Method Article

Schnelle magnetische Mikrobead-Methode zur effizienten Aufreinigung von Neutrophilen niedriger Dichte

DOI:

10.3791/69407

⸱

November 11th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Departamento de Inmunología, Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neutrophile niedriger Dichte (LDN) nehmen bei mehreren Krankheiten signifikant zu. LDN werden in der Regel durch Zellsortierung isoliert. Wir stellen eine praktische Methode vor, um reines und lebensfähiges LDN zu erhalten. Nach der Dichtegradientenzentrifugation von peripherem Blut werden die Zellen mit magnetischen Mikrokügelchen inkubiert und dann LDN durch magnetische Säulen getrennt.

Abstract

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Neutrophile, wichtige Leukozyten der angeborenen Immunität, gelten traditionell als homogene Zellpopulation. Nichtsdestotrotz haben neuere Erkenntnisse gezeigt, dass Neutrophile in mehreren Subpopulationen vorkommen. Eine solche Subpopulation sind Neutrophile mit niedriger Dichte (LDN). LDN kommen in geringer Zahl im Blut gesunder Personen vor, aber ihre Anzahl steigt bei Krankheiten wie systemischem Lupus erythematodes, Autoimmunerkrankungen, Krebs und Infektionen deutlich an. In diesen Fällen kann LDN an der Pathogenese der Krankheit beteiligt sein. Die einzige Möglichkeit, LDN zu isolieren, ist die Dichtegradientenzentrifugation des peripheren Blutes. Nach der Zentrifugation co-reinigen LDN jedoch mit mononukleären Zellen. Daher ist die Untersuchung dieser neutrophilen Subpopulation eine Herausforderung. Es gibt keine Standardmethodik zur Trennung von LDN von mononukleären Zellen. Typischerweise werden LDN durch Zellsortierung in einem Durchflusszytometer getrennt. Diese Methode erfordert jedoch lange Sortierzeiten (Stunden), um genügend reine Zellen für weitere funktionelle Studien zu erhalten. Dies beeinträchtigt die Lebensfähigkeit und Funktion der Zellen erheblich. Hier schlagen wir eine praktische Methode vor, um in kurzer Zeit große Mengen an reinem und lebensfähigem LDN zu erhalten. Nach der Dichtegradientenzentrifugation wird die mononukleäre Zellfraktion mit magnetischen Anti-CD66b-Mikrokügelchen inkubiert, und dann werden LDN in < 30 Minuten durch magnetische Säulen getrennt. Aufgereinigte LDN (CD66b+ -Zellen) werden mit monoklonalen Antikörpern gegen CD10, CD11b, CD14, CD15, CD16b, CD33, CD62L, CD66b und CD98 markiert und zur Bestätigung durchflusszytometrisch analysiert. Aufgereinigte LDN sind vollständig funktionsfähig, was sich in ihrer Fähigkeit zeigt, reaktive Sauerstoffspezies zu produzieren und extrazelluläre Fallen für neutrophile Embryonen zu bilden. Diese neue Reinigungsmethode führt in kurzer Zeit zu LDN mit hoher Reinheit (mehr als 90 %) und Lebensfähigkeit (mehr als 96 %). Diese Methode kann leicht skaliert werden, um große Mengen an reinem LDN zu erhalten, um die LDN-Funktionen bei verschiedenen Krankheiten durch biochemische oder andere Omics-Analysen zu bewerten.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neutrophile, die vorherrschenden Leukozyten im menschlichen Blut1, sind wichtige Akteure des angeborenen Immunsystems. Sie gelangen in großer Zahl in Gewebe mit Entzündungen oder Infektionen2. Dort aktivieren Neutrophile verschiedene Effektorfunktionen, wie z.B. Phagozytose 3,4, Degranulation 5,6 und Bildung von extrazellulären Fallen (NETs) für Neutrophile7. Darüber hinaus sind Neutrophile auch an der adaptiven Immunantwort beteiligt8. Die klassische Sichtweise von Neutrophilen betrachtet sie als homogene Zellen, die im Knochenmark produziert werden und auf die sie vorbestimmt reagieren, 9,10. Neuere Studien zeigen jedoch, dass Neutrophile heterogene Zellen mit mehreren phänotypischen und funktionellen Zuständen sowohl im gesunden als auch im Krankheitszustand sind 11,12,13,14,15.

