Standardisierte Isolierung und Zytokin-Priming von mesenchymalen Stromzellen aus dem Mausknochenmark zur verbesserten Immunmodulation

Zusammenfassung

Hier demonstrieren wir ein Protokoll zur Isolierung von mesenchymalen Stromalzellen aus dem Mausknochenmark sowie eine Zytokin-Priming-Methode, um die immunsuppressive Wirkung der BMSCs auf Immunzellen zu verstärken.

Zusammenfassung

Mesenchymale Stromalzellen (MSCs) besitzen eine starke regenerative und immunmodulatorische Funktion. Diese Eigenschaften machen MSCs zu wirksamen zellulären Arzneimitteln zur Behandlung mehrerer Immunerkrankungen. Das Knochenmark ist die primäre und am häufigsten genutzte Quelle für MSCs. Präklinische mechanistische Studien mit Mausmodellen sind entscheidend, um Kenntnisse über die optimalen Wirkstoffabgabestrategien für BMSCs in humanen klinischen Studien zu gewinnen. Daher ist auch die Standardisierung des Herstellungsprozesses der murinen MSCs entscheidend, um bessere therapeutische Ergebnisse zu erzielen. Ein zentrales Ziel dieses Protokolls ist es, zu zeigen, wie kontrolliertes Interferon-Gamma (IFN-γ) Priming die intrinsischen immunsuppressiven Eigenschaften von BMSCs verstärkt. Wir beschreiben die Erzeugung konditionierter Medien (CM) aus unbehandelten oder IFN-γ-prälizenzierten BMSCs und bewerten deren biologische Aktivität anhand primärer peritonealer Makrophagen. Durch ELISA und durchflusszytometrische Profilierungen beschreibt das Protokoll, wie das von BMSC-abgeleitete Sekretom – insbesondere wenn es mit IFN-γ primiert ist – eine antiinflammatorische Makrophagenpolarisation fördert, die durch erhöhte IL-10-Produktion und M2-assoziierte Oberflächenmarker gekennzeichnet ist. Insgesamt etabliert dieses Protokoll einen einheitlichen Rahmen zur Produktion funktionell konsistenter muriner BMSCs und zur Bewertung ihrer immunmodulatorischen Potenz. Durch die Reduzierung der technischen Variabilität und die Bereitstellung visueller und prozeduraler Klarheit unterstützt es eine verbesserte Reproduzierbarkeit in der präklinischen MSC-Forschung und optimierte MSC-Einsatzstrategien für translationale Studien.

Einleitung

Aus dem Knochenmark abgeleitete mesenchymale stromale Zellen (BMSCs) haben weitreichende Anwendungen sowohl in präklinischen als auch in klinischen Studien. Ihre geringe Immunogenität, Easy-Accessibility und Multilineage-Differenzierungsfähigkeit machen BMSCs zu vielversprechenden Kandidaten für den klinischen Einsatz als zelluläre Arzneimittel ^1,2,3. Ihre immunsuppressiven und regenerativen Eigenschaften wurden in klinischen Studien umfassend genutzt, um entzündliche Erkrankungen wie Graft-versus-Host-Erkrankung (GVHD)⁴, Sepsis⁵ und entzündliche Darmerkrankung (IBD)⁶ zu behandeln. Die stromale Knochenmarknische umfasst eine heterogene stromale Zellpopulation. Dennoch erfüllen alle MSCs die von der International Society for Cellular Therapy (ISCT) definierten Kriterien, darunter: plastische Adhärenz, Oberflächenrezeptorexpression – CD73, CD90 und CD105 beim Menschen sowie CD29, CD44 und CD90 bei Mäusen – ohne die Expression hämatopoietischer oder endothelialer Marker – CD11b, CD14, CD19, CD34, CD45, CD79a, HLA-DR und die Fähigkeit für adipogene Merkmale, chondrogene oder osteogene Differenzierung⁷.

BMSCs bleiben funktionell durch die Freisetzung von parakrinen Faktoren, die zusammen als Sekretom bekannt sind und zu denen Zytokine, Chemokine, Wachstumsfaktoren, extrazelluläre Vesikel und verschiedene andere lösliche und kontaktabhängige Moleküle ^gehören. Das Sekretom der MSCs moduliert die Nische, indem es bidirektional mit Elementen des angeborenen Immunsystems interagiert¹⁰. Faktoren, die während MSCs-Makrophagen-Interaktionen freigesetzt werden, können die Makrophagen entweder in Richtung pro-inflammatorischer oder anti-inflammatorischer Phänotyp^11,12 verschieben. Umgekehrt wird der funktionelle Zustand der MSCs auch von lokalen Immunzellen – insbesondere Makrophagen – durch Rückkopplungsmechanismen^reguliert. Dieses MSC-Makrophagen-Übersprechen ist für die immunsuppressive Funktionalität von MSCs unverzichtbar. Adoptiv übertragene MSCs reduzieren Gewebeentzündungen nur, wenn Makrophagen vorhanden sind, wie in Kolitis-Mausmodellen beobachtet wird. Im Gegensatz dazu reicht die Interaktion von MSCs mit B- oder T-Lymphozyten ohne Makrophagen nicht aus, um deren therapeutische Wirkung zu entfalten¹³.

