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Methodenartikel

Modellierung tumorassoziierter Makrophagen in vitro: Die Rolle sekretierter Faktoren in der Dynamik der Tumormikroumgebung

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DOI:

10.3791/69406

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30. Dezember 2025

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1Instituto de Farmacología, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires, 2Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), 3Instituto de Medicina Experimental (IMEX), CONICET, Academia Nacional de Medicina

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Manuskript präsentiert ein in-vitro-Protokoll zur Erzeugung tumorassoziierter, makrophagenähnlicher Zellen, indem menschliche Monozyten konditionierten Medien von Tumorzelllinien ausgesetzt werden.

Zusammenfassung

Makrophagen zeigen eine bemerkenswerte Plastizität, die es ihnen ermöglicht, als Reaktion auf verschiedene Umweltsignale unterschiedliche funktionelle Zustände zu erreichen. In soliden Tumoren bilden sie häufig die häufigste Immunzellpopulation innerhalb der Tumormikroumgebung, wo sie als tumorassoziierte Makrophagen (TAMs) bezeichnet werden. TAMs interagieren eng mit bösartigen Zellen und fördern so aktiv das Tumorwachstum, die Angiogenese und die Immunausweichung. Tumorzellen können Makrophagen durch direkten Zellkontakt und eine Vielzahl ausgeschiedener Faktoren umprogrammieren, wodurch ihre Polarisation in Richtung pro-tumorale Phänotypen geformt wird. Um diese TAM-Polarisationsmechanismen in vitro zu untersuchen, schlagen wir eine Methode vor, bei der menschliche Monozyten löslichen Faktoren ausgesetzt werden, die in tumorlinienkonditionierten Medien vorhanden sind. Dieses Protokoll ermöglicht die Erzeugung von TAM-ähnlichen Makrophagen unter kontrollierten Bedingungen und erleichtert die Analyse phänotypischer und funktioneller Veränderungen, die durch tumorabgeleitete Signale induziert werden. Unser Ansatz bietet ein reproduzierbares und physiologisch relevantes Modell zur Untersuchung von Tumor-Makrophagen-Interaktionen, vertieft unser Verständnis der Makrophagen-Reprogrammierung und unterstützt die Forschung zu neuartigen therapeutischen Strategien in der Krebsimmunologie und Immuntherapie.

Einleitung

Makrophagen sind multifunktionale angeborene Immunzellen, deren bemerkenswerte Plastizität es ihnen ermöglicht, vielfältige Phänotypen als Reaktion auf Umweltsignaleanzunehmen. Innerhalb solider Tumore werden Makrophagen oft zur häufigsten Immunzellpopulation und differenzieren sich zu tumorassoziierten Makrophagen (TAMs)2. Diese Zellen werden vom Tumormikromilieu aktiv umprogrammiert, um das Tumorwachstum zu unterstützen, Angiogenese zu fördern, Metastasen zu fördern und wirksame antitumorale Immunantworten zu unterdrücken. Tumorzellen treiben diese Polarisation sowohl durch direkte Cell-Zell-Interaktionen als auch durch ein komplexes Repertoire ausgeschiedener Faktoren voran, darunter Zytokine, Chemokine und Wachstumsfaktoren, die die transkriptionellen und funktionellen Programme der Makrophagen umgestalten3. Dieses dynamische Zusammenspiel untermauert die zentrale Rolle der TAMs in der Krebsbiologie und hebt die Makrophagenplastizität sowohl als Herausforderung als auch als Chance für therapeutische Interventionen hervor2.

Die klinische Relevanz von TAMs wird zunehmend anerkannt: Ihre Häufigkeit in Tumoren korreliert oft mit schlechter Prognose und Therapieresistenz 4,5. Daher haben sich TAMs6 als attraktive therapeutische Ziele etabliert. Strategien, die darauf abzielen, ihre Rekrutierung zu blockieren, ihr Überleben zu hemmen oder sie in Richtung entzündlicher und tumorzidaler Phänotypen umzuprogrammieren, werden derzeit untersucht6. Das Verständnis der Mechanismen, durch die tumorabgeleitete Faktoren Makrophagen zu TAMs polarisieren, ist daher entscheidend für die Entwicklung wirksamer Immuntherapien. Während die Immunkontrollpunkt-Blockade bei vielen Krebsarten großen Erfolg gezeigt hat, bleibt ihre Wirksamkeit bei anderen begrenzt7. Die Kombination von T-Zell-gezielten Therapien, wie Anti-Programmed Cell Death Protein 1 (PD-1) oder Anti-Programmed Cell Death Ligand 1 (PDL-1) Antikörpern, mit Makrophagen-Reprogrammierungsstrategien kann die gesamte antitumorale Immunantwort verbessern.

Traditionelle experimentelle Modelle zur Untersuchung der TAM-Biologie umfassen in vivo Mauskrebs-Modelle, die eine komplexe und physiologisch relevante Umgebung bieten8. Diese Modelle haben grundlegende Einblicke in die Rekrutierung und Funktion von TAM geliefert. Signifikante Unterschiede zwischen Arten in der Immunsignalübertragung, Tumorbiologie und Makrophagenontogenese können jedoch die direkte Übersetzung zur menschlichen Krankheit 9,10 einschränken. Darüber hinaus macht die Komplexität von In-vivo-Systemen es schwierig, spezifische Signalwege oder molekulare Ereignisse zu isolieren und zu untersuchen, die die Makrophagenpolarisation antreiben.