Unter den verschiedenen Neutrophilen-Subpopulationen haben die Neutrophilen niedriger Dichte (LDN) aufgrund ihrer intrinsischen Eigenschaften und weil ihre Zahl bei mehreren Krankheiten zunimmt, großes Interesse geweckt 16,17,18. LDN wurden 1986 im Blut von Patienten mit systemischem Lupus erythematodes (SLE) gefunden19. Sie wurden nach dem Verfahren zur Trennung von Leukozyten in einem Dichtegradienten20,21 nachgewiesen. Nach der Zentrifugation von Blut oder leukozytenreichem Plasma auf einem Dichtemedium (z. B. Ficoll-Paque) bilden Monozyten und Lymphozyten (bekannt als mononukleäre Zellen des peripheren Blutes [PBMC]) eine Bande im oberen Teil (niedriger Dichte) des Röhrchens. Neutrophile Sedimente sedimentieren am Boden der Röhre. Unter den PBMC wurden auch einige Neutrophile gefunden; dies sind LDN (Abbildung 1). Eine geringe Anzahl von LDN befindet sich im Blut gesunder Personen22. Die LDN-Zahlen steigen jedoch bei mehreren Immunsuppressions- und chronischen Entzündungszuständen signifikant an, darunter SLE23,24, Sepsis25, Psoriasis26, Asthma27, juvenile idiopathische Arthritis28, anti-neutrophile zytoplasmatische Antikörper (ANCA)-assoziierte Vaskulitis29, HIV-Infektion30, Malaria31 und Tuberkulose32. Obwohl die LDN-Zahlen bei allen genannten Pathologien zunehmen, wurden LDN hauptsächlich im Zusammenhang mit SLE17 untersucht. LDN aus dem Blut von SLE-Patienten scheint eine größere Kapazität zu haben, NETszu bilden 33, große Mengen an proinflammatorischen Mediatoren zu sezernieren34 und T-Zellenzu aktivieren 24. Bei anderen Erkrankungen, wie z. B. Krebs, besteht LDN jedoch aus reifen und unreifen Neutrophilen35 mit T-Zell-suppressiven Eigenschaften 36,37,38. In ähnlicher Weise wird bei COVID-19-Patienten berichtet, dass LDN auch die T-Zell-Proliferation unterdrückt39, aber im Gegensatz zu SLE scheint LDN weniger NETs zu produzieren39. Daher sind Herkunft, Zusammensetzung und funktionelle Eigenschaften von LDN nach wie vor umstritten.

Da LDN zusammen mit PBMC gefunden werden, ist ihre Untersuchung technisch kompliziert. Um die LDN-Eigenschaften bei verschiedenen Pathologien vollständig zu erforschen, ist es notwendig, sie zu reinigen. Ein gängiges Verfahren der LDN-Trennung ist die Fluoreszenzzellsortierung 22,40,41,42,43,44,45. Die Zellsortierung benötigt jedoch eine lange Zeit für die Zelltrennung. Dies kann zu Zellverlust oder geringer Wiederfindung führen, wenn die Sortierzeit nicht ausreicht. Darüber hinaus werden die Zellen übermäßig belastet, was zu unterschiedlichen Ergebnissen bei der Untersuchung der Funktion dieser Zellen führt. Lange Sortierzeiten erhöhen auch die Kosten für experimentelle Verfahren und erfordern spezialisiertes Personal.