Die erste klinische Phase-III-Studie mit allogenen BMSCs wurde von Osiris Therapeutics in den Vereinigten Staaten zur Behandlung von steroidresistenter GVHD (NCT00366145)¹ abgeschlossen. Seitdem wurden zahlreiche präklinische und klinische Studien durchgeführt, obwohl der Erfolg klinischer Studien den Erwartungen auf Grundlage der präklinischen Ergebnisse nicht gerecht wurde. Um die Erfolgsrate von MSC-basierten klinischen Studien zu verbessern, ist die Optimierung der Strategien zur Arzneimitteleinsetzung unerlässlich. Das Verständnis des optimalen Verabreichungswegs, der therapeutischen Zelldosis und des physiologischen Zustands der Zellen am Behandlungsort ist entscheidend. Beispielsweise haben Studien in einem in-vivo-Kolitis-Mausmodell gezeigt, dass kryokonservierte MSCs oder intravenöse Verabreichung suboptimale Verabreichungsmethoden sind.

Verschiedene Ansätze, wie die Vorlizenzierung von Zytokinen, genetische Modifikation oder hypoxische Präkonditionierung, wurden umfassend untersucht, um die Persistenz und den therapeutischen Nutzen von MSCs in vivo zu verbessern¹⁵. Im Modell der Maus-Hinterglied-Ischämie verbesserte die Hypoxie-Präkonditionierung (2 %_O2) die Proliferations- und Migrationskapazität von MSCs durch eine erhöhte Expression des Hitzeschockproteins, 78-kD-Glukose-reguliertes Protein (GRP78)¹⁶. Die Vorlizenzierung von IL-1β (Interleukin-1 Beta) erweitert die Fähigkeit von MSCs, Neutrophile, Monozyten, Lymphozyten und Eosinophile einzusetzen. Nach der Verabreichung in vivo werden MSCs aktivierten T- und NK-Zellen ausgesetzt, die von IFNγ abgeleitet wurden, was die Produktion von Indoleamin 2,3-Dioxygenase (IDO) durch MSCs¹⁸ steigert. IDO ist ein wesentlicher Bestandteil des MSCs-Sekretoms, was die Proliferationsrate der T-Zellen senkt. Interessanterweise wird die immunsuppressive Kapazität von MSCs reduziert, wenn sie mit IFNγ-/- von Mäusen abgeleiteten T-Lymphozyten¹⁹ kokultiviert werden. Studien haben ergeben, dass IFN-γ Vorlizenzierung die Rate der T-Zell-vermittelten Apoptose in kryokonservierten MSCs^13,20 reduziert. IFNγ-Priming verbessert das therapeutische Ergebnis von BMSCs¹³. All diese Belege zeigen zusammen die unverzichtbare Rolle von IFNγ bei der Produktion potenterer immunsuppressiver MSCs.

Um die effektivste Verabreichungsmodalität von MSCs zu bestimmen, wurden Tiermodelle häufig wegen ihrer ethischen Zugänglichkeit verwendet. Um die Variabilität der präklinischen Ergebnisse zu verringern, ist es entscheidend, eine optimierte Methode für den Herstellungsprozess der MSCs zu etablieren, die hohe Ausbeute, Zelllebensfähigkeit und Konsistenz über die Zeit sicherstellt²¹. Der Durchgang von MSCs ist eine wichtige Variable, die unterschiedliche therapeutische Ergebnisse hervorrufen kann. Während der In-vitro-Kultivierung kann das Passaging die Charakterisierung und Wirksamkeit von MSCs regulieren, und nach einer bestimmten Anzahl von Durchgängen werden die Zellen seneszent²². Daher ist es in jeder klinischen oder präklinischen Studie entscheidend, bei der Verwendung der MSC-Bestandenzahl konsequent zu sein. Ebenso ist die Konsistenz mit einem spezifischen Protokoll für die Isolierung von MSCs ebenfalls ein entscheidender Faktor für die Reproduzierbarkeit im Ergebnis der MSCs-Nutzung. Unter vielen Ansätzen sind die antikörperbasierte Zellsortierung²³, die Negativselektionsmethode²⁴ und die enzymatische Verdauung²⁵ beliebte Methoden zur Isolierung von MSCs. Die Anwendbarkeit dieser Methoden hängt jedoch von der Quelle ab, da unsachgemäße Verwendung Ertrag, Potenz und die Differenzierungsfähigkeit der Trilineage-Fähigkeit verringert.

