,B). Ohne DHT wirkten die Zellen flacher und unregelmäßiger in der Form, während bei 10 nM DHT die Zellen eng mit einer polygonalen Anordnung zusammengedrängt waren, die einer Kopfsteinpflastermorphologie ähnelt (ergänzende Abbildung 1B).

Bemerkenswert ist, dass 3D-Organoidkulturen auch morphologische Veränderungen durchliefen, wenn sie bei unterschiedlichen DHT-Konzentrationen kultiviert wurden. Konkret wurde eine deutliche dosisabhängige Zunahme der Organoidgröße beobachtet, wobei die größten Organoide in Anwesenheit von 10 nM DHT entstanden (Abbildung 1B, ergänzende Abbildung 2A,B). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der AR-Weg nicht nur für die Zelldifferenzierung entscheidend ist, sondern auch für die Modulation der Wachstumsdynamik von Mausprostataorganoiden.

Um die Epithelintegrität und Polarisation der Modelle zu bewerten, führten wir transepitheliale elektrische Widerstandsmessungen (TEER) im organoidbasierten Modell durch, das ohne oder 10 nM DHT gezüchtet wurde. Die TEER-Werte stiegen in beiden Erkrankungen im Laufe der Zeit, waren jedoch bei Anwesenheit von 10 nM DHT deutlich höher (Abbildung 3A), was auf eine verbesserte Funktion der epithelialen Barriere hinweist. Diese Ergebnisse wurden durch eine Phalloidin-Färbung der Aktinfilamente unterstützt, die typischerweise in einem apikalen Ring an den Zell-Zell-Übergängen in luminalen Prostataepithelzellen organisiert sind. Im 10-nM-DHT-Zustand erschien der Aktinring im Vergleich zur Kontrollbedingung stärker definiert, was mit erhöhter Zellpolarität und epithelialer Organisation übereinstimmt (Abbildung 3B). Zusätzlich zeigte die Immunfärbung für zonula occludens 1 (ZO-1) eine Zunahme der engen Verbindungen im 10-nM-DHT-Zustand (Abbildung 3C), was die verstärkte Integrität der epithelialen Barrieren und die Differenzierung hin zu einem luminalen Phänotyp weiter unterstützt. Orthogonale Projektionen zeigen, dass Organoide, die mit 10 nM DHT kultiviert wurden, eine wohldefinierte epithelliale Polarität aufweisen (ergänzende Abbildung 3A). Basale KRT5⁺-Zellen befinden sich am unteren Rand, und luminale CD24a⁺-Zellen sind entlang der Epithelschicht verteilt und zeigen eine stärkere Färbungsintensität zur Apikalseite hin. Diese Architektur ähnelt derjenigen, die im Prostatagewebe der Maus beobachtet wird (ergänzende Abbildung 3B). Bemerkenswert ist, dass Daten aus dem Human Protein Atlas zeigen, dass diese Marker eine vergleichbare Lokalisierung im menschlichen Prostatagewebe aufweisen, wobei KRT5⁺-Basalzellen eine CD24a⁺-Luminalschicht unterlagern (Ergänzende Abbildung 3C)³³. Im Gegensatz dazu zeigen unter Kontroll- oder 1 nM-DHT-Bedingungen kultivierte Zellen keine klare räumliche Trennung zwischen basalen und luminalen Markern, und die Zellhöhe war deutlich geringer als bei der 10-nM-Bedingung (ergänzende Abbildung 3A). Dies zeigt, dass die 10-nM-DHT-Supplementierung die epithhelale Differenzierung und Polarisation im 2D-Modell fördert, was mit dem nativen Prostataepithel vergleichbar ist. Da das organoidbasierte Modell, das mit 10 nM DHT gezüchtet wird, dem nativen Maus-Prostataepithel stark ähnelt (Abbildung 2D, ergänzende Abbildung 3A,B), dient es als relevante Plattform zur Untersuchung von Wirts-Pathogen-Interaktionen. Um die Anwendbarkeit des Modells zu demonstrieren, verwendeten wir Infektionen mit UPEC, insbesondere den UTI89-Stamm, einen der am häufigsten verwendeten UPEC-Stämme im Bereich des Genitaltrakts, als Beispiel. Wie in Abbildung 4A gezeigt, wurden Bakterien 24 Stunden lang in LB-Brühe gezüchtet (wie in Methode 4 beschrieben) und eine Stunde lang mit den Zellen inkubiert. Extrazelluläre Bakterien wurden anschließend mit Gentamicin getötet, um Invasion und intrazelluläre Replikation zu quantifizieren. Nach der Infektion des organoidbasierten Modells haftete UPEC in hoher Zahl an den Epithelzellen (0 hpi; Abbildung 4B, linkes Panel; Abbildung 4C). Dann und nach der Gentamicin-Behandlung (1 HPI) nahm die Anzahl der UPEC-positiven Zellen aufgrund des tods extrazellulärer Bakterien signifikant ab (Abbildung 4B, mittleres Panel; Abbildung 4C). Bei 24 hpi blieb die Anzahl der infizierten Zellen unverändert (Abbildung 4C), jedoch zeigte konfokalmikroskopische Bildgebung, dass intrazelluläre Bakterien sich weiterhin vermehrten und gemeinschaftsähnliche Strukturen bildeten, ähnlich denen zuvor im Blasenepithel beschrieben (Abbildung 4B, rechter Panel). Infizierte Zellen wurden mittels mCherry-Fluoreszenz unter Verwendung nicht-infizierter (naive) Kontrollgruppen als Referenz identifiziert, nach Ausschluss von Trümmern und Dubletten (ergänzende Abbildung 4).

