Methodenartikel

Peroxisom-Färbung in Säugetierzellen mittels peroxisom-spezifischen Sonden

DOI:

10.3791/69405

⸱

19. Dezember 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Biological Sciences, University of Southampton, 2The Mina and Everard Goodman Faculty of Life Sciences, Bar-Ilan University, 3Biosciences, Faculty of Health and Life Sciences, University of Exeter, 4Institute of Bioengineering, Faculty of Life Sciences, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), 5Biomolecular Screening Facility, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), 6Conquest

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PeroxiSPY-Sonden werden verwendet, um Peroxisome in Säugetierzellen nachzuweisen. Hier zeigen wir, wie die Sonden verwendet werden können, um Peroxisome in lebenden und fixierten Zellen zu färben.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Peroxisome sind allgegenwärtige Organellen mit wesentlichen Rollen für die menschliche Gesundheit, und ihre Funktionsstörung führt zu einer Vielzahl genetischer Erkrankungen. Die Visualisierung von Peroxisomen ist der Schlüssel zur Erkennung einer Peroxisomendysfunktion; Der Fortschritt wurde jedoch durch das Fehlen von peroxisom-spezifischen Sonden eingeschränkt. Durch die Entwicklung von PeroxiSPY, peroxisom-spezifischen Sonden, die natürliche Peroxisom-Metaboliten nachahmen, ermöglichten wir die Echtzeit-Erkennung, Verfolgung und Quantifizierung der Peroxisom-Dynamik in lebenden Säugetierzellen. Darüber hinaus zeigen die Anwendungen dieser Technik auf Patientenzellen mit Peroxisomenerkrankungen pathologische Phänotypen. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll zur Detektion von Peroxisomen in lebenden Säugetierzellen sowie zur Erkennung von Peroxisomen nach der Färbung in fixierten Cellen. Wir demonstrieren, wie Peroxisome in lebenden Zellen mit peroxisom-spezifischen Sonden gefärbt werden können, wobei wir uns auf die Zellvorbereitung, den Zeitpunkt des Verfahrens, die Reproduzierbarkeit und die Problemlösung konzentrieren. Diese Sonden ermöglichen eine schnelle, spezifische und nicht-toxische Lebendzell-Detektion von Peroxisomen und bieten eine einzigartige, quantitative Methode zur Beurteilung der Peroxisomenfunktion und deren Dysfunktion bei peroxisomenbezogenen Erkrankungen.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das Peroxisom ist das häufigste eukaryotische Organelle, mit einigen Zellen über tausend Peroxisomen1. Ihre Funktionen sind entscheidend für die Entwicklung des Organismus und die metabolische Anpassung 1,2, was sich in einer Reihe menschlicher Peroxisomenerkrankungen zeigt, typischerweise unheilbare neurodegenerative und neurometabolische Erkrankungen bei kleinen Kindern 3,4. Soweit wir wissen, gab es zuvor keine selektiven Methoden zur Markierung von Peroxisomen in lebenden Zellen und Geweben. Diese Werkzeuge sind für Forschungs- und Diagnoseanwendungen von unschätzbarem Wert und ermöglichen eine direkte und quantitative Messung mehrerer Aspekte der Peroxisomenbildung und Funktion6. Diese Sonden sind einerseits vielseitig genug, um eine quantitative Anzeige der Peroxisomenfunktion in Zellen zu liefern, andererseits in translationalen Wirksamkeitstests oder als Diagnostik für Peroxisomenerkrankungen6 eingesetzt zu werden. Die PeroxiSPY-Färbung ist eine schnelle, spezifische, nicht-zytotoxische Technik zur nicht-invasiven Nachweisung von Peroxisomen aus lebenden Zellen. Hier beschreiben wir, wie Peroxisome in Säugetierzelllinien mit Peroxisom-Sonden gefärbt werden können (die Sonden haben auch spezifische peroxisomale Färbungen in Zebrafisch-Embryonen gezeigt, sind jedoch nicht geeignet für die Färbung von Peroxisomen in Pflanzenzellen von Arabidopsis thaliana 6). Die Färbung kann in weniger als 10 Minuten erfolgen. Die Sonde kann dann stundenlang nachgewiesen oder mit einem Paraformaldehydfixierungsprotokoll zur weiteren Immunfärbung fixiert werden.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Färben lebender Zellen