Hier stellen wir ein standardisiertes Protokoll zur Isolierung und Charakterisierung von BMSCs vor, wobei wir die bevorzugte Durchgangsnummer, die Kryokonservierungstechnik und die von BMSC-abgeleitete Condition-Mediensammlung betonen. Wir stellen außerdem ein Protokoll für IFN-γ-vermitteltes MSC-Priming bereit und demonstrieren schließlich eine vergleichende Studie, wie peritoneale Makrophagen unterschiedlich auf normale oder IFN-γ vorlizenzierte BMSCs reagieren.

Protokoll

Die vorliegende Studie wurde mit Genehmigung und unter Einhaltung der Richtlinien des Tierethikkomitees des ICMR-National Institute for Research in Reproductive and Child Health (IAEC-Projekt Nr. 09/23) sowie des Institutional Animal Care and Use Committee der University of Wisconsin-Madison durchgeführt. Weibliche C57Bl/6J-Mäuse im Alter von 6-8 Wochen, gezüchtet und unter spezifischen krankheitserregerfreien (SPF) Bedingungen gehalten, wurden für die vorliegende Studie verwendet.

HINWEIS: Wir haben die vom Institutional Biosafety Committee (IBSC) festgelegten Biosicherheitsprotokolle während der Arbeit an den in vivo - oder in-vitro-Studien befolgt. Kurz gesagt, bei Tierversuchen haben wir vorsichtig gehandhabt, um Stress und Verletzungsrisiko zu verringern. Wir verwendeten geeignete PSA, wie Schutzbrillen, Handschuhe, einen Laborkittel, eine Maske und eine Einweg-Bouffant-Mütze. Für biohazard chemische Reagenzien wie DMSO haben wir einen Biosicherheitsschrank verwendet, um die Chemikalien zu handhaben. Wir haben den speziellen Abfallbehälter verwendet, um biogefährliche Reagenzien oder scharfe Gegenstände zu entsorgen.

1. Isolierung der mesenchymalen stromalen Zellen des Mausknochenmarks

HINWEIS: Nach der Sammlung der Hintergliedmaßen sollten die restlichen Schritte in einer laminaren Gewebekulturhaube durchgeführt werden, sowie in sterilen aseptischen Techniken²⁶.

1. Die Maus wird durch eine zervikale Verrenkung eingeschläfert, gefolgt von einer gründlichen Spülung mit 70 % Ethanol. Mit einer Augenzange, die Bauchhaut zwischen den beiden Hüftgelenken der Maus vorsichtig zupfen und die Haut vorsichtig mit einer Schere zu schneiden.
2. Trennen Sie die Haut, indem Sie sanft zum Fuß ziehen. Schneide an den Hüftgelenken und am Knöchel ab, um beide Hintergliedmaßen zu befreien.
3. Schnell werden die Hintergliedmaßen in eiskaltes DMEM übertragen, ergänzt mit 1x Penicillin/Streptomycin und 2% FBS, um Gewebeschäden bis zum weiteren Dissektionsprozess zu vermeiden.
4. Nehmen Sie jedes Hintergliedmaß in einer Petrischale mit dem eiskalten Medium. Lösen Sie vorsichtig den Muskel und das Bindegewebe vom Oberschenkelknochen und Schienbein, indem Sie die Diaphyse des Knochens vorsichtig abkratzen. Übertragen Sie den gereinigten Knochen in eine neue Petrischale mit dem eiskalten Medium.
5. Lösen Sie den Oberschenkelknochen und das Schienbein, gefolgt von einem Schnitt an den Enden des Tibia und Oberschenkelknochens direkt unterhalb des Ende der Markhöhle. Schützen Sie die Knochenmarkhöhle während der Oberschenkel- und Schienbein-Dissektion maximal.
6. Nimm eine 1-mL sterile Spritze mit einer 21-G-Nadel und ziehe das Medium von der Petriplatte ab. Mit einer sterilen Pinzette halten Sie den entfernten Oberschenkelknochen fest und führen Sie die Nadel vorsichtig in die Knochenmarkhöhle ein. Spülen Sie die Knochenmarkhöhle, um das Knochenmark zu entfernen. Wiederhole diesen Schritt, bis der Knochen weiß ist. Spülen Sie das Tibia auf die gleiche Weise.
7. Pipette vorsichtig hinein und aus, um die Zellklumpen in der Petrischale zu verteilen. Mit einem 70-mm-Filtergitter filtern Sie die Zellsuspension, um alle Knochenpartikel zu entfernen. Sammeln Sie das Filtrat auf und zentrifugieren Sie es bei 230 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
8. Entsorgen Sie das Supernatant und suspendieren Sie das Pellet mit vollständigem Medium (DMEM, 10 % FBS, 5 % L-Glutamin, Penicillin und Streptomycin). Messen Sie die Ausbeute und Lebensfähigkeit von Zellen durch Trypan Blue Exclusion und Zählung auf einem Hämozytometer.
9. Säen Sie die Zellen in einem 75 cm² großen, mit Gewebekulturbehandlung behandelten Kolben und einer Zelldichte von 5000 Zellen/^cm2 in vollständigem DMEM-Medium¹³. Entfernen Sie nicht adhärente hämatopoätische Zellen nach 48 Stunden Kultur durch Wechsel des Mediens. Ersetze das Medium alle 3-4 Tage durch frisches.
   HINWEIS: Verwenden Sie eine Zellkulturflasche anstelle einer Schale, um eine Kontamination zu vermeiden. Nehmen Sie die Flasche nicht häufig aus dem Inkubator, um die Zellen zu kontrollieren, da dies das Zellwachstum stört.
10. Um die adhärenten Zellen abzulösen, waschen Sie die Zellen einmalig mit PBS, fügen Sie 0,25 % Trypsin-EDTA hinzu und lassen Sie die Zellen 5 Minuten in Trypsin. Das hilft, die Zellen vom Brunnen zu lösen.
11. Volles Medium hinzufügen, neu suspendieren und bei 230 x g für 5 Minuten bei Zimmertemperatur zentrifugieren. Entsorge das Supernatant. Fügen Sie dem Pellet komplettes DMEM-Medium hinzu, suspendieren Sie es erneut und säen Sie die Zellen mit einer Dichte von 5.000 Zellen/cm^{² aus}.
12. Durchqueren Sie die Zellen wöchentlich, indem Sie das Medium alle 3-4 Tage wechseln. Nach dem dritten Durchgang wird die MSC-Kultur mittels Durchflusszytometrie analysiert, wie in Schritt 6 beschrieben. Verwenden Sie Passage 3-5 Zellen für jedes Experiment.
    HINWEIS: Um die Zellen für zukünftige experimentelle Anwendungen zu kryokonservieren, zentrifugieren Sie die Zellen mit dem gewünschten Volumen, suspendieren Sie sie in Gefriermedien neu, lagern 1 x 10 ×⁶ Zellen in 1 ml Gefriermedium in jedem Kryovial bei -80 °C über Nacht und anschließend werden die Zellen für den Langzeitgebrauch in Stickstoff umgewandelt.
    Zusammensetzung der Gefriermedien: 70 % DMEM, 20 % FBS, 10 % DMSO.