Abbildung 1: Überblick über den Arbeitsablauf und die morphologische Entwicklung der Prostataorganoide und der organoidbasierten Modelle im Laufe der Zeit. (A) Schematische Darstellung des experimentellen Arbeitsablaufs (Methode 1). (B) Brightfield-Bilder, die die morphologische Entwicklung der Prostataorganoide zeigen, ergänzt mit 1 nM DHT, aufgenommen an den Tagen 0, 1, 3, 5 und 7 (von links nach rechts). Skalenbar: 200 μm. (n = 3). (C) Brightfield-Bilder des organoidbasierten Modells, ergänzt mit 1 nM DHT, aufgenommen an den Tagen 0, 1, 3, 5 und 7 (von links nach rechts). Skalenbar: 200 μm. (n = 3). (D) Repräsentative Immunfluoreszenzmikroskopie-Bilder des organoidbasierten Modells, ergänzt mit 1 nM DHT und gefärbt mit CellMask (rot), an den Tagen 1, 3, 5 und 7 (von links nach rechts). Die Kerne wurden mit Hoechst 33342 (blau) gekonterfärbt. Maßstabsleiste: 50 μm. (n = 3) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: DHT moduliert die Liniendifferenzierung im organoidbasierten Modell. (A) Schematische Darstellung der verschiedenen Bedingungen für die Differenzierung. (B-D) Repräsentative Immunfluoreszenzmikroskopie-Bilder des organoidbasierten Modells, die 7 Tage lang in (B) Abwesenheit (Ctrl) oder Anwesenheit von (C) 1 nM oder (D) 10 nM DHT gezüchtet wurden. Die Bilder wurden an den Tagen 1, 3, 5 und 7 (von links nach rechts) aufgenommen. Die organoidbasierten Modelle wurden auf CD24a (luminaler Zellmarker, grün) und KRT5 (Basalzellmarker, magenta) gefärbt. Die Kerne wurden mit Hoechst 33342 (blau) gekonterfärbt. Skalenbalken: 50 μm. (n = 4). (E,F) Bildquantifizierung von (E) KRT5⁺ und (F) CD24a⁺ Zellen im organoidbasierten Modell ohne DHT (Ctrl), 1nM oder 10nM. Die Daten werden als Prozentsatz der positiven Zellen pro Sichtfeld angezeigt. Statistischer Test: Einweg-ANOVA mit Tukeys Post-hoc-Test. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Das organoidbasierte Modell, differenziert mit 10 nM DHT, zeigt eine höhere Zellpolarisation im Vergleich zur Kontrollgruppe. (A) TEER-Analyse des organoidbasierten Modells, das 7 Tage lang in Abwesenheit (Ctrl; pink) und DHT (10 nM; grün) gezüchtet wurde. Fehlerbalken repräsentieren SD (n = 3). Statistischer Test: Einweg-ANOVA mit Tukeys Post-hoc-Test. (B,C) Repräsentative Immunfluoreszenzmikroskopie-Bilder des organoidbasierten Modells, die 7 Tage lang ohne (Ctrl; oben) oder mit 10 nM DHT (unten) gezüchtet wurden und auf (B) F-Actin (rot) und (C) ZO-1 (rot) gefärbt wurden. Die Kerne wurden mit Hoechst 33342 (blau) gekonterfärbt. Maßstabsleiste: 50 μm. (n = 3) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Analyse der Infektionsdynamik im organoidbasierten Modell. (A) Schematische Darstellung des Infektionsprotokolls (Abschnitt 4). (B) Repräsentative Immunfluoreszenzmikroskopie-Bilder, die das infizierte, organoidbasierte Modell 0, 1 und 24 Stunden nach der Infektion zeigen (HPI; von links nach rechts). UPEC sind in Rot dargestellt. Die Kerne wurden mit Hoechst 33342 (blau) gekonterfärbt. Skalenbar: 50 μm. (n = 3). (C) Durchflusszytometrieanalyse von UPEC-positiven Zellen (mCherry-positiv, infizierte Zellen) bei 0, 1 und 24 hpi. Die Gating-Strategie ist in ergänzender Abbildung 4 dargestellt. Fehlerbalken repräsentieren SEM (n = 3). Statistischer Test: Einweg-ANOVA mit Tukeys Post-hoc-Test. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergänzende Abbildung 1: Morphologische Entwicklung des organoidbasierten Modells im Laufe der Zeit. (A,B) Brightfield-Bilder des organoidbasierten Modells in (A) Abwesenheit (Strg) und (B) Anwesenheit von 10 nM DHT, aufgenommen an den Tagen 0, 1, 3, 5 und 7 (von links nach rechts). Skalenleiste: 200 μm. (n = 3) Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Die DHT-Konzentration beeinflusst das Wachstum des 3D-Prostataorganoids. (A) Brightfield-Bilder des organoidbasierten Modells in Abwesenheit (Strg; oben) und Anwesenheit von 10 nM DHT (unten), abgebildet an den Tagen 0, 1, 3, 5 und 7 (von links nach rechts). Skalenbar: 200 μm. (n = 3). (B) Quantifizierung der 3D-Organoidgröße am Tag 7, gewachsen unter drei verschiedenen Bedingungen: kein DHT (Ctrl; pink), 1 nM DHT (lila) und 10 nM DHT (grün). Statistischer Test: Einweg-ANOVA mit Tukeys Post-hoc-Test (n = 3). