Methodenartikel

Eine computergestützte Pipeline für die Quantifizierung intergener/intragener Enhancer-RNA in embryonalen Stammzellen der Maus

DOI:

10.3791/69400

⸱

28. Oktober 2025

 ,  , 
1Department of Convergent Bioscience and Informatics, and Graduate School of Biological Sciences, Chungnam National University (CNU)

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll bietet eine optimierte rechnerische Pipeline zur Quantifizierung von naszierenden Enhancer-Transkripten. Durch die Integration von Chromatinzugänglichkeit, Chromatinmerkmal und Transkriptionsdaten ermöglicht es einen genauen Nachweis und eine strangspezifische Analyse der Enhanceraktivität in komplexen intragenen Regionen, während es für Forscher ohne umfangreiche bioinformatische Ausbildung zugänglich bleibt.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zentrale cis-regulatorische Elemente, die als Enhancer bekannt sind, spielen eine zentrale Rolle bei der präzisen transkriptionellen Regulation von Zielgenen, die verschiedene zelluläre Funktionen und Entwicklungsprozesse steuern. Diese Enhancer werden oft in beide Richtungen transkribiert, wodurch lange nicht-kodierende Transkripte entstehen, die als Enhancer-RNAs (eRNAs) bezeichnet werden. Die Expression von eRNAs ist eng mit aktiven Chromatinmerkmalen wie H3K27ac und der Rekrutierung von Co-Aktivatoren verbunden und trägt funktionell zur transkriptionellen Aktivierung von Zielgenen bei. Dennoch bleibt der Nachweis und die Quantifizierung von eRNAs eine Herausforderung, insbesondere wenn sie sich mit der Wirt-Gen-Transkription überlappen. Um dies zu adressieren, stellen wir einen standardisierten, benutzerfreundlichen computergestützten Workflow zur Analyse der Enhancer-Transkription aus naszierenden RNA-Sequenzierungsdaten vor. Das Protokoll führt den Benutzer durch die Datenvorverarbeitung, das Read-Mapping und die Qualitätskontrolle, gefolgt von der strangspezifischen Quantifizierung der Enhancer-assoziierten Transkription mit speziellen Verfahren für intragene Enhancer, bei denen die Signalzuordnung komplex ist. Visualisierungsmodule ermöglichen eine klare Inspektion der Enhancer-Aktivität in genomischen Kontexten, und integrierte Optionen unterstützen die Analyse von intergenen und intragenen Enhancern. Dieser Workflow wurde für Forscher mit begrenzter bioinformatischer Expertise entwickelt und bietet einen praktischen Rahmen für konsistente, reproduzierbare und skalierbare Studien der Enhancer-Transkription und ermöglicht so eine breitere Anwendung der Enhancer-Biologie in verschiedenen Systemen.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Enhancer sind cis-regulatorische DNA-Elemente, die die Transkription von Zielgenen steuern, indem sie das Chromatin-Looping organisieren und die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren 1,2,3. Ihre gewebespezifische Aktivität ermöglicht eine präzise Regulation während der Entwicklung und der Bindung an die Abstammungslinie 4,5,6,7,8. Aktive Verstärker weisen charakteristische Chromatinmerkmale wie H3K4me1 (Histon-H3-Lysin-4-Monomethylierung) und H3K27ac (Histon-H3-Lysin-27-Acetylierung) auf und sind normalerweise in DNase-I-überempfindlichen Regionen zu finden, die das offene Chromatin 9,10,11,12 markieren. Diese Merkmale ermöglichen es Transkriptionsfaktoren und RNA-Polymerase II, auf die DNA zuzugreifen und die naszierende Transkription an den Enhancer-Loci 13,14,15,16 zu initiieren.

Dieser sequentielle biologische Prozess erzeugt von Enhancern abgeleitete Transkripte, sogenannte eRNAs, bei denen es sich um bidirektionale, nichtkodierende und typischerweise nicht-polyadenylierte RNAs handelt 13,14,15,16. eRNAs dienen als Marker für die Enhancer-Aktivität und fungieren als eigenständige Effektoren 16,17,18,19,20,21,22,23,24. Sie fördern die produktive Elongation, indem sie den negativen Elongationsfaktor (NELF) aus der pausierten RNA-Polymerase IIfreisetzen 16,19 und helfen, Enhancer-Promotor-Schleifen zu stabilisieren 17,18,20. Sie unterstützen auch die Bildung von transkriptionellen Kondensaten, möglicherweise über die Modifikation von m6A (N 6-Methyladenosin) 21,22,23.

Dennoch bleibt die Funktion der intragenen Enhancer-Transkription, die von regulatorischen Elementen innerhalb der Genkörper initiiert wird, umstritten. Einige Studien berichten, dass eRNAs aus intagenen Enhancern die Genexpression des Wirts erhöhen25, möglicherweise durch Förderung der NELF-Freisetzung und der stimulusabhängigen produktiven Elongation26,27. Im Gegensatz dazu deuten andere Arbeiten darauf hin, dass diese Transkription Wirtsgene durch RNA-Polymerase II-Kollisionen oder transkriptionelle Interferenz behindern kann, was zu einer Abschwächung oder vorzeitigen Beendigung führt28,29. Diese widersprüchlichen Beobachtungen, zusammen mit der doppelten Rolle von eRNAs als Marker und Regulatoren, unterstreichen die Notwendigkeit einer sorgfältigen Quantifizierung und funktionellen Dissektion. Die Messung intragener eRNAs ist jedoch schwierig, da sie häufig die Transkripte des Sinnesstrangs des Wirtsüberlappen 13,25,26,30. Die Herausforderung wird verstärkt, wenn sich Enhancer in Regionen mit verschachtelten Genen oder überlappender Transkription auf beiden Strängen befinden, wodurch Enhancer-spezifische Signale verdeckt werden.

