Modellierung von Gehirnmetastasen: Standardisierte Analyse metastatischer Kolonisierung und histologischer Wachstumsmuster durch stereotaktische intrakortikale Injektion

Zusammenfassung

Die stereotaktische intrakranielle Injektionstechnik ermöglicht eine präzise und lokalisierte Einpflanzung von Tumorzellen in den Mauskortex und ist damit ein wirkungsvolles Modell zur Untersuchung der metastatischen Besiedlung des Gehirns.

Zusammenfassung

Hirnmetastasen sind eine häufige und verheerende Komplikation fortgeschrittener solider Tumore, die häufig mit schlechter Prognose, neurologischem Abbau und verminderter Lebensqualität einhergeht. Die Häufigkeit von Versagen des zentralen Nervensystems (ZNS) und neurologischem Tod nimmt rapide zu, doch die Mechanismen, die die Endstadien der Gehirnmetastasen antreiben, wie sekundäre Verbreitung, Wiederbesiedlung und der Beitrag des histologischen Wachstumsmusters (HGP) als potenzieller Ersatzparameter, sind weiterhin wenig verstanden.

Das standardisierte stereotaktische intrakortikale Injektionsmodell ermöglicht eine präzise und reproduzierbare Einnistung von Tumorzellen oder gemischten Populationen, einschließlich stromaler oder immuner Komponenten, direkt in den Großhirnrinde der Maus. Dieses Protokoll unterstützt auch die Erstellung eines präklinischen Gewebearchivs und bietet eine robuste Plattform zur Untersuchung wesentlicher Aspekte der ZNS-Kolonisierung, wie z. B. metastasiertes Auswachsen, HGP-spezifische Wachstumsdynamik und pathophysiologische Mechanismen, die zum neurologischen Versagen beitragen. Zusätzlich unterstützt dieses Modell pharmakologische Tests in einem reproduzierbaren klinisch relevanten Kontext.

Im Gegensatz zu systemischen Injektionsmethoden (z. B. Schwanzvene oder intrakardial), die für die Untersuchung früher metastatischer Schritte optimiert sind, aber zu variablen und oft niedrigen Hirnkolonisationsraten führen, gewährleistet das stereotaktische Modell ein konsistentes, gehirnspezifisches metastasiertes Wachstum und ermöglicht die Untersuchung später Stadien der ZNS-Metastase. Im Vergleich zu ex-vivo-Systemen wie Organoiden oder Hirnschnittkulturen erhält das in vivo stereotaktische Modell die Gefäßbildung, die systemische Signalübertragung und die volle Komplexität der Immunlandschaft des Gehirns und unterstützt langfristige Studien zum Tumorverlauf und zur therapeutischen Antwort.

Durch die Bereitstellung einer reproduzierbaren und klinisch relevanten Plattform verbessert unser Modell die Fähigkeit des Fachgebiets, prognostische Marker zu identifizieren, therapeutische Strategien zu erforschen und die Mechanismen der späten Hirnmetastasen zu verstehen.

Einleitung

Hirnmetastasen sind eine häufige und verheerende Komplikation bei Patienten mit soliden Tumoren, häufig mit schlechter Prognose, erheblichem neurologischem Abbau und verminderter Lebensqualität^{verbunden 1,2,3}. Insbesondere sind das Versagen des zentralen Nervensystems (ZNS) und der neurologische Tod immer häufiger bei Krebsarten wie Lungen-, Brust- und Melanom 4,5,6,7 geworden. Das ZNS-Versagen im Zusammenhang mit Hirnmetastasen kann durch verschiedene Mechanismen entstehen, darunter lokaler Masseneffekt, peritumorales Ödem, intrakranielle Blutungen und meningeale Verbreitung, die unabhängig oder synergetisch wirken und letztlich zum neurologischen Tod führen^können.

Trotz seiner klinischen Bedeutung sind die pathophysiologischen Mechanismen, die dem ZNS-Versagen zugrunde liegen, und den letzten Stadien des metastasierenden Fortschreitens weiterhin nur wenig verstanden. Prozesse wie alternative Verbreitung, sekundäre Verbreitung und Wiederbesiedlung stehen selten im Mittelpunkt einer gezielten Untersuchung⁸. Sowohl klinische als auch präklinische Studien beschränken ihre Analysen oft auf Endpunkte wie die Anzahl der Metastasen im Gehirn, die Größe oder das Gesamtüberleben (OS) und übersehen dabei kritische mechanistische Erkenntnisse sowie die wahren Ursachen für neurologischen Abbau und Tod.

In diesem Zusammenhang haben wir und andere unterschiedliche histologische Wachstumsmuster (HGPs) bei Hirnmetastasen identifiziert, die mit klinischen Endpunkten ^9,10,11 korrelieren. Drei große HGPs wurden beschrieben: i) nicht-infiltrativ, gekennzeichnet durch eine gut abgegrenzte Tumorgrenze, die oft von einem reaktiven astrozytischen Rand umgeben ist; ii) epithheliale Infiltration, bei der Cluster von Tumorzellen das benachbarte Hirnparenchym ohne astrozytische Eindämmung infiltrieren; und iii) diffuses Infiltrativ, gekennzeichnet durch eine weitreichende Infiltration einzelner Tumorzellen oder kleiner Cluster, was eine ausgedehnte Astrogliose^10,12 verursacht.

Klinisch sind infiltrative HGPs mit deutlich schlechterer Prognose assoziiert im Vergleich zu nicht-infiltrativen Mustern ^9,10,11. Darüber hinaus scheinen HGPs zentrale Aspekte der Tumorwachstumsdynamik und der Mechanismen zu widerspiegeln, die zum neurologischen Tod führen. Während nicht-infiltrative Metastasen typischerweise als einzelne Läsion expandieren und lebenswichtige Strukturen im Gehirn einschränken, zeigen infiltrative Läsionen eine sekundäre Verbreitung (ausgehend von der bestehenden Läsion und nicht vom primären Tumor) im ZNS, was zu weitreichenden Schäden und vollständiger Organzerstörung beiträgt (unveröffentlichte Daten). Infiltrative Läsionen können auch die Meningealen neu besiedeln, was zur meningealen Metastasen beiträgt und^{den Krankheitsverlauf} weiter erschwert^. Trotz ihrer klinischen Relevanz bleiben die HGPs von Hirnmetastasen und die Endstadien der ZNS-Kolonisierung, einschließlich der sekundären Verbreitung und Wiederbesiedlung desselben Organs, wenig erforscht, was vor allem auf das Fehlen geeigneter experimenteller Modelle zurückzuführen ist.