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: Charakterisierung der Morphologie des Prostataorganoids und der epithelialen Polarität. (A) Orthogonale Projektionen von konfokalen Z-Stacks, die die Epithelorganisation und die apikal-zu-basale Polarität unter unterschiedlichen DHT-Konzentrationen (Ctrl, 1 nM und 10 nM DHT) veranschaulichen. Basalzellen wurden auf KRT5 (magenta) und luminale Zellen auf CD24a (grün) gefärbt. Skalenbar: 50 μm.(B) Immunfluoreszenzfärbung von OCT-eingebettetem Mausprostatagewebe mit basalen (KRT5, magenta) und luminalen (CD24a, grünen) epithelialen Markern. Die Kerne werden mit DAPI (blau) gegenfärbt. Maßstabsanzeige: 50 μm. Kurz gesagt wurden Mausgewebestücke mit 4 % PFA fixiert, über Nacht mit 30 % Saccharose dehydriert und in OCT eingebettet³². Die Objektträger wurden anschließend für 10 Minuten in PBS rehydriert und nach Abschnitt 3 immunfärbt. (C) Immunhistochemische Analyse der CD24a- und KRT5-Proteinexpression im menschlichen Prostatagewebe (Panel C wurde aus der Human Protein Atlas Database (Version 25.0) gewonnen; Human Protein Atlas proteinatlas.org), Uhlén, M. et al(2015)³³, https://www.proteinatlas.org/ENSG00000186081-KRT5/tissue/prostate). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 4: Durchflusszytometrie-Gating-Strategie zur Identifizierung infizierter Zellen. Die Zellen wurden zunächst anhand der Seitenstreuhöhe (SSC-H) versus der Vorwärtsstreuungshöhe (FSC-H) gegartet, um Trümmer auszuschließen, gefolgt von einer Gatierung auf SSC-H gegenüber Seitenstreufläche (SSC-A), um einzelne Zellen auszuwählen. mCherry-positive (infizierte) Zellen wurden anschließend mittels Counts versus PE-Texas Red-H Fluoreszenz (Histogramm) identifiziert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Eine Reihe von Krankheiten kann die Prostata betreffen, darunter gutartige Prostatahyperplasie, Prostatitis und Prostatakrebs. Diese Krankheiten sind sehr verbreitet und beeinflussen die Lebensqualität der Patienten^{erheblich 2}. Trotz ihres erheblichen Einflusses auf das Gesundheitswesen bleibt unser Verständnis dieser Krankheiten, insbesondere der zugrunde liegenden Mechanismen und der Wirtsreaktionen bei nicht-krebsartigen Erkrankungen, begrenzt. Dies liegt vor allem am Mangel an physiologisch relevanten experimentellen Modellen. Einerseits erfassen unsterbliche Zelllinien nicht die Komplexität oder den Differenzierungsstatus des normalen Prostataepithels. Tiermodelle hingegen – vor allem Nagetiere – werfen ethische Bedenken auf und sind nicht kosteneffizient. Ein alternativer Ansatz ist die Verwendung menschlicher Primärzellen oder von Patienten abgeleiteter Gewebeexplantierungen. Die begrenzte Verfügbarkeit von frischem Prostatagewebe schränkt jedoch ihre breite Anwendung ein. Diese Einschränkungen unterstreichen die Notwendigkeit weiterer in-vitro-Systeme, die physiologisch relevant, einfach zu bedienen und experimentell handhabbar sind. In diesem Zusammenhang hat die Organoid-Technologie adulter Stammzellen die Krankheitsmodellierung grundlegend verändert. Diese 3D-Kulturen sind in der Lage, sich selbst zu organisieren, wodurch die epitheliale Identität und die epitheliale zelluläre Diversität^{erhalten bleiben} 23,34,35,36,37,38. Während ihre 3D-Architektur Anwendungen in der Krebsforschung, Arzneimitteltests und regenerativer Medizin ermöglicht,^stellt ihre geschlossene Struktur mit nach innen gerichteter apikaler Oberfläche praktische Herausforderungen für den experimentellen Zugang, insbesondere als In-vitro-Technik Infektionsmodelle. Apical-out-Organoide beheben diese Einschränkung, indem sie die Epithelpolarität umkehren und die apikale Oberfläche für direkte Infektionsstudien freilegen^27,28. Ihre Wirksamkeit als Infektionsmodell kann jedoch durch Variabilität ihrer Größe, ungleiche Exposition gegenüber Krankheitserregern und Fragilität während einer Langzeitinfektion begrenzt sein.