2. Herstellung eines konditionierten Mediums aus kultivierten MSCs

1. Säen Sie die Zellen mit einer Dichte von 5000 Zellen/^cm² in einer 6-Well-Platte. Kultur-MSCs bis zu 80 % confluent.
2. Nehmen Sie das konditionierte Material von der Zellkulturplatte ab und zentrifugieren Sie bei 230 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur, filtern Sie und verwenden Sie es zur Behandlung.

3. Herstellung eines IFNγ grundierten, konditionierten Mediums aus kultivierten MSCs

1. Säe die Zellen in 6 Brunnenplatten mit einer Dichte von 5000 Zellen/cm^{² aus}. Behandeln Sie die Zellen mit 25 ng/mL IFNγ für 48 Stunden. Führen Sie eine dosisabhängige Studie durch, um die optimale Wirkung von IFNγ auf MSCs zu erhalten. Für dieses Experiment wählen Sie einen Bereich von IFNγ-Konzentrationen aus, 5, 10, 25, 50, 100 ng/mL, um MSCs vorab zu lizenzieren. Die Konzentrationen von 5 und 10 ng/mL waren bei der Makrophagepolarisation signifikant weniger wirksam, und 25 ng/mL wurden als optimale Konzentration identifiziert (ergänzende Abbildung 1).
2. Nach dem Dekantieren des mit IFN-γ enthaltenden Medien wird der Brunnen zweimal mit PBS gewaschen, um die vollständige Entfernung von IFN-γ sicherzustellen. Eventuelle verbleibende IFN-γ können das Studienergebnis beeinträchtigen.
3. Inkubieren Sie die Zellen weitere 24 Stunden in normalem DMEM-Medium bei 37 °C. Nach 24 Stunden sammeln Sie das konditionierte Material nach Schritt 2.

4. Isolierung und Kultur von peritonealhöhlenabgeleiteten Makrophagen

1. Injizieren Sie 5 ml eiskaltes PBS (mit 3 % FBS) in die Bauchhöhle der Mäuse, gefolgt von einer sanften Massage des Bauches.
2. Die PBS-Lösung mit einer sterilen Spritze wiederherstellen. Sammeln Sie sie in einem 10-mL-Rohr. Zentrifugiere die Lösung bei 300 x g für 5 Minuten.
3. Entferne das Überwasser. Lösen Sie das Pellet in vollständigen RPMI-Medien auf (RPMI, 10 % FBS, 1x Penicillin und Streptomycin). Plattiere die Zellen mit 5000 Zellen/cm^².
4. Entfernen Sie nicht anhaftende Zellen nach 24 Stunden und kultivieren Sie bis zur Zusammenfluss. Verwenden Sie Zellen für weitere experimentelle Verfahren bei Bedarf.