Um diese Lücke zu schließen, stellen wir ein stereotaktisches intrakranielles Injektionsmodell vor, das eine präzise, reproduzierbare Einnistung von Tumorzellen oder zellulären Mischungen aus Tumoren und einem oder mehreren Nicht-Tumorzelltypen in den Großhirnrinde experimenteller Mäuse ermöglicht. Dieses Modell überwindet zentrale Einschränkungen systemischer Metastasenmodelle und bietet eine robuste Grundlage, um wesentliche Aspekte der ZNS-Kolonisierung zu untersuchen, wie z. B. Tumor-Immunzell-Interaktionen während der Kolonisierung¹⁴, die Auswirkungen vorbehandelter zellulärer Mischungen¹⁵, metastasiertes Auswachsen¹⁶, HGP-spezifische Wachstumsdynamiken und pathophysiologische Mechanismen, die zum neurologischen Versagen beitragen (unveröffentlichte Daten). Darüber hinaus unterstützt dieses Modell pharmakologische Tests in einem reproduzierbaren und klinisch relevanten Kontext^14,15.

Dieses Protokoll bietet einen detaillierten methodischen Rahmen zur Umsetzung des stereotaktischen Injektionsmodells zur Untersuchung von HGPs bei Gehirnmetastasen. Es unterstützt außerdem die Entwicklung eines strukturierten präklinischen Probenarchivs und einer digitalen Gewebebibliothek für die systematische Untersuchung der Spätphase der ZNS-Kolonisationsbiologie. Unser Ziel ist es, die Identifizierung prognostischer und potenziell prädiktiver Biomarker zu ermöglichen, zur Entwicklung verbesserter therapeutischer Strategien beizutragen und unsere Fähigkeit zur Vorhersage akuter und chronischer Reaktionen des Hirnparenchyms und des Immunsystems zu verbessern. Durch diesen Ansatz wollen wir eine standardisierte Plattform für eine systematische Untersuchung der ZNS-Kolonisierung und metastatischen Fortschreitung bieten.

Protokoll

Alle in diesem Protokoll beschriebenen Tierverfahren wurden gemäß institutionellen Richtlinien durchgeführt und von der Regierung Niederfranken genehmigt (Genehmigungsnummer: RUF-55.2.2-2532-2-1678). Dieses Protokoll ist für die stereotaktische intrakortikale Injektion von Tumorzellen bei syngenen erwachsenen Mäusen (10–12 Wochen alt) konzipiert und dient als Modell für die metastasierte Besiedlung des Gehirns. Etwaige Änderungen am Protokoll sollten mit dem benannten Tierschutzbeauftragten besprochen werden.