Um diese Herausforderungen zu meistern, haben wir eine bioinformatische Pipeline entwickelt, um Enhancer-assoziierte Transkripte zu detektieren, zu quantifizieren und zu visualisieren, mit besonderem Fokus auf intragene Regionen. Die Pipeline integriert den Assay für Transposase-zugängliches Chromatin mittels Sequenzierung (ATAC-seq), Chromatin-Immunpräzipitationssequenzierung (ChIP-seq), Global Run-on Sequencing (GRO-seq) und genomischen Annotationen, um auch in komplexen genomischen Kontexten eine Auflösung auf Enhancer-Ebene zu erreichen.

Die Pipeline umfasst vier Hauptschritte: (i) Vorverarbeitung, Ausrichtung, Peak-Calling und Signalerzeugung31; (ii) Identifizierung von Verstärkern anhand von Chromatinmerkmalen; iii) Zuweisung der Strangorientierung, insbesondere innerhalb von Genkörpern; und (iv) Quantifizierung und Visualisierung von naszierenden Enhancer-Transkripten. Dieser Rahmen ist besonders nützlich für Systeme mit hochauflösenden Sequenzierungsdaten, wie z. B. die in dieser Studie analysierten embryonalen Stammzellen der Maus, und er kann auf andere Organismen ausgeweitet werden, wenn geeignete Datensätze verfügbar sind. Durch die Ermöglichung einer Enhancer-spezifischen Quantifizierung an den Stellen, an denen bestehende Pipelines nicht ausreichen, bietet dieser Workflow ein praktisches Werkzeug für das Benchmarking und die Untersuchung der intragenen eRNA-Transkription in verschiedenen genomischen Kontexten.

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Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HINWEIS: Alle Rohdatensätze, die im Workflow verwendet werden, sind in Tabelle 1 aufgeführt. Einzelheiten zu den Bioinformatik-Werkzeugen finden Sie in der Materialtabelle. Die Anzahl der in dieser Pipeline verwendeten Threads kann angepasst werden, indem die Variable THREADS geändert wird, die am Anfang jedes Skripts definiert ist. Benutzer können die Anzahl erhöhen, um die Analyse abhängig von den CPU-Ressourcen des Benutzers zu beschleunigen.
Nach jedem Schritt wird eine Protokolldatei generiert. Verwenden Sie für eine schnelle Fehlerüberprüfung Befehle wie cat StepXX_log.txt; grep -qF "ERROR" StepXX_log.txt & echo "ERROR found. Vor dem nächsten Schritt beheben." || echo "OK: keine ERROR-Markierungen". Wenn ein FEHLER angezeigt wird, behandeln Sie den Schritt als fehlgeschlagen, und beheben Sie ihn zuerst.

1. Herunterladen der vollständigen Analyse-Pipeline aus dem GitHub-Repository

(https://github.com/myunggeunO/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization/)

  1. Starten Sie die Befehlszeilenschnittstelle (CLI), die für das verwendete Betriebssystem geeignet ist.
    1. Windows: Richten Sie eine Linux-Umgebung mit dem Windows-Subsystem für Linux (WSL) ein. Befolgen Sie die offiziellen Anweisungen zum Installieren und Konfigurieren von WSL, bevor Sie fortfahren32.
    2. macOS: Fahren Sie ohne zusätzliche Einrichtung fort, da macOS Unix-basiert ist. Lesen Sie in der offiziellen Anleitung nach, um das Terminal33 zu öffnen.
    3. Linux-Benutzer, insbesondere solche, die Ubuntu verwenden: Öffnen Sie ein Terminal, wie in den referenzierten Anweisungenbeschrieben 34.
  2. Führen Sie wget https://github.com/myunggeunO/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization/archive/refs/heads/main.zip -O ~/pipeline.zip   im Terminal aus, um die Pipeline für die Identifizierung von Enhancern und die Quantifizierung der Enhancer-RNA herunterzuladen.
  3. Geben Sie unzip ~/pipeline.zip -d ~/ in das Terminal ein. Dadurch werden alle notwendigen Dateien in das Home-Verzeichnis extrahiert.
  4. Führen Sie rm ~/pipeline.zip aus und geben Sie mv ~/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization-main ~/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization ein, um das Archiv zu entfernen und den extrahierten Ordner umzubenennen.
  5. Geben Sie cd ~/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization/ ein, und führen Sie chmod +x scripts/* aus, um alle Skripte im Verzeichnis "scripts/" ausführbar zu machen.