5. Enzymgekoppelter Immunsorbent-Test

1. Um IL-10 aus BMSCs-CM-behandelten Makrophagen zu erkennen, folgen Sie den folgenden Schritten.
   1. Behandeln Sie die Makrophagen 24 Stunden lang mit BMSCs-CM und sammeln Sie das Supernatant am folgenden Tag.
   2. Messen Sie die Menge an IL-10 mit dem IL-10 ELISA-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
2. Um CCL2 von BMSCs oder IFNγ-behandelten BMSCs zu erkennen, verwenden Sie das CCL2 ELISA-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.

6. Flusszytometrieanalyse für MSCs und Makrophagenphänotypisierung

1. Säe die Zellen in einer 6-Well-Platte aus und mache sie zusammenfließend. Waschen Sie einmal mit PBS (1 ml), gefolgt von einer Trypsinisierung. Gib Trypsin mit 0,25 % hinzu und inkubiere 5 Minuten in Trypsin, um die Zellen vollständig von der Platte zu heben.
2. Füge Medien hinzu, um die Trypsin-Aktivität zu deaktivieren. Sammeln Sie die Zellen in einem 10-mL Polystyrolrohr. Zentrifugiere bei 300 x g für 5 Minuten bei 4 °C für Makrophagen und 230 x g für 5 Minuten bei 4 °C für BMSCs.
3. Entferne das Supernatant und suspendiere die Zellen in 2 ml Farbstoffpuffer (eiskaltes PBS mit 2 % FBS und 0,05 % Azid). Drehen Sie bei 230 x g für 7 Minuten. Dekantieren und das Pellet zerstören. Gib 1 ml Ghost Red 780 Viability-Farbstoff und 50 ml FACS-Puffer, suspendiere es wieder und lege es in das Durchflussrohr. 30 Minuten im Dunkeln beizen.
4. Nach 30 Minuten wasche du die Zellen mit 1 ml Farbstoffpuffer. Dekantieren und das Pellet zerstören. Fügen Sie das gewünschte Volumen an Antikörper- oder Isotypkontrolle hinzu. Inkubiere weitere 30 Minuten im Dunkeln. Waschen Sie die Zellen mit Fleckpuffer, dekantieren Sie sie und lassen Sie sie in 400 ml Fleckpuffer wieder aufhängen. Das Probenröhrchen ist bereit zur Entnahme.
5. Zur Vorbereitung der Kontrolle lebender toter Färbungen wird nach Trypsinisierung und Zentrifugation das Pellet in 2 ml Fleckenpuffer aufgelöst. Entnehmen Sie 1 ml in einem anderen Mikrozentrifugenrohr und fügen Sie dazu 10 ml DMSO, um die Zellen abzutöten. Vortex und 10 Minuten inkubieren. Mische dies nun mit den anderen 1 ml der zellhaltigen Lösung in einem Durchflussrohr.
6. Gib 1 ml Staining Buffer hinzu und schleudere 7 Minuten bei 230 x g . Dekantieren und das Pellet zerstören. Gib 1 ml Ghost Red 780 Viability-Farbstoff und 50 ml FACS-Puffer, suspendiere es wieder und lege es in das Durchflussrohr. 30 Minuten im Dunkeln beizen. Nach 30 Minuten wasche du die Zellen mit 1 ml Farbstoffpuffer. Dekantieren und das Pellet zerstören. Wieder in 400 mL Beizpuffer aufhängen. Die lebend tot-gefärbte Probe ist bereit zur Aufnahme.
   HINWEIS: Für die Färbung von Mausmakrophagen sollte vor dem Standardfärbungsprotokoll ein zusätzlicher Färbeschritt hinzugefügt werden. Um Ungenauigkeiten in den Flussdaten zu vermeiden, ist die Blockierung des FC-Rezeptors ein entscheidender Schritt, der verhindert, dass sich nicht spezifische Antikörper an Fc-Rezeptoren auf Zellen binden. Um den Fc-Rezeptor zu blockieren, geben Sie 1 ml Fc-Blockierungsreagenz (gereinigter Anti-Maus-Antikörper CD16/CD32) zur Zellsuspension und inkubieren Sie 15 Minuten bei Raumtemperatur. Führen Sie die verbleibenden Antikörperfärbungsschritte durch, ohne das Fc-Blockierungsreagenz abzuwaschen.
7. Um die Flussdaten zu analysieren, sollten zunächst einzelne Zellen anhand der vorwärts gestreuten und seitlichen Streuparameter ausgewählt werden. Dieser Schritt ist entscheidend, um Ablagerungen und Zellaggregate zu entfernen. Dann werden die einzelnen Zellen basierend auf der Färbung von lebenden Toten abgesperrt. Führen Sie weitere Analysen basierend auf der lebenden Zellpopulation durch (ergänzende Abbildung 2).