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Erstellung eines organoidbasierten Modells der Mausprostata, das die Epithelzellenzusammensetzung und das Transkriptionsprofil des nativen Mausepithels repapituliert und gleichzeitig einen einfachen Zugang zur apikalen Oberfläche ermöglicht. Optimiert in unserer vorherigen Arbeit³², ermöglicht dieses Modell eine präzise Kontrolle über wichtige experimentelle Variablen, darunter die Aussaatdichte, die gleichmäßige Exposition gegenüber Reizen, definierte Bakterien-zu-Zell-Verhältnisse (MOI) und hochdurchsatzbildende Bildparameter, die in herkömmlichen 3D-Organoidsystemen oft schwer zu standardisieren sind.

Im Einklang mit dem 3R-Prinzip (Ersetzen, Reduzieren, Verfeinern) für Tierversuche⁴² stammen die Organoide, die als Quelle von Primärzellen für dieses Modell verwendet werden, von wildartigen, naiven Mäusen ab, die für andere Zwecke wie Zucht geopfert wurden. Prostata wird durch Spenden aus nahegelegenen Tiereinrichtungen gewonnen, wodurch die Notwendigkeit reduziert wird, gezielt für dieses Protokoll weitere Tiere zu opfern.

Eine robuste und zuverlässige Differenzierung von Organoiden und organoidbasierten Modellen ist entscheidend, um die zelluläre Zusammensetzung und funktionellen Eigenschaften nativen Gewebes getreu zu replizieren und deren Relevanz als In-vitro-Modelle sicherzustellen. Die Zelldifferenzierung innerhalb von Organoiden wird stark von der spezifischen Zusammensetzung des Kulturmediums beeinflusst, einschließlich der genauen Konzentrationen von Wachstumsfaktoren und pharmakologischen Wirkstoffen (d. h. Arzneimittelinhibitoren). Die Manipulation dieser Faktoren ermöglicht eine direkte Differenzierung in Richtung spezifischer Zelllinien, wie in verschiedenen organoiden Systemen demonstriert. Zum Beispiel fördert die Entfernung von WNT bei Intestinalorganoiden die Enterozytendifferenzierung, die durch Interferon-Gamma weiter verstärkt werden kann (Bericht in³⁸). Die Differenzierung in Kelchzellen kann durch Entfernung von P38-Inhibitoren und Nikotinamid oder durch Notch-Hemmung mittels DAPT/DBZ erreicht werden (überprüft in³⁸). IGF-1 und FGF-2 haben ebenfalls gezeigt, dass sie die langfristige Ausweitung sekretorisch-zellangereicherter Kulturen unterstützen⁴³. Darüber hinaus fördert IL-22 die Paneth-Zelldifferenzierung, und enteroendokrine Zellen entstehen durch Hemmung von Signalwegen wie Notch und BMP³⁸. Ähnlich zeigen Magenorganoide und organoidbasierte Monoschichten eine Differenzierung hin zu Grubenzellen, wenn WNT aus dem Kulturmedium entnommen wird, während das Zufügen von Nikotinamid die Zellen in einen Drüsenphänotyp (Hals- und Hauptzellen^{) führt}.