2. Einrichten der mamba/conda-Umgebung für die Analysepipeline

  1. Geben Sie bash scripts/Step1_conda_environment_formation.sh ein, um eine virtuelle Mamba-Umgebung zu erstellen und auszuführen. Wenn Sie während der Ausführung dazu aufgefordert werden, geben Sie Y ein und drücken Sie die Eingabetaste , um die Paketinstallation zu bestätigen. Führen Sie für macOS Schritt 2.1.1 aus. Für Systeme, auf denen Mamba oder Conda bereits installiert sind, führen Sie Schritt 2.1.2 aus.
    1. MacOS: Öffnen Sie das Skript und ersetzen Sie den miniconda-Download-Link durch die macOS-Version:
      https://repo.anaconda.com/miniconda/Miniconda3-latest-MacOSX-x86_64.sh
      Führen Sie dann Schritt 2.1 aus.
    2. Sobald (enhancer-env) in der Eingabeaufforderung angezeigt wird, geben Sie bash scripts/Step2_package_installation.sh ein, um die erforderlichen Pakete für nachgelagerte Analysen zu installieren. Geben Sie Y ein und drücken Sie die Eingabetaste , wenn Sie während der Installation dazu aufgefordert werden.
    3. Überprüfen Sie nach dem Ausführen von Schritt 2.2 die Terminalausgabe auf Fehlermeldungen. Beheben Sie alle Probleme; Führen Sie dann Schritt 2.2 erneut aus.
    4. (FAKULTATIV) Führen Sie mamba list aus, um zu bestätigen, dass alle von Mamba verwalteten Pakete in der Materialtabelle installiert sind. HOMER wird manuell installiert und erscheint nicht in der Mamba-Liste. Überprüfen Sie HOMER, indem Sie überprüfen, ob das Verzeichnis "~/homer/" vorhanden ist.

3. Laden Sie öffentlich zugängliche ChIP-seq-, ATAC-seq- und GRO-seq-Datensätze von SRA (Sequence Read Archive) herunter

  1. Führen Sie cp scripts/Step{3..12}_*.sh ./ aus, um die notwendigen Shell-Skripte für die Rohleseverarbeitung zu kopieren.
  2. Geben Sie bash Step3_download_file_list.sh > Step3_log.txt 2>&1 ein und drücken Sie die Eingabetaste , um Rohsequenzierungsdaten von SRA herunterzuladen und zu verarbeiten.
    HINWEIS: Dieses Skript automatisiert das Herunterladen und Vorbereiten von öffentlichen Sequenzierungsdaten für die Analyse. Es erstellt eine standardisierte Ordnerstruktur unter "MATERIAL/", die nach Assay-Typ und Replikation organisiert ist (biologisch: rep1/rep2; technisch: trep1/trep2). Eine integrierte Liste von SRA-Zugangsnummern steuert den Abruf mit Prefetch (v3.2.0), die Konvertierung in FASTQ mit fasterq-dump (v3.2.0) (paired-end: --split-files) und die Komprimierung mit pigz (v2.8), um den Speicherplatz zu reduzieren. Die Verarbeitung erfolgt nach prefetch, fasterq-dump, pigz, wobei die Ausgaben in die entsprechenden "00.Rawdata/"-Verzeichnisse geschrieben werden.

4. Führen Sie eine Qualitätskontrolle und ein Trimmen von Rohlesevorgängen durch

  1. Geben Sie bash Step4_read_trimming_and_QC.sh > Step4_log.txt 2>&1 ein, um Lese-, Trimm- und Qualitätskontrollen von FASTQ-Rohdateien durchzuführen.
    HINWEIS: Dieses Skript verarbeitet unformatierte FASTQ-Dateien aus GRO-seq, ATAC-seq und ChIP-seq (H3K27ac, H3K4me1) mit entsprechenden Eingabesteuerelementen. Es führt FastQC (v0.12.1)35 auf Rohlesevorgängen aus und trimmt dann Adapter mit Trim Galore (v0.6.10)36 unter Verwendung von Assay-spezifischen Parametern. Für GRO-seq werden zuerst NextSeq G-Schwänze und sehr kurze Reads (--nextseq 20, --length 20) entfernt, dann wird Cutadapt (v5.1)37 verwendet, um lange Poly-A-Trakte zu entfernen, während Reads, die länger als 20 Nukleotide sind ( -a A{15}, -m 20), beibehalten werden. Für ATAC-seq verarbeitet es Paired-End-Bibliotheken und zielt auf Tn5/Nextera-Adapter ab (--paired, --nextera). Für H3K27ac und die entsprechenden Eingaben werden ChIP-seq-Bibliotheken mit gekoppelten Enden (--paired) verarbeitet. Für H3K4me1 und seinen Eingang führt es das standardmäßige Single-End-Trimmen durch (Standard). FastQC wird bei getrimmten Lesevorgängen erneut ausgeführt. Die Ausgaben werden in das Verzeichnis "01.Clean/" jedes Assays geschrieben, und intermediäre GRO-seq-Adapter-gekürzte Dateien werden entfernt.

5. Bereiten Sie den Bowtie2-Referenzindex vor

  1. Wählen Sie eine der beiden folgenden Optionen, um den Bowtie2 (v2.5.4)38-Genomindex für das mm10-Referenzgenom (Mus musculus) vorzubereiten.
    1. Führen Sie bash Step5_1_download_reference_index.sh > Step5_1_log.txt 2>&1 aus, um den vorgefertigten Bowtie2-Index zu verwenden, der von Entwicklern bereitgestellt wird.
    2. Laufen Bash-Step5_2_download_reference_make_index_with_
      bowtie2.sh > Step5_2_log.txt 2>&1       , um die rohe mm10-Genomsequenz herunterzuladen und den Index manuell zu erstellen.
      HINWEIS: Beide Ansätze generieren eine Indexdatei in das Verzeichnis "reference_index/" und sind funktional äquivalent für die Standardausrichtung.