  1. Zellkulturvorbereitung für die Lebendzellbildgebung (Dauer: 24 st.)
    HINWEIS: Die Studie folgte den standardisierten Zellkultivierungsprotokollen für alle Experimente. Die Zelllinien wurden in DMEM oder DMEM/F12 für SH-SY5Y erhalten, ergänzt durch 10 % fetales Rinderserum (FBS), 1 % Penicillin/Streptomycin bei 37 °C und 5 %CO2. Einige Bildgebungssysteme reagieren empfindlich auf die Zusammensetzung des Mediums. Wenn das Mikroskop das Signal von Phenolrot im Medium erkennt, verwenden Sie phenolrotfreie Alternativen. Zusätzlich, wenn das Mikroskop nicht mit einerCO2-Kammer ausgestattet ist, wird das Medium durch ein mit HEPES (pH 7,4) enthaltenes Medium ersetzt.
    1. Einen Tag vor dem Experiment werden die Zellen in eine Glasboden-Bildplatte aufgeteilt, um am nächsten Tag eine 30-70%ige Konfluenz zu erreichen.
      HINWEIS: In diesem Protokoll wurden 4-Well-35-mm-Platten verwendet.
      1. (Kritisch) Verwenden Sie keine ausgehungerten oder gestressten Zellen zur Spaltung für das Experiment. Stellen Sie sicher, dass die Zelllinien regelmäßig frische Medienwechsel haben (mindestens alle 2-3 Tage) und vor einer 90%igen Zusammenfluss getrennt werden. Das Ziel ist eine gesunde Zelllinie, um eine gleichmäßige Färbung zu gewährleisten.
        HINWEIS: Einige Zellen, z. B. Stammzellen, benötigen eine Glasbeschichtung mit einer geeigneten Schicht, z. B. Matrigel, die die Färbung nicht beeinträchtigt.
  2. Vorbereitung des Bildgebungs-Setups (Dauer: 1 St.)
    HINWEIS: Die Bildgebung von Organellen und Organellendynamik erfordert eine hohe räumliche Auflösung. Für dieses Protokoll wurde ein konfokales Mikroskop mit einem GaAsP-Photomultipliermodul, einerCO-2-Kammer und einer Temperaturkontrolleinheit verwendet. Die Bildgebung erfolgte mit einem bidirektionalen Galvanometer-Scanning-Modus mit einem CFI Plan Apo Lambda 60x Öl NA 1.42-Objektiv, und für die 555-Sonde wurde ein 561 nm Laser (50 mW) verwendet. Verwenden Sie einen 640-nm-Laser oder ein Äquivalent für die 650-Sonde. Peroxisome wurden in menschlichen Zelllinien visualisiert. Die Inkubationszeit mit den Sonden kann je nach Zelllinie unterschiedlich sein. Es wird empfohlen, das Timing zu optimieren, indem Zellen an verschiedenen Zeitpunkten nach der Färbung visualisiert werden (Abbildung 2A).
    1. Starte das Konfokalsystem. Stellen Sie sicher, dassCO2 und Temperatur (37 °C) für 20 Minuten stabilisiert sind, bevor Sie mit der Färbung beginnen und die Zellen dem Mikroskop vorgeführt werden.
      HINWEIS: (Kritisch) Es ist unerlässlich, durch visuelle Inspektion zu überprüfen, dass die Zellen während des gesamten Experiments gesund bleiben und dass pH-Wert sowie Temperatur des Mediums erhalten bleiben. Dies kann erreicht werden, indem Steuereinheiten für Parameter verwendet und die Medienfarbe visuell inspiziert werden, wenn Phenolrot verwendet wird. Dafür können Temperatur- undCO2-Regler verwendet werden.
    2. Richte die Konfokalmikroskop-Software ein. Starte die Software und schalte den 561-nm-Laser für die 555-Sonden-Färbung ein. Passen Sie die Parameter der Erfassung und Laserleistung an. Dieses Protokoll verwendet 1 % Laserleistung, eine HV (Verstärkung) von 100 und eine Auflösung von 1024 1024 Pixeln mit 3 Zoom, um die Zellen abzubilden.
  3. Peroxisomfärbung (Dauer: 1–5 Min)
    1. Pipettiere einen Aliquot der Sonde für eine endgültige Arbeitskonzentration von 1 μM, z. B. für 0,5 mL Medien, pipette 0,5 μL der Sonde.
