Ein Protokoll zur Konstruktion eines Mausmodells für hypertensive Myokardfibrose unter Verwendung von Angiotensin II

Summary

Die kontinuierliche Infusion von Angiotensin II (Ang II) über osmotische Pumpen ist eine der klassischen Methoden zur Konstruktion von Tiermodellen der hypertensiven Myokardfibrose. Dieses Protokoll optimierte systematisch den Prozess der Erstellung dieses Modells und erarbeitete die Schlüsselpunkte der Implantation der osmotischen Pumpe, der Positionierung und der Einstellung der Ang II-Konzentration.

Abstract

Die kontinuierliche Infusion von Angiotensin II (Ang II) über osmotische Pumpen ist ein weit verbreiteter Ansatz zur Etablierung von Tiermodellen für hypertensive Myokardfibrose. Dennoch weist diese Technik in aktuellen Berichten gewisse Einschränkungen auf, wie z. B. die Instabilität von Ang II, die ungenaue Platzierung der Pumpe und das Fehlen eines standardisierten Verfahrens. Die derzeitigen Berichte über die Methodik für die Einrichtung sind nach wie vor relativ begrenzt. Dieses Protokoll hat die Etablierung von Ang II osmotischen Pumpen-induzierten hypertensiven Myokardfibrosemodellen bei Mäusen systematisch optimiert, einschließlich der standardisierten Herstellung von Ang II Lösung, der Kalibrierung der Dosierung, der präzisen subkutanen Implantation von osmotischen Pumpen und quantitativer Standards für Modellbewertungsindikatoren. Experimentelle Ergebnisse zeigten, dass die osmotische Ang II-Pumpe eine hypertensive Myokardfibrose bei Mäusen mit hohen Überlebensraten induzierte. Der systolische Blutdruck (SBP) stabilisierte sich nach siebentägiger subkutaner Implantation bei 160 mmHg. Die Modellmäuse wiesen signifikant reduzierte linksventrikuläre Ejektionsfraktionen und erhöhte enddiastolische Dimensionen des linken Ventrikels auf. Im Vergleich zur Scheinchirurgie-Gruppe nahm die Kollagenablagerung im hypertensiven myokardialen interstitiellen Gewebe und in den perivaskulären Regionen zu. Diese Studie, die auf einer kleinen Stichprobengröße (n = 6) basierte, validierte vorläufig die Machbarkeit der Etablierung eines Mausmodells für hypertensive Myokardfibrose unter Verwendung von Ang II in Kombination mit einer osmotischen Pumpe und etablierte ein quantitatives Phänotyp-Verifizierungssystem.

Introduction

Myokardfibrose (MF), eine wichtige pathologische Folge von Bluthochdruck, ist durch eine übermäßige Ablagerung von Kollagenfasern im geschädigten oder komprimierten Myokard gekennzeichnet. Sie stellt eine der wichtigsten Formen der Hypertonie-vermittelten Schädigung von Zielorganen dar und trägt zu einer fortschreitenden Herzfunktionsstörung bei ^1,2. Die Etablierung geeigneter Tiermodelle ist unerlässlich, um die mechanistische Forschung voranzutreiben und neue therapeutische Strategien für hypertensive Myokardfibrose zu entwickeln. Angiotensin II (Ang II), ein zentraler Effektor des Renin-Angiotensin-Systems, spielt eine zentrale Rolle bei der Pathogenese des Bluthochdrucks³. Die Ang II-basierte Induktion hat sich daher zu einem weit verbreiteten Ansatz für die Etablierung von Bluthochdruckmodellen bei Mäusen entwickelt.

Zu den derzeitigen Methoden zur Konstruktion von Bluthochdruck-Tiermodellen gehören hauptsächlich die chirurgische Induktion, die pharmakologische Induktion und transgene Spontanmodelle. Bei der chirurgischen Induktion werden in der Regel Techniken wie die Verengung der Nierenarterien, die aufsteigende Aortenverengung oder die Verengung des Aortenbogens verwendet, um den Blutflusswiderstand künstlich zu erhöhen und dadurch einen erhöhten Blutdruck zu induzieren⁴. Während diese Methoden schnell Hypertoniezustände herstellen können, die sich für die Untersuchung von stressbelastungsbedingten kardialen Umbauprozessen eignen, beinhalten sie komplexe Verfahren mit zahlreichen postoperativen Komplikationen. Bei der pharmakologischen Induktion wird im Allgemeinen eine intraperitoneale Injektion oder orale Verabreichung verwendet, um den Blutdruck bei Versuchstieren zu erhöhen⁵. Obwohl die Technologie relativ einfach ist, bleibt die Modellstabilität anfällig für Störungen durch die Dosierung des Medikaments, die Verabreichungshäufigkeit und die Stressreaktionen der Tiere. Transgene Modelle wie spontan hypertensive Ratten und BPH/2J-hypertensive Mäuse, die stabile Hypertonie-Phänotypen aufweisen, werden in der hereditären Hypertonieforschung häufig eingesetzt. Ihre einzigartigen pathogenen Mechanismen schränken jedoch ihre Fähigkeit ein, eine multifaktorinduzierte klinische Hypertonie zu simulieren.