Hier stellen wir eine schnelle und effiziente Methode vor, mit der in sehr kurzer Zeit große Mengen an reinen und lebensfähigen humanen LDN gewonnen werden können. Nach der Dichtegradientenzentrifugation werden LDN durch magnetische Zellsortierung (MACS; Abbildung 1). Der Hauptvorteil dieser Reinigungsmethode besteht darin, dass LDN mit hoher Reinheit (mehr als 90 %) und Lebensfähigkeit (mehr als 96 %) getrennt werden. Außerdem sind gereinigte LDN vollständig funktionsfähig, was durch ihre Fähigkeit zur Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und zur Freisetzung von NETs angezeigt wird. Dieses Protokoll kann leicht in jedem Labor implementiert werden, das sich für die Biologie von Neutrophilen interessiert, um LDN schnell aus dem Blut von Menschen mit mehreren Krankheiten zu trennen und diese Zellen weiter zu untersuchen.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle Verfahren in diesem Protokoll folgen den Richtlinien der Bioethikkommission für die Humanforschung am Instituto de Investigaciones Biomédicas - Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM). Alle Teilnehmer gaben eine Einverständniserklärung.

1. Isolierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) und Neutrophilen aus menschlichem Blut

  1. Gewinnen Sie etwa 10 ml Blut von einem gesunden erwachsenen Freiwilligen durch Venenpunktion. Fügen Sie 10 U/ml Heparin als Antikoagulans hinzu.
    ACHTUNG: Entsorgen Sie die Nadel in einem Entsorgungsbehälter für Biogefahrennadeln. Spritzen und andere Materialien, die mit Blut in Berührung kommen, sollten vor der Entsorgung in einen Beutel gelegt und autoklaviert werden.
  2. In ein konisches Zentrifugenröhrchen mit 15 ml werden 2 ml 6 % Dextran T500 in PBS gegeben. Fügen Sie dann 10 ml Blut hinzu, indem Sie es an der Seite des Röhrchens abtropfen lassen. Drehen Sie das Röhrchen ein paar Mal um, um das Blut und das Dextran zu mischen.
  3. Lassen Sie die Röhre 45 Minuten ruhen, während sich die Erythrozyten sedimentieren. Das leukozytenreiche Plasma tritt oberhalb der Erythrozytenschicht auf.
  4. In ein weiteres 15-ml-Zentrifugenröhrchen geben Sie 5 mL Dichtegradientenmedium hinzu. Pipettieren Sie das Plasma vorsichtig, ohne die Erythrozyten zu berühren, und schichten Sie es auf das Medium. Es müssen zwei getrennte Phasen gebildet werden.
  5. Das Röhrchen bei 516 x g für 20 min bei 4 °C zentrifugieren. Mononukleäre Zellen (PBMC) bilden eine Bande zwischen dem Plasma und den Medienschichten. Neutrophile bilden am Boden ein Pellet (Abbildung 1).
  6. Isolierung von PBMC
    1. Eliminieren Sie durch Aspiration das Plasma auf dem PBMC, ohne die Zellen zu berühren. Sammeln Sie die Zellen aus der Bande zwischen dem Plasma und dem Medium. Achten Sie darauf, so wenig Medium wie möglich anzusaugen.
    2. Legen Sie die Zellen in ein konisches 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie 20 ml PBS hinzu. Das Röhrchen bei 400 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
    3. Saugen Sie den Überstand vorsichtig ab und kratzen Sie das Röhrchen ab, um die Zellen zu trennen. Fügen Sie 10 ml kaltes PBS hinzu, um die Zellen zu resuspendieren. Zählen Sie die PBMC mit einer Neubauer-Kammer.
      HINWEIS: Verwenden Sie keine Pipette, um die Zellen zu resuspendieren, da dies die Zellen beschädigen kann.
  7. Isolierung von Neutrophilen
    1. Entfernen Sie den Dichtegradienten Mittel. Trennen Sie die Zellen, indem Sie das Röhrchen abkratzen und fügen Sie 10 ml kaltes PBS hinzu.
    2. Die Zellen in ein frisches 50 mL Zentrifugenröhrchen geben und bei 400 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Den Überstand aspirieren und die Zellen wie in Schritt 1.6.3 beschrieben trennen.
  8. Um verbleibende Erythrozyten zu beseitigen, fügen Sie 10 ml kalte hypotone Lösung (0,2 % NaCl, 1 % BSA, 20 mM Hepes, pH = 7,4) hinzu und mischen Sie vorsichtig genau 1 Minute lang.
  9. Fügen Sie schnell 10 ml kalte hypertonische Lösung (1,6 % NaCl, 1 % BSA, 20 mM HEPES, pH = 7,4) hinzu, um die Lösung isotonisch zu machen.
  10. Zählen Sie die Neutrophilen mit einer Neubauer-Kammer (Reinheit > 95%). Die Zellen werden durch Zentrifugieren wie in Schritt 1.6.2 granuliert. und resuspendieren Sie sie in kaltem PBS. Halten Sie den Schlauch auf Eis.
    HINWEIS: Es wird berichtet, dass die Halbwertszeit von Neutrophilen in vitro 8 - 12 h 46,47,48 beträgt. Nach unseren Erfahrungen mit diesem Protokoll behalten Neutrophile ihre Funktionen für etwa 6 bis 8 Stunden bei.

