Schnelle magnetische Mikrobead-Methode zur effizienten Aufreinigung von Neutrophilen niedriger Dichte

Summary

Neutrophile niedriger Dichte (LDN) nehmen bei mehreren Krankheiten signifikant zu. LDN werden in der Regel durch Zellsortierung isoliert. Wir stellen eine praktische Methode vor, um reines und lebensfähiges LDN zu erhalten. Nach der Dichtegradientenzentrifugation von peripherem Blut werden die Zellen mit magnetischen Mikrokügelchen inkubiert und dann LDN durch magnetische Säulen getrennt.

Abstract

Neutrophile, wichtige Leukozyten der angeborenen Immunität, gelten traditionell als homogene Zellpopulation. Nichtsdestotrotz haben neuere Erkenntnisse gezeigt, dass Neutrophile in mehreren Subpopulationen vorkommen. Eine solche Subpopulation sind Neutrophile mit niedriger Dichte (LDN). LDN kommen in geringer Zahl im Blut gesunder Personen vor, aber ihre Anzahl steigt bei Krankheiten wie systemischem Lupus erythematodes, Autoimmunerkrankungen, Krebs und Infektionen deutlich an. In diesen Fällen kann LDN an der Pathogenese der Krankheit beteiligt sein. Die einzige Möglichkeit, LDN zu isolieren, ist die Dichtegradientenzentrifugation des peripheren Blutes. Nach der Zentrifugation co-reinigen LDN jedoch mit mononukleären Zellen. Daher ist die Untersuchung dieser neutrophilen Subpopulation eine Herausforderung. Es gibt keine Standardmethodik zur Trennung von LDN von mononukleären Zellen. Typischerweise werden LDN durch Zellsortierung in einem Durchflusszytometer getrennt. Diese Methode erfordert jedoch lange Sortierzeiten (Stunden), um genügend reine Zellen für weitere funktionelle Studien zu erhalten. Dies beeinträchtigt die Lebensfähigkeit und Funktion der Zellen erheblich. Hier schlagen wir eine praktische Methode vor, um in kurzer Zeit große Mengen an reinem und lebensfähigem LDN zu erhalten. Nach der Dichtegradientenzentrifugation wird die mononukleäre Zellfraktion mit magnetischen Anti-CD66b-Mikrokügelchen inkubiert, und dann werden LDN in < 30 Minuten durch magnetische Säulen getrennt. Aufgereinigte LDN (CD66b⁺ -Zellen) werden mit monoklonalen Antikörpern gegen CD10, CD11b, CD14, CD15, CD16b, CD33, CD62L, CD66b und CD98 markiert und zur Bestätigung durchflusszytometrisch analysiert. Aufgereinigte LDN sind vollständig funktionsfähig, was sich in ihrer Fähigkeit zeigt, reaktive Sauerstoffspezies zu produzieren und extrazelluläre Fallen für neutrophile Embryonen zu bilden. Diese neue Reinigungsmethode führt in kurzer Zeit zu LDN mit hoher Reinheit (mehr als 90 %) und Lebensfähigkeit (mehr als 96 %). Diese Methode kann leicht skaliert werden, um große Mengen an reinem LDN zu erhalten, um die LDN-Funktionen bei verschiedenen Krankheiten durch biochemische oder andere Omics-Analysen zu bewerten.

Introduction

Neutrophile, die vorherrschenden Leukozyten im menschlichen Blut¹, sind wichtige Akteure des angeborenen Immunsystems. Sie gelangen in großer Zahl in Gewebe mit Entzündungen oder Infektionen². Dort aktivieren Neutrophile verschiedene Effektorfunktionen, wie z.B. Phagozytose ^3,4, Degranulation ^5,6 und Bildung von extrazellulären Fallen (NETs) für Neutrophile7. Darüber hinaus sind Neutrophile auch an der adaptiven Immunantwort beteiligt

Protocol

Alle Verfahren in diesem Protokoll folgen den Richtlinien der Bioethikkommission für die Humanforschung am Instituto de Investigaciones Biomédicas - Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM). Alle Teilnehmer gaben eine Einverständniserklärung.

1. Isolierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) und Neutrophilen aus menschlichem Blut

1. Gewinnen Sie etwa 10 ml Blut von einem gesunden erwachsenen Freiwilligen durch Venenpunktion. Fügen Sie 10 U/ml Heparin als Antikoagulans hinzu.
   ACHTUNG: Entsorgen Sie die Nadel in einem Entsorgungsbehälter für Biogefahrennadeln. Spritzen und ....