1. Präoperative Verfahren

1. Akklimatisierung der Tiere
   HINWEIS: Mäuse müssen mindestens 7 Tage vor Beginn der experimentellen Verfahren akklimatisiert sein.
   1. Versuchstiere werden in Gruppen unter standardisierten Laborbedingungen (22 ± 2 °C, 50-60 % relative Luftfeuchtigkeit, 12 Stunden Hell/Dunkel-Zyklus) mit Ad-Libitum-Zugang zu Futter und Wasser untergebracht.
   2. Um das Wohlbefinden zu fördern und Stress zu reduzieren, bieten Sie Umweltbereicherung in Form von Nistmaterial, Unterkünften und Nagblöcken.
   3. Behandle die Tiere einmal täglich (3-5 Minuten pro Sitzung) während der Eingewöhnungsphase, um sie mit menschlichem Kontakt vertraut zu machen. Zusätzlich führen Sie Probeverfahren durch, die zentrale Aspekte der bevorstehenden Operation simulieren, einschließlich Wiegen und Exposition gegenüber dem Anästhesie-Setup, ohne invasive Interventionen durchzuführen. Diese Sitzungen zielen darauf ab, die Tiere an das prozedurale Umfeld zu gewöhnen und stressbedingte Variabilität zu minimieren.
2. Körperliche Untersuchung (präoperative Gesundheitskontrolle)
   HINWEIS: Vor der Tumorzellinjektion müssen alle Tiere einer gründlichen körperlichen und neurologischen Untersuchung unterzogen werden, um vorbestehende Anomalien, die nicht mit der Studie in Zusammenhang stehen, auszuschließen. Tiere mit Defiziten oder Anomalien sollten aus der Studie ausgeschlossen werden. Die körperliche Untersuchung kann am Tag vor der Injektion durchgeführt werden.
   1. Führen Sie eine vollständige körperliche Untersuchung durch, um die allgemeine Gesundheit zu bewerten, einschließlich Fellzustand, Haltung, Atmung, Gang, Körpergewicht und allgemeines Verhaltens.
   2. Bewerten Sie die neurologische Funktion mit dem Hanging Wire Test, um Griffstärke und Koordination zu beurteilen. Um den Hängedrahttest durchzuführen, hängen Sie einen horizontalen Draht (etwa 2 mm im Durchmesser) zwischen zwei Stützen, wobei an den Enden Fluchtplattformen etwa 30 cm über einer gepolsterten Oberfläche positioniert sind. Platziere die Maus in die Mitte des Drahts und lass sie den Draht mit den Vorderpfoten greifen. Lass die Maus los und beginne sofort mit dem Timing. Beenden Sie die Prüfung, wenn die Maus entweder eine der Plattformen erreicht oder fällt. Betrachte eine Maus als erfolgreich, wenn sie die Plattform innerhalb von 60 Sekunden erreicht; Registriert als Fehlschlag, wenn er innerhalb dieses Zeitlimits den Bahnsteig erreicht oder nicht erreicht.
3. Vorbereitung von Arbeitsplätzen
   1. Am Tag der Operation (Tag 0) richten Sie vier dedizierte Arbeitsstationen wie unten beschrieben ein, um einen effizienten Arbeitsablauf zu gewährleisten und die sterile Technik während des gesamten Eingriffs aufrechtzuerhalten.
      HINWEIS: Verwenden Sie sterile chirurgische Materialien (Unterlagen, Mullkompressen, Nähte usw.) und autoklavierte chirurgische Instrumente (Skalpell, Pinzette, Schere, Pfannenwender usw.).
      1. Arbeitsstation #1 – Tiervorbereitung vor der Operation: Verwenden Sie diese Arbeitsstelle, um die Mäuse zu wiegen, die Anästhesielösung vorzubereiten und die Anästhesie zu verabreichen. Bereiten Sie eine saubere Oberfläche vor, die eine Waage, zwei Käfige mit Einstreu enthält (einen für narkosierte Mäuse bestimmt), eine 1-ml-Spritze mit der Betäubungslösung und eine Augensalbe.
      2. Arbeitsstation #2 – Vor- und Nachoperationsaufbau: Nutzen Sie diese Arbeitsstation, um den Kopfschnitt durchzuführen, den Schädel zu versiegeln und die Wunde zu nähen. Bereiten Sie eine saubere Oberfläche vor, die ein Skalpell, eine 10-ml-Spritze mit 0,9 % NaCl, Knochenwachs, einen Spatel, Nahtmaterial, Pinzetten und Scheren, Wattestäbchen, Desinfektionsmittel (70 % Ethanol), eine 1-ml-Spritze mit Schmerzmitteln sowie ein Heizkissen oder eine ähnliche Wärmeplattform enthält.
      3. Arbeitsstation #3 – Vorbereitung der Tumorzellen: Verwenden Sie diese Arbeitsstelle, um die Tumorzelllösung vor der Impfung vorzubereiten. Bereiten Sie eine saubere Oberfläche mit einer 10 μL Hamilton-Spritze und einem Eppendorf-Rohr mit Zellsuspension in einem extrazellulären Matrixmedium (ECM) vor, einer Pipette mit 100 μL Spitzen zum Resuspendieren der Zellen sowie drei Gefäßen zur Reinigung der Hamilton-Spritze nach der Tumorzelleninokulation mit destilliertem Wasser, 70 % Ethanol und 0,9 % NaCl.
      4. Arbeitsstation #4 – Stereotaktische Injektion: Verwenden Sie diese Arbeitsstation, um die stereotaktische Tumorzellinjektion in den Großhirnrinde durchzuführen. Bereiten Sie eine saubere Oberfläche vor, die den stereotaktischen Rahmen für kleine Tiere, einen Präzisionszahnbohrer, große Pinzetten und Wattestäbchen enthält.
4. Herstellung der Tumorzellsuspension
   HINWEIS: Alle Verfahren zur Herstellung der Tumorzellsuspension müssen in einem zertifizierten biologischen Sicherheitsschrank (Klasse II Kapuze) mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA), einschließlich Laborkittel, Handschuhen und Augenschutz, durchgeführt werden, um Sterilität zu gewährleisten und das Personal vor möglicher Biohazard-Exposition zu schützen.
   1. Trypsinisiere Zellen mit 1 ml Trypsin 1x EDTA.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, Tumorzellen in der exponentiellen Wachstumsphase zu verwenden.
   2. Bestimmen Sie die Zellzählung genau mit einer geeigneten Zählmethode (z. B. Hämozytometer oder automatischem Zellzähler).
   3. Bereiten Sie eine Zellsuspension vor, die pro Tier 1 x 10^{× 3} Zellen in 3 μL ECM-Medium enthält. Verwenden Sie eine 2:1-Mischung aus ECM und einem Standardkulturmedium mit 10 % FCS und anderen Nahrungsergänzungsmitteln, wenn es passend ist. Skalieren Sie das Suspensionsvolumen und die Zellanzahl entsprechend der Anzahl der Tiere (z. B. bereiten Sie bei 10 Mäusen 10 × 10³ Zellen in 30 μL ECM-Medium vor).
      HINWEIS: Die Anzahl der injizierten Zellen sollte für jede Zelllinie sorgfältig getitriert werden.
   4. Lassen Sie die Zellsuspension bis zur Injektion auf Eis, maximal 2 Stunden.