In der Prostata spielt der Androgenrezeptor (AR) eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Gewebehomöostase 46,47,48,49. Testosteron, das von Leydig-Zellen in den Hoden produziert wird, wird in den Prostataepithelzellen durch die 5α-Reduktase in DHT umgewandelt. DHT aktiviert AR, das dimerisiert, in den Zellkern translokiert und an Androgenantwortelemente bindet, um Gene zu regulieren, die an der Zelldifferenzierung und Homöostase^{beteiligt sind}. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Supplementierung von 1 nM in 3D-Mausprostataorganoiden ausreicht, um die Zelldifferenzierung in luminale^{Zellen 51} zu erreichen. Andere haben auch gezeigt, dass die Supplementierung mit Vitamin D (insbesondere 1,25-Dihydroxyvitamin D) das Wachstum menschlicher Prostataorganoide förderte und die Differenzierung beschleunigte, indem sie die kanonische WNT-Aktivität hemmte und das WNT-Familienmitglied DKK3⁵² unterdrückte. In diesen Studien wurden jedoch nur 3D-Organoide verwendet. Unsere vorherigen Arbeiten³² und andere⁵³ zeigten, dass eine Supplementierung mit 10 nM DHT in 3D-Organoiden nicht ausreicht, um eine vollständige Differenzierung zu erreichen. Im Gegensatz dazu reicht es aus, das hier beschriebene 2D-Modell zu verwenden, also die Zellen in 2D mit 10 nM DHT zu säen, um das Modell in einen Zustand ähnlich dem nativen^{Gewebe 32} zu differenzieren. Um diesen Unterschied zwischen den 3D- und 2D-Modellen zu verstehen, ist weitere Arbeit erforderlich, aber sie könnten durch die unterschiedlichen mechanophysikalischen Hinweise zwischen den Systemen oder durch das Vorhandensein von ECM mit Wachstumsfaktoren im 3D-Modell erklärt werden.

Im adulten Prostatagewebe finden sich drei Haupttypen von Epithelzellen: luminale, basale und neuroendokrine Zellen. Von diesen sind in allen bisher veröffentlichten Organoid-Modellen nur luminale und basale Zellen vorhanden. Das Fehlen der seltenen neuroendokrinen Zellen deutet darauf hin, dass die aktuellen organoiden Protokolle möglicherweise nicht vollständig optimiert sind. Zwischen luminalen und basalen Zellen wurde eine Prostata-Intermediärzellpopulation ebenfalls als Übergangszustand beschrieben, der sowohl luminale (d. h. CD24a) als auch basale (d.h. SCA-1) Marker^18,51 ausdrückt. Diese Subpopulation befindet sich häufig im periurethralen Prostatabereich, weshalb sie häufig als periurethrale luminale^{Zellen 54} bezeichnet werden. Obwohl dies in einigen 3D-Organoidsystemen unter spezifischen Differenzierungs- oder Signalisierungsbedingungen^53,55 berichtet wurde, beobachten wir in unserem System³² keine klare Trennung zwischen luminalen und intermediären Zellen. Eine mögliche Erklärung ist, dass wir während der 3D-Organoid-Erzeugung nicht zwischen verschiedenen Prostataregionen unterscheiden und zur Vermeidung einer Kontamination mit Harnröhrenzellen das direkt angrenzende Gewebe entfernen. Daher sind organoide Kulturen, die aus proximalen oder harnröhrennahen Regionen stammen, wahrscheinlich besser in der Lage, intermediäre Zellen zu erzeugen.

Die Integrität der Barriere gilt als Kennzeichen eines reifen und differenzierten Epithels, das eine schützende Barriere gegen Toxine und Mikroben bietet, die das darunterliegende Gewebe erreichen. Enge Verbindungen (reich an ZO-1-Proteinen⁵⁶) spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der parazellulären Permeabilität und der Erhaltung der Integrität der Epithelbarriere⁵⁷. Während sich die Epithelzellen differenzieren, verstärkt die Reifung dieser interzellulären Verbindungen die^{Barriere 58}. Daher ist die Bewertung der Barrierenintegrität eine wichtige Anzeige für ein in-vitro-Epithelmodell . In diesem Protokoll zeigen wir drei komplementäre Methoden zur Bewertung der Barrierenintegrität: TEER-Messung, ZO-1-Immunfärbung und F-Aktin-Färbung. Obwohl alle drei Methoden die Barrierenintegrität effektiv bewerten, unterscheiden sie sich erheblich in der benötigten Ausrüstung und den benötigten Ressourcen. TEER-Messungen liefern einen quantitativen Wert, der über die Zeit verfolgt werden kann und dynamische Einblicke in die Barrierefunktion bietet; diese Technik erfordert jedoch spezialisierte Hardware und Software, die nicht in jedem Labor verfügbar ist. Im Gegensatz dazu ist die Färbung mit Anti-ZO-1-Antikörpern oder Phalloidin zeitlich und kostenmäßig deutlich besser handhabbar (z. B. kann die Phalloidin-Färbung in etwa 3 Stunden – Abschnitt 3 – durchgeführt werden).