Im Gegensatz dazu bieten In-vitro-Modelle einfachere und kontrollierte Bedingungen zur Analyse dieser Mechanismen. Der am weitesten verbreitete Ansatz besteht darin, humane, von Monozyten abgeleitete Makrophagen mit definierten Reizen zu polarisieren: Interferon gamma (IFN) und bakterielles Lipopolysaccharid (LPS), um pro-inflammatorische Makrophagen (M1) zu erzeugen, oder Interleukin 4 (IL-4) und Interleukin 10 (IL-10), oder Dexamethason, um verschiedene antiinflammatoriske Makrophagen (M2) zu erhalten: 11,12,13,14. Diese Modelle haben geholfen, molekulare Marker und Transkriptionsprogramme zu identifizieren, die mit kanonischen Makrophagenpolarisationszuständen assoziiert sind. Dennoch verfehlen sie es, das komplexe, multifaktorielle Milieu zu replizieren, das Makrophagen in Tumoren ausmachen, wo Polarisation durch den gleichzeitigen Einfluss zahlreicher löslicher Mediatoren, metabolischer Signale und Zell-zu-Zell-Interaktionen15,16 resultiert. Obwohl die klassische M1/M2-Klassifikation weiterhin nützlich ist, um funktionale Makrophagenzustände zu beschreiben, ist inzwischen klar, dass es deutlich mehr Makrophagenpopulationen gibt als bisher angenommen. Die Arbeit von Dr. Ginhoux' Gruppe und anderen, die einzellige transkriptomische Ansätze einsetzt, hat die große Vielfalt der Makrophagen-Untergruppen sowohl unter physiologischen Bedingungen als auch bei Krankheiten17,18 demonstriert. Dies verdeutlicht, dass TAMs, obwohl sie oft M2-ähnliche Profile ähneln, nicht streng mit Makrophagen gleichgesetzt sind, die ausschließlich mit kanonischen Zytokinen differenziert sind; vielmehr teilen sie bestimmte Merkmale, zeigen aber auch deutliche und kontextabhängige Unterschiede.

Um diese Lücke zu schließen, präsentieren wir ein in-vitro-Protokoll, das TAM-ähnliche Polarisation modelliert, indem humane, von Monozyten abgeleitete Makrophagen einem konditionierten Medien, das aus Tumorzelllinien gesammelt wird, ausgesetzt wird. Diese Methode erfasst den Einfluss des Tumorsekretoms, einer reichen Mischung aus Zytokinen, Chemokinen und Wachstumsfaktoren, die von Krebszellen ausgeschieden werden. Es bietet somit ein relevantes und experimentell zugängliches System zur Untersuchung der phänotypischen und transkriptionellen Umprogrammierung von Makrophagen als Reaktion auf tumorabgeleitete lösliche Faktoren. Im Gegensatz zu früheren Ansätzen, bei denen Monozyten direkt tumorbedingten Medien ausgesetzt waren, konzentriert sich dieses Protokoll speziell auf die Umprogrammierung von Makrophagen und spiegelt so das Verhalten der residenten Makrophagen innerhalb der Tumormikroumgebungbesser wider. Zusätzlich enthält es ein optimiertes und unkompliziertes Panel von Oberflächenmarkern zur Bestimmung der Makrophagenpolarisation mittels Durchflusszytometrie, was leicht umzusetzen ist und je nach Bedarf des Forschers erweitert werden kann 14,21. Schließlich haben wir, da gezeigt wurde, dass M-CSF Monozyten auf einen M2-ähnlichen Phänotyp 10,15,22,23,24 vorbereitet, ihn bewusst weggelassen, um sicherzustellen, dass jede beobachtete Makrophagepolarisation speziell durch die Exposition gegenüber von Tumorzelllinien abgeleiteten konditionierten Medien verursacht wird.

Dieser Ansatz hat mehrere Stärken: Er bewahrt die Reproduzierbarkeit und Einfachheit von In-vitro-Systemen, nutzt primäre menschliche Zellen für größere translationale Relevanz und spiegelt die heterogene, multifaktorielle Natur der Tumormikroumgebung besser wider als Einzelzytokin-Modelle 25,26,27,28. Darüber hinaus erleichtert es vergleichende Studien der Makrophagenantworten auf konditionierte Medien verschiedener Tumortypen oder gentechnisch veränderter Krebszellen und dient als Plattform zur Untersuchung pharmakologischer Wirkstoffe, die die TAM-Polarisation verändern können. Über ihre allgemeine Anwendbarkeit hinaus kann diese Methode auf verschiedene Tumormodelle angepasst werden, indem geeignete Zelllinien ausgewählt oder der Anteil konditionierter Medien angepasst wird. Dennoch sollten Nutzer sich bewusst sein, dass Variabilität zwischen gesunden Spendern und Tumorzelllinien die Reproduzierbarkeit beeinflussen kann, was die Bedeutung sorgfältiger experimenteller Planung und Standardisierung unterstreicht.