2. Intraoperative Eingriffe

1. Mausanästhesie
   1. Wiegen Sie jede Maus mit einer Präzisionswaage und berechnen Sie das erforderliche Volumen an Anästhetikum basierend auf dem Körpergewicht.
   2. Verabreichen Sie das berechnete Volumen des Anästhetikums intraperitoneal.
      HINWEIS: Verwenden Sie ein Anästhesie-Regime, das den gesamten Eingriff abdeckt (etwa 2 Stunden). Zum Beispiel: Ketamin 10 % (Ketaminhydrochlorid, 100 mg/mL; 100 mg/kg Körpergewicht) kombiniert mit Domitor (Medetomidinhydrochlorid, 1 mg/mL; 0,25 mg/kg Körpergewicht) oder einem gleichwertigen Protokoll.
   3. Sobald die ausreichende Anästhesietiefe bestätigt ist, legt man die Maus auf ein vorgewärmtes Heizkissen (bei 37–38 °C gehalten), um die Thermoregulation zu unterstützen, und trägt Augensalbe auf, um die Hornhaut vor dem Austrocknen zu schützen.
      HINWEIS: Überprüfen Sie die ausreichende Anästhesietiefe, indem Sie die Hinterpfote sanft mit einer Pinzette kneifen. Operieren Sie nur, wenn kein Entzugsreflex festgestellt wird.
2. Kopfhautvorbereitung und Schnitt
   1. Verabreichen Sie Lidocain präoperativ, um eine lokale Betäubung an der Schnittstelle zu gewährleisten. Verwenden Sie eine 1%ige Lidocain-Lösung (5 mg/mL) und injizieren Sie etwa 0,05–0,1 ml subkutan entlang der geplanten Schnittlinie. Lassen Sie mindestens 2-3 Minuten ein, damit das Anästhetikum wirkt, bevor Sie mit dem Kopfhautschnitt fortfahren.
   2. Desinfizieren Sie die Kopfhaut gründlich mit einer jodbasierten Lösung.
   3. Spannen Sie die Haut straff und machen Sie mit einem sterilen Skalpell einen Mittellinienschnitt von etwa 3–4 mm entlang des Schädels.
   4. Mit demselben Skalpell kratzen Sie vorsichtig das Periost ab, um die Schädeloberfläche freizulegen.
3. Stereotaktischer Rahmenaufbau, Koordinatenidentifikation und Kraniotomie
   1. Sichern Sie den Kopf der Maus im stereotaktischen Rahmen mit Ohrbügeln.
   2. Mit dem stereotaktischen Arm lokalisieren Sie Bregma (die Schnittstelle der koronalen und sagittalen Schädelnähte), bewegen Sie den stereotaktischen Arm 2 mm vorder und 1 mm lateral (rechts) zur Zielinjektionsstelle im Frontallinex, wie in Abbildung 1B gezeigt, und markieren sie mit einem chirurgischen Marker.
      HINWEIS: Befindet sich ein Blutgefäß an der vorgesehenen Injektionsstelle, kann die Stelle um bis zu 0,5 mm angepasst werden, um eine Blutung zu verhindern.
   3. Bohren Sie vorsichtig mit einem präzisen Zahnbohrer durch den Schädel und achten Sie darauf, die Dura Mater nicht zu durchdringen.
   4. Überprüfen Sie die Öffnung, indem Sie vorsichtig mit einer sterilen Zange tasten, um nach Durchbruch zu tasten.
4. Tumorzellinjektion
   HINWEIS: Arbeiten Sie während dieses Schritts schnell, da ECM bei Raumtemperatur zu erstarren beginnt, was die Genauigkeit und Konsistenz der Injektion beeinträchtigen kann.
   1. Suspendieren Sie die Tumorzellsuspension gründlich wieder, indem Sie sie auf und ab pipetten, um eine gleichmäßige Verteilung sicherzustellen.
      HINWEIS: Vermeiden Sie Vortexen, um die Bildung von Luftblasen zu verhindern.
   2. Laden Sie 3 μL der Zellsuspension in eine 10 μL Hamilton-Spritze und setzen Sie sie mit dem entsprechenden Halter in den stereotaktischen Rahmen.
   3. Positioniere die Spritzennadel vorsichtig über dem Gratloch.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Fasen der Nadel nach links zeigt, um die Reproduzierbarkeit während der Injektion zu verbessern.
   4. Führe die Nadel vertikal ins Hirngewebe bis zu einer Tiefe von 3,5 mm ein. Sobald diese Tiefe erreicht ist, ziehen Sie die Nadel langsam um 0,5 mm zurück, um den Rückfluss der Zellsuspension während und nach der Injektion zu verhindern.
   5. Injizieren Sie die 3 μL Tumorzellsuspension langsam über einen Zeitraum von 1 Minute. Nachdem das gesamte Volumen verabreicht ist, lassen Sie die Nadel noch weitere 2 Minuten an Ort und Stelle halten, damit sich die Zellen und die ECM setzen können und das Rückflussrisiko minimiert wird.
   6. Ziehen Sie die Spritze vorsichtig heraus und nehmen Sie die Maus aus dem stereotaktischen Rahmen.
5. Nähte und Erholung von der Narkose
   1. Spülen Sie den Schädel vorsichtig mit steriler 0,9%iger NaCl-Lösung ab.
   2. Trocknen und versiegeln Sie das Gratloch mit Knochenwachs.
   3. Schließen Sie den Kopfhautschnitt mit 3 bis 4 Nähten, wobei jede Naht mit drei festen Knoten nahe den Wundrändern für eine ordnungsgemäße Heilung verbunden ist.
   4. Markieren Sie die Ohren der Maus mit einem passenden Ohrlochmuster, das der angegebenen Identifikationsnummer entspricht.
   5. Tragen Sie bei Bedarf die Augensalbe erneut auf, um das Austrocknen der Hornhaut während der Erholung zu verhindern. Unmittelbar danach werden die Maus wieder in ein vorgewärmtes Heizkissen (bei 37–38 °C gehalten) zurückgegeben, um die Thermoregulation zu unterstützen und eine reibungslose Anästhesie-Erholung zu ermöglichen.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, Mäuse während der Genesung einzeln zu unterbringen, um Verletzungen durch Interaktionen zwischen wachen und erholenden Tieren zu vermeiden.
   6. Gründlich reinigen und desinfizieren Sie die Hamilton-Spritze, indem Sie Nadel und Fass dreimal hintereinander abspülen: zuerst mit destilliertem Wasser, dann mit 70 % Ethanol und schließlich mit steriler 0,9 % NaCl-Lösung.
   7. Nach der Reinigung bewahren Sie die Hamilton-Spritze auf Eis auf, bis sie sie wieder verwendet.