    2. Wähle den Brunnen zum Beizen aus und beschrifte ihn außen mit einem Stift.
    3. Aus dem gewählten Bohrloch pipettieren Sie das gesamte (0,5 mL) Medium und geben Sie es in ein Mikrozentrifugenrohr mit der Sonde aliquot aus Schritt 1.3.1.
      HINWEIS: Es ist entscheidend, in diesem Schritt alle Medien aus dem Brunnen zu entfernen, um eine gleichmäßige Fleckung zu gewährleisten.
    4. Pipette dreimal hoch und runter, um das Medium und die Sonde zu mischen. Aspirieren Sie die gesamte Mischung in die Pipette.
      HINWEIS: Das Mischen durch Vortexing kann statt Pipettieren verwendet werden.
    5. Gib die Mischung Tropfen für Tropfen zurück in den gewählten Brunnen und stelle sicher, dass die Pipette Kontakt mit der Wand des Brunnens hat. Nachdem Sie die Mischung wieder in den Brunnen gegeben haben, starten Sie einen 10-minütigen Timer.
    6. Schließen Sie den Deckel, geben Sie einen Tropfen Tauchöl auf das Objektiv (dieses Protokoll verwendet 60× Ölobjektiv) und positionieren Sie die Platte auf dem Mikroskop zur Bildgebung.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, die Konzentration der Sonde für jede Zelllinie zu optimieren, um eine gleichmäßige Färbung zu gewährleisten. Tests bei 0,25, 0,5, 1 und 2 μM für 5–20 Minuten werden empfohlen; niedrigere Konzentrationen färben typischerweise mit dem unteren Hintergrund (Abbildung 2A). Je nach Empfindlichkeit der Zelllinie und des Mikroskopdetektors können gefärbte Zellen von etwa 5 Minuten nach der Zugabe der Sonde bis 24 Stunden nach der Zugabe abgebildet werden. In einigen Fällen, zum Beispiel bei der Bildgebung von Stammzellen, kann die Visualisierung der Zellen über 180 Minuten nach der Probe-Addition durchgeführt werden, ohne dass sich das Signal verändert. Zu jedem Zeitpunkt kann das Medium geändert werden, um die Sonde auszuwaschen. Das führt zu einem allmählichen Verlust der Färbung in etwa 30 Minuten für HEK293T Zellen.
  4. Konfokale Bildgebung von Peroxisomen in lebenden Zellen (Dauer: 10 Min–3 H)
    1. Sobald die Platte auf dem Mikroskop positioniert ist, richten Sie den Fokus auf die Zellen im gefärbten Brunnen und beginnen Sie mit der Bildgebung.
    2. Sobald die Zellen scharf sind, passen Sie die Verstärkung (HV- oder Detektorempfindlichkeit) und die Laserleistung anhand der standardmäßigen Konfokalmikroskop-Setup-Richtlinien an.
    3. Finde und positioniere (zoome ein) auf die Gruppe der Zellen. Nachdem Sie sich auf die Zellen konzentriert haben, passen Sie die Aufnahmeparameter an die gewünschte Bildqualität an.
      1. Stellen Sie die Bildparameter für die Bildaufnahme ein: 0,5–1 % Laserleistung, 100 HV (Verstärkung) in NIS-Elements Software. Überprüfen Sie, ob das Bild nicht übersättigt ist (falls doch, ändern Sie Intensität und Gain).
      2. Wählen Sie die Scangröße aus. Aufnahme von 1024 1024 px-Bildern, Scangeschwindigkeit (1/2-1/4), Linienmittelung (2), Zoom (3), entsprechend der für die durchgeführten Bildaufnahmen geeignet.
        HINWEIS: Peroxisome bewegen sich während der Bildaufnahme, was zu Artefakten führen kann. Empfohlene Parameter werden optimiert, um die Bewegungsspuren zu minimieren und gleichzeitig eine ausreichende Bildqualität für die Quantifizierung sicherzustellen. Beim Erstellen eines Zeitraffers sollten vor Beginn des Videos Intervall, Dauer und Schleifen angegeben werden. Die Sonden sind fotostabil.
    4. Erwerben und speichern Sie alle Bilder mit zugänglichen Labels (hier wird das .nd2 NIS-Elements Nikon Software Format verwendet).