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Protokoll

Periphere Blutproben wurden von gesunden Spendern nach informierter Einwilligung gemäß der Helsinkier Erklärung entnommen. Dieses Protokoll wurde vom institutionellen Ethikkomitee der Universität Buenos Aires genehmigt. Siehe die Materialtabelle für Details zu allen Materialien und Reagenzien, die in diesem Protokoll verwendet werden.

HINWEIS: Sterile Bedingungen während des gesamten Protokolls aufrechterhalten, arbeiten Sie in einem Biosicherheits-Level-2-Kabinett (BSL-2) und gewährleisten Sie die Zelllebensfähigkeit >90%. Zur Entsorgung müssen alle biologischen Abfälle zunächst durch mindestens 30 Minuten in einer 10%igen Natriumhypochloritlösung entkontaminiert und anschließend in den entsprechenden Bio-Hazard-Entsorgungsbehälter gelegt werden.

1. Tumorzelllinienkultur und konditionierte Medienvorbereitung

  1. Tauen Sie die MDA-MB-231 dreifach-negative menschliche Brustkrebszelllinie (oder einen anderen ausgewählten Tumor) aus flüssigem Stickstoff auf. Tauchen Sie Kryoröhren mit Zelllinien sofort in ein 37 °C Wasserbad und bewegen Sie das Fläschchen sanft, um ein schnelles und gleichmäßiges Auftauen zu gewährleisten. Entfernen Sie das Fläschchen umgehend, wenn es größtenteils aufgetaut ist.
  2. Übertragen Sie die aufgetauten Zellen in ein 15-ml-Zentrifugationsrohr mit 5 ml steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 400 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur (RT).
    HINWEIS: Der Auftauprozess muss schnell durchgeführt werden, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten.
  3. Entsorgen Sie das Supernatant vorsichtig und suspendieren Sie das Zellpellet schnell in 1 ml frisches, vollständiges Dulbeccos modifiziertes Eagle Medium (DMEM), das einen hohen Glukosewert (4,5 g/L) mit 10 % fetalem Rinderserum (FBS), 4 mM Glutamin und 1 mM Natriumpyruvat enthält. Zählen Sie die Zellen im resuspendierten Pellet und führen Sie folgende zweistufige serielle Verdünnung durch:
    1. Zuerst bereiten Sie eine 1:5-Zell-Suspensionsverdünnung in sterilem DMEM-Medium vor und dann (1:2) mit der Viabilitätsfarbe Trypan Blue, um eine endgültige Verdünnung von 1:10 zu erzielen.
    2. Verwenden Sie ein Lichtmikroskop, um die lebensfähigen Zellen im Neubauer-Hämozymeter (oder Zählkammer) zu zählen. Zähle lebensfähige Zellen (nur Zellen, die den blauen Farbstoff ausschließen) und bestimme die durchschnittliche Anzahl lebensfähiger Zellen pro großem Eckquadrat.
    3. Berechnen Sie die Endkonzentration mit folgender Formel: Zellen/mL = (Durchschnittliche Zellen pro Quadrat) x (Verdünnungsfaktor) x 10.000.
      HINWEIS: Die Zellen in einem gewünschten Volumen vollständigen DMEM-Mediums wieder suspendieren, um eine Endkonzentration von 1x 105 Zellen/mL zu erhalten.
  4. Samen 2,5 x 105 bis 5,0 x 10Zellen in einen T25-Kulturkolben mit 5 ml vollständigem DMEM-Medium. Halten Sie die Kultur bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2, bis die erforderliche Zelldichte für die Ernte erreicht ist.
  5. Am nächsten Tag nach der Aussaat überprüfe die Zellbindung unter dem Mikroskop. Wenn mehr als 50 % der Zellen schwimmen (was auf Zelltod hinweist), aspirieren Sie das alte Medium vorsichtig und ersetzen Sie es durch 2,5 ml frisches, vorgewärmtes Medium.