3. Postoperative Eingriffe

1. Postoperative Analgesie
   1. Verabreichen Sie Schmerzmittel subkutan, während die Maus noch unter Narkose ist, um sofortige Schmerzlinderung nach der Operation sicherzustellen.
      HINWEIS: Verwenden Sie Analgetika, die für diese Art des Eingriffs geeignet sind. Zum Beispiel Carprofen mit 10 mg/kg Körpergewicht.
   2. Sobald die Maus vollständig wach ist und die normale motorische Funktion wiederhergestellt hat, bringen Sie sie in einen sauberen Käfig mit frischer Einstreu. Überwachen Sie das Tier kurz auf normales Verhalten und Atemmuster.
   3. Nach vollständiger Genesung sollten Sie mindestens 24 Stunden nach der Operation Analgesie mittels Trinkwasser (z. B. Metamizol mit 200 mg/kg Körpergewicht) verabreichen.
      HINWEIS: Um die Wasseraufnahme zu fördern, süßen Sie das Trinkwasser mit 0,5 % Saccharose. Wickeln Sie Trinkflaschen in Alufolie, um die Lösung vor Licht zu schützen, und ersetzen Sie sie täglich. Beschrifte jede Flasche, um die Aufnahme von Schmerzmitteln zu verfolgen. Wenn Schmerzmittel nicht über Wasser eingenommen werden oder Schmerzanzeichen festgestellt werden, verabreichen Sie Carprofen (10 mg/kg Körpergewicht) subkutan alle 12 Stunden bis zur vollständigen Genesung.
2. Mausüberwachung
   1. Überwachen Sie alle Mäuse alle 24 Stunden während der ersten 48 Stunden nach der Operation genau und bewerten Sie die motorische Funktion und das Verhalten. Ab Tag 3 überwachen Sie die Mäuse mindestens alle 3 Tage, einschließlich Körpergewichtsmessungen.
   2. Wenn Anzeichen von Belastung oder abnormalem Verhalten festgestellt werden (z. B. beeinträchtigte motorische Aktivität, ungewöhnliches Verhalten), führen Sie den Hängedrahttest wie zuvor beschrieben durch. Wenn die Maus den Test besteht, überwachen Sie weiter und wiederholen Sie den Test jeden zweiten Tag.
   3. Euthanasieren Sie Mäuse sofort (siehe Abschnitt 3.4), sobald einer der vordefinierten humanen Endpunkte erreicht wird: Gewichtsverlust > 20 % ab dem Anfangsgewicht (Tag 0), Nichtbestehen des Hängedrahttests oder anhaltender mäßiger Stress bis zu 48 Stunden.
3. Therapeutische Behandlung (optional)
   1. Nach vollständiger postoperativer Genesung kann je nach experimenteller Erholung ein therapeutisches Regime eingeleitet werden. Falls dies der Fall ist, definieren Sie den Zeitpunkt des Behandlungsbeginns klar im Studienprotokoll und passen Sie den Überwachungsplan an die erwarteten Effekte und potenziellen Nebenwirkungen der therapeutischen Intervention an.
      HINWEIS: Die Behandlung sollte erst beginnen, wenn die Tiere normales Verhalten, ein stabiles Gewicht und keine Anzeichen postoperativer Belastungen zeigen.
4. Euthanasie und Gewebesammlung
   HINWEIS: Mäuse müssen unmittelbar nach Erreichen vordefinierter humaner Endpunkte oder zu festgelegten experimentellen Zeitpunkten eingeschläfert werden, je nach den spezifischen Forschungszielen.
   1. Betäuben Sie die Maus mit einer geeigneten Methode (siehe Schritt 2.1.2).
   2. Öffnen Sie die Brusthöhle und führen Sie transkardiale Perfusion mit 10–20 ml eiskalten sterilen 0,9 % NaCl durch, gefolgt von 10–20 ml eiskalten 4 % Paraformaldehyd (PFA).
      HINWEIS: Wenn frisches Gewebe für nachgelagerte Anwendungen benötigt wird (z. B. RNA-Isolierung oder FACS), sollte der PFA-Perfusionsschritt weggelassen werden.
   3. Sammeln Sie das Gehirn und andere interessante Organe.
      HINWEIS: Die Organe können in flüssigem Stickstoff gefroren, für die FFPE-Verarbeitung in Formalin fixiert oder direkt für nachgelagerte Analysen verwendet werden.
5. Strukturierte Postmortale Analyse
   HINWEIS: Um metastasiertes Wachstum zu bestätigen und zugehörige histopathologische Merkmale zu charakterisieren, sollte eine postmortale Analyse des Hirngewebes sowohl mit nativen (frisch gefrorenen) als auch fixierten (FFPE) Proben durchgeführt werden.
   1. Gewebedissektion
      1. Sezieren Sie das Gehirn auf Höhe der Injektionsstelle, wie im in Abbildung 1C angegebenen Schema dargestellt.
      2. Bewahren Sie den vorderen Teil für die frisch gefrorene (FF) Verarbeitung auf. Teilen Sie diesen Teil in injizierte (i.) und nicht injizierte (n.i.) Hemisphären.
      3. Bewahren Sie den zentralen Teil für die Formalinfixierung und Paraffineinbettung (FFPE).
      4. Entfernen Sie den hinteren Teil, einschließlich des Kleinhirns und des Hirnstamms.
   2. Probenverarbeitung
      1. Den vorderen Teil mit flüssigem Stickstoff einfrieren und FF-Proben bei -80 °C bis zur weiteren Verwendung aufbewahren.
      2. Fixiere den zentralen Teil 48 Stunden vor der FFPE-Verarbeitung in 5-7 ml 4 % PFA bei Raumtemperatur.
         HINWEIS: Die PFA-Fixierung muss in einer chemischen Abgashaube durchgeführt werden, während geeignete PSA getragen wird, um eine Exposition gegenüber giftigen Dämpfen zu vermeiden.
   3. Quantifizierung der metastatischen Last (FF-Proben)
      1. Isolieren Sie die gesamte RNA mit einem geeigneten Extraktionskit oder Protokoll, das für Hirngewebe optimiert ist.
         HINWEIS: Die RNA-Isolierung muss in einem biologischen Sicherheitsschrank mit geeigneter PSA durchgeführt werden, um Kontamination und Exposition gegenüber gefährlichen Reagenzien zu verhindern.
      2. Führen Sie quantitative PCR (qPCR) mit einem tumorzellspezifischen Marker wie Ck8 durch.
         HINWEIS: Weitere Ziele (z. B. Immun- oder Stromenzellenmarker) können durch Auswahl geeigneter Genmarker bewertet werden. RNA-Sequenzierung (RNA-seq) kann als Alternative zur transkriptomweiten Analyse verwendet werden.
      3. Berechnen Sie die relative Tumorlast, indem Sie das interessierende Gen (GOI, z. B. Ck8) auf ein Housekeeping-Gen (HK) normalisieren.
   4. Histologische Analyse (FFPE-Proben)
      1. Formalinfixiertes Gewebe in Paraffin einbetten.
      2. Proben werden mit einem Mikrotom in 3 μm dicke Schnitte geschnitten.
         HINWEIS: Die Nutzung des Mikrotoms muss von geschultem Personal mit geeigneter Schutzausrüstung durchgeführt werden, wobei beim Schneiden der Klingenschutz verwendet und Klingen in scharfen Behältern entsorgt werden, um die Sicherheit zu gewährleisten.
      3. Durchführung der Standard-Hämatoxylin- und Eosin-(H&E)-Färbung sowie Immunhistochemie (IHC) mit relevanten Antikörpern wie Ck8 (Tumorzellen), Cd3 (T-Zellen), Iba1 (Mikroglia/Makrophagen) und Gfap (Astrozyten).
         HINWEIS: H&E- und IHC-Verfahren müssen in einem gut belüfteten Bereich oder Dampfhaube durchgeführt werden, um die Sicherheit zu gewährleisten und eine Chemikalienexposition zu vermeiden.
      4. Scannen Sie alle gefärbten Objektträger digital mit einem hochauflösenden Diascanner, um eine digitale Gewebebibliothek aufzubauen.
      5. Bewerten Sie das histologische Wachstumsmuster (HGP) der Hirnmetastasen gemäß dem veröffentlichten Protokoll^10,12.

