Eine einfache Mikroaspirationstechnik zur Isolierung somatischer Zellen aus kryokonserviertem Pferdesamen als Kernspender für das Klonieren

Summary

Dieses Protokoll bietet eine einfache Mikroaspirationstechnik, um lebensfähige somatische Zellen (SCs) aus kryokonserviertem Pferdesamen zu isolieren. Im Gegensatz zu herkömmlichen Ansätzen vermeidet diese Technik lange In-vitro-Kulturen und verhindert die Spermienkontamination, was den sofortigen Einsatz beim somatischen Zellklonen ermöglicht.

Abstract

Sperma ist eine komplexe Flüssigkeit, die neben Spermatozoen auch andere Zellpopulationen enthält, darunter Immunzellen, unreife männliche Keimzellen, Epithelzellen und Fibroblasten. Diese Zellen teilen die diploide Bedingung, was sie zu geeigneten Kandidaten als Kernspender für das klonen Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) macht. Die Entstehung lebensfähiger Embryonen und Nachkommen wurde mit diesen Zellen nachgewiesen. Effektive Methoden zur Isolierung von Sperma sind Zentrifugation und osmotische Gradiententechniken; jedoch sind längere In-vitro-Kulturperioden notwendig, um Primärkulturen aus diesen isolierten Zellen herzustellen. Darüber hinaus enthielten die entnommenen Proben eine hohe Menge an Spermien, was die Einrichtung und Erhaltung von In-vitro-Kulturen beeinträchtigt. Bis heute wurden Primärkulturen nur erfolgreich aus frischen Samenproben etabliert, während Versuche mit kryokonserviertem Sperma konsequent gescheitert sind. Diese Einschränkung schränkt das Potenzial erheblich ein, Klone aus kryokonservierten Spermaproben zu erzeugen. Die vorliegende Studie schlägt eine einfache mikroaspirationsbasierte Methodik zur Isolierung somatischer Zellen aus kryokonserviertem Pferdesamen vor. Dieser Ansatz ermöglicht die schnelle Rückgewinnung einer ausreichenden Anzahl von Zellen für den sofortigen Einsatz bei SCNT-Klonverfahren.

Introduction

Das Klonieren des somatischen Zellkerntransfers ist ein unschätzbares Werkzeug zur Rettung und Vermehrung von Individuen von zootechnischem und wissenschaftlichem Interesse. Zahlreiche Zelllinien wurden als Kernspender verwendet, darunter Zellen aus Haut, Muskeln, Granulosa, Lymphozyten und Urinzellen 1,2,3,4. Interessanterweise hat sich Samen als neuartige Alternative zur Sammlung somatischer Zellen (SCs) etabliert, die als nukleare Spender für das Klonen^{verwendet werden sollen.} Diese Erkenntnis ist besonders wichtig für die Rettung von Personen, für die nur Sperma erhalten wurde. Die Etablierung von Primärkulturen aus SCs, die aus gefrorenem Samen isoliert wurden, war jedoch erfolglos und bleibt bis heute das Haupthindernis, um klonierte Tiere aus dieser Quelle^zu erhalten^. Diese Zellen stammen wahrscheinlich aus Drüseepithel und der Auskleidung von Tubulus, aus Samensekreten und – wichtig – aus Samenkontamination mit Urin, wobei letztere eine bekannte Quelle somatischer Zellen mit hohem proliferativem und undifferenziertem Potenzial³ ist.

Verschiedene Methoden zur Isolierung von SCs aus Samen wurden implementiert, darunter Zentrifugation⁵, osmotische Gradienten^{7, 8, 10} und Durchflusszytometrie¹¹. Somatische Zellen, sobald sie mit diesen Methoden isoliert sind, benötigen jedoch weiterhin optimierte Bedingungen für Anheftung, Wachstum und Proliferation⁸. Die spezifischen Anforderungen dieser Zellen machen die In-vitro-Kultur komplexer, da für die Etablierung von Primärzellkulturen längere Inkubationszeiten erforderlich sind. Außerdem stört die hohe Konzentration an Spermatozoen in den Proben sowohl den Beginn als auch die Erhaltung dieser Kulturen⁵.