Dieses Protokoll beschreibt, wie man 3D-Prostataorganoide der Maus verwendet, um ein apikal zugängliches 2D-Modell zu erzeugen. Mehrere Übersichtsartikel haben die Vor- und Nachteile von Organoiden und organoidbasierten Systemen bei der Untersuchung von Wirts-Pathogen-Interaktionen^beschrieben 23,36,59. In Infektionsstudien ist es entscheidend, den natürlichen Wechselwirkungsort zwischen Krankheitserregern und dem Wirtsepithel zu berücksichtigen. In der Prostata sind die Luminalzellen typischerweise der erste Kontaktpunkt, weshalb der Zugang zur apikalen Oberfläche unerlässlich ist, um die Infektionsdynamik genau zu modellieren. Bei herkömmlichen 3D-Prostataorganoiden zeigt die apikale Oberfläche zum Organoid-Lumen und ist nicht direkt zugänglich. Dabei kann die Exposition von Krankheitserregern durch Mikroinjektion erreicht werden, die wenig durchsatzfähig und technisch anspruchsvoll ist, oder durch Störung der Organoide, was die Epithelpolarität beeinträchtigt und zu nicht-physiologischen Interaktionsstellen^führt. Im Gegensatz dazu bietet das apikal zugängliche 2D-Modell, das in diesem Protokoll präsentiert wird, direkten Zugang zur luminalen Oberfläche. Dies ermöglicht eine kontrollierte und physiologisch relevante Exposition gegenüber Krankheitserregern, eine präzise Regulation des MOI sowie die Kompatibilität mit Hochdurchsatz-, hochauflösenden oder Live-Zell-Bildgebungsplattformen. Hier zeigen wir die Verwendung dieses Modells als in-vitro-Infektionssystem unter Verwendung des UPEC-Referenzstamms UTI89, einer weit verbreiteten Referenz, die die Hauptbakterienarten repräsentiert, die für die bakterielle Prostatitis⁹ verantwortlich sind. Dieses Modell lässt sich jedoch leicht anpassen, um andere Prostatapathogene wie Enterococcus faecalis oder Pseudomonas aeruginosa zu untersuchen, was es zu einer vielseitigen Plattform für die Infektionsbiologie der Prostata macht.

Die Dissoziation von 3D-Organoiden ist ein entscheidender Schritt für die erfolgreiche Etablierung des organoidbasierten Modells. Das Versäumnis, die 3D-Organoide vollständig zu dissoziieren, was zu großen Fragmenten führt, kann die Zelladhäsion an der Kulturoberfläche beeinträchtigen, während eine längere Exposition gegenüber dem Dissoziationsreagenz länger als 30 Minuten die Lebensfähigkeit der Zellen verringert. Darüber hinaus ist es unerlässlich, ein konstantes Durchgangsintervall von etwa sieben Tagen vor Dissoziation und Aussaat einzuhalten, da der physiologische Zustand der Organoide ihre Fähigkeit zur Anhaftung und Differenzierung stark beeinflusst. Eine weitere entscheidende Variable, die die erfolgreiche Entwicklung des prostataorganoidbasierten Modells beeinflusst, ist die Aussaatdichte. Die hier verwendete Säkonzentration wurde auf die Differenzierung über 7 Tage optimiert. Eine Erhöhung oder Abnahme dieser Konzentration würde wahrscheinlich zu unterschiedlichen Differenzierungszeiten führen. Zudem kann eine unzureichende Zellresuspension vor der Beschichtung zu einer ungleichmäßigen Zellverteilung über Brunnen führen, was zu variablen Zelldichten führt, die wiederum sowohl die Proliferation als auch die Differenzierung beeinflussen. Außerdem können, wie in anderen organoiden Modellen, verschiedene Chargen von ECM oder Wachstumsfaktoren das Wachstum und die Differenzierungsfähigkeit beeinflussen. Daher ist es wichtig zu überprüfen, dass das organoidbasierte Modell nach jeder Änderung der Wachstumsfaktor-Charge oder Chargenzahl einen konsistenten Phänotyp beibehält.

Sobald das organoidbasierte Modell etabliert ist, müssen auch die Infektionsparameter sorgfältig optimiert werden. Unterschiedliche MOIs sind oft erforderlich, um robuste und reproduzierbare Infektionsniveaus zu erreichen, abhängig vom Bakterienstamm und dem gewählten Messwert. Für den UPEC-Stamm UTI89 (hier und in³² verwendet) und für mehrere Prostatitis-Isolate³² reichte ein MOI von 100 aus, um eine zuverlässige Anzahl infizierter Zellen über Adhäsions-, Invasions- und Replikationszeiten zu erhalten. Wenn jedoch die Inkubation von Zellen mit Bakterien über 1 Stunde hinaus verlängert werden muss, sollte ein niedrigeres MOI verwendet werden, um ein extrazelluläres Überwachsen von UPEC im Medium und die anschließende Toxizität der Zellen zu verhindern. In diesem Protokoll wurde die Infektion mit zwei Methoden bewertet: I) Durchflusszytometrie zur Quantifizierung des Anteils infizierter Zellen und II) Konfokalmikroskopie zur Bewertung der bakteriellen Lokalisation. Es können jedoch auch mehrere andere Ansätze verwendet werden, wie zum Beispiel Kolonienbildungseinheitstests zur Messung von bakteriellen³², Immunfärbung zur Erkennung von Wirts- oder Bakterienmarkern³² oder transkriptomische Analysen zur Profilierung von Wirtsantworten.