Ergebnisse

Das stereotaktische Injektionsprotokoll (Abbildung 1) kann je nach wissenschaftlicher Fragestellung sowohl auf syngene als auch auf Xenograft-Mausmodelle angewendet werden, einschließlich Wildtyp- oder gentechnisch veränderter Stämme. Jede geeignete Zelllinie, die im Gehirn wachsen kann, kann verwendet werden. Beispiele für Maustumorzelllinien, die das Gehirn besiedeln können, sind unter anderem die Brusttumorzellen 4T1 und 410.4, die Darmkrebszellen CMT93 und die Melanomzelllinie B16-F10. Die Zeit, die Tumorzellen benötigen, um Metastasen im Gehirn zu etablieren, variiert je nach Zelllinie und reicht von wenigen Tagen bis zu mehreren Wochen, und die Penetranz ist ebenfalls variabel. Wir empfehlen die Verwendung eines Modells mit ~70 % Durchdringung, was bedeutet, dass mindestens 7 von 10 Tieren innerhalb eines maximalen experimentellen Zeitraums von 20 Wochen Metastasen entwickeln (Abbildung 2A). Jede Zelllinie sollte individuell optimiert und die Anzahl der injizierten Zellen sorgfältig getitriert werden.

Als Beispiel verglichen wir zwei eng verwandte syngene Brustkrebs-Hirnmetastasenmodelle: 410.4 und deren Ableitung 4T1. Trotz ihrer genetischen Ähnlichkeit¹⁷ zeigen diese Zelllinien deutlich unterschiedliche metastatische Verhaltensweisen und Wachstumsmuster im Gehirn¹⁶. Obwohl beide eine ähnliche metastatische Belastung (Abbildung 2B) erreichen, zeigt jede einen einzigartigen Zeitverlauf (Abbildung 2C) und deutlich unterschiedliche HGPs (Abbildung 2D). Um die Kolonisierungseffizienz zwischen verschiedenen Zelllinien systematisch zu bewerten und zu vergleichen, entwickelten wir den Colonization Index, eine mathematische Formel, die die Anzahl der injizierten Zellen, die mediane Überlebenszeit und den Erfolg der Kolonisierung integriert (Abbildung 2E-G).

Beim ersten Durchführen der stereotaktischen Injektion oder beim Testen einer neuen Zelllinie ist es wichtig, Wachstumsmuster sorgfältig zu bewerten und Ergebnisse bei Tieren, Operationen und Experimentatoren zu vergleichen, um die Reproduzierbarkeit sicherzustellen. Ein entscheidender Schritt ist die Injektion der Tumorzellen, bei der ein Auslaufen der Zellsuspension auftreten kann. Dies kann zu irreführender Tumorlokalisierung führen, insbesondere zur iatrogenen Aussäung von Tumorzellen auf den Schädel und/oder die Meningen, was potenziell zu falsch-positiven meningealen Metastasen führen kann, die keine echte intrazerebrale Besiedlung mit anschließender sekundärer meningealer Verbreitung darstellt. Diese Szenarien sind in Abbildung 3 dargestellt.