Im Gegensatz zu den zuvor beschriebenen Ansätzen bietet diese Mikroaspirationstechnik mehrere klare Vorteile. Sie ermöglicht die Auswahl von SCs basierend auf Größe und Morphologie^{12 und} ermöglicht die Rückgewinnung von Kernen sowohl aus lebensfähigen als auch aus nicht lebensfähigen Zellen, eine Strategie, die erfolgreich mit gefrorenem Gewebe ohne Kryoprotektionen¹³ und gefriergetrockneten Fortpflanzungszellen 14,15,16 demonstriert wurde. Wichtig ist, dass SCs unmittelbar nach dem Auftauen des Samens verwendet werden können, wodurch das Risiko von Ploidyfehlern, die typischerweise mit einer verlängerten In-vitro-Kultur primärer somatischer Zellen für das Klonieren von Tieren verbunden ^{sind, reduziert werden}. Konkret konzentriert sich die Technik auf kryokonserviertes Pferdesamen, wodurch eine ausreichende Anzahl von SCs sofort für SCNT¹² gesammelt werden kann.

Die Herstellung von Mikropipetten und die Entwicklung von Mikroaspirationstechniken haben in den letzten Jahrzehnten erhebliche Fortschritte gemacht. Der Einsatz dieser Werkzeuge ermöglicht eine präzise Manipulation von Gameten, Embryonen und ihren Zytostrukturen und eröffnet neue Möglichkeiten im Bereich der Reproduktionsbiotechnologie (https://www.jove.com). Mikromanipulationstechniken ermöglichen die Bewertung zellulärer mechanischer Eigenschaften und liefern wertvolle Einblicke in ihren physiologischen Zustand^19,20, doch dieses Feld ist noch relativ unerforscht.

Bis heute hat keine Forschung eine wirksame Methode zur Isolierung von SCs aus Samen mittels einer Variante von Mikromanipulationsverfahren beschrieben. Angesichts der Einschränkungen herkömmlicher Isolationsmethoden schlägt diese Studie ein praktisches, mikroaspirationsbasiertes Protokoll zur Isolierung von SCs aus kryokonserviertem Pferdesamen vor, um deren sofortigen Einsatz bei somatischen Klonverfahren nach der Sammlung zu ermöglichen.

Protocol

Kryopkonservierte Samenproben, die über 19 Jahre in flüssigem Stickstoff konserviert wurden, wurden von kommerziellen Händlern gewonnen, die von den zuständigen veterinärmedizinischen Behörden in Mexiko autorisiert wurden, gemäß dem mexikanischen Offiziellen Standard NOM-027-ZOO-1995, der den zoosanitären Prozess von Samen von Haustieren regelt. Alle Samenproben, egal ob sie verwendet oder für die Analyse ungeeignet waren, wurden inaktiviert und gemäß institutionellen Biosicherheitsprotokollen und geltenden Vorschriften entsorgt, einschließlich NOM-087-ECOL-SSA1-2002 für die Behandlung biologisch-infektiöser Abfälle in Mexiko. Die restliche Flusssäure (HF) wurde unter einer Dampfhaube sicher neutralisiert, indem sie langsam in einen Kunststoffbehälter übertragen und kleine Mengen von CaCO₃ oder Ca(OH)₂ allmählich hinzugefügt wurden, bis die Spritzung aufhörte und unlösliches CaF₂ entstand. Der pH-Wert der neutralisierten Suspension lag zwischen 6 und 8, bevor sie gemäß den örtlichen Vorschriften als anorganischer chemischer Abfall behandelt wurde. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Mikropipettennadelherstellung zur somatischen Zellisolation