2. Färbung fixierter Zellen

  1. Zellkulturvorbereitung für die Lebendzellbildgebung (Dauer: 24 st.)
    HINWEIS: Für alle Experimente wurden standardisierte Zellkultivierungsprotokolle befolgt. Huh7-Zellen wurden in DMEM/F12 erhalten, ergänzt mit 10 % FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin, bei 37 °C und 5 %CO-2.
    1. Einen Tag vor dem Experiment werden die Zellen mit Überlagen in eine Platte aufgeteilt, um am nächsten Tag eine Konfluenz von 30–70 % zu erreichen.
      HINWEIS: Säen Sie 50.000 Zellen/Bohrloch in 12-Bohrloch-Platten mit 18-mm-Überdeckungen oder 15.000 Zellen/Bohrloch in 24-Bohrloch-Platten mit 13-mm-Überdeckungen.
  2. Peroxisomfärbung (Dauer: 1–5 Min)
    1. Verdünnen Sie die Sonde mit neuen Medien auf eine endgültige Arbeitskonzentration von 4 μM in einer leeren, lichtempfindlichen Mikrozentrifugenröhre, z. B. für 0,5 mL Medium, pipettieren Sie 2 μL der Sonde (Standardlösung: 1 mM).
    2. Wähle den Brunnen zum Beizen aus und beschrifte ihn außen mit einem Filzstift.
    3. Aus dem gewählten Brunnen werden alle (0,5 mL) des Mediums abgesaugt und durch das Sondenmedium aus Schritt 2.2.1 ersetzt. Geben Sie das Sondenmedium Tropfen für Tropfen in den gewählten Brunnen und stellen Sie sicher, dass die Pipette mit der Wand des Bohrlochs in Kontakt steht.
    4. Nach dem Zurückgeben der Mischung in den Brunnen inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C 10–15 Minuten.
      HINWEIS: Ab diesem Zeitpunkt sind die Zellen lichtempfindlich und sollten mit Alufolie bedeckt werden.
  3. Nachfärbungsfixierung und Bildgebung von Peroxisomen in fixierten Zellen
    1. Nach der Färbung werden das Medium vorsichtig entfernt und die Zellen zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen.
    2. Trage 4%ige Paraformaldehydlösung (PFA) in PBS bei Raumtemperatur für 20 Minuten auf.
    3. Entferne PFA vorsichtig in einen speziell vorgesehenen Abfallbehälter. Wasche die Zellen einmal mit PBS.
      VORSICHT: PFA ist giftig und muss gemäß institutionellen Vorschriften entsorgt werden.
    4. Um mit der Immunfluoreszenz fortzufahren, folgen Sie den folgenden Schritten
      1. Fügen Sie 0,5 % Triton-X (verdünnt in PBS) hinzu, um die Zellen zu permeabilisieren. Gehen Sie 2,5 Minuten.
      2. Entferne vorsichtig Triton-X. Wasche die Zellen zweimal für 10 Minuten mit PBS.
      3. Blockieren Sie mit 5 % Rinderserum-Albumin (BSA)-Lösung in PBS für 20 Minuten bei Zimmertemperatur oder über Nacht bei 4 °C.
      4. Führen Sie das Standard-Immunfluoreszenzverfahren durch.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PeroxiSPY-Sonden sind so konstruiert, dass sie natürliche Substrate von Peroxisomen nachahmen – verzweigte und sehr langkettige Fettsäuren5. Daher führt die Färbung zu einem Adenosintriphosphat (ATP) Binding Cassette Subfamily D (ABCD)-abhängigen Import der Sonden aus dem Zytoplasma in die Peroxisome 5,6,7. Je nach Zellstoffwechselzustand kann der ATP-abhängige ABCD-Transport die Sonden effizient und schnell importieren, was zu einem hohen Peroxisom-zu-Zytoplasma-Verhältnis der Fluoreszenzintensität führt (Abbildung 1A). Wichtige Schritte, um ein hohes Verhältnis zu gewährleisten, sind die Vermeidung von Zellverhungern, indem man regelmäßig Zellmedien ersetzt und Zellen nicht bei hoher Zusammenfluss wachsen lässt.