6. Ausrichten der getrimmten Reads an das mm10-Referenzgenom

  1. Geben Sie bash Step6_alignment_to_make_bam.sh > Step6_log.txt 2>&1 ein, um die Lesevorgänge jedes Assays an die Referenz anzupassen und BAM-Dateien zu generieren.
    HINWEIS: In diesem Schritt werden die Reads jedes Assays auf die zuvor indizierte mm10-Referenz abgebildet. H3K27ac ChIP-seq und der entsprechende Eingang verwenden ein Paired-End-Mapping für eine ausgewogene Genauigkeit (-1, -2) mit Standardempfindlichkeit. H3K4me1 ChIP-seq und die entsprechende Eingabe verwenden ein Single-End-Mapping unter den Standardeinstellungen (-U). ATAC-seq verwendet ein hochempfindliches Mapping, um variable, lange, von Tn5 abgeleitete Fragmente (--very-sensitive, -X 2000) mit Paired-End-Eingabe (-1, -2) zu berücksichtigen. GRO-seq verwendet hochempfindliches Mapping, um kurze, getrimmte Lesevorgänge (--very-sensitive) mit Single-End-Eingang (-U) besser zu platzieren. SAM-Dateien werden in BAM konvertiert und mit der samtools (v1.22.1)39-Ansicht gefiltert, wobei moderates MAPQ für ChIP/Eingabe (-b, -q 10) und strengere Schwellenwerte für ATAC-seq und GRO-seq (-b, -q 30) verwendet werden. Die endgültigen BAM-Dateien werden in das Verzeichnis "02.Align/" jedes Datasets geschrieben.

7. Zusammenführen von technischen Replikaten von H3K27ac ChIP-seq-Daten

  1. Führen Sie bash Step7_merge_trep.sh > Step7_log.txt 2>&1 aus, um technische Replikate von H3K27ac ChIP-seq und den entsprechenden BAM-Eingabedateien zusammenzuführen.
    HINWEIS: Dieses Skript sortiert BAM-Dateien für technische Replikate mit sambamba (v1.0.1)40 sort und führt dann H3K27ac ChIP-seq und entsprechende Eingabereplikate in konsolidierte BAMs mit sambamba merge zusammen. Wenn das Dataset des Benutzers keine technischen Replikate enthält, überspringen Sie diesen Schritt, und fahren Sie mit einzelnen BAM-Dateien fort.

8. Entfernen Sie Duplikate und nicht essentielle Chromosomen

  1. Entfernen Sie Duplikate, und sortieren Sie zugeordnete Lesevorgänge für ChIP-seq und GRO-seq.
    1. Geben Sie bash Step8_1_duplicate_removal_sorting-ChIP_GRO.sh > Step8_1_log.txt 2>&1 ein, um Duplikate aus Histon-ChIP-seq-Datasets zu entfernen und sowohl ChIP-seq- als auch GRO-seq-Ausgabe-BAM zu sortieren.
      HINWEIS: Dieses Skript entfernt PCR-Duplikate mit Samamba-Markup (-r) und Koordinatensortierungen mit Samamba-Sortierung. Für H3K27ac zielt die Verarbeitung auf BAMs aus zusammengeführten technischen Replikaten ab, wobei ChIP und Eingabe getrennt behandelt werden. Für H3K4me1 wird jede replizierte und abgeglichene Eingabe einzeln verarbeitet. Für GRO-seq wird das Entfernen von Duplikaten übersprungen und nur die Koordinatensortierung angewendet. Die Ausgaben werden im Verzeichnis "02.Align/" jedes Datensatzes gespeichert.
  2. Entfernen Sie Duplikate und filtern Sie mitochondriale Chromosomen-kartierte Reads aus ATAC-seq.
    1. Geben Sie bash Step8_2_duplicate_chrM_removal_sorting_ATAC.sh > Step8_2_log.txt 2>&1 ein, um PCR-Duplikate zu entfernen, mitochondriale Reads (chrM) zu filtern und ATAC-seq-BAM zu sortieren.
      HINWEIS: Dieses Skript verweist auf ENCODE-Pipelineempfehlungen für die ATAC-seq-Datenverarbeitung. Es beginnt mit der Namenssortierung mit sambamba sort (-n) und der Korrektur von Mate-Pair-Informationen mit samtools fixmate (-m). Dieser Schritt stellt sicher, dass die Verknüpfungsinformationen vor dem Markieren von Duplikaten ordnungsgemäß zugewiesen werden. Anschließend werden PCR-Duplikate mit Hilfe von Samamba-Markup (-r) entfernt. Mitochondriale Reads werden entfernt, indem eine Keep-Liste aus samtools idxstats generiert wird (ohne chrM und *) und nur aufgelistete Referenzen mit samtools view (-b) beibehalten werden. Die abschließende Koordinatensortierung erfolgt mit Sammba Sort. Bereinigte BAMs werden in das Verzeichnis "02.Align/" jedes Replikats geschrieben.

9. Führen Sie Peak-Calling für jedes Dataset durch

  1. Führen Sie das Skript für Schritt 9 aus, indem Sie bash Step9_peak_calling.sh > Step9_log.txt 2>&1 eingeben, um Spitzenaufrufe für ChIP-seq- und ATAC-seq-Daten auszuführen.
    HINWEIS: Dieses Skript führt Spitzenaufrufe mit MACS3 (v3.0.3)41 für ATAC-seq und ChIP-seq (H3K27ac, H3K4me1) aus. ATAC-seq erzeugt Peaks, indem es alle replizierten BAMs als Signal im No-Model-Modus mit Shift/Extension versorgt (-f BAMPE, --nomodel, --shift -100, --extsize 200, -q 0.01). H3K27ac ruft breite Peaks aus zusammengeführten technischen Replikaten mit übereinstimmender Eingabe auf (-f BAMPE, --broad). H3K4me1 verarbeitet jedes Replikat einzeln mit seiner abgestimmten Eingabe im Single-End-Broad-Modus (-f BAM, --broad), und überlappende Peaks werden mit bedtools (v2.31.1)42 intersect erhalten. Die Ausgaben werden in das Verzeichnis "peak_calling/" jedes Datensatzes geschrieben, wobei H3K4me1-Spitzenwerte mit hoher Zuverlässigkeit unter "peak_calling/overlapped_peak/" angezeigt werden.