  6. Überwachen Sie das Zellwachstum täglich. Wenn die Kultur etwa 90 % Konfluenz erreicht (geschätzt 2,3 x 106 Zellen in einem T25-Kolben), sind die Zellen typischerweise innerhalb von 5 Tagen bereit, subkultiviert (geteilt) zu werden. Um die Zellen im Verhältnis 1:8 zu teilen, folgen folgende Schritte:
    1. Entfernen Sie das verbrauchte Medium mit einer sterilen Pasteur-Pipette.
    2. Spülen Sie die Zellmonoschicht einmal mit 3 ml sterilem 1x PBS, um das Restserum zu entfernen, das Trypsin hemmt. Aspirieren und 1x PBS entsorgen.
    3. Geben Sie den Zellen 1 ml 0,25 % Trypsin – 1 mM Ethylendiaminetetraessigsäure (EDTA) und inkubieren Sie bei 37 °C, 5 % CO2in einem befeuchteten Inkubator für 3 Minuten, um die Zellen abzulösen.
      HINWEIS: Die optimale Inkubationszeit mit Trypsin/EDTA hängt von der spezifischen Zelllinie ab und muss gegebenenfalls angepasst werden. Untersuchen Sie die Zellen nach 3 Minuten unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass sie vollständig abgelöst sind.
    4. Neutralisieren Sie die enzymatische Aktivität durch Zugabe von 3 ml vollständigem DMEM-Medium. Unmittelbar danach pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um die Zellen vollständig abzulösen und aufzuhängen.
  7. Übertragen Sie 3,5 ml der Zellsuspension in ein 15 mL konisches Rohr und zentrifugieren Sie es 5 Minuten bei 400 x g bei RT.
  8. Entfernen Sie vorsichtig das Supernatant und suspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml Gefriermedium (das 90 % FBS plus 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO) enthalten muss. Transfert und aliquotiert die Zellsuspension in Kryoviale, wobei eine Konzentration von 5 x 105 Zellen pro Röhre für die zukünftige Verwendung gewährleistet ist.
    1. Das Einfrieren muss schrittweise abgekühlt werden, indem die Kryoviale in einen Mr. Frosty (oder einen ähnlichen kontrollierten Gefrierbehälter) gelegt werden. Bringen Sie den Behälter in einen Gefrierschrank von -80 °C und lassen Sie die Zellen über Nacht einfrieren. Die Zellen können einige Tage bei -80 °C gehalten werden, sollten dann aber zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff umgestellt werden.
      HINWEIS: Führen Sie detaillierte Aufzeichnungen über Zellpassagen und verwenden Sie frühe Passagen für Experimente. Es wird empfohlen, Zellen mit weniger als 20 Durchgängen zu verwenden.
  9. Sobald neue Kulturen wieder ~90 % Konfluenz erreichen, aspirieren und sammeln Sie Supernatant in einem 15-mL konischen Rohr. Wenn Sie die Kultur am Laufen halten möchten, ersetzen Sie das gesammelte Volumen durch ein frisches, vollständiges DMEM-Medium.
    1. Zentrifugieren Sie das gesammelte Supernatant bei 400 × g für 5 Minuten bei 4 °C, um Zellreste zu pelletieren und Zellreste zu entfernen. Bewahre das Supernatant (das klarisierte, konditionierte Medium) auf und entsorge das Pellet.
  10. Aliquot das geklärte, konditionierte Medium in 1-mL-Portionen, beschrifte die Röhren und lagere sie bis zur Nutzung bei -20 °C.
    HINWEIS: Zur Qualitätskontrolle sollten Sie stets das Datum der bedingten Mediensammlung und die Bestätigung des Aliquots aufzeichnen, ob der Aliquot bereits aufgetaut wurde. Es wird dringend empfohlen, dasselbe Aliquot nicht mehr als zweimal aufzutauen. Außerdem sollten Sie die Konditionierung innerhalb eines Monats nach dem Einfrierdatum verwenden, um die optimale Aktivität sicherzustellen.