2. Aufreinigung von Neutrophilen niedriger Dichte (LDN)

  1. PBMC bei 400 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Überstand entfernen und Zellen in 120 μl Kaltwaschpuffer (1 % BSA in PBS) resuspendieren.
  2. Fügen Sie 35 μl magnetische Mikrokügelchen CD66b hinzu. Die Mischung im Dunkeln bei 4 °C 30 min inkubieren. Alle 10 Minuten vorsichtig mischen, um eine Zellaggregation zu verhindern.
  3. Fügen Sie 1 ml Kaltwaschpuffer hinzu. Die Zellen in eine Mikrozentrifuge geben und 3 Minuten lang bei 400 x g drehen.
  4. Entfernen Sie den Überstand, trennen Sie das Zellpellet durch Abkratzen des Röhrchens und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml Waschpuffer.
  5. Setzen Sie eine magnetische Trennsäule auf einen Magneten. Geben Sie 0,5 ml Waschpuffer in die Säule und lassen Sie ihn durch die Säule laufen.
  6. Übertragen Sie die Zellen (1 ml) auf die Säule. Lassen Sie den Puffer die Spalte Tropfen für Tropfen durchlaufen.
  7. Geben Sie 0,5 mL Waschpuffer in die Säule und lassen Sie ihn passieren. Geben Sie weitere 0,5 ml Waschpuffer in die Säule.
  8. Nehmen Sie die Säule vom Magneten und legen Sie sie in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie 1 ml Waschpuffer in die Säule.
  9. Setzen Sie den Kolben oben auf die Säule ein und üben Sie vorsichtig Druck aus, um die Zellen zu eluieren. Entfernen Sie den Kolben und setzen Sie die Säule auf ein neues Mikrozentrifugenröhrchen.
  10. Fügen Sie weitere 1 ml Waschpuffer hinzu. Setzen Sie den Kolben oben auf die Säule ein und üben Sie vorsichtig Druck aus, um die Zellen zu eluieren.
  11. Legen Sie beide Röhrchen in eine Mikrozentrifuge und schleudern Sie sie 3 min lang bei 800 x g . Zum Schluss resuspendieren Sie die Zellen (LDN) aus beiden Röhrchen in 1 ml kaltes PBS. Bleiben Sie auf Eis.
    HINWEIS: Die ersten 2 mL Durchfluss enthalten den Rest der PBMC. Diese Zellen können für andere Studien verwendet werden.