Results

Neutrophile Zellen niedriger Dichte (LDN) bei gesunden Personen machen etwa 5 % der PBMC aus (Abbildung 2A). Das hier beschriebene Protokoll liefert in der Regel reines LDN (> 90 %). Die Zellen werden auch effizient zurückgewonnen (Ausbeute um 98 %) mit hoher Lebensfähigkeit (> 95 %; Abbildung 2B). Zum Vergleich wurden LDN auch durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung aufgereinigt, wie zuvor be.......

Discussion

Im Allgemeinen wurden Neutrophile als homogene Zellen angesehen. Neuere Erkenntnisse haben jedoch gezeigt, dass Neutrophile als Zellen mit unterschiedlichen Aktivierungszuständen und/oder mehreren Phänotypen existieren können. So können verschiedene neutrophile Subpopulationen existieren 13,14,15. Eine Neutrophilen-Subpopulation, die Neutrophilen niedriger Dichte (LDN), hat aufgrund ihrer besond.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Citrullin-Kaninchen-Polyklonal-Antikörper	AbCam	ab100932	1/50 Verdünnung
96-Well-Gewebekulturplatte	Costar; Corning, Inc.	3596
Alexa Fluor 488 antihumaner CD11b-Maus-IgG1-Antikörper	BioLegend	301317	0,25 μ g/mL
Alexa Fluor 647 anti-menschlicher CD66b-Maus-IgM-Antikörper	BioLegend	305109	0,05 μ g/mL
Anti-Maus IgG (H+L) Ziegenantikörper, Alexa Fluor 488	Invitrogen – Thermo Fisher Scientific	A-11001	1/50 Verdünnung
Anti-Neutrophil-Elastase-Maus-monoklonaler IgG1-Antikörper	Santa Cruz Biotechnologie	SC-55549	10 & Mikro; g/mL
Anti-Kaninchen-IgG (H+L) Esel-Antikörper, Alexa Fluor 555	Invitrogen – Thermo Fisher Scientific	A-31572	1/50 Verdünnung
APC-antihumaner CD62L-Maus-IgG1-Antikörper	BioLegend	304809	0,03 μ g/mL
APC/Cyanin7 antihumaner CD14-Maus-IgG1-Antikörper	BioLegend	367107	0,25 μ g/mL
Attune NxT Flow Cytometer	Thermo Fisher Scientific, Inc.	(blau/rote Laser)
Rinderserumalbumin (BSA) Fraktion V	MP Biomedizin	810025
Brilliant Violet 510 anti-menschlicher CD33-Maus-IgG1-Antikörper	BioLegend	366609	0,30 μ g/mL
DAPI	Calbiochem/EMD Millipore	268298
Dextran T500	Pharmakosmos Klimaanlage	5.51005E+11
Dihydrorhodamin-123	Anaspec, Inc.	AS-85711
FACS-Zellsortierer	Becton Dickinson	Modell FACSAria
Fetales Rinderserum (FBS)	Gibco	16000-044
Ficoll-Paque	Merck KG	GE 17-1440-03
FITC-Antihuman-CD98-Maus-IgG1-Antikörper	BioLegend	315603	0,30 μ g/mL
FlowJo Software	Becton Dickinson	Version 10, 2019
Fluoreszenz-invertiertes Mikroskop	Olympus	Modell IX-70
Heparin	Inhepar - PiSA Farmaceutica	3660149	5000 UI/mL
Hepes	Sigma Aldrich	H7006
MACSprep Chimerism CD66b Mikroperlen	Miltenyi Biotec	130-111-552
Magnet	Miltenyi Biotec	130-042-102
Magnetische Trennsäule	Miltenyi Biotec	130-042-201
Mikrozentrifuge	Eppendorf	Modell 5415C
Mikroplatten-Leser	BioTek-Instrumente	Modell Synergie HT
Paraformaldehyd	Sigma Aldrich	158127
PE anti-menschlicher CD10-Maus-IgG1-Antikörper	BioLegend	312203	0,05 μ g/mL
PE anti-menschlicher CD16b-Maus-IgG2a-Antikörper	BD Pharmingen	550868	1/40 Verdünnung
PE/Cyanin5-antihumaner CD15-Maus-IgG1-Antikörper	BioLegend	323013	0,25 μ g/mL
Phorbol 12-Myristat 13-Acetat (PMA)	Sigma Aldrich	P8139
poly-L-Lysin	Sigma Aldrich	P2658
Gekühlte Zentrifuge	Eppendorf	Modell 5702R
RPMI-1640 Gewebekulturmedium	Gibco	23400-021
SYTOX Green	Molekulare Sonden, Inc.	S-7020
Tween-20	Sigma Aldrich	P2287
Vectashield	Vektorlabore	H-1000