2. Isolierung peripherer mononukleärer Blutzellen (PBMCs)

HINWEIS: PBMCs werden aus 40 ml peripherem Blut isoliert, das mit 3,8 % Natriumcitrat antikoaguliert ist. Die Isolierung erfolgt unter Verwendung eines Ficoll-Hypaque-Dichtegradienten (1077) und Zentrifugation. Dieses gesamte Protokoll muss unter sterilen Bedingungen in einem BSL2-Gehäuse durchgeführt werden.

  1. Aliquot die antikoagulierte periphere Blutprobe in ein 15 mL oder 50 mL konisches Rohr vor dem bevorstehenden Zentrifugationsschritt.
  2. Zentrifugiere Blutproben mit niedriger Geschwindigkeit, 200 × g für 15 Minuten bei RT, um die Blutbestandteile zu trennen. Dieser Prozess erzeugt plättchenreiches Plasma (PRP) als oberste Schicht und die zelluläre Fraktion (rote und weiße Blutkörperchen) darunter. Verwenden Sie eine Zentrifugeneinstellung: Beschleunigung: 4 und Abbremsung: 2, wenn die maximale Einstellung 5 beträgt.
  3. Nach der Zentrifugation wird das Überstandsmittel (der obere Anteil), also das PRP, abgesaugt und in ein neues steriles Rohr übertragen.
    HINWEIS: Bei Bedarf für nachgelagerte Experimente kann das gesammelte PRP erneut bei 600 × g bei RT für 10 Minuten (maximale Beschleunigung und Verzögerung) zentrifugiert werden, um die Thrombozyten zu entfernen, und das Plasma ohne Thrombozyten bei -20 °C für weitere Tests zu speichern.
  4. Der zelluläre untere Anteil, der durch die anfängliche Zentrifugation in Schritt 2 gewonnen wurde, sollte sanft auf ein 2- bis 3-faches Endvolumen mit sterilem, raumtemperaturmäßigem 1x PBS verdünnt werden. Homogenisieren Sie sanft durch Inversion der resultierenden Suspension und verwenden Sie sie für die Ficoll-Hypaque-Dichtegradientenzentrifugation.
  5. Gib 15 ml Zimmertemperatur-Ficoll-Hypaque in ein steriles 50-mL-Rohr.
  6. Schichten Sie vorsichtig und langsam 30 ml verdünntes Blut über den Ficoll-Hypaque, um sicherzustellen, dass sich die beiden Phasen nicht vermischen.
  7. Zentrifugiere das Ficoll-Blut-Schichtrohr für 25 Minuten bei 600 × g bei RT. Stelle die Zentrifuge ohne Bremse ein (Beschleunigung: 1; Verzögerung: 0).
  8. Verwenden Sie eine sterile Pasteur-Pipette, um mindestens 4 mL der gewonnenen oberen Fraktion zu entsorgen und ein Verschütten zu vermeiden. Anschließend wird dieselbe Pipette verwendet, um den weißen Ring mit den PBMCs zu gewinnen, der zwischen dem oberen Anteil und dem Ficoll-Hypaque-transparenten Anteil gebildet wird. Vermeide es, Ficoll mit dem PBMC-Ring zu sammeln.
  9. Übertragen Sie den PBMC-Ring aus dem Rohr in ein steriles 15-mL-Zentrifugenrohr mit mindestens 3 mL 1x PBS.
  10. Fülle die 15-ml-Röhre mit mehr 1x PBS und zentrifugiere bei 600 × g (maximale Beschleunigung und Verzögerung) für 10 Minuten bei RT.
  11. Entfernen Sie das Supernatant durch Inversion, füllen Sie erneut mit 1x PBS auf und zentrifugieren Sie mit 600 × g (maximale Beschleunigung und Verzögerung) für 10 Minuten bei RT.
  12. Entfernen Sie das Supernatant und suspendieren Sie das PBMC-Pellet erneut in 2 bis 3 ml steriles 1x PBS plus 2 % hitzeinaktiviertes FBS (1x PBS-2 % FBS), dann erhöhen Sie das Volumen auf 10 mL. Zähle die Zellen, bereite eine 1:5-Zellsuspension vor, die in steriler, kaltem 1x PBS verdünnt wird und dann (1:2) in 0,4% Trypan Blue verdünnt wird, um eine endgültige Verdünnung von 1:10 zu erhalten. Verwenden Sie eine Zellkammer an einem Lichtmikroskop, wie in Schritt 1.3.2 beschrieben, zum Zählen.
  13. Drehen Sie die PBMC-Aufhängung auf 300 × g für 5 Minuten bei 8-10 °C. Die Zellen in einem gewünschten Volumen steriler, kalter 1x PBS-2% FBS neu suspendieren, um eine Endkonzentration von 108 Zellen/mL zu erhalten. Lassen Sie diese Zellen bis zum nächsten Schritt bei 4 °C.
    HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt können gesammelte PBMCs in einem kryogenen Fläschchen mit 108 Zellen/mL in Gefriermedium (90 % FBS-10 % DMSO) eingefroren werden. Lagere über Nacht bei -80 °C in einem Mr. Frosty-Behälter, damit die Zellen langsam einfrieren. Am nächsten Tag werden die Zellen in eine Aufbewahrungsbox umgefüllt und ein paar Tage bei -80 °C gelassen oder für eine längere Lagerung in ein flüssiges Stickstoffbecken gebracht oder das Protokoll fortgesetzt.

3. CD14+-Monozytensortierung mit magnetischen Perlen

HINWEIS: Gereinigte CD14+-Monozyten werden aus PBMC mit einem humanen CD14+ positiven Selektions-Magnetsortierset11 gewonnen. Der Zellanteil von CD14+ in PBMC ist donorabhängig, kann aber auf 10 % geschätzt werden (zwischen 5 und 20 %). Passe die anfängliche Anzahl der PBMC und die endgültigen Reaktionsvolumina basierend auf der erforderlichen Anzahl der Monozyten für dein Experiment an. Das empfohlene minimale Reaktionsvolumen beträgt 100 μL, selbst bei der Verarbeitung von weniger als 1 × 107 PBMC .