Um die Spezifität der Peroxisom-Färbung zu überprüfen, wird empfohlen, mehrere Kontrollen einzubeziehen (Abbildung 1B,C). Kolokalisationsanalyse mit einem Referenz-peroxisomalen Marker, zum Beispiel dem Proteinimportmarker – GFP-SKL (Abbildung 1B,C). Zusätzlich, wenn peroxisome-defizitende Zelllinien verfügbar sind, z. B. PEX19 KO, fehlt die Färbung in diesen Zellen (Abbildung 1B)5,8.

Peroxisome-Sonden können zur Messung der Peroxisomendichte verwendet werden (Abbildung 1C)5,9 und werden entwickelt, um Substratimport, Peroxisomdynamik und Wechselwirkungen zu bewerten. Für quantitative Bildgebung ist es wichtig, das Färbeverfahren, den Zeitpunkt der Bildaufnahme (z. B. 10–20 Minuten nach der Färbung), die Zelllinienvorbereitung und die Erfassungsparameter zu standardisieren. Einige Zelllinien erfordern eine Optimierung der Sondenkonzentration sowie des Zeitpunkts, um die Signalintensität der Peroxisome im Vergleich zum zytosolischen Hintergrund zu verbessern, z. B. funktionieren 250 nM und 20 Minuten besser für COS-7-Zellen (Abbildung 2A). Die Zellen metabolisieren die Sonden, was im Laufe der Zeit zu einer allmählichen Verringerung der Peroxisomfärbung führt; das Verhältnis von Peroxisom zu Zytoplasma kann sich jedoch über 24 Stunden verbessern (Abbildung 2B). Zusätzlich entwickelten wir ein Fixationsverfahren, das eine Co-Färbung mit Antikörpern und die Visualisierung der Peroxisome zu einem späteren Zeitpunkt ermöglicht (Abbildung 2C,D).

figure-results-1
Abbildung 1: Lebendzellbildgebung von Peroxisomen. (A) Schematische Färbung. (B) Konfokalmikroskopie von WT und PEX19 KO HEK293T Zellen, die GFP-SKL überexprimieren und mit der roten Peroxisom-Sonde gefärbt werden (1 μM für 10 Minuten). Skalenbalken – 1 μm und 10 μm. Das repräsentative Intensitätsprofil wird gezeigt. (C) Konfokalmikroskopie menschlicher Fibroblasten, die GFP-SKL überexprimieren und mit PeroxiSPY gefärbt sind (1 μM für 10 Minuten). Skalenbalken – 1 μm und 10 μm. Das repräsentative Intensitätsprofil wird gezeigt. (D) Konfokalmikroskopie von SW13 (Nebennierenkortex), SH-SY5Y (Neuroblasten), CCL-136 (Myozyten), HaCat (Keratinozyten), U2OS (Osteoblasten) und HEK293T (Human Embryonale Kidney) Zellen, gefärbt mit der roten Peroxisom-Sonde (1 μM für 10 Minuten). Skalenbalken – 2 μm und 10 μm. Die Quantifizierung wurde mit Fidschi wie zuvor beschrieben9 durchgeführt und zeigt die Anzahl der Peroxisome pro Mikrometerquadrat, Mittelwert ± SEM, N = 100 Zellen, zusammengefasst aus 3 biologischen Wiederholungen, *** - p < 0,001, **** - p < 0,0001, Kruskal-Wallis-Test. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