3. Mehrfarbige Durchflusszytometrie

  1. Resuspendieren Sie gereinigte Zellen bei 1 x 106 Zellen/ml in Markierungspuffer (1 % FBS in PBS). Geben Sie 250 μl Zellen in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
  2. Fügen Sie die entsprechenden Antikörper gegen neutrophile Membranmoleküle hinzu (Details siehe Materialtabelle). Inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang bei 4 °C und schützen Sie sie vor Licht.
  3. Fügen Sie 1 ml PBS hinzu. Legen Sie die Röhrchen in eine Mikrozentrifuge und schleudern Sie sie 3 min lang bei 800 x g .
  4. Aspirieren Sie den Überstand, brechen Sie das Zellpellet durch Klopfen auf das Röhrchen und resuspendieren Sie die Zellen in 0,5 ml 1 % Paraformaldehyd.
  5. Bewahren Sie die Zellen bei 4 °C lichtgeschützt auf, bis sie durch Durchflusszytometrie analysiert werden. Analysieren Sie Zellen mittels Durchflusszytometrie und erfassen Sie 10.000 Ereignisse pro Probe. Führen Sie die Zellsortierung wie zuvor beschriebendurch 22.
    ACHTUNG: Paraformaldehyd ist ein Reizstoff für die Haut und die Atemwege. Achten Sie darauf, dass Sie die Dämpfe nicht einatmen.

4. Nachweis von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS)

  1. In ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen 2,5 x 105 Zellen geben. Die Röhrchen in eine Mikrozentrifuge geben und bei 800 x g 3 min schleudern.
  2. Aspirieren Sie den Überstand, kratzen Sie das Röhrchen ab, um die Zellen zu trennen, und resuspendieren Sie die Zellen in 100 μl 15 μM Dihydrorhodamin 123 in PBS.
  3. Inkubieren Sie die Zellen lichtgeschützt bei 37 °C für 20 min. Fügen Sie 1 ml PBS hinzu.
  4. Die Röhrchen in eine Mikrozentrifuge geben und bei 800 x g 3 min schleudern. Aspirieren Sie den Überstand, kratzen Sie das Röhrchen ab, um die Zellen zu trennen, und resuspendieren Sie sie in 100 μl 50 nM Phorbol-12-Myristat-13-acetat (PMA) in PBS.
  5. Inkubieren Sie die Zellen lichtgeschützt bei 37 °C für 45 min. Fügen Sie 1 ml PBS hinzu.
  6. Legen Sie die Röhrchen in eine Mikrozentrifuge und schleudern Sie sie 3 min lang bei 800 x g . Aspirieren Sie den Überstand, kratzen Sie das Röhrchen ab, um die Zellen zu trennen, und resuspendieren Sie sie in 0,5 ml 1% Paraformaldehyd in PBS.
  7. Bewahren Sie die Zellen bei 4 °C lichtgeschützt auf, bis sie durch Durchflusszytometrie analysiert werden. Analysieren Sie Zellen mittels Durchflusszytometrie und erfassen Sie 10.000 Ereignisse pro Probe.