  1. Fügen Sie 10 μL des positiven Selektionscocktails für jeweils 100 μL PBMCs hinzu, pipetten Sie auf und ab und lassen Sie sie 15 Minuten auf dem Eis stehen.
  2. Wirbeln Sie die Perlen 30 Sekunden lang auf, bevor sie verwendet werden. Dann fügen Sie 10 μL der Perlen pro 100 μL PBMC-Suspension hinzu. Gut mischen und 15 Minuten auf Eis inkubieren.
  3. Gib 1x PBS – 2 % FBS – 1 mM EDTA zu einem Endvolumen von 2,5 mL hinzu, mische die Suspension vorsichtig und führe das Rohr auf den Magneten ein und inkubiere es 5 Minuten.
  4. Wenden Sie den Magneten (ohne das Rohr zu entfernen) für 2-3 Sekunden über ein Empfängerrohr zu werfen, um jegliche Bewegungen zu vermeiden. Positive Zellen bleiben im Rohr.
  5. Nimm die Röhre aus dem Magneten und gib 1x PBS – 2 % FBS – 1 mM EDTA über die Röhrenwände, bis das Endvolumen 2,5 ml erreicht.
  6. Führe das Rohr erneut in den Magneten ein und inkubiere es 5 Minuten.
  7. Wenden Sie den Magneten (ohne das Rohr zu entfernen) für 2-3 Sekunden über ein Empfängerrohr zu werfen, um jegliche Bewegungen zu vermeiden. Holen Sie die Röhre vom Magneten und geben Sie 3 ml 1x PBS-2% FBS über die Röhrenwände, um alle Zellen zurückzugewinnen.
  8. Nehmen Sie 10 μL, um die Anzahl der CD14+-Zellen in einer Neubauer-Kammer mit Lichtmikroskop zu zählen. Verdünnen Sie mit Trypan Blue 1:2.
    HINWEIS: Berechnen Sie die Anzahl der Zellen gemäß dieser Gleichung: Anzahl der CD14+-Zellen = Medienanzahl lebender Zellen pro Quadranten x Verdünnungsfaktor x 10,000.
  9. Setzen Sie die CD14+-Zellsuspension in ein neues, steriles 15-ml-Rohr und waschen Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 600 × g (maximale Beschleunigung und Verzögerung) für 10 Minuten bei 4 °C.
  10. Suspendiere CD14+-Zellen mit einem RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin (P/S) komplettem Medium in einem geeigneten Volumen, um für den nächsten Schritt 2,5 x 106 Zellen/mL zu erhalten, unter Berücksichtigung der gewonnenen Zellanzahl.
    HINWEIS: Halten Sie die CD14+-Monozyten bis zum nächsten Schritt auf Eis, um eine Anhaftung dieser Zellen an der Kunststoffröhrenwand zu vermeiden.

4. Differenzierung von Makrophagen

  1. Plattenreinigung CD14+-Monozyten mit 2,5 x 105 Zellen, suspendiert in 250 μL vollständigem RPMI-Medium (10 % FBS-1 % PS) pro Bohrloch in einer 48-Well-behandelten Platte.
    HINWEIS: Es kann auch mit der Hälfte der Anzahl von Zellen in einer 96-gut behandelten Platte durchgeführt werden.
  2. Gib steriles Wasser zu den umliegenden leeren Brunnen, um die Verdunstung während der Platteninkubation zu reduzieren.
  3. Inkubieren Sie die Zellen 5 Tage lang bei 37 °C mit 5 % CO₂ in einem befeuchteten Inkubator ohne Störung und überwachen Sie täglich Morphologie, Differenzierung und Lebensfähigkeit.
    HINWEIS: Obwohl M-CSF (25 ng/mL) zur Differenzierung hinzugefügt werden kann, bestätigen wir, dass unser Protokoll ausschließlich 10 % hochwertiges FBS verwendet, um nach fünf Tagen Kultur M0-Makrophagen zu erhalten. Wir empfehlen ausdrücklich, M-CSF zu vermeiden, da es Monozyten auf einen M2-ähnlichen Phänotyp10,22 vorbereiten kann.

5. Exposition von Makrophagen gegenüber konditionierten Medien und Analyse

  1. Am Tag 5 der Differenzierung entfernen Sie vorsichtig 50 % (125 μL) des Mediums aus jedem Bohrloch und ersetzen Sie durch entweder:
    1. 125 μL frisches RPMI-Komplettmedium (Steuerung),
    2. 125 μL Tumorzelllinienkonditioniertes Medium (z. B. von MDA-MB-231), oder
    3. 125 μL DMEM-Komplettmedium (Steuerung für konditionierte Medien).
      HINWEIS: Für die anfängliche Optimierung mit neuen Tumorzelllinien wird eine Reihe konditionierter Medienkonzentrationen getestet (z. B. 10 %, 25 % und 50 %). Dieser Bereich wird vorgeschlagen, um die Lebensfähigkeit der Makrophagen und Veränderungen in der Differenzierung sicherzustellen. Wählen Sie die höhere Konzentration konditionierter Medien, die eine hohe Makrophagenlebensfähigkeit zeigt.
  2. Inkubation bis Tag 7 fortsetzen.
    HINWEIS: Am Tag 5 werden M0-Makrophagen gewonnen, danach reichen zwei weitere Tage Kultur in Anwesenheit konditionierter Medien aus, um die Expression von Oberflächenpolarisationsmarkern zu induzieren. Polarisationsflächenmarker werden durch Durchflusszytometrie bestimmt, ähnlich wie bei der Verwendung standardisierter Zytokine zur Erzeugung von M1- oder M2-Makrophagen11,14.
  3. Bewerten Sie täglich die Lebensfähigkeit und Morphologie der Makrophagen unter dem Mikroskop.
    HINWEIS: Überwachen Sie die Makrophagendifferenzierung täglich über den 7-tägigen Kulturzeitraum. Die Zelladhärenz dient als Indikator für eine gesunde, lebensfähige Kultur. Ein höherer Anteil fusiformer Zellen deutet auf eine erhöhte Differenzierung und Polarisation in der behandelten Behandlungsgruppe für konditionierte Medien (CM) hin, wie in Abbildung 2 dargestellt.