10. Zusammenführen biologischer Replikate von ChIP-seq- und ATAC-seq-BAM-Dateien für die nachgelagerte Signalanalyse

  1. Führen Sie bash Step10_merge_rep_forMakingSignal.sh > Step10_log.txt 2>&1 aus, um BAM-Dateien aus biologischen Replikaten von ATAC-seq und H3K4me1 ChIP-seq zusammenzuführen.
    HINWEIS: Dieses Skript kombiniert replizierte BAMs mit Samamba-Merge für ATAC-seq, H3K4me1 ChIP-seq und die entsprechende H3K4me1-Eingabe. Zusammengeführte BAMs unterstützen nachgelagerte Analysen (z. B. BigWig-Signalgenerierung, Normalisierung). Ausgabe-BAMs werden in den Verzeichnissen "merge/02.Align/" unter jedem Sample-Pfad gespeichert.

11. Generieren Sie Tag-Verzeichnisse und Signal-BigWig-Dateien aus gemappten Lesevorgängen

  1. Führen Sie bash Step11_make_tag_to_signal.sh > Step11_log.txt 2>&1 aus, um Tag-Verzeichnisse zu erstellen und bigWig-Signaldateien für zugeordnete Lesevorgänge jedes Datensatzes zu generieren.
    HINWEIS: Dieses Skript erstellt HOMER-Tag-Verzeichnisse mit makeTagDirectory und generiert dann bigWig-Signalspuren mit dem Befehl makeUCSCfile unter Verwendung der Pakete HOMER (v5.1)43 und ucsc-bedgraphtobigwig (v482)44 . Alle Signalspuren werden unter Verwendung von Chromosomengrößendateien aus dem UCSC Genome Browser (https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/mm10/) erstellt. GRO-seq erzeugt strangspezifische Signalspuren (-style rnaseq, -strang + / -, -bigWig). ATAC-seq erzeugt nicht normalisierte Spuren aus zusammengeführten BAM (-bigWig). ChIP-seq (H3K27ac, H3K4me1) erzeugt eingabenormalisierte Spuren mit einer Pseudoanzahl von 1 (-bigWig, -i, -pseudo 1). Die Ausgaben sind unter "03.TagDir/" und "04.bigwig/" organisiert.

12. Bereiten Sie Dateien für die Identifizierung von Enhancern vor

  1. Geben Sie bash Step12_E_identification_material.sh > Step12_log.txt 2>&1 in das Terminal ein, um die erforderlichen Dateien und Referenzen für die Enhancer-Identifizierung vorzubereiten.
    HINWEIS: In diesem Schritt werden alle notwendigen Dateien für die Identifizierung des Enhancers in den Ordnern "01.E_identification/material/" gesammelt, die in den Ordnern "ATAC/", "Histone/" und "Annotation/" organisiert sind. Es kopiert Peak-Dateien (ATAC-seq, H3K27ac, H3K4me1) in die entsprechenden Verzeichnisse. Die GENCODE M23-Annotationsdatei (mm10) wird automatisch heruntergeladen, und Referenzdateien, einschließlich der ENCODE-Blacklist45 (mm10-blacklist.v2.bed) und der Chromosomengrößendatei (mm10.chrom.sizes), werden aus einem vordefinierten Pfad kopiert.

13. Identifizieren Sie Promotorkandidaten und Genkörper anhand der Annotation

  1. Geben Sie cd 01.E_identification/ ein, um das Arbeitsverzeichnis aufzurufen, und führen Sie dann cp .. /scripts/Step{13..20}_*.sh ./ zum Kopieren von Enhancer-Identifikationsskripten.
  2. Führen Sie bash Step13_promoter_candidates_genebody_identification.sh > Step13_log.txt 2>&1 aus, um BED-Dateien für Promotorregionen, Genkörper und proteinkodierende Gene (PCGs) mithilfe der GENCODE-Annotation zu generieren.
    HINWEIS: Dieses Skript verarbeitet heruntergeladene GENCODE M23 Gene Transfer Format (GTF), um BED-Dateien für Promotorkandidaten, alle Genkörper und PCG-Körper zu erstellen, und speichert die Ausgaben in "material/Annotation/". Promotoren sind definiert als ein 2 kb großes Fenster um die TSS (Transcription Start Site) jedes Transkripts mit bedtools slop (-b 2000, -g mm10.chrom.sizes). Gen- und Protein-kodierende Körper werden von GTF-Einträgen abgeleitet, die als Gen annotiert sind, wobei proteinkodierende Einträge weiter nach "gene_type = protein_coding" gefiltert werden.

14. Prozesspeaks zur Identifizierung von Enhancern

  1. Führen Sie bash Step14_ATAC_ChIP-seq_processing.sh > Step14_log.txt 2>&1 aus, um ATAC-seq- und Histon-ChIP-seq-Peak-Dateien für die Enhancer-Identifizierung vorzuverarbeiten.
    HINWEIS: Dieses Skript verarbeitet Peak-Sets für den Enhancer-Aufruf vor. Für ATAC-seq werden Regionen entfernt, die sich mit bedtools subtract (-A) überlappen, und dann Peaks, die sich mit bedtools subtrahieren (-A) überlappen, ausgeschlossen. Bei Histonmarkierungen (H3K27ac, H3K4me1) dehnt es jeden Peak symmetrisch um 1 kb auf jeder Seite mit bedtools slop (-b 1000 -g mm10.chrom.sizes) aus und entfernt dann Promotorüberlappungen mit bedtools subtrahiert.