figure-results-2
Abbildung 2: Optimierung der Peroxisomenbildgebung und Färbung fixierter Zellen. (A) Konfokalmikroskopie der COS-7-Zellen (Afrikanischer Grüner Affen-Nieren), gefärbt mit der roten Peroxisom-Sonde gemäß dem Protokoll (1 μM für 10 Minuten; vor der Optimierung) und unter optimierten Bedingungen (250 nM für 20 Minuten; nach der Optimierung). Skala – 10 μm. Die mittlere Pixelintensität von Peroxisomen und Zytosol wurde mittels Fiji quantifiziert und als Verhältnis angegeben. N = 7 Zellen (vor der Optimierung) und 21 Zellen (nach der Optimierung). Mittelwert ± SEM, *** - p < 0,001, **** - p < 0,0001, Shapiro-Wilks-Test. (B) Konfokalmikroskopie HEK293T Zellen, gefärbt mit der roten Peroxisom-Sonde (1 μM) für 15 Minuten und 24 Stunden. Die Quantifizierung zeigt die Fluoreszenzintensität von Peroxisomen und Zytoplasma sowie das Verhältnis von Peroxisom zu Cytoplasma, Mittelwert ± SEM, N = 680 Peroxisome, zusammengefasst aus 3 biologischen Wiederholungen, **** - p < 0,0001, Shapiro-Wilks-Test. (C) Konfokalmikroskopie von Huh7-Zellen, gefärbt mit Peroxisom-Sonden unter Verwendung des Fixationsprotokolls. Peroxisome wurden zusammen mit dem primären Anti-PEX14-Antikörper (1:100 in Blocklösung, 1 Stunde Inkubation bei RT) und sekundärer Antikörper (1:1000 in Blocklösung, Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 488, 1 Stunde Inkubation bei RT) gefärbt. Repräsentative konfokale Bilder werden gezeigt. Skalenbalken – 10 μm. (D) Die Quantifizierung zeigt die Veränderungen der Peroxisomen-Fluoreszenzintensität während der Fixierung und Permeabilisierung, die an HEK293T Zellen gemäß dem Protokoll durchgeführt wurden, Mittelwert ± SEM, N = 100 Zellen, zusammengefasst aus drei biologischen Wiederholungen, **** – p < 0,0001, Shapiro-Wilks-Test. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese einfache Peroxisomenerkennung kann in Tierzellen in weniger als 10 Minuten erfolgen. Die PeroxiSPY-Färbung ermöglicht die Visualisierung, Quantifizierung und Nachverfolgung von Peroxisomen in lebenden Zellen und ist als rote (Materialtabelle) und als fernrote Sonde5 (Materialtabelle) verfügbar. Die Färbung bietet eine ähnliche Peroxisom-Visualisierung wie eine klassische Peroxisom-Zielsignal-(PTS1)l-basierte Färbung10 (Abbildung 1B), ohne dass eine Überexpression erforderlich ist. Die Fluorophore sind fotostabil und können für Superauflösungsbildgebung und Langzeiterfassung der Peroxisomendynamik unter verschiedenen experimentellen Bedingungenverwendet werden 5,9,11. Außerdem sind die Sonden empfindlich gegenüber der Funktion des Peroxisomens; daher können sie zur Erkennung und Quantifizierung der Peroxisom-Pathologie5 für Forschungs- und Diagnoseanwendungen verwendet werden. Die Peroxisomenfärbung hängt vom Peroxisomstoffwechsel und der Fähigkeit der Peroxisome ab, Fettsäuren zu importieren und zu oxidieren. Daher ist es wichtig, die Konzentration und das Timing der verwendeten Zelllinien zu optimieren. Hier präsentieren wir ein Standardverfahren, das für die getesteten Zelllinien funktioniert; allerdings kann der Zeitpunkt der Färbung auf 24 Stunden verlängert werden, ohne dass das Fluoreszenz-Intensitätsverhältnis von Peroxisom zu Zytoplasma verloren geht (Abbildung 2B).