1. Wählen Sie Borosilikatglas-Kapillaren aus (1,0 mm O.D. × 0,78 mm I.D. × 100 mm).
2. Verwenden Sie einen Mikropipettenzieher, um fein gespitzte Kapillaren zu erzeugen. Stellen Sie den Schneidpunkt an, um den Spitzendurchmesser zu variieren.
3. Führe die Kapillare in den Zieher ein und verriege ihn fest.
4. Entfernen Sie die Mikropipette vorsichtig nach dem Ziehen und legen Sie sie horizontal auf die Mikroschmiede.
5. Richten Sie Heizer und Mikropipette im Sichtfeld des Mikroskops aus.
6. Lokalisieren Sie den Schneidpunkt mit dem Okular-Fadenkreuz (Abbildung 1A, B).
7. Bringen Sie die Mikropipettenspitze in Kontakt mit der Glasperle (am Heizfaden).
8. Erhöhe die Hitze allmählich, bis die Spitze in die Perle einschmilzt.
   1. Mach die Heizung aus.
   2. Lassen Sie die Spitze an der Perle haften und trennen Sie sich.
      HINWEIS: Es ist nicht notwendig, die Mikropipette zu biegen; er kann in seiner geraden Form verwendet werden. Wird jedoch vom Operator bevorzugt, kann ein Winkel gebildet werden (Abbildung 1C).
9. Glätten Sie die Spitze nicht, da dieser Schritt für den Eingriff nicht notwendig ist.
10. Reinigen Sie die Pipettenspitzen, indem Sie jede Spitze für ~10 Sekunden nacheinander eintauchen lassen:
    1. 20 % Flusssäure (HF).
       VORSICHT: Flusssäure ist hochgiftig und korrosiv. Verwenden Sie die vom Lieferanten angegebene persönliche Schutzausrüstung. Betonen Sie die Verwendung von Augen- und Gesichtsschutz, Handschuhen und einem Laborkittel und arbeiten Sie immer mit einer Abgashaube.
    2. Steriles, doppelt destilliertes Wasser.
    3. Absolutes Ethanol.
       HINWEIS: Um das Waschen der Pipettenspitzen zu erleichtern, bereiten Sie die oben genannten Lösungen in 15-mL sterilen Corning-Tuben vor.
11. Trockne Mikropipetten im Ofen bei 50 °C.
12. Bewahren Sie Mikropipetten in einem sterilen Behälter auf.

2. Mikroaspirations-Aufbau

1. Überprüfen Sie, ob das Mikroaspirationssystem in einwandfreiem Zustand ist, wobei der Mikroaspirations-Joystick zentriert auf dem Bedienfeld ist.
2. Bei Systemen mit Öl sollten keine Luftblasen im System vorhanden sein, da diese die Bewegungspräzision beeinträchtigen können.
3. Setzen Sie die somatische Zellaspirationsmikropipette in den Haltmanipulator auf der dominanten Handseite des Bedieners ein.
   HINWEIS: Ersetzen Sie die Mikropipette durch eine neue, falls die Spitze während der somatischen Zellentnahme verstopft.

3. Auftauen und Verdünnung des kryokonservierten Pferdesamens

1. Strohhalme aus flüssigem Stickstoff entfernen, 10 Sekunden Luft aussetzen und 30 Sekunden bei 37 °C auftauen.
2. Erste Samenverdünnung: Nehmen Sie eine Probe aus dem aufgetauten Sperma (250 μL) und verdünnen Sie mit 1,0 mL DMEM/F12-Medium, ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum, 0,1 mg/mL Rinderserumalbumin, 12,5 μM β-Mercapptoethanol und 1 % Antibiotika-Antimykotika.
   1. Die Mischung 30 Minuten bei 37 °C inkubieren.
3. Zweite Samenverdünnung: Nehmen Sie 25 μL aus der ersten Verdünnung, verdünnen Sie sie in 975 μL 1x DPBS und ergänzen Sie sie mit 0,1 mg/mL Poly(Vinylalkohol) (PVA) oder Polyvinylpyrrolidon (PVP), geben Sie sie in ein 1,5 mL Mikrozentrifugenrohr und mischen Sie es sanft.
   1. Halten Sie diese Mischung während des gesamten Zellentnahmeprozesses bei 37 °C.