Während das prostataorganoidbasierte Modell ein physiologisch relevantes System bietet, sollten bei der Anwendung auf die Infektionsforschung mehrere Einschränkungen berücksichtigt werden. Eine wesentliche Einschränkung dieses Modells ist das Fehlen von residenten oder peripheren Immunzellen, was seine Fähigkeit einschränkt, die Wirtsreaktion auf eine Infektion vollständig zu erfassen (z. B. Immunzellrekrutierung oder immunvermittelte Clearance). Weitere wesentliche Komponenten, die im Modell fehlen, sind Gefäße, Stroma und Nerven, die alle die Interaktionen zwischen Wirt und Erreger beeinflussen können. Die Einbeziehung zusätzlicher Zelltypen wie stromale Fibroblasten, Immunzellen und Endothelzellen würde helfen, eine vollständigere Gewebemikroumgebung wiederherzustellen. Fortschrittliche Kokultursysteme oder mikrofluidische Organ-on-a-Chip-Plattformen könnten komplexe zelluläre Interaktionen weiter unterstützen und dynamische Infektionsstudien ermöglichen. Außerdem müssen bei der Verwendung von Organoiden, die aus Tiermodellen abgeleitet sind, artspezifische Unterschiede berücksichtigt werden, insbesondere bei der Untersuchung menschenspezifischer Krankheitserreger. Obwohl unsere vorherigen Arbeiten³² zeigten, dass Ergebnisse des auf Mausprostataorganoiden basierenden Modell im menschlichen Gewebe reproduziert werden können, kann interspezifische Variation in Genregulation, Rezeptorexpression oder hormonellen Reaktionen dennoch die direkte Relevanz des Modells für die menschliche Physiologie einschränken. Die Einbeziehung menschlicher Organoide, wenn möglich, würde den translationalen Wert erhöhen, indem sie die Untersuchung menschlich-spezifischer Erregerinteraktionen und -reaktionen ermöglicht. Während diese Ergänzungen organoidbasierte Modelle als leistungsstarke Werkzeuge zur Untersuchung der Prostatabiologie, der Infektionspathogenese und der therapeutischen Entwicklung stärken könnten, bietet das rein epitheliale Modell, das wir präsentieren, ein vereinfachtes und kompartimentiertes System. Dies ermöglicht eine gezielte Untersuchung epithelspezifischer Wirts-Pathogen-Interaktionen, ohne dass andere Gewebekomponenten eingreifen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
48 Brunnenplatten	Sarstedt	83.3923	Untere Form: flach
5α-Androstan-17β-ol-3-one Dihydrotestosteron	Sigma-Aldrich	A8380	Es wurde als DHT bezeichnet. Stocklösung 10μ M in 100 % Ethanol
8-Bohrloch-PET-Objektträger mit 40 Elektroden pro Brunnen	Angewandte Biophysik	8W10E+	Objektträger für TEER-Messungen verwendet
96 Brunnenplatten	Sarstedt	82.1583	Untere Form: konisch
Vorwärts Dulbecco' s modifizierte Eagle Medium/F12	Thermo Fisher Scientific	12634028	Es wurde als adDMEM/F12+/+ bezeichnet, wenn es mit 10 mmol L&minus ergänzt wurde; 1 HEPES und 1x GlutaMAX
Ampicilin	Roth	K029.2	Konzentrationsbestand 100 mg/mL
Anti-CD24a-Antikörper	Proteintech	10600-1-AP	Primärer Antikörper; Verdünnung 1:100 in 1x PBS 1%BSA
Anti-Cytokeratin 5 Alexa Fluor 647 Antikörper	Abcam	ab193895	Primärer Antikörper; Verdünnung 1:100 in 1x PBS 1%BSA
Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488  Antikörper	Invitrogen	A21441	Sekundärer Antikörper; Verdünnung 1:500 in 1x PBS 1%BSA
Anti-ZO-1 Polyklonaler Antikörper	Proteintech	21773-1-AP	Primärer Antikörper; Verdünnung 1:750 in 1x PBS 1%BSA
B27, 50x	Thermo Fisher Scientific	12587010
Bovines Serumalbumin (BSA) Fraktion V, Neuseeland – Ursprung	Roth	8076.3	Komponente des Blockierungspuffers, die bei 1 % in 1x PBS verwendet wird
Kammer-µ-Slide-8-Bohrungen	Ibidi	80806	Oberflächenmodifikation: ibiTreat
Konisches Rohr (15 mL)	Sigma Aldrich	T1943	Der flache Boden eignet sich besser für kleine Pellets.