Die Sonden wurden in vielen Säugetierzelllinien getestet (Abbildung 1 und Abbildung 2) sowie in Zebrafisch-Danio-rerio-Zellen und Embryonen5, wobei sie Spezifität gegenüber Peroxisomen und einfache Anwendung zeigten. Diese Sonden wurden nicht in anderen tierischen Zelllinien getestet, und die Bedingungen sowie die Sondenkonzentrationen müssen für sie optimiert werden. Die Sonden färben keine Peroxisome in Pflanzenzellen von Arabidopsis thaliana 5.

Einige Probleme und ihre jeweiligen Lösungen zur Fehlersuche werden hier besprochen. Wenn das Verhältnis von Peroxisom zu Zytoplasma zu niedrig ist (niedrige Peroxisomenfärbung), stellen Sie sicher, dass die Zellen frisch gespalten sind, und teilen Sie sie dann erneut für die Färbung. Verwenden Sie 30-70 % Confluency für die Färbung. Optimieren Sie die Konzentration der Sonde (zu hohe Konzentration führt dazu, dass die Peroxisomenkapazität zur Aufnahme der Sonden überschritten wird) und das Timing (siehe zum Beispiel Abbildung 2A). Verwenden Sie eine 35-mm-Glasbodenschale (das Beizen in 96-Loch-Tellern ist wegen des geringen Mischens schwieriger). Stellen Sie sicher, dass die Sonden dem Mikrozentrifugenröhrchen hinzugefügt und vor der Zugabe an die Zellen gründlich mit dem Medium vermischt werden. Verschiedene Zelllinien und unterschiedliche Bedingungen beeinflussen die Färbung. Schließlich reduziert das Auswaschen der Sonde den Hintergrund; das Signal geht jedoch allmählich verloren, was die Zeit verkürzt, in der die Bildgebung effektiv durchgeführt werden kann.

Wenn keine sichtbaren Peroxisome vorhanden sind, stellen Sie sicher, dass die Sonde mit dem Medium vermischt wurde. Erhöhen Sie die Konzentration der Sonde (z. B. auf 2 μM). Fügen Sie einen zusätzlichen peroxisomalen Marker hinzu, um sicherzustellen, dass Peroxisome sichtbar werden können. Wenn es Zell-zu-Zell-Unterschiede bei der Färbung gibt, ist es wichtig, alle Medien zu entfernen und gründlich mit dem Aliquot zu mischen, bevor es wieder in die Zellen eingefügt wird. Das sorgt für gleichmäßige Flecken. Wenn es weiterhin Variation gibt, ist es möglich, dass die Zellpopulation in ihrer peroxisomen Substratimportkapazität heterogen ist. Die Synchronisation der Zellen durch regelmäßige Spaltung trägt zur gleichmäßigen Färbung bei. Wenn kein Signal erkannt wird, überprüfen Sie, ob die Lasereinstellungen des Mikroskops mit den Anregungs-/Emissionsparametern der Sonde kompatibel sind. Wenn der Hintergrund außerhalb der Zelle zu hell ist, werden die Sonden ausgewaschen, um diesen Hintergrund zu entfernen; das Signal geht jedoch allmählich verloren, wodurch das Zeitfenster, in dem die Bildgebung effektiv durchgeführt werden kann, verkürzt wird. Zusätzlich kann Fixierung genutzt werden, um den Hintergrund zu reduzieren. Wenn das Signal nach der Fixierung sehr schwach ist, prüfen Sie, ob das Signal nach der Addition von Triton-X 100 verloren geht. Dieser Schritt kann je nach nachgelagerter Anwendung modifiziert oder entfernt werden. Reduzieren Sie Waschschritte.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LR besitzt Anteile an der Spirochrome AG. Alle anderen Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken dem School of Biological Sciences Imaging and Microscopy Centre (IMC) für den Zugang zu wichtigen Geräten. TA wurde durch das HFSP Long-term Fellowship (LT000559/2021-L), die University of Southampton, das Wessex Medical Research Innovation Grant und die European Leukodystroph Association (ELA) finanziert. Der MS wird vom ELISIR-Programm der EPFL School of Life Sciences, der Stiftung Bryn Turner-Samuels und der Fondation Bios pour la recherche unterstützt. CH wurde durch das Sommerstipendium der Royal Microscopical Society finanziert. REC wird durch ein Discovery Fellowship des Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/Z514767/1) unterstützt. MSvA wurde durch ein Sommerferienstipendium der Biochemical Society unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Anti-PEX14-AntikörperProteintech10594-1-AP
KonfokalmikroskopNikonA1rJedes konfokale Mikroskop mit hohem NA-Objektiv, z. B. 60x Öl NA1.4
DMEMPan Biotech  P04-03590Zellkulturmedien
Glasboden-BildplattenCellvisD35C4-20-1.5-N
Ziegen-Anti-Kaninchen-Alexa Fluor 488 ABCAMab150081
HEK293TATCCCRL-3216 
PeroxiSPY555Spirochromhttps://spirochrome.com/product/peroxi_spy555/  https://doi.org/10.1038/s41467-024-48679-2
PeroxisPY650Spirochromhttps://spirochrome.com/product/peroxi_spy650/  https://doi.org/10.1038/s41467-024-48679-2