In jüngerer Zeit haben Hypertoniemodelle, die auf einer kontinuierlichen Ang II-Infusion über subkutane osmotische Pumpen basieren, an Popularität gewonnen. Diese Methode ermöglicht eine anhaltende Freisetzung von Ang II mit einer konstanten Rate, wobei die Blutkonzentrationen über längere Zeiträume stabil bleiben, um pathologische Prozesse genau nachzuahmen und die hypertensive Myokardfibrose der Maus^zu replizieren ^6,7,8. Nichtsdestotrotz bleiben wichtige Einschränkungen bestehen, insbesondere in Bezug auf die Standardisierung des Protokolls und inkonsistente fibrotische Ergebnisse, die durch Faktoren wie die Pumpenimplantationstechnik und tierspezifische Reaktionen beeinflusst werden können⁹. Um diese Lücken zu schließen, verfeinert diese Studie das auf osmotischen Ang-II-Pumpen basierende Modell, standardisiert die wichtigsten Schritte und stellt ein visualisiertes Protokoll zur Verfügung. Diese Verbesserungen verbessern die Reproduzierbarkeit und praktische Anwendbarkeit und bieten eine wertvolle Referenz für zukünftige Studien zur hypertensiven Myokardfibrose.

Protocol

Alle experimentellen Verfahren wurden gemäß den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt, und die Versuchsprotokolle wurden vom Tierforschungsausschuss der Southwest Medical University (Zulassungsnummer SWMU2020317) genehmigt.

1. Herstellung der Ang II-Lösung und Befüllung der osmotischen Pumpe

1. Wählen Sie 12 männliche C57BL/6J-Mäuse mit Lichtschutzfaktor (siehe Materialtabelle) mit einem Gewicht von 20 ± 1 g aus, indem Sie 8 Wochen alte Tiere nach ihrer Entwicklungsgleichmäßigkeit auswählen, um altersbedingte Störfaktoren zu kontrollieren. Teilen Sie die Mäuse mit einer einfachen Randomisierungsmethode in eine Schein-OP-Gruppe und eine Modellgruppe mit jeweils 6 Mäusen ein.
2. Messen Sie das Anfangskörpergewicht der Maus und bestimmen Sie die Dosis von Ang II (siehe Materialtabelle) mit 1,46 mg/kg/d.
   HINWEIS: Dem vorläufigen Versuch zufolge ist 1,46 mg/kg/Tag die optimale Dosis von Ang II. Diese Dosis hält den systolischen Blutdruck zuverlässig bei etwa 160 mmHg, induziert effektiv eine pathologische Myokardfibrose und sichert gleichzeitig das Überleben der Tiere während der gesamten 4-wöchigen Studie.
3. 2,45 ml 0,9 % sterile Kochsalzlösung, vorgekühlt auf 4 °C, zu 10 mg Ang II lyophilisiertem Pulver hinzufügen. Mischen Sie die Lösung gründlich und bewahren Sie sie für den sofortigen Gebrauch auf Eis auf.
4. Führen Sie den Vorgang auf Eis durch, indem Sie mit einer Spritze die Ang II-Lösung aufziehen und dann nacheinander 200 μl (3,91 mmol/l Konzentration) in jede der sechs Kammern der osmotischen Pumpe (siehe Materialtabelle) injizieren.
5. Aktivieren Sie den osmotischen Druckantrieb, indem Sie die Pumpe 48 h lang in 37 °C sterile Kochsalzlösung tauchen.
   HINWEIS: Füllen Sie die osmotischen Pumpen für die Scheinchirurgie-Gruppe mit dem gleichen Volumen Kochsalzlösung. Da Ang II lichtempfindlich ist, muss der Eingriff durchgehend unter vollständigem Lichtschutz durchgeführt werden.