Abbildung 1: Vor-, intra- und postoperative Verfahren für die stereotaktische intrakortikale Tumorzellinjektion bei Mäusen. Schematische Übersicht des Verfahrens. (A) Die präoperative Phase umfasst die Akklimatisierung der Tiere, Gesundheitsbewertung, Vorbereitung des Operationsstelles und die Tumorzellaufhängung. (B) Die intraoperative Phase umfasst Anästheseinduktion, Kopfhautschnitt, Platzierung im stereotaktischen Rahmen, präzise Kraniotomie, Injektion von Tumorzellen in den Großhirnrinde mittels stereotaktischer Koordinaten, Wundverschluss und Erholung aus der Anästhesie. (C) Die postoperative Phase umfasst die Verabreichung von Schmerzmitteln, routinemäßige Überwachung zur Beurteilung der postoperativen Genesung, den allgemeinen Gesundheitszustand und die Entwicklung neurologischer Symptome (Hängedrahttest), gefolgt von Euthanasie und Organentnahme. Eine strukturierte Postmortem-Analyse ist enthalten, um die metastatische Last in frisch eingefrorenem (FF) Gewebe mittels qPCR zu beurteilen und histologische Wachstumsmuster in FFPE-Proben aus einer digitalen Dia-Bibliothek zu bewerten. Wichtige Verfahrensphasen werden fortlaufend dargestellt, um das Timing und den chirurgischen Arbeitsablauf zu betonen. Bild erstellt in BioRender. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Repräsentative Ergebnisse des metastatischen Wachstums in Mausmodellen von Hirnmetastasen nach stereotaktischer Injektion von 4T1- und 410,4-Brustkrebszellen. (A) Makroskopische Bilder, die das Fehlen von Tumorwachstum bei ECM-injizierten Kontrollmäusen Balb/C (Kontroll) und das Vorhandensein sichtbarer metastatischer Läsionen bei Mäusen zeigen, die mit Tumorzell-ECM-Suspensionen injiziert wurden (Met). (B) Quantifizierung der metastatischen Belastung bei ECM-injizierten Kontrollmäusen (CTRL) und Mäusen mit Hirnmetastasen, die aus 4T1- und 410.4-Brustkrebs-Zellen abgeleitet sind. Die metastatische Last wurde mittels qPCR unter Verwendung von Ck8 als Tumormarker bewertet, mit Gapdh und Pgk1 als Housekeeping-Gene (HK). Die Daten werden als Mittelwerte mit einzelnen Datenpunkten präsentiert. Die statistische Analyse wurde mit Einweg-ANOVA durchgeführt, gefolgt von Dunnetts Mehrfachvergleichstest (n = 5; ****P < 0,0001). (C) Kaplan-Meier-Überlebenskurven, die das Gesamtüberleben (OS) von Mäusen vergleichen, die stereotaktisch ausschließlich mit ECM (Kontroll, schwarz), 4T1 (orange) oder 410,4 (blauen) Tumorzellen injiziert wurden. Die statistische Analyse erfolgte mit dem Log-Rank-Test (Mantel-Cox) (4T1 vs 410,4; n = 10; ***P < 0,001). (D) Repräsentative histologische Bilder von Hirnmetastasen, abgeleitet aus 4T1- und 410.4-Zellen, die Unterschiede in Wachstumsmustern veranschaulichen, einschließlich Kohorten- bzw. strangartiger infiltrativer epithelialer HGPs. Gewebeschnitte wurden mit einem Anti-Cytokeratin-8-Antikörper gefärbt. (E) Vergleichende Analyse der Kolonisierungseffizienz mit dem Kolonisierungsindex (KI). KI-Werte von 4T1 (orange) und 410,4 (blau) werden angezeigt. (F) Formel zur Berechnung des KI. (G) Tabelle, die die im CI enthaltenen Parameter für beide Modelle zusammenfasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Repräsentative Beispiele für erfolgreiche und suboptimale stereotaktische Injektionsergebnisse. (A,C) Makroskopische Bilder, die metastasiertes Wachstum an verschiedenen Stellen zeigen: (A) Tumorwachstum im Schädel und in den Meningen durch eine falsche Injektion und das Auslaufen von Tumorzellen, und (C) erfolgreiche Parenchymalmetastase nach ordnungsgemäßer intrakortikaler Injektion. (B,D) Entsprechende histologische Schnitte bestätigen (B) das intrameningeale Tumorwachstum mit anschließender Infiltration in das Hirnparenchym und (D) die sekundäre Verbreitung der Meningen durch eine etablierte Parenchymalmetastase. Gewebeschnitte wurden mit einem Anti-Cytokeratin-8-Antikörper gefärbt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Diskussion

Die stereotaktische intrakranielle Injektionstechnik ermöglicht die präzise und lokalisierte Abgabe von Tumorzellen oder zellulären Gemischen direkt in den Großhirnrinde experimenteller Mäuse. In Kombination mit einer strukturierten Postmortemanalyse ist dieses Modell besonders wertvoll zur Untersuchung später Stadien von Gehirnmetastasen, einschließlich metastasiertem Auswachsen, sekundärer intraorganischer Verbreitung und der möglichen Todesursache. Im Gegensatz dazu eignen sich systemische Injektionsmethoden (z. B. Schwanzvenen- oder intrakardiale Injektion) besser, um die frühen Schritte der metastatischen Kaskade zu untersuchen, wie das Überleben von Tumorzellen im Kreislauf, die Extravasation und die Aussaatung in entfernten Organen. Diese Ansätze sind jedoch nicht hirnspezifisch und führen typischerweise zu niedrigen und inkonsistenten Hirnkolonisierungsraten^{von 18, 19 und 20}.

Systemische Modelle zeigen zudem eine hohe biologische Variabilität, insbesondere hinsichtlich der betroffenen Hirnregionen, was therapeutische Studien herausfordernd macht und große Tierkohorten erfordert. Außerdem entwickeln Tiere häufig extrakranielle Metastasen, die zu einem frühen Abbruch der Versuche^{führen können}. Diese Einschränkungen verringern ihre Nützlichkeit für die Untersuchung von späten Hirnmetastasen erheblich. Zudem ist die sekundäre Verbreitung und Wiederbesiedlung mit systemischen Modellen besonders schwer zu untersuchen, da die Unterscheidung zwischen primärer Ausbreitung (ausgehend vom primären Tumor) und sekundärer Ausbreitung (verursacht durch bereits etablierte Metastase) nahezu unmöglich ist. Darüber hinaus ist eine strukturierte postmortale Analyse, insbesondere zur Bewertung des makrometastasierten Wachstums und der HGPs von Hirnmetastasen, in diesen Situationen begrenzt.