5. Visualisierung von extrazellulären Fallen (NETs) von Neutrophilen

  1. Legen Sie Deckgläser in Vertiefungen einer 12-Well-Platte und bedecken Sie sie mit 10 μg/mL Poly-L-Lysin. Die Platte über Nacht bei 4 °C unter leichtem Rühren inkubieren.
  2. Entfernen Sie das Poly-L-Lysin und waschen Sie die Deckgläser mit PBS, indem Sie die Platte 5 Minuten lang bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren inkubieren. Waschen Sie die Deckgläser noch zwei Mal mit PBS.
  3. Entfernen Sie das PBS und lassen Sie die Deckgläser trocknen, indem Sie die Platte für 2 Stunden in eine Laminar-Flow-Haube legen.
  4. Resuspendieren Sie LDN bei 1 x 106 Zellen/ml in RPMI-1640 Medium mit 5 % FBS. Nehmen Sie 350 μl (3,5 x 105 Zellen) der Zellsuspension und geben Sie sie in eine Vertiefung der 12-Well-Platte, die die Deckgläser enthält.
  5. Bewahren Sie die Platte 30 min lang in einem 5%igen CO2 -Inkubator bei 37 °C auf. Geben Sie 3,5 μl 5 μM PMA, verdünnt in PBS, in jede Vertiefung (die Endkonzentration von PMA beträgt 50 nM).
  6. Bewahren Sie die Platte 4 h lang in einem 5%igen CO2 -Inkubator bei 37 °C auf. Fügen Sie 350 μl 8 % Paraformaldehyd in PBS hinzu und bewahren Sie die Platte über Nacht in einem 5 % CO2 -Inkubator bei 37 °C auf.
  7. Über einen Reagenzglasständer, wie zuvorbeschrieben 49, wird eine transparente Folie gelegt, so dass sich an den Röhrchenlöchern Vertiefungen bilden.
  8. Füllen Sie jede Vertiefung mit den verschiedenen Lösungen, um die Deckgläser zu waschen oder zu beflecken, so dass ein großer Tropfen entsteht. Entfernen Sie die Deckgläser und legen Sie sie kopfüber für 5 Minuten auf einen Tropfen Wasser. Waschen Sie die Deckgläser auf die gleiche Weise noch dreimal mit Wasser.
  9. Legen Sie die Deckgläser kopfüber auf einen Tropfen Blockierungspuffer (5 % BSA in PBS) und inkubieren Sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur.
  10. Die Deckgläser werden in einen Tropfen des entsprechenden Primärantikörpers (z. B. Anti-Elastase oder Anti-Citrullin) in Blockierungspuffer überführt und 60 min bei Raumtemperatur inkubiert.
  11. Waschen Sie Deckgläser 2x in 0,01 % Tween-20 in PBS. Die Deckgläser werden in einen Tropfen des entsprechenden Sekundärantikörpers in einem Blockpuffer mit 150 nM DAPI überführt und 60 Minuten lang bei Raumtemperatur lichtgeschützt inkubiert.
  12. Waschen Sie Deckgläser 2x in 0,01 % Tween-20 in PBS. Geben Sie einen Tropfen Antifading-Eindeckmittel auf einen Objektträger und legen Sie die Deckgläser auf den Kopf.
  13. Versiegeln Sie Deckgläser mit Nagellack. Gelagerte Objektträger bei 4 °C lichtgeschützt lagern. Visualisieren Sie NETs mit einem Fluoreszenzmikroskop.

6. Nachweis von neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs)

  1. Resuspendieren Sie die Zellen in einer Menge von 5 x 105 Zellen/ml in 500 nM Sytox Green, verdünnt in RPMI-1640 Medium mit 5 % FBS.
  2. Nehmen Sie 100 μL (5 x 104 Zellen) der Zellsuspension und geben Sie sie in eine Vertiefung einer 96-Well-Gewebekulturplatte.
  3. Bewahren Sie die Platte 20 min lang in einem 5%igen CO2 -Inkubator bei 37 °C auf. Geben Sie in jede Vertiefung 20 μl 300 nM PMA, verdünnt in RPMI-1640-Medium (die Endkonzentration von PMA beträgt 50 nM).
  4. Übertragen Sie die Platte in einen vorgewärmten Mikroplatten-Reader. Die Platte wird 4 Stunden lang bei 35 °C inkubiert und alle 5 Minuten Fluoreszenzmessungen von der Unterseite der Platte durchgeführt (mit den 485-nm-Anregungs- und 528-nm-Emissionsfiltern).