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kassmann, C. M. Myelin peroxisomes - essential organelles for the maintenance of white matter in the nervous system. Biochimie. 98, 111-118 (2014).
  2. van den Bosch, H., Schutgens, R. B., Wanders, R. J., Tager, J. M. Biochemistry of peroxisomes. Annu Rev Biochem. 61, 157-197 (1992).
  3. Aubourg, P., Wanders, R. Peroxisomal disorders. Handb Clin Neurol. 113, 1593-1609 (2013).
  4. Honsho, M., Okumoto, K., Tamura, S., Fujiki, Y. Peroxisome biogenesis disorders. Adv Exp Med Biol. 1299, 45-54 (2020).
  5. Korotkova, D., et al. Fluorescent fatty acid conjugates for live cell imaging of peroxisomes. Nat Commun. 15, 4314(2024).
  6. Bezman, L., Moser, H. W. Incidence of X-linked adrenoleukodystrophy and the relative frequency of its phenotypes. Am J Med Genet. 76 (5), 415-419 (1998).
  7. Visser, W. F., van Roermund, C. W., Ijlst, L., Waterham, H. R., Wanders, R. J. Metabolite transport across the peroxisomal membrane. Biochem J. 401 (2), 365-375 (2007).
  8. Matsuzono, Y., et al. Human PEX19: cDNA cloning by functional complementation, mutation analysis in a patient with Zellweger syndrome, and potential role in peroxisomal membrane assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (5), 2116-2121 (1999).
  9. Borisyuk, A., Howman, C., Pattabiraman, S., Kaganovich, D., Amen, T. Protein Kinase C promotes peroxisome biogenesis and peroxisome-endoplasmic reticulum interaction. J Cell Biol. 224 (9), e202505040(2025).
  10. Gould, S. G., Keller, G. A., Subramani, S. Identification of a peroxisomal targeting signal at the carboxy terminus of firefly luciferase. J Cell Biol. 105 (6 Pt 2), 2923-2931 (1987).
  11. Lukinavicius, G., et al. A near-infrared fluorophore for live-cell super-resolution microscopy of cellular proteins. Nat Chem. 5 (2), 132-139 (2013).

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Peroxisomen SondenLive Cell ImagingPeroxisomen DynamikFluoreszenzsondenPeroxisomen DysfunktionImmunfluoreszenzf rbungPeroxisomen QuantifizierungFixzellf rbung

Verwandte Artikel