15. Enhancer identifizieren und klassifizieren

  1. Führen Sie bash Step15_inter_intragenic_E_sets_identification.sh > Step15_log.txt 2>&1 aus, um Enhancer anhand von Chromatin-Peak-Daten zu definieren und zu klassifizieren.
    HINWEIS: In diesem Schritt werden Enhancer mit bedtools definiert und kommentiert. Überlappungen zwischen ATAC-seq-Peaks und slop-expandierten H3K4me1-Peaks werden mit Schnittpunkten (-wa, -u) erhalten, und Regionen, die sich ebenfalls mit flankierten H3K27ac-Peaks überlappen, werden als aktive Enhancer mit Schnittpunkt (-wa, -u) klassifiziert; Nicht aktive Enhancer werden abgeleitet, indem aktive Regionen aus dem vollständigen Enhancer-Set mit Subtraktion entfernt werden. ATAC-seq-Gipfel, die jeden Enhancer-Satz überlappen, werden mit Schnittpunkt (-u) gesammelt, dann werden Gipfel in intergene und intragene mit Schnittpunkt (-v oder -u) gegen den Genkörper aufgeteilt. Die Enhancer-Intervalle werden schließlich intergenen/intragenen Klassen zugeordnet, basierend auf dem dem Peak zugeordneten Gipfel mit dem Schnittpunkt (-u). Alle Ergebnisse werden in "01.E_identification/" unter "01.allE/", "02.interE/" und "03.intraE/" gespeichert.

16. Zuweisen von temporären Stranginformationen zu intagenen Verstärkern

  1. Geben Sie bash Step16_assign_temp_strand_from_gene_overlap.sh > Step16_log.txt 2>&1 ein, um dem intragenic-enhancer BED temporäre Stranginformationen zuzuweisen.
    HINWEIS: In diesem Schritt werden intragene Enhancer mit Genstrangmarkierungen versehen, indem die Enhancer-Intervalle mit den Genkörpern unter Verwendung von bedtools intersect (-wa, -wb) überlappt werden. Die Spalten 1, 2, 3, 4, 5, 16 werden mit awk beibehalten, dann werden die Datensätze sortiert und dedupliziert. Die Ausgabe wird als "03.intraE/strand_designation/01.overlapped_gene_strand/ES_E_intragenic_strand_with_dup.bed" gespeichert.

17. Priorisieren Sie die Strangzuordnung für Enhancer, die beide Stranggene überlappen

  1. Typ bash Step17_initial_strand_assignment_for_both_strand_enhancers_PCG_based.sh > Step17_log.txt 2>&1 , um die Strangrichtung für intragene Enhancer aufzulösen, die Gene auf beiden Strängen überlappen.
    HINWEIS: Dieses Skript behebt die Mehrdeutigkeit von Strängen für intragene Enhancer, die Gene auf beiden Strängen überlappen, indem PCG-Überlappungen priorisiert werden. Enhancer, die auf beiden Strängen vorhanden sind, werden zunächst isoliert (awk-Gruppierung nach chrom/start/end/id/strang), PCG-überlappende Fälle auf demselben Strang werden mit bedtools-Schnittpunkten (-s, -wa, -u) ausgewählt, und Nicht-PCG-Fälle werden mit bedtools-Schnittpunkt (-v) beibehalten. Ausgewählte und beibehaltene Sätze werden verkettet und sortiert. Ausgang: "03.intraE/strand_designation/02.enhancer_with_PCG_priority/ES_E_intragenic_PCG_priority.bed".

18. Berechnen Sie strangspezifische RPKM-Werte (Reads Per Kilobase per Million Mapped Reads) für Gene, die sich mit PCG-priorisierten intragenen Enhancern überlappen

  1. Geben Sie bash Step18_RPKM_cal_from_partially_strand_assigned_enhancers.sh > Step18_log.txt 2>&1 ein, um die strangspezifische RPKM für Gene zu berechnen, die Enhancer auf demselben Strang überlappen.
    HINWEIS: In diesem Schritt wird "ES_E_intragenic_PCG_priority.bed" aus Schritt 17 verwendet, das Enhancer enthält, die (i) ein PCG auf einem Strang überlappten und einen Strang erhielten, (ii) PCGs auf beiden Strängen überlappten und mehrdeutig blieben, oder (iii) keine PCG-Überlappung aufwiesen und beide Stränge zurückhielten. Überlappende Gene desselben Strangs werden mit bedtools intersect (-s, -wa, -u) selektiert, via awk in GTF umgewandelt und aus GRO-seq mit featureCounts (v2.1.1)46 strangspezifischem Zählmodus quantifiziert (-s 1, -t Gen, -g gene_id, -O, --fraction). Die Gesamtzahl der kartierten Lesevorgänge wird mit sambamba flagstat erhalten, und RPKM wird aus der Genlänge, der Anzahl und den Summen berechnet. Die Ausgänge werden in "03.intraE/strand_designation/03.RPKM_calculation_of_overlapped_gene/" geschrieben.