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neutrophile Zellen niedriger Dichte (LDN) bei gesunden Personen machen etwa 5 % der PBMC aus (Abbildung 2A). Das hier beschriebene Protokoll liefert in der Regel reines LDN (> 90 %). Die Zellen werden auch effizient zurückgewonnen (Ausbeute um 98 %) mit hoher Lebensfähigkeit (> 95 %; Abbildung 2B). Zum Vergleich wurden LDN auch durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung aufgereinigt, wie zuvor beschrieben2...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Im Allgemeinen wurden Neutrophile als homogene Zellen angesehen. Neuere Erkenntnisse haben jedoch gezeigt, dass Neutrophile als Zellen mit unterschiedlichen Aktivierungszuständen und/oder mehreren Phänotypen existieren können. So können verschiedene neutrophile Subpopulationen existieren 13,14,15. Eine Neutrophilen-Subpopulation, die Neutrophilen niedriger Dichte (LDN), hat aufgrund ihrer besond...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren geben an, dass diese Studie ohne kommerzielle oder finanzielle Verbindungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt wahrgenommen werden könnten.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren danken César Díaz-Godínez (Instituto de Investigaciones Biomédicas-UNAM) für seine Hilfe bei der Fluoreszenzmikroskopie zur Visualisierung von NETs. Diese Forschung wurde durch das Stipendium PAPIIT IN205523 der Dirección General de Asuntos del Personal Académico, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), Mexiko, und durch das Stipendium CF-2023-I-610 der Secretaría de Ciencias, Humanidades, Tecnología e Inovación (Secihti), Mexiko, unterstützt.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
  Anti-Citrullin-Kaninchen-Polyklonal-AntikörperAbCamab1009321/50 Verdünnung
96-Well-GewebekulturplatteCostar; Corning, Inc.3596
Alexa Fluor 488 antihumaner CD11b-Maus-IgG1-AntikörperBioLegend3013170,25 μ g/mL
Alexa Fluor 647 anti-menschlicher CD66b-Maus-IgM-AntikörperBioLegend3051090,05 μ g/mL
Anti-Maus IgG (H+L) Ziegenantikörper, Alexa Fluor 488Invitrogen – Thermo Fisher ScientificA-110011/50 Verdünnung
Anti-Neutrophil-Elastase-Maus-monoklonaler IgG1-AntikörperSanta Cruz BiotechnologieSC-5554910 & Mikro; g/mL
Anti-Kaninchen-IgG (H+L) Esel-Antikörper, Alexa Fluor 555Invitrogen – Thermo Fisher ScientificA-315721/50 Verdünnung
APC-antihumaner CD62L-Maus-IgG1-AntikörperBioLegend3048090,03 μ g/mL
APC/Cyanin7 antihumaner CD14-Maus-IgG1-AntikörperBioLegend3671070,25 μ g/mL
Attune NxT Flow Cytometer Thermo Fisher Scientific, Inc.(blau/rote Laser)
Rinderserumalbumin (BSA) Fraktion VMP Biomedizin810025
Brilliant Violet 510 anti-menschlicher CD33-Maus-IgG1-AntikörperBioLegend3666090,30 μ g/mL
DAPICalbiochem/EMD Millipore268298
Dextran T500Pharmakosmos Klimaanlage5.51005E+11
Dihydrorhodamin-123Anaspec, Inc.AS-85711
FACS-ZellsortiererBecton Dickinson Modell FACSAria
Fetales Rinderserum (FBS)Gibco16000-044
Ficoll-PaqueMerck KGGE 17-1440-03
FITC-Antihuman-CD98-Maus-IgG1-AntikörperBioLegend3156030,30 μ g/mL
FlowJo SoftwareBecton DickinsonVersion 10, 2019
Fluoreszenz-invertiertes MikroskopOlympusModell IX-70
HeparinInhepar - PiSA Farmaceutica36601495000 UI/mL
HepesSigma AldrichH7006
MACSprep Chimerism CD66b MikroperlenMiltenyi Biotec130-111-552
MagnetMiltenyi Biotec130-042-102
Magnetische TrennsäuleMiltenyi Biotec130-042-201
MikrozentrifugeEppendorfModell 5415C
Mikroplatten-LeserBioTek-InstrumenteModell Synergie HT
ParaformaldehydSigma Aldrich158127
PE anti-menschlicher CD10-Maus-IgG1-AntikörperBioLegend3122030,05 μ g/mL
PE anti-menschlicher CD16b-Maus-IgG2a-AntikörperBD Pharmingen5508681/40 Verdünnung
PE/Cyanin5-antihumaner CD15-Maus-IgG1-AntikörperBioLegend3230130,25 μ g/mL
Phorbol 12-Myristat 13-Acetat (PMA)Sigma AldrichP8139
poly-L-LysinSigma AldrichP2658
Gekühlte ZentrifugeEppendorfModell 5702R
RPMI-1640 GewebekulturmediumGibco23400-021
SYTOX GreenMolekulare Sonden, Inc.S-7020
Tween-20 Sigma AldrichP2287
VectashieldVektorlaboreH-1000

References

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