2. Implantation der osmotischen Pumpen und Bau des Modells ⁶

1. Vorbereitung und Anästhesie der Tiere
   1. Fasten Sie die Mäuse für 4 h mit freiem Zugang zu Wasser. Wiegen Sie dann jede Maus und berechnen Sie die geeignete Anästhesiedosis (80 mg/kg Pentobarbital-Natrium)¹⁰.
   2. Betäuben Sie die Mäuse durch intraperitoneale Injektion der berechneten Dosis von Pentobarbital-Natrium.
      HINWEIS: Der Umgang mit Pentobarbital erfordert die Einhaltung von Vorschriften, den Betrieb in einem Abzug, das Tragen von Schutzausrüstung und die Kennzeichnung von Restflüssigkeit für die getrennte Entsorgung.
2. Entfernen Sie die Haare von der Rückenhaut über den Bereich, der sich vom Schwanzansatz bis zum mittleren Rückenbereich erstreckt, mit einem Rasiermesser oder einer Enthaarungscreme.
3. Desinfizieren Sie die rasierte Stelle dreimal gründlich mit 70%igem Ethanol¹¹.
4. Machen Sie mit einem Skalpell einen 0,5 cm langen subkutanen Schnitt innerhalb des desinfizierten Bereichs.
5. Trennen Sie das Unterhautgewebe durch den Schnitt mit einer Pinzette stumpf in Richtung des hinteren Halses, so dass eine Tasche entsteht.
6. Richten Sie den Pumpenkörper so aus, dass die Katheterspitze zum Kopf der Maus zeigt. Klemmen Sie dann die Spitze mit einer hämostatischen Pinzette fest und führen Sie die Pumpe subkutan in diese Richtung ein.
7. Nach der Pumpenimplantation wird das Unterhautgewebe mit unterbrochenen resorbierbaren 6-0-Nähten vernäht und der Hautschnitt mit chirurgischen Nähten verschlossen. Legen Sie die Maus dann in eine vorgeheizte 37 °C warme Thermomatte, bis sie sich vollständig von der Narkose erholt hat (ca. 5-10 Minuten).
8. Die vorbereitete Ang II-Lösung wird 28 Tage lang kontinuierlich in der vorgegebenen Dosis (1,46 mg/kg/Tag) über die osmotischen Pumpen infundiert.
9. Sammeln Sie nach Abschluss der 28-tägigen Infusionszeit alle experimentellen Daten. Dann betäuben Sie die Mäuse auf die gleiche Weise wie bei früheren Anästhesungen, d. h. nach den in den Schritten 2.1.1-2.1.2 beschriebenen Verfahren, und euthanasieren Sie sie durch Zervixluxation.

3. Blutdruckmessung

1. Ausrüstung (siehe Materialtabelle) Vorwärmen: Stellen Sie die Heizplattform auf 37-38 °C ein, um eine Vasodilatation in den Blutgefäßen des Mausschwanzes zu gewährleisten.
2. Fassen Sie die Maus vorsichtig an und legen Sie sie in den Rückhaltehalter, wobei Sie darauf achten, dass der Schwanz frei durch das hintere Loch ragt. Reinige dann den freiliegenden Schwanz gründlich mit einem alkoholgetränkten Wattebausch.
3. Lege eine aufblasbare Manschette an die Basis des Schwanzes. Positionieren Sie den Pulssensor ca. 5-10 mm distal zur Manschette im mittleren bis unteren Heckbereich.
4. Aktivieren Sie das Gerät und warten Sie, bis sich die Pulswellenform stabilisiert hat, bevor Sie fortfahren.
5. Starten Sie den Messzyklus. Das System bläst die Manschette automatisch auf einen Druck von mehr als 200 mmHg auf, um den Blutfluss zu verschließen, und entleert sich dann langsam mit 2-3 mmHg pro Sekunde. Der Sensor erkennt das Wiederauftreten der Pulswelle, wenn der Fluss wieder aufgenommen wird, und bestimmt den systolischen Druck.
6. Messen Sie den systolischen Blutdruck (SBP) in 7-Tage-Intervallen nach der Modellierung, für insgesamt fünf Messungen. Zeichnen Sie für jede Maus zu jedem Zeitpunkt drei aufeinanderfolgende Messwerte auf, wobei zwischen aufeinanderfolgenden Messungen eine Ruhezeit von 2 Minuten eingeräumt wird.
7. Bringen Sie die Maus nach den Messungen mit Futter und Wasser in ihren Käfig zurück. Reinigen Sie den Halter und die Heckhülse, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.