Dinatriumethylendiamintetraacetat 2H2O (EDTA)	Roth	8043.2	Hausgemacht: 93,0 g in 400 mL H2O, pH-Wert auf 8,0 anpassen, einfach das Volumen mit H2O bis 500 mL; 0,5 M EDTA; Komponente des Durchflusszytometerpuffers
Dulbeccos ausgewogene Salzlösung (DPBS)	Gibco	14190-144	PBS
ECHO Revolve Mikroskop	ECHO
ECIS  Z-Theta -  Impedanzbasiertes Zellanalysesystem	Angewandte Biophysik	ECIS  Z-Theta	Das System umfasst: 16 und/oder 96 Brunnenstationen; externes Steuermodul; Laptop-PC; ECIS-Steuerungs-, Erfassungs- und Anzeigesoftware; erhöhtes Feldmodul für automatisierte Zellmigration und Elektroporation 
Fetales Rinderserum (FBS) Superior	Sigma Aldrich	S0615	Komponente des Durchflusszytometerpuffers; Komponente des Kulturmediums der 293T-Zelllinie; Bestandteil des Kulturmediums HEK293T Zelllinie
Flash-Phalloidin Rot 594	Biolegende	424203	Verdünnung 1:250 in 1x PBS 1%BSA
Durchflusszytometerpuffer			1x PBS, 10% FBS, 5 mM EDTA
Gentamicin	Sigma Aldrich	G1272
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050-038	L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptid, Bestandteil von adDMEM/F12+/+
Harvard Biochrom Ultrospec 10 Zelldichtemeter	Fisher Scientific	10704417
HCS CellMask Deep Red Fleck	Lebenstechnologien	H32721	Verdünnung 1:1.000 in 1x PBS 1%BSA
HEK293T Zelllinie, transfiziert mit dem Noggin-Fc-Expressionsvektor der Maus	Zelllinie von Prof. Dr. Clevers		Wurde verwendet, um Noggin zu produzieren; Kulturmedium: 500 ml DMEM, hoher Glukosespiegel, GlutaMAX, Pyruvat (Gibco Life Technologies, 31966) + 50 ml FBS; Farin et al. Gastroenterologie 143.6 (2012): 1518-1529
HEPES	Thermo Fisher Scientific	15630056	Komponente von adDMEM/F12+/+
Hoechst 33342	Lebenstechnologien	H3570	Verdünnung 1:5.000 in 1x PBS
Menschlicher epidermaler Wachstumsfaktor (EGF)	Peprotech	AF-100-15	Konzentrationsstock 500 & Mikro; g/mL
Inokulationsschleifen	Sarstedt	86.1567.010
Inokulationsröhrchen	Sarstedt	62.515.006
Leica Stellaris 5 Konfokalmikroskop	Leica
Luria Bertani Brühe (LB Brühe)	Roth	X968.1
Matrigel	Corning	356231	Extrazelluläre Matrix (ECM)
N-Acetylcystein	Sigma-Aldrich	A9165-25G	Konzentrationsstock 500 mM
Noggin CM
NovoCyte Quanteon	Agilent		Durchflusszytometer
Paraformaldehyd (PFA)	Sigma Aldrich	P6148	verwendet mit 4 % in 1x PBS, 4 % Saccharose
Primocin	Invivogen	Ant-pm-1
Q-VETTES semi-mikro	Ratiolab	2712120
RHOKi (Y-27632)	AbMole	M1817	RhoA/ROCK-Inhibitor; Konzentrationsstock 10 mM
R-spodin1 CM
R-Spondin1 exprimiert die 293T-Zelllinie	Sigma Aldrich	SCC111	Zur Herstellung von R-spo1 CM verwendet; Kulturmedium: 500 ml DMEM, hoher Glukosespiegel, GlutaMAX, Pyruvat (Gibco Life Technologies, 31966) + 60 ml FBS
TGFβ i (A-83-01)	Tocris	2939	ALK4/5/7-Inhibitor; Konzentrationsbestand 5 mM
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284	verwendet 0,5 % verdünnt in PBS 1x
TrypLE Express Enzym	Gibco	12605028	Enzymatisches Zell-Dissoziationsmittel zur Verdauung von 3D-Maus-Prostataorganoiden
Uropathogene Escherichia coli Stamm UTI89	WT-Stamm von Prof. Dr. Dobrindt		transformiert mit pFPV-mCherry (Addgene #20956)