19. Endgültige Strangzuordnung auf der Grundlage der Genexpression (RPKM) überlappender Gene

  1. Geben Sie bash Step19_second_strand_assignment_by_RPKM.sh > Step19_log.txt 2>&1 ein, um die Strangzuordnung für intragene Verstärker abzuschließen.
    HINWEIS: In diesem Schritt werden Stränge intragenen Enhancern unter Verwendung der Genexpressionsunterstützung aus Schritt 18 zugewiesen. Überlappungen gleicher Stränge zwischen Enhancern (ES_E_intragenic_PCG_priority.bed) und Genen finden sich mit bedtools-Schnittpunkten (-s, -wa, -wb). Die RPKM-Werte der Gene werden über awk/sort/join mit den Genintervallen verbunden, wodurch das Gen-RPKM-BED erzeugt wird. Für jeden Enhancer wird das überlappende Gen mit dem höchsten RPKM ausgewählt, und der Enhancer erbt den Strang dieses Gens. Die Ergebnisse werden in "03.intraE/strand_designation/04.enhancer_strand_designation_by_RPKM_of_gene/ES_E_intragenic_PCG_priority_strand_by_gene_RPKM.bed" gespeichert.

20. Zuordnen von Stranginformationen zu intagenen Enhancern und Enhancer-Summits

  1. Geben Sie bash Step20_strand_assignment_for_intragenicE_and_summits.sh > Step20_log.txt 2>&1 ein, um allen intagenen Enhancern und jedem Summit festgelegte Stranginformationen zuzuweisen.
    HINWEIS: Dieser Schritt schließt die Strangzuordnung für intragene Enhancer und passende Summits mit Hilfe von Bedtools ab. Gegensätzliche Strangintervalle werden durch Subtraktion (-S) entfernt, Strang-designierte Enhancer werden mit aktiven und nicht-aktiven Sätzen unter Verwendung von intersect (-wa, -u) geschnitten, und Summit-Dateien werden durch überlappende Summits mit strang-designierten Enhancern über intersect (-wa, -wb) neu annotiert und Strang mit awk abrufen. Die Ergebnisse werden in "03.intraE/final_strand_IntragenicE/" und dessen Unterordner "summit/" gespeichert.

21. Bereiten Sie Eingabedateien für die Enhancer-Validierung, eRNA-Quantifizierung und Visualisierung vor

  1. Geben Sie cd .. / oder cd ~/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization, um zum Pipeline-Stamm zu wechseln, und geben Sie dann cp scripts/Step21_preparing_quantification_and_visualization.sh ./ ein, um das Skript für die Vorbereitung der Downstream-Analyse zu kopieren.
  2. Führen Sie bash Step21_preparing_quantification_and_visualization.sh > Step21_log.txt 2>&1 aus, um alle erforderlichen Dateien für die Enhancer-Aggregation, die GRO-seq-Signalverarbeitung und die eRNA-Quantifizierung vorzubereiten.
    HINWEIS: In diesem Schritt werden die Eingabedateien und die Verzeichnisstruktur für die Enhancer-Validierung, die eRNA-Quantifizierung und die Signalvisualisierung unter "02.E_visualization_quantification/" vorbereitet. Unterordner werden für bigWig-Dateien, Enhancer-BEDs, BAMs, Signalmatrizen, Zählungen und Plots erstellt. Wichtige Eingaben wie Summit-BEDs, bigWigs, Enhancer-Listen und GRO-seq-BAMs werden an die entsprechenden Speicherorte kopiert.

22. Generieren Sie Aggregationsdiagramme für die Enhancer-Validierung

  1. Geben Sie cd 02.E_visualization_quantification/ ein, um das Arbeitsverzeichnis aufzurufen, und geben Sie dann cp .. ein. /scripts/Step{22..24}_*.* ./ um die notwendigen Skripte für die nachgelagerte Analyse zu kopieren.
  2. Führen Sie bash Step22_generation_of_aggregation_plot.sh > Step22_log.txt 2>&1 aus, um Aggregationsdiagramme von Chromatinsignalen um jeden Typ von Enhancer-Gipfel zu erzeugen.
    HINWEIS: Dieser Schritt visualisiert die durchschnittliche Anreicherung des Chromatinsignals zentriert auf Enhancer-Gipfeln mit computeMatrix und plotProfile von deepTools (v3.5.6)47. Für jeden definierten Enhancer-Satz berechnet computeMatrix reference-point (--referencePoint center, -a 5000, -b 5000, --missingDataAsZero) die Signaldichte innerhalb eines 10-KB-Fensters um Enhancer-Gipfel unter Verwendung von bigWig-Dateien für ATAC-seq, H3K27ac und H3K4me1. Die Ausgabematrix wird an plotProfile übergeben, das Signalaggregationskurven für den Vergleich zwischen Enhancer-Gruppen generiert. Die Aggregationsdiagramme werden im Verzeichnis "01.Profiling/04_1.aggregation/" gespeichert.