Ergebnisse

Der gesamte experimentelle Schaltplan ist in Abbildung 1 beschrieben. Das Mausknochenmark wurde sowohl vom Oberschenkelknochen als auch vom Schienbein entnommen, mit Samen, Passage und Flowzytometrie charakterisiert (Abbildung 1A). BMSCs-Condition-Medien (BMSCs-CM) mit oder ohne IFNγ-Vorlizenzierung wurden gesammelt, und einige Phiolen mit BMSCs-CM wurden bei -80 °C für zukünftige experimentelle Bedürfnisse gelagert (Abbildung 1B).

Knochenmark-abgeleitete Zellen wurden mit dem Hämozytometer (Abbildung 2A) gezählt und mit einer Dichte von 5000 Zellen/cm^² in vollständigen DMEM-Medien ausgesät. Nach 48 Stunden wurde das erste Medium gewechselt, dann alle 3/4 Tage bis zur vollständigen Konfluenz. Wir durchführten die Zellen, als sie 80 % Konfluenz erreichten (Abbildung 2B). In Abschnitt 4 charakterisierten wir Zellen anhand der MSC-spezifischen Markerexpression. Die Zellen waren CD44, CD29 und CD90 positiv und negativ für CD45, CD11b und CD34 (Abbildung 2C). BMSCs können sich in adipogene, osteogene und chondrogene Linien unterscheiden: 14,27,28,29. Dies hält die Richtlinien für die Identität der International Society for Cellular Therapy aufrecht.

Um die immunsuppressive Wirkung von MSCs-CM zu verstehen, behandelten wir peritonealhöhlenabgeleitete Makrophagen (PMφ) und behandelten sie mit BMSCs-CM (Abbildung 3A). Wir führten eine Flowzytometrieanalyse von BMSCs – CM-behandelten Makrophagen durch (Abbildung 3B, C). Peritonealhöhlen-residente, kulturangepasste Makrophagen wurden mit M1- und M2-spezifischen Oberflächenmarkern gefärbt. Wir verhinderten die unspezifische Antikörperbindung, indem wir Makrophagen mit gereinigtem Anti-Maus-CD32/CD16 (Mouse Fc Block) inkubierten, bevor die Färbungsantikörper hinzugefügt wurden, bevor die zellulären Marker tatsächlich gefärbt wurden. Die Expression der M1-spezifischen Marker CD86 und iNOS sowie der M2-spezifischen Marker CD206 und CD163 wurde untersucht. Die Zellen wurden zunächst auf Basis des hämatopoietischen Markers CD45.2 (für C57BL6) gegartet. IL-10 ist das charakteristische Zytokin des M2-Phänotyps. IL-10, freigesetzt von MSCs-CM-behandelten Makrophagen, wurde in einer ELISA-Studie gemessen (Abbildung 3D). Da LPS/IFNg die M1-Polarisation³⁰ induziert, diente diese Behandlung als negative Kontrolle.

CCL2 ist eines der charakteristischen Zytokine, die im Sekretom von MSCs identifiziert wurden und die Makrophagenpolarisation¹³ auslösen. CCL2, freigesetzt von MSCs, wurde von ELISA erkannt (Abbildung 3E). Um die Rolle von CCL2 bei der Makrophagenpolarisation zu bestätigen, behandelten wir Makrophagen mit einem CCR2-Inhibitor und anschließend mit einer MSC-CM-Behandlung (Abbildung 3F), und die Makrophagenpolarisation wurde erneut durch die IL-10 ELISA-Studie nachgewiesen (Abbildung 3F).

Unsere Ergebnisse zeigen eindeutig, dass das Sekretom der MSCs eine entzündungshemmende Makrophagepolarisation induzieren kann, wie eine erhöhte IL-10-Produktion in darmabgeleiteten Makrophagen nach Behandlung mit konditionierten Medien zeigt (Abbildung 3).