6. Makrophagen zur Bewertung der Polarisationsmarker mittels Durchflusszytometrie ernten

HINWEIS: Optional, um die Phänotypcharakterisierung tumorassoziierter Makrophagen weiter zu erweitern, sollte RNA isoliert werden, um die Expression polarisationsassoziierter Gene (z. B. TGM2, IRF-4 und CXCL10) durch quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) zu messen, oder die Kultursupernatanten zur Messung der kanonischen Zytokinproduktion (z. B. TNFα, IL-6 und IL-10) durch einen enzymgebundenen Immunsorbent-Test (ELISA) zu isolieren, wie von unserer Gruppe11 berichtet, 14.

  1. Entsorge es durch vorsichtiges Aspiratieren mit einer sterilen Pasteur-Pipet oder kippe das gesamte Kulturmedium jedes Bohrlochs und füge 200 μL kalten 1x PBS-2% FBS-1 mM EDTA-Puffer für die Zellentnahme hinzu.
  2. Inkubiere 10 bis 15 Minuten auf Eis und gib dann 200 μL 1x PBS-2% FBS hinzu, um den EDTA-Puffer zu verdünnen. Sammle die Makrophagen, indem du auf und ab pipettiere (immer noch auf Eis) für weitere 5 Minuten, bis alle Zellen abgetrennt sind.
    HINWEIS: Dieser Schritt ist entscheidend, um eine gute Anzahl lebensfähiger Makrophagen zu erhalten. Es ist wichtig, die Zeit unter EDTA-Exposition nicht mehr als empfohlen zu verlängern, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten. Überprüfen Sie die Zellen nach Abschluss des Eingriffs unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass sie vollständig abgelöst sind.
  3. Sammeln Sie Makrophagen auf einem 1,5 ml Mikrorohr und waschen Sie sie mit 1 ml 1x PBS-2% FBS durch Zentrifugation bei 400 × g für 5 Minuten bei 8–10 °C.
  4. Das Makrophagen-Pellet mit 200 μL 1x PBS-5% FBS neu suspendieren und es auf eine 96-Well-Mikroplatte mit rundem Boden für unspezifische Blockierung bei RT für 15 Minuten übertragen. Zentrifugiere die Zellen bei 400 x g für 5 Minuten bei 8-10 °C.
  5. Entsorge das Supernatant, indem du die Platte schnell umdrehst.
  6. Bereiten Sie den passenden Cocktail direkt konjugierter Antikörper in 1x PBS-2% FBS mit einem Verdünnungsfaktor von 1:50 pro Antikörper vor. Färben Sie jede Probe mit 50 μL des Antikörpercocktails und inkubieren Sie 30 Minuten im Dunkeln auf Eis.
    HINWEIS: Antikörper-Cocktail: CD11b-PE/Cy7 (200 μg/mL), CD64-AlexaFluor 647 (150 μg/mL), CD163-PerCP/Cy5,5 (200 μg/mL), HLADR-PE (40 μg/mL) und CD206-AlexaFluor 488 (400 μg/mL). Die Prä-Kitzel-Antikörperkonzentration ist in Tabelle 1 aufgeführt; Katalognummern sind in der Materialtabelle zu finden.
  7. Waschen Sie die gefärbten Makrophagen, indem Sie 150 μL 1x PBS hinzufügen, und zentrifugieren Sie bei 400 × g für 5 Minuten bei 8-10 °C.
  8. Entsorge das Supernatant, indem du die Platte schnell umdrehst.
  9. Um die Lebensfähigkeit der Zellen zu messen, fügen Sie 100 μL des fixierbaren Lebensfähigkeitsfarbemittels Zombie Violet (1:1.000 in 1x PBS) hinzu und brüten Sie 30 Minuten im Dunkeln auf Eis.
  10. Waschen Sie die gefärbten Zellen, indem Sie 100 μL 1x PBS hinzufügen und bei 400 x g für 5 Minuten bei 8-10 °C zentrifugieren. Wiederholen Sie das Waschverfahren mit 200 μL 1x PBS.
  11. Beheben Sie, indem Sie das Zellpellet mit 20 μL frisch vorbereitetem 1%-Paraformaldehyd neu suspendieren und es 20 Minuten lang auf Eis und im Dunkeln inkubieren.
    HINWEIS: 1 % Paraformaldehyd wurde zur Fixierung ohne Permeabilisierung verwendet. Optional: Die kommerzielle Fixativkomponente (aus dem BD-Fixativ-/Permeabilisierungskit) kann für diesen Schritt11 ebenfalls verwendet werden.
  12. Waschen Sie die Zellen, indem Sie 180 μL 1x PBS-2% FBS hinzufügen und mit 400 x g für 5 Minuten bei 8-10 °C zentrifugieren. Wiederholen Sie das Waschverfahren mit 200 μL 1x PBS-2% FBS.
  13. Entsorgen Sie Supernatant durch Platteninversion und suspendieren Sie das Pellet in 200 μL 1x PBS, um es zur Messung an die Durchflusszytometrieausrüstung zu bringen.
    HINWEIS: Wenn gefärbte und fixierte Proben nicht am selben Tag durch Durchflusszytometrie durchgeführt werden können, lagern Sie sie bei 4 °C und schützen Sie sie vor Licht. Analysieren Sie die Proben so bald wie möglich an den folgenden Tagen.
  14. Analysieren Sie die Ergebnisse der Durchflusszytometrie mit der Software FlowJo. Die Gating-Strategie beginnt damit, Trümmer mithilfe von Vorwärts- und Seitenstreuung (FSC/SSC) auszuschließen. Anschließend werden lebende Makrophagen als CD11b⁺ Zombie-Violettzellen ausgewählt.
    HINWEIS: Da Autofluoreszenz in Makrophagen donorabhängig ist, ist es wichtig, für jedes Experiment Kontrollen aus demselben Spender zu verwenden.