4. Zubereitung von Gerichten für die Sammlung von SCs

1. Sammle die SCs mit zwei Deckeln aus 35 mm durchmessigen Kulturschalen.
2. Bereiten Sie den ersten Deckel wie folgt vor (Deckel #1, Abbildung 2A).
   1. Nehmen Sie 100 μL der zweiten Samenverdünnung und legen Sie sie in der Mitte des Deckels ab (siehe Abbildung 2A).
   2. Machen Sie einen zweiten Mikrotropfen (10 μL) von 1x DPBS, ergänzt mit 0,1 mg/mL PVA oder PVP auf dem ersten Tropfen (siehe Abbildung 2A).
   3. Decken Sie beide Mikrotropfen vollständig mit Paraffinöl ab, um Verdunstung zu verhindern und die Temperaturstabilität während der Aspiration des SC zu gewährleisten.
3. Bereiten Sie das zweite Lid vor, um Zellreste und begleitende Spermatozoen zu entfernen (Deckel #2, Abbildung 2B).
   1. Platzieren Sie drei 30-50 μL Tropfen 1x DPBS, ergänzt mit 0,1 mg/mL PVA oder PVP, in die Mitte des Deckels; Bedecken Sie sie nicht mit Mineralöl.
      HINWEIS: Bereiten Sie diese Kulturschüssel erst zu, nachdem alle somatischen Zellen ausgewählt wurden, um Veränderungen der physikochemischen Eigenschaften der DPBS-Lösung durch Luftexposition zu verhindern.
4. Führen Sie alle Mikroaspirationsschritte unter einem umgekehrten Mikroskop bei Raumtemperatur durch. Vermeiden Sie plötzliche Temperaturschwankungen.

5. Mikroaspirationsverfahren zur Isolierung von SCs aus kryokonserviertem Pferdesperma

1. Setzen Sie den ersten Deckel (Deckel #1, Abbildung 2A) auf die Mikroskopstufe, bereit zum Sammeln der SCs.
2. Wählen Sie eine Mikropipette mit dem richtigen Durchmesser aus, um die SCs aufzufangen und sie mit dem mechanischen Aspirationssystem anzuschließen.
3. Führe die Mikropipette vorsichtig in den Mikrotropfen ein und richte sie am Boden des Geschirrdeckels aus. Sobald die Pipette ein aspiriertes Kulturmedium hat, beginnt die individuelle Erfassung der SCs.
4. Am Boden der Schale sollten verschiedene Zellmorphologien sichtbar sein (Abbildung 3).
5. Positioniere die Mikropipettenspitze neben jedem SC und sauge sie unter Unterdruck an. Atmen Sie alle runden und verlängerten Zellen unabhängig von ihrer Größe an. Das Aspirationsvolumen variiert zwischen den Aufnahmen von SCs.
6. Nach dem Einfangen von 10 Zellen werden sie in den Mikrotropfen oben (10μL) abgelegt (Abbildung 2A). Wiederholen Sie diesen Schritt, bis die erforderliche Anzahl von SCs für das Klonexperiment erreicht ist.
7. Bewahren Sie alle gefangenen somatischen Zellen während des gesamten Sammelprozesses in diesem Mikrotropfen auf.
8. Sobald die erforderliche Anzahl von SCs für das Klonen erreicht ist, führen Sie ein einfaches Waschverfahren mit Mikrotropfen durch, um begleitende Spermien, Zellreste und mikrobielle Verunreinigungen zu entfernen.
9. Nimm den zweiten Spüldeckel und führe eine sequentielle dreistufige Wäsche der SCs durch (Deckel #2, Abbildung 2B):
   1. Fangen Sie die somatischen Zellen mit einer Mikropipette ein und legen Sie sie vorsichtig auf die Oberfläche des ersten Tropfens. Lassen Sie sie 3-5 Minuten zur Ruhe kommen (Abbildung 2B; Abwurf #1).
   2. Wiederholen Sie Schritt 5.9.1 und legen Sie sie in den zweiten Tropfen (Abbildung 2B; Drop #2).
   3. Wiederholen Sie Schritt 5.9.1 und legen Sie die somatischen Zellen in den dritten Tropfen ab (Abbildung 2B; Abwurf #3).
10. Als letzten Schritt werden die isolierten somatischen Zellen in einen finalen Mikrotropfen abgelagert, der für den späteren Einsatz bei somatischen Zellkerntransferverfahren vorbereitet ist (Abbildung 4D).
    HINWEIS: Saugen Sie bei jeder Rückaufnahme SCs in möglichst kleinstmöglichem mittleren Volumen ab, um Spermien, Ablagerungen und mikrobielle Verunreinigungen zu minimieren.