23. Quantifizierung und Visualisierung der Enhancer-RNA-Expression

  1. Führen Sie bash Step23_quantifing_eRNA_RPKM.sh > Step23_log.txt 2>&1 aus, um die eRNA-Expressionsniveaus aus GRO-seq mithilfe von featureCounts zu quantifizieren.
    HINWEIS: In diesem Schritt wird die eRNA-Transkription aus definierten Enhancer-Regionen auf strangspezifische Weise unter Verwendung von GRO-seq quantifiziert. Intergene Enhancer werden mit featureCounts im ungestrandeten Modus (-s 0, -t Enhancer, -g gene_id, -O, --fraction) gezählt, und intragene Enhancer werden im Antisense-Modus (-s 2) quantifiziert, um Signale aus einer überlappenden Gentranskription auszuschließen. BED-Regionen werden vor dem Zählen mit awk in GTF konvertiert. Die Gesamtzahl der zugeordneten Lesevorgänge stammt von sambamba flagstat, und die Anzahl wird mithilfe der Enhancer-Länge, der Leseanzahl und der Gesamtzahl der zugeordneten Lesevorgänge auf RPKM normalisiert. Die Ausgaben sind unter "02.eRNA_quantification/03.count_normalized_with_RPKM/" durch "inter/" und "intra/" organisiert.
  2. Führen Sie Rscript Step24_visualization_of_enhancer_transcript aus. R > Step24_log.txt 2>&1 zur Visualisierung und zum Vergleich der eRNA-Expressionsniveaus über Enhancergruppen hinweg mit R.
    HINWEIS: Das R-Skript verwendet die Pakete ggplot2 (v3.5.2)48 und cowplot (v1.2.0)49 , um Violin- und Boxplots zu generieren, die aktive und nicht-aktive Enhancer-Ausdrücke basierend auf RPKM-Werten vergleichen. Für Visualisierungs- und statistische Tests werden RPKM-Werte in Log2 (RPKM + 1) transformiert. Die statistische Signifikanz wird mit dem Wilcoxon-Rangsummentest bewertet. Sowohl die Zusammenfassungsdiagramme als auch die p-Wert-Tabelle werden zur nachgelagerten Interpretation in "03.eRNA_visualization/" gespeichert.
    HINWEIS: Wenn ein Schritt in dieser Pipeline fehlschlägt und auch nach der erneuten Ausführung bestehen bleibt, melden Sie das Problem unter https://github.com/myunggeunO/Enhancer-transcript-identification-from-read-to Visualisierung(en). Durch die eindeutige Angabe des fehlgeschlagenen Schritts und das Anhängen der Protokolldatei wird eine genaue Unterstützung bei der Fehlerbehebung gewährleistet.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schematischer Arbeitsablauf für die Pipeline zur Quantifizierung von Enhancer-Transkripten
Öffentlich zugängliche ChIP-seq-Datensätze (H3K27ac, H3K4me1), ATAC-seq und GRO-seq (Tabelle 1) wurden mit einer standardisierten Pipeline verarbeitet, die in erster Linie für die Validierung konzipiert wurde. Das Trimmen des Adapters und die Qualitätsfilterung wurden mit Trim Galore und Cutadapt durchgeführt, gefolgt von der Ausrichtung auf das mm10-Referenzgeno...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nach der Entdeckung von Enhancer-abgeleiteten Transkripten 13,14,15 ist die genaue Quantifizierung von eRNAs eine große Herausforderung geblieben, insbesondere in ingogenen Kontexten, in denen sich eRNAs häufig mit Wirtsgentranskripten überlappen. Diese Überlappung erschwert die Strangzuordnung und Signalzuordnung, was es schwierig macht, eine echte Enhancer-Transkription von der Hintergrundgene...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Studie wurde unterstützt durch den Forschungsfonds der Chungnam National University [2022-0582-01 (S.-K.K.) und 2023-0545-01 (S.-K.K.)], Südkorea. Abbildung 1 wurde mit BioRender (https://biorender.com/) erstellt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
BettgeräteQuinlan Lab, University of Utah v2.31.1Dienstprogramme zum Bearbeiten von BED-Dateien
Bowtie2Langmead-Labor, Johns Hopkins Universityv2.5.4Multithreaded Aligner zur Abbildung liest auf ein Referenzgenom
CowplotWilke-Labor, Universität von Texasv1.2.0Werkzeuge zum Kombinieren und Ausrichten von ggplot2-basierten Figuren
cutadaptScience For Life Labor, Universität Stockholmv5.1Adapter und Poly-A/G-Hecktrimmer
DeeptoolsBioinformatik-Einrichtung, Max-Planck-Institutv3.5.6Lesezählwerkzeug zur Quantifizierung von Reads in definierten genomischen Regionen
FastQCBabraham Bioinformatik, Babraham Institutv0.12.1Qualitätskontrolle für Sequenzlesungen
featureCounts (Unterlesung)Shi Lab, Monash Universitätv2.1.1Rohe Lesezählwerkzeuge für bestimmte genomische Regionen
HomerBenner-Labor, University of California San Diego (UCSD)v5.1Toolkit für ChIP-seq, ATAC-seq und neu entwickelte RNA-Analysen; enthält die Erstellung von Tag-Verzeichnissen und Signalprofilierung
MACS3Chan Zuckerberg Initiativev3.0.3Spitzenaufruf für ChIP-seq und ATAC-seq Datensätze
Pigz.v2.8Multithread-Kompressionstool zur Generierung von gzip-komprimierten Dateien
SamambaStaatliche Universität Petersburgv1.0.1Multithreaded SAM/BAM-Dateiverarbeitungstoolkit
SamtoolsWellcome Trust Sanger Institutv1.22.1Werkzeuge zur Verarbeitung und Bearbeitung von SAM/BAM-Dateien
sra-toolsNationales Zentrum für Biotechnologie-Information (NCBI)v3.2.0Zum Herunterladen von SRR-Dateien aus der NCBI SRA-Datenbank
tidyversePosit PBCv2.0.0Sammlung von R-Paketen zur Datenmanipulation und -visualisierung
Trim-galoreAltos Labs, Cambridge Institute of Sciencev0.6.10Adapter und minderwertiges Basistrimmen mit Multi-Threading
Ubuntu 20.04Entwicklung und Tests der Pipeline
ucsc-bedgraphtobigwig Kent-Labor, University of California Santa Cruzev482Werkzeuge zur Erzeugung von bigWig-Signalspuren

Referenzen

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