4. Messung der Herzfunktion

1. Am Tag 28 der Modellierung werden alle Versuchsmäuse mit Natrium-Pentobarbital (80 mg/kg Pentobarbital-Natrium) anästhesiert.
2. Positionieren Sie die Maus in Rückenlage auf einer Plattform mit konstanter Temperatur.
3. Führen Sie eine transthorakale Echokardiographie mit einem Ultraschallsystem durch (siehe Materialtabelle). Verbinden Sie die Gliedmaßen der Maus mit Elektroden auf der Plattform, um Elektrokardiogramm-Signale (EKG) zu überwachen.
4. Erhalten Sie eine Kurzachsen-Bildgebung auf Höhe des Brustmuskels über M-Modus-Ultraschall, um das Herz zu visualisieren und die Herzfunktion zu analysieren. Nehmen Sie drei Bilder pro Maus auf und mitteln Sie die Daten für die anschließende Analyse der linksventrikulären internen diastolischen Dimension (LVIDd), des linksventrikulären internen Durchmessers systolisch (LVIDs), der linksventrikulären fraktionellen fraktionellen Verkürzung (LVFS) und der linksventrikulären Ejektionsfraktion (LVEF).
   HINWEIS: Halten Sie den Sondenkontakt mit der Brustwand, ohne die Brusthöhle zu komprimieren. sicherstellen, dass die Probenahmeleitung im M-Modus senkrecht zum Ventrikelseptum verläuft; Führen Sie kontinuierliche Messungen für ≥ 3 Herzzyklen durch, um Mittelwerte zu erhalten.

5. Masson-Färbung

1. Probenahme und Fixierung des Herzens
   1. Betäuben Sie die Maus mit Natrium-Pentobarbital (80 mg/kg Pentobarbital-Natrium). Nehmen Sie dann mit einer Schere einen Längsschnitt von etwa 1,5 cm in die Brusthöhle vor, ligieren Sie die großen Herzgefäße und entfernen Sie schnell das Herz, um Traktionsverletzungen zu vermeiden¹².
   2. Spülen Sie das herausgeschnittene Herz sofort mit vorgekühltem PBS aus, um Blut zu entfernen, und tupfen Sie überschüssige Feuchtigkeit vorsichtig mit sauberem Filterpapier ab. Anschließend wird ein Querschnitt entlang des Papillarmuskels durchgeführt, um ein 3 mm dickes Gewebestück zu erhalten.
   3. Tauchen Sie die Herzproben zur Fixierung länger als 48 Stunden in 4 % Paraformaldehyd, wobei ein minimales Volumenverhältnis von Gewebe zu Fixiermittel von 1:10 sichergestellt wird.
2. Entfernen Sie das Herzgewebe aus dem 4%igen Paraformaldehyd-Fixiermittel. Anschließend wird das Gewebe unter einem Abzug mit einem chirurgischen Messer in einer Dicke von 4 μm dünn geschnitten und die Scheiben in eine Dehydratisierungskassette¹³ überführt.
3. Laden Sie die Gewebeschnitte in den Dörrautomat und führen Sie die folgenden Schritte durch: 70 % Ethanol, 80 % Ethanol, 95 % Ethanol für jeweils 1 Stunde; 100% Ethanol I & II für je 45 min; Xylol I & II für jeweils 30 min.
4. Betten Sie das Gewebe in Paraffin ein und verfestigen Sie die Blöcke dann auf einer vorgekühlten -20 °C-Kühlplatte.
5. Verwenden Sie ein Paraffinmikrotom, um 4 μm dicke Längsschnitte aus den in Paraffin eingebetteten Gewebeblöcken zu erhalten. Tauchen Sie dann die Abschnitte nacheinander jeweils 5 Minuten lang in die folgenden Lösungen, um sie zu entparaffinisieren und zu rehydrieren: Xylol I, Xylol II, absolutes Ethanol, 95 % Ethanol, 80 % Ethanol, 70 % Ethanol und schließlich destilliertes Wasser.
6. Tauchen Sie das Gewebe für 8 min in die vorbereitete Weigert's Eisen-Hämatoxylin-Färbelösung. Spülen Sie dann wiederholt mit destilliertem Wasser ab, um überschüssige Fleckenlösung zu entfernen. Differenzieren Sie 5 s lang in saurer Ethanol-Differenzierungslösung, gefolgt von einer Bläuung in Massons Bläuungslösung für 5 min. Zum Schluss mit destilliertem Wasser^{abspülen 14}.
7. Färben Sie die Schnitte 10 Minuten lang karminrot und tragen Sie ca. 200-300 μl pro Objektträger auf, um eine vollständige und gleichmäßige Abdeckung des Gewebes zu gewährleisten. Anschließend die Abschnitte 1 min lang in 0,2 % Eisessig spülen.
8. Behandeln Sie die Abschnitte ca. 5 Minuten lang mit Phosphomolybdsäurelösung oder bis die Muskelfasern rot werden. Färben Sie dann die Schnitte 5 Minuten lang mit einer ausreichenden Menge Anilinblaulösung, um das Gewebe vollständig zu bedecken (typischerweise 200-300 μl pro Objektträger). Zum Schluss werden die Abschnitte mit 0,2%iger Eisessiglösung¹⁵ gespült.
9. Entwässern Sie die Abschnitte durch eine abgestufte Ethanolreihe. Fahren Sie fort, das Gewebe mit Xylol zu reinigen, indem Sie dreimal 1-2 Minuten eintauchen.
10. Montieren Sie die Abschnitte, indem Sie eine kleine Menge neutrales Harz auftragen und mit einem Deckglas abdecken.
11. Mikroskopische Untersuchung (siehe Materialtabelle): Beobachten Sie Masson-gefärbtes Gewebe bei 40×, 20× und 10× Vergrößerung. Fotografieren Sie jede Folie, um repräsentative Bilder zu erhalten.
    HINWEIS: Entsorgen Sie alle Abfälle gemäß den Sicherheitsprotokollen der Einrichtung. Saure Differenzierungslösung und Eisessig in korrosionsbeständigen Fässern auffangen, hochkonzentrierte Abfälle auf pH 6-8 neutralisieren und nicht mit alkalischen Lösungen mischen. Lagern Sie Ethanol in explosionsgeschützten Fässern an einem kühlen Ort, fern von Brandherden. Bewahren Sie Xylol in braunen Fässern auf, arbeiten Sie in einem Abzug mit getragener Schutzausrüstung und mischen Sie keine Säuren (Substanzen) mit Ethanol. Tierisches Gewebe in beschriftete Behälter geben, verschließen und unter Gefrierbedingungen lagern¹⁶. Schließlich alle Abfälle zur Entsorgung an qualifizierte Berufsinstitutionen zu übergeben; Verbieten Sie strengstens das Mischen von Abfällen oder deren beiläufige Entsorgung.