Im Vergleich zu ex vivo Systemen wie patientenabgeleiteten Organoiden (PDOs) und organotypischen Gehirnschnittkulturen^(21,22,23,24) bietet die stereotaktische Injektion mehrere entscheidende Vorteile. Während ex-vivo-Modelle Aspekte der nativen Gehirnarchitektur bewahren und möglicherweise ansässige und infiltrierende Immunzellen von Patienten oder Spendern enthalten, fehlt ihnen die Gefäßbildung, systemische Signalübertragung und die volle Komplexität des in vivo Tumor-Mikroumfelds, insbesondere die weitere Infiltration von T-Zellen oder anderen aus Blut oder Knochenmark abgeleiteten Immunzellen²³. Diese Einschränkungen beschränken ihre Anwendung auf Kurzzeitstudien und vereinfachte Umgebungen, wie etwa Drogentests oder grundlegende metastasierte Zell-Hirn-Interaktionstests. Im Gegensatz dazu unterstützt der stereotaktische Ansatz Langzeitstudien zum Tumorverlauf, zur Immunantwort und zur therapeutischen Intervention in einem lebenden, intakten Organismus. Wichtig ist, dass die Bewertung neurologischer Symptome als humaner Endpunkt eine klinisch relevante Messung des makrometastatischen Auftretens ermöglicht. Dadurch spiegelt das Modell noch stärker den Verlauf der menschlichen Krankheit wider, was besonders in der translationalen Forschung von Wert ist. Obwohl es den Einsatz von Tieren beinhaltet, was ethische Überlegungen aufwirft, die durch die Einhaltung der 3Rs (Ersatz, Reduktion und Verfeinerung) berücksichtigt werden, kann dieses Modell derzeit nicht vollständig durch ex-vivo-Alternativen ersetzt werden. Seine Fähigkeit, den vollständigen physiologischen Kontext der Gehirnmetastasen zu replizieren, macht sie unentbehrlich, um unser Verständnis der metastatischen Dynamik und der zennsspezifischen Pathophysiologie zu fördern.

Trotz seiner zahlreichen Vorteile hat das stereotaktische Injektionsmodell einige Einschränkungen, die berücksichtigt werden sollten. Ein zentrales Problem ist das mögliche Auslaufen der Tumorzellsuspension während der Injektion, was zu irreführenden Wachstumsmustern führen kann. Insbesondere kann eine unbeabsichtigte Anhaftung von Tumorzellen an den Meningen zu iatrogenen meningealen Metastasen⁸ führen, die den natürlichen Verlauf der metastasierenden Ausbreitung in dieser speziellen Zelllinie nicht genau widerspiegelt. Um die Zuverlässigkeit der Daten sicherzustellen, sollten die Wachstumsmuster einer bestimmten Tumorzelllinie konsequent über Tiere, chirurgische Eingriffe und Experimentatoren hinweg verglichen werden. Um das Lecken von Tumorzellen zu minimieren, schlagen wir die Verwendung der extrazellulären Matrix (ECM) vor, da ihre gelartige Konsistenz und ihre Fähigkeit, bei Körpertemperatur zu erstarren, sie zu einem nützlichen Werkzeug machen. ECM stellt jedoch auch Herausforderungen dar, darunter die Notwendigkeit einer schnellen Handhabung während der Injektion, um eine vorzeitige Verhärtung zu verhindern. Ein weiterer Aspekt in unserem Protokoll ist, dass Tumorzellen in einer Mischung aus ECM und serumhaltigen Medien injiziert werden. Während FBS die Tumorzellentransplantation fördert, indem es Nährstoffe liefert, die im Gehirn typischerweise begrenzt sind, kann es auch Entzündungen fördern. Wenn dies ein Problem ist, können serumfreie Medien oder ausgewogene Salzlösungen (z. B. HBSS oder PBS) als Alternativen verwendet werden.

Darüber hinaus ist die stereotaktische Injektion technisch anspruchsvoller als andere Methoden, wie etwa intravenöse (i.v.)-Injektion. Es erfordert eine spezielle Schulung, um die Reproduzierbarkeit sicherzustellen, und der Eingriff ist deutlich zeitaufwändiger und dauert typischerweise 15–30 Minuten pro Tier im Vergleich zu 3–5 Minuten für Intraven-Injektionen. Diese längere Dauer begrenzt die Anzahl der Tiere, die pro Sitzung verarbeitet werden können, was eine Herausforderung für therapeutische Studien darstellen kann, die große Kohorten erfordern, um statistische Stärke zu erreichen. Diese Einschränkung kann jedoch effektiv durch die Verteilung der Injektionen über mehrere Tage behoben werden, was nicht nur die experimentelle Flexibilität und Machbarkeit erhöht, sondern auch wertvolle biologische Variabilität einführt, die realistischere interindividuelle Unterschiede sowohl im Verhalten der Tumorzellen als auch in der Wirtsreaktion widerspiegelt.

Abschließend ist es wichtig zu beachten, dass dieses Modell frühere Schritte der metastatischen Kaskade, wie bereits besprochen, umgeht. Das passende experimentelle Modell sollte anhand der Forschungsfrage und der spezifischen Metastasephase ausgewählt werden. Für die Untersuchung der späten Gehirnkolonisierung bleibt die stereotaktische intrakortikale Injektion der Goldstandard.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Tierohr-Puncherzange	LabArt
Bepanthen® Augen- und Nasensalbe	Bayer Vital GmbH	1578675
Knochenwachs	B. Braun	210434
Wattestäbchen	Hartmann	143213
Cultrex-Basementmembran (ECM)-Extrakt	B& D	3432-005-01
Desinfektionsmittel	B. Braun	107190
Bohrer	Bilaney Consultants GmbH	D #76
Augenschere	Hermle	501
Hamilton-Spritze (10µ L-Volumen)	VWR	5491135
Heizkissen	Intergastro	258122
Mausnase/Zahnbar-Test (900/1430)	Bilaney Consultants GmbH	DKI 926-B
Noyes Augenschere	Hermle	545
Paur 60 Grad; tip non noptore Maus-Ohrbügel	Bilaney Consultants GmbH	DKI 922
Skalpell	PFM Medical AG	17027
Semkin-Standardpinzette	Hermle	710
Seralon-Polyamidnaht (DR-009, USP 7/0, EP 0,5)	Serag-Wiessner GmbH	V0053491
Stereotaxischer Bohrer – Jacobs Chuck-18000 U/min	Bilaney Consultants GmbH	DKI 1471-200-CE-A
Stereotaxisch ohne Rattenadapter	Bilaney Consultants GmbH	DKI 963 % 920
Spritzen-Hdder für 5& 10µ I Hamilton	Bilaney Consultants GmbH	DKI 1772-F1
TC-Nadelhalter Mayo-Heear 160mm	Hermle	6425