Abbildung 1: Studienflussdiagramm. (A) C57BL/6 Mäuse wurden eingeschläfert. Das Knochenmark wurde sowohl aus dem Oberschenkelknochen als auch aus dem Schienbein ausgespült, eine Woche lang zentrifugiert und kultiviert, wobei das Medium alle drei Tage gewechselt wurde. MSCs wurden durchgeführt und bei Passage 4 durch Durchflusszytometrie und Adipogenese charakterisiert. (B) Die MSCs von Passage 4 wurden in 6-Well-Platten ausgesät, in einem Satz mit IFNγ bei einer Konzentration von 25 ng/mL, und in einem anderen Set unbehandelt. Nach 48 Stunden ersetzen Sie durch normale, frische, vollständige DMEM-Medien. Nach 24 Stunden sammeln Sie das Medium von der Platte, Zentrifuge und dem Filter. Lagere das Condition-Medium bei -80 °C für die spätere Nutzung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Phänotypische Charakterisierung. (A) Knochenmark-abgeleitete Zellen wurden vor der Aussaat mit einem Hämozytometer gezählt. (B) Die Zellen durften vor jedem Durchgang bis zu 80 % Zusammenfluss wachsen. (C) Passage-4-Zellen wurden durch eine Durchflusszytometrieanalyse mit mausspezifischen MSC-spezifischen Markern charakterisiert. Die Skala repräsentiert 100 mM. Abbildung 2C wurde von¹⁴ abgewandelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: BM-MSC-Sekretom-Analyse. (A) Schaltplan der Experimente. (B) Repräsentative Plot für die zytometrische Analyse von MSC-CM-behandeltem PMφ. Peritoneal-abgeleitete Zellen wurden auf Basis der hämatopoietischen Marker der CD45.2-positiven Population gegatiert. Die ausgewählte Population wurde weiter durch M1-spezifische Marker CD86 oder iNOS, M2-spezifische Marker CD206 oder CD163 sowie CD11b-Doppelfärbung in jedem Fall gefärbt. (C) Der Prozentsatz der M1- oder M2-Zellpopulation wurde quantifiziert. Eine mit LPS/IFNγ behandelte Zellpopulation diente als Negativkontrolle. (D) ELISA wurde durchgeführt, um IL-10 zu quantifizieren, das von MSC-CM-treatedPMφ freigesetzt wurde. ELISA wurde durchgeführt, um (E) CCL2 von MSC-CM und (F) IL-10 von PMφ freigegeben zu quantifizieren. Wie in der Abbildung dargestellt, wurde eine Reihe von Experimenten in Anwesenheit eines CCR2-Antagonisten durchgeführt. Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± SEM dar. Daten, die 3 unabhängige Experimente mit 3 MSC-Stichproben pro Gruppe repräsentieren. Der t-Test der Schüler wurde verwendet, um statistische Analysen aller Experimente durchzuführen. ∗p < 0,05, ∗∗p < 0,01, ∗∗∗p < 0,001, ∗∗∗∗p < 0,0001. Abbildung 3B-F wurde von¹³ modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergänzende Abbildung 1: BMSCs wurden mit 0, 5, 10, 25, 50, 100 ng/mL IFNg vorlizenziert. Makrophagen wurden mit IFNγ vorlizenzierten MSCs-CM behandelt. ELISA wurde durchgeführt, um IL-10 zu quantifizieren, das durch MSC-CM-behandeltes PMφ freigesetzt wurde. Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± SEM dar. Daten, die 3 unabhängige Experimente mit 3 MSC-Stichproben pro Gruppe repräsentieren. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: (A-C) Einzelzellen wurden basierend auf den vorwärts gestreuten und seitlichen Streuparametern ausgewählt. (D) Einzelzellen wurden aufgrund von lebenden Toten-Färbungen abgesperrt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Die Isolierung mesenchymaler stromaler Zellen aus dem Mausknochenmark ist eine entscheidende Technik, um die intrinsischen immunsuppressiven und regenerativen Eigenschaften von MSCs in in vivo Tiermodellen zu verstehen. Obwohl die Methode unkompliziert und leicht zu verfolgen scheint, müssen mehrere Schritte präzise ausgeführt werden, um bakterielle Kontaminationen zu verhindern und eine optimale zelluläre Ausbeute zu gewährleisten. Jeder Schritt des Eingriffs sollte aseptisch in einer ultrasauberen Umgebung durchgeführt werden.

Um eine geringe Zellausbeute zu vermeiden, wählen Sie Mäuse in der Altersgruppe von 6 bis 8 Wochen aus. Beim Schneiden der Enden des Oberschenkelknochens und des Schienbeins muss das Knochenmark so gut wie möglich geschützt werden, und der Spülvorgang sollte fest, aber sanft erfolgen, um eine vollständige Markextraktion zu gewährleisten. Die isolierten Zellen sollten unter einer angemessenen CO₂-Konzentration und unter befeuchteten Bedingungen inkubiert werden. Während des Medienwechsels ist es unerlässlich, die Zellen vorsichtig mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) zu waschen, bevor das Medium wieder eingetauscht wird, um kontaminierende hämatopoietische Zellen zu beseitigen. Um eine Kontamination der hämatopoietischen Zellen zu vermeiden, sollte die Trypsinisierung zum Zeitpunkt der Wiederpassage nicht mehr als 5 Minuten dauern. Im frühen Durchgang sollte der Medienwechsel nicht zu schnell erfolgen, da häufiger Medienwechsel zu bakterieller Kontamination führen kann.