Results

Tabelle 1 zeigt, dass die Mikroaspirationstechnik somatische Zellen effizient aus kryokonserviertem Pferdesamen zurückgewinnt, mit Fangraten von 317,7 ± 9,60 bis 424,7 ± 33,65 Zellen pro Stunde bei drei Hengsten. Hengst #03 erzielte die höchste Erträge, was die Wirksamkeit der Methode auch bei langfristig gelagerten Proben zeigt. Die Daten zeigen, dass die Technik somatische Zellen konsistent und effektiv vom Sperma isoliert, und die mittleren Abfangraten sowie Standardab...

Discussion

Die Mikromanipulation von Zellen und Gameten hat es ermöglicht, komplexe assistierte Fortpflanzungstechniken zu vereinfachen. Beispiele hierfür sind somatische Klonierung durch Handgemachtes Klonen²¹, assistiertes Schlüpfen²², intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI)²³ und pronukleare Mikroinjektion bei Zygoten²⁴, unter anderem.

Die Entwicklung wirksamer Metho...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Beta-Mercaptoethanol	SIGMA	M7522	Somatische Zellkultur
1x DPBS	GIBCO	REF-21600010	Somatische Zellmanipulation
Absolutes Ethanol	HYCEL	EL CRISOL 50181-1L73	Zur Herstellung von Pipetten
Antibiotikum-antimikotikum 100x	INVITRO SA. M&eakut; xico		Somatische Zellkultur
Borosilikat-Kapillaren (1,0 mm O.D. & Times; 0,78 mm I.D. & Times; 100 mm Länge)	HARVARD-APPARAT, USA	EC1-30-0035	Zur Herstellung von Pipetten
BSA	SIGMA	A3311	Somatische Zellkultur
DMEM/F12 Medium	GIBCO	REF-12500-062	Somatische Zellkultur
Kryokonservierte Samenprobe des Pferdes			Die kryokonservierten Samenproben wurden von einem kommerziellen Händler bezogen und waren seit mehr als 19 Jahren in flüssigem Stickstoff konserviert. Alle gefrorenen Pferdesamenproben wurden von kommerziellen Vertriebspartnern erhalten, die von den zuständigen veterinärmedizinischen Behörden in Mexiko gemäß dem mexikanischen Offiziellen Standard NOM-027-ZOO-1995, Zoosanitary Process of Semen from Domestic Animals, genehmigt sind.
Okular-Fadenkreuz		Werkzeug zur Herstellung von Pipetten	Erforderliche Ausrüstung
Fetales Rinderserum	GIBCO	REF-26140-079	Somatische Zellkultur
Wassersäure	SIGMA-ALDRICH	339261	Zur Herstellung von Pipetten
Invertoptisches optisches Mikroskop	Finsternis, TE 200	NIKON	Somatische Zellen-Mikromanipulation
Labor  Trockenofen		Werkzeug zur Herstellung von Pipetten	Erforderliche Ausrüstung
Microforge		Werkzeug zur Herstellung von Pipetten	Erforderliche Ausrüstung
Mikromanipulator-Set für Invertiertes Mikroskop		Mikromanipulation von Zellen	Erforderliche Ausrüstung
Mikropipettenzieher	P-97, SUTTER-INSTRUMENT	Werkzeug zur Herstellung von Pipetten	Verwenden Sie folgende Einstellungen— Vorlauf: 720; Zug: 30; Geschwindigkeit: 50; Zeit: 220; Druck
Mineralöl	SIGMA	M8410	Somatische Zellmanipulation
Nunklon & Nunclon; Zellkulturschalen, Durchmesser & Times; H 35 mm & mal; 10 mm	NUNCLON	Nunc 153066
PVA	SIGMA	P8136	Somatische Zellkultur
PVP	SIGMA	P5288	Somatische Zellkultur
Trypan-blaue Lösung 0,4 %	GIBCO	REF- 15250061	Zellfarbe