6. Statistische Analyse

1. Sammeln Sie alle numerischen Daten und analysieren Sie sie mit GraphPad Prism 9.0.
2. Verwenden Sie den t-Test für unabhängige Stichproben, um die Unterschiede zwischen den Gruppen zu analysieren.
3. Legen Sie die statistische Signifikanz auf **P < 0,01 für hochsignifikant und *P < 0,05 für signifikant fest.

Results

Zwölf Mäuse wurden subkutan mit osmotischen Pumpen implantiert und überlebten. Alle Modellgruppen entwickelten Hypertonie (n = 6). Sieben Tage nach der Implantation lag der mittlere SBP in der Modellgruppe bei über 160 mmHg (Abbildung 1A). An den Tagen 14, 21 und 28 blieb der SBP in der Modellgruppe konstant über 160 mmHg. Im Gegensatz dazu behielt die Scheinchirurgie-Gruppe während des gesamten Experiments normale SBP-Spiegel (ca. 90-110 mmHg) ohne signifikante Erhöhung bei.

Discussion

Dieses Protokoll optimierte die Schlüsselschritte bei der kontinuierlichen Infusion von Ang II zur Induktion einer hypertensiven Myokardfibrose mit einer osmotischen Pumpe und erläuterte die kritischen Aspekte, wie z. B. die Implantationspositionierung der osmotischen Pumpe und die Einstellung der Ang II-Konzentration. Die Pumpe des Modells 2004 wurde aufgrund ihrer Dauer von 4 Wochen ausgewählt, und die Ang II-Dosis wurde auf der Grundlage der nominalen Infusionsrate berechnet, wobei ei...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ang II	Sigma-Aldrich Corporation	Sigma, A9525
Tieranästhesiemaschine	Shenzhen Reward Life Science Co., Ltd	R530
Tierbeatmungsgerät	Shenzhen Reward Life Science Co., Ltd	R415
GraphPad Prism	GraphPad Software Inc.	Version 9.0
Intelligentes, nicht-invasives Blutdruckmessgerät	Nippon Soft Dragon Co., Ltd	Softron, BP-98A
Lichtmikroskop	Yijingtong Optical Technology (Shanghai) Co., Ltd	OLYMPUS, SZ61TR
Masson Tricolor Färbelösung und Kit	Beijing Soleibao Technology Co., Ltd	Solarbio, G1340
Mäuse	Chengdu Dossy Exprimental Animals CO., Ltd	C57BL/6J
Osmotische Pumpen	ALZA Corporation	Alzet, Modell 2004
Ultraschallbildgebungssysteme	FUJIFILM VisualSonics Corporation, Kanada	FUJIFILM, Vevo 3100