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Ergebnisse

Wir erzeugten dreifach-negative Brustkrebstumor-assoziierte Makrophagen (TAM)-ähnliche Zellen, indem wir monozytenabgeleitete Makrophagen mit 50 % konditioniertem Medium (CM) aus der MDA-MB-231-Zelllinie behandelten. Monozyten wurden aus peripheren mononuklearen Blutzellen (PBMC) von sechs unabhängigen gesunden Spendern sortiert und nach unserem Protokoll differenziert. Die CM-Präparation nutzte MDA-MB-231-Zellen bei 90 % Konfluenz (Abbildung 1).

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Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll bietet einen reproduzierbaren und praktischen Ansatz zur Untersuchung tumorassoziierter makrophagenähnlicher Polarisation, indem humane, monozytenabgeleitete Makrophagen dem von der Tumorzelllinie konditionierten Medien ausgesetzt werden. Dieses System erfasst den Einfluss löslicher Faktoren, die von Tumorzellen ausgeschieden werden und dafür bekannt sind, eine entscheidende Rolle bei der Makrophagen-Reprogrammierung

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte, die offengelegt werden müssen.

Danksagungen

Wir erkennen die finanzielle Unterstützung der Nationalen Agentur zur Förderung von Wissenschaft und Technologie (ANPCyT-FONCYT) durch Fördermittel PICT 2021 I-INVI-00034 (an DR), PICT 2021-I-A-00807 (an E.A.C.S.) und PICT 2021-I-A-00716 (an A.E.E.) an. Wir danken außerdem dem Nationalen Wissenschaftlichen und Technischen Forschungsrat (CONICET) für den Zuschuss PIP 2022-0763 und der Universität Buenos Aires für PIDAE 2022, der an A.E.E. vergeben wurde.

M.C.L. erhielt ein Legado Peruilh-Stipendium von der Medizinischen Fakultät der Universität Buenos Aires und ist Inhaber eines ANPCyT-FONCYT-Doktorstipendiums. D.R., E.A.C.S. und A.E.E. sind Berufsforscher bei CONICET.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Alexa Fluor 488 Maus-Anti-Mensch  CD206 Antikörperklon 15-2BioLegend, San Diego, CA, USA.Katze# 321113; RRID:AB_571874
Alexa Fluor 647 Maus-Antihuman-CD64-Antikörperklon 10.1BioLegend, San Diego, CA, USA.Katze# 305012; RRID:AB_528867
BD Cytofix/CytopermBD Biosciences, San Jose, CA, USAKatze# 554714Fixativ-/Permeabilisierungs-Kit
Dulbeccos modifiziertes Eagle Medium (DMEM), hoher GlukosespiegelGibco  Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA Katze# 11965092
EasySep Human CD14 Positive Selektionskit; EasySep Positive Selection Cocktail; EasySep magnetische Nanopartikel; Easy Sep MagnetSTEMCELL Technologies, Vancouver, KanadaKat# 18058
FACS Canto Zytometer Becton Dickinson, Franklin Lakes, New Jersey, USA.
Fetales Rinderserum, qualifiziert, Neuseeland Gibco & Handel;   Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA Katze# 10091148
Ficoll-Paque PLUS CytivaGE Healthcare – Life Sciences, USAKatze# 17144003
FlowJoFlowJo LLC.RRID:SCR_008520
GraphPad Prism   GraphPad Software Inc.RRID:SCR_002798
Partec CyFlow Space Cytometer Sysmex Partec, Deutschland
PE Anti-Mensch HLA-DR Antikörperklon L243BioLegend, San Diego, CA, USA.Katze# 307605; RRID:AB_314683
PE/Cy7 Ratten-Antimaus/menschlicher CD11b-Antikörperklon M1/70BioLegend, San Diego, CA, USA.Katze# 101216; RRID:AB_312799
PerCP/Cy5.5 Maus-antihumaner CD163-Antikörperklon GHI/61BioLegend, San Diego, CA, USA.Katze# 333607; RRID:AB_1134006
RPMI 1640 MittelGibco  Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA Katze# 11875119
NatriumpyruvatlösungSigma-Aldrich Merck, San Luis, MO, USA. Cat#  S8636
Trypsin-EDTA (0,25 %), PhenolrotGibco  Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA Katze# 25200056
Zombie Violet Reparierbares Brauchbarkeits-SetBioLegend, San Diego, CA, USA.Katze# 423113

Referenzen

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