An jedem Durchgang ist es notwendig, die Zellen in mehreren Chargen zu kryokonservieren, um Konsistenz und Verfügbarkeit zu gewährleisten. Für IFN-γ-Priming sollte ein dosisabhängiges Experiment durchgeführt werden, um die effektivsten Vorlizenzbedingungen für das MSC-konditionierte Medium zu bestimmen. In unseren Experimenten testeten wir einen Bereich von IFNγ-Konzentrationen, also 5, 10, 25, 50, 100 ng/mL, um MSCs vorab zu lizenzieren. Dann wurde 25 ng/mL als optimale Konzentration identifiziert.

Um die Datenintegrität zu wahren, sollten Zellen einer bestimmten Durchgangsnummer konsequent für alle experimentellen Tests verwendet werden. Für die durchflusszytometrische Charakterisierung von MSCs sollten Zellen aus Passage 3 oder höher verwendet werden, um eine zuverlässige Erkennung der Oberflächenrezeptorexpression sicherzustellen. Die Diskriminierung von lebenden und toten Zellen während der Durchflusszytometrie-Färbung ist unerlässlich, da sie die Wahrscheinlichkeit von falsch-negativen Ergebnissen verringert.

Die Ergebnisse stellen einen Schlüsselmechanismus dar, durch den exogen abgegebene BMSCs die Darmentzündung während der Kolitis abschwächen. IFN-γ Grundierung verstärkt die Wirkung von MSC-konditionierten Medien auf die Makrophagenpolarisation. CCL2, das von BMSCs freigesetzt wird, ist ein kritisches Chemokin, das auf Makrophagen wirkt, um die M2-Polarisation zu induzieren. Unsere bisherigen Ergebnisse zeigten, dass CCL2- und CXCL12-Chemokine gemeinsam auf Makrophagen wirken, um ihre Polarisation zu fördern. Dieses Ereignis ist entscheidend, um entzündungshemmende Signale durch die anschließende Modulation der T-Zell- und B-Zell-Phänotypen¹³ zu propagieren.

In unserer Studie folgten wir speziell einem einfachen Protokoll zur Isolierung von BMSCs, das auf der plastischen Adhärent-Eigenschaft von MSCs basiert. Flowzytometrie-Sortierung oder immunmagnetische Sortierung kann verwendet werden, um BMSCs anhand MSC-spezifischer Oberflächenmarker zu isolieren. Bei beiden Methoden besteht jedoch die Gefahr, dass während der Probenvorbereitung viele Zellen verloren gehen. Da das Maus-Knochenmark nur sehr wenige MSCs enthält (geschätzt auf etwa 0,001 % bis 0,08 % der Knochenmarkzellen), bevorzugten wir die standardmäßige Methode der plastischen Adherent-Eigenschaften-basierten Isolation. Diese Methode hat jedoch einige Nachteile. Das größte Risiko ist eine hämatopoietische Zellkontamination, die die therapeutische Kapazität von MSCs verringern kann. Daher ist die Identifizierung einer bestimmten Durchgangsnummer entscheidend, wenn eine bedeutende Zellpopulation MSC-spezifische Oberflächenrezeptoren exprimiert.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Zellkulturhaube mit vertikalem laminarem Fluss, ausgestattet mit UV-Licht;
Sterile chirurgische Schere
25/75-cm2 Flask
5/10-mL-Spritzen mit 27G-Nadeln
6-Brunnen-Kulturgerichte
Accutase	Corning	#AT104
Anit-Mouse F4/80 APC	Biolegende	#123116
Anti-Maus CD 11b PE	BD PharMingen	#557397
Anti-Maus CD 45.2 APC	BD PharMingen	#558702
Anti-Maus CD163 Percp eFluor710	eBioscience	#46-1631-80
Anti-Maus CD206 PE	Biolegende	#141706
Anti-Maus CD86 FITC	BD PharMingen	#553691
Anti-Maus iNOS PE-Cy7	eBioscience	#25-5920-80
CCL2 ELISA-Kit	Invitrogen	#554722
CCR2-Antagonist (RS 102895)	Sigma	#R1903
Zentrifuge
DPBS	Corning	#21-031-CV
Dulbeccos modifiziertes Adlermedium (DMEM)	Corning	# 10-013-CV
Fetales Rinderserum	Sigma	#F8067
Filternetz (70 mm)
Ghost Red 780 Viability-Farbstoff	Tonbo-Biowissenschaften	#13-0865-T100
IL-10 ELISA-Kit	Invitrogen	#88-7105-88
L-Glutamin	Corning	#25-005-CI
Mikroskop mit Phasenkontrastgerät
Murine IFNγ	R& D-Systeme	#485-MI-100
Penicillin-Streptomycin	Corning	#30-002-CI
Ratten-Maus-CD16/CD32	BD PharMingen	#553142
RPMImedium	Corning	#10-040-CV
Sterile chirurgische Pinzette (gerade und gebogen)
Temperatur- und Gaszusammensetzungskontroll-Inkubator
Trypsin	Corning	#25052-CL
Wasserbad mit Temperaturregelung