Methodenartikel

Morphologische Charakterisierung der vorderen Regeneration bei Diopatra claparedii

DOI:

10.3791/69421

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13. März 2026

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1Faculty of Science and Marine Environment, Universiti Malaysia Terengganu, 2STEM Foundation Centre, Universiti Malaysia Terengganu

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll bietet einen fokussierten Rahmen zur Charakterisierung des vorderen Regenerationsprozesses bei Diopatra claparedii und dient als entscheidender Schritt für zukünftige regenerative Studien.

Zusammenfassung

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Polychaeten besitzen die Fähigkeit, vordere und hintere Segmente nach einer Verletzung oder Selbstamputation zu regenerieren, was ein handhabbares System zur Untersuchung von Wundreparatur und Gewebemusterung bietet. Zur Unterstützung vergleichender und mechanistischer Studien zur Annelidenregeneration präsentiert diese Studie ein Protokoll zur Einleitung und Charakterisierung der vorderen Regeneration bei Diopatra claparedii (D. claparedii). Das Protokoll beschreibt Schritte für die Probenhandhabung, Immobilisierung und präzise Amputation, gefolgt von geplanten Beobachtungszeitpunkten, um den morphologischen Verlauf während der Regeneration zu dokumentieren. D. claparedii wurden vorsichtig mit einem stumpfen Stab aus ihren Röhren entfernt und mit 4 % Magnesiumchlorid immobilisiert, um Entspannung zu induzieren. Die vordere Amputation wurde am 4. Chaetiger unter einem Stereomikroskop durchgeführt, und der Regenerationsprozess wurde an den Tagen 1, 6, 15, 30 und 60 nach der Amputation überwacht. Das Verfahren ermöglicht eine konsistente Induktion der vorderen Regeneration und erfasst wichtige morphologische Merkmale bei frühem Wundverschluss, Blastemabildung und Segmentwiederherstellung. Durch die Bereitstellung eines reproduzierbaren Arbeitsablaufs und morphologischen Bezugs für D. claparedii bietet dieses Protokoll eine praktische Grundlage, die zukünftige Untersuchungen unterstützt, die darauf abzielen, morphologische Beobachtungen mit zugrunde liegenden zellulären oder molekularen Prozessen der Annelidenregeneration zu verknüpfen.

Einleitung

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Polychaeten machen fast 65 % aller beschriebenen Annelidenarten aus und gehören damit zu den vielfältigsten Gruppen mariner Wirbellosen1. Eine kürzlich aktualisierte Checkliste der Polychaetenarten (Annelida) verzeichnete insgesamt 57 Arten aus 47 Gattungen aus 30 Familien aus den malaysischen Küstengewässern, wobei die Mehrheit der Arten (53 Arten) von der malaysischen Halbinsel2 stammt. Unter ihnen ist Diopatra claparedii (D. claparedii) Grube, 1878, oder lokal bekannt als Ruat Sarung, eine der kommerziell genutzten Polychaetenarten in Malaysia. Er ist überwiegend entlang von Schlammflächen an der Westküste der malaysischen Halbinsel zu finden, darunter Standorte wie Jeram Beach und Selangor 2,3.

D. claparedii gehört zur Familie der Onuphidae und ist ein sesshaftes, röhrenlebendes Polychaete, das für seine Fähigkeit bekannt ist, sowohl vordere als auch hintere Körpersegmente zu regenerieren. Dies umfasst Komponenten des zentralen und peripheren Nervensystems4. Sein gut definierter segmentaler Körperplan und seine ausgeprägte Regenerationskapazität machen D. claparedii zu einem vielversprechenden und handhabbaren Wirbellosenmodell zur Untersuchung der Geweberegeneration in relativ komplexen biologischen Systemen. Die Auswahl von D. claparedii als Modellorganismus für Regenerationsstudien ist auf seine ökologische Relevanz, regionale Bedeutung und die derzeitigen wissenschaftlichen Wissenslücken bezüglich seiner Regenerationskapazität zurückzuführen. Diese Art wird kommerziell gefischt und in Malaysia weit verbreitet als Angelköder verwendet, was darauf hindeutet, dass sie den lokalen Gemeinschaften gut bekannt ist und nicht als seltengilt 2,3. Daher hat die Untersuchung der Regeneration in D. claparedii einen praktischen und wirtschaftlichen Wert, da die Ergebnisse dazu beitragen können, wissenschaftliches Wissen an lokale Akteure weiterzugeben und potenziell Strategien zur Unterstützung der Populationsnachhaltigkeit durch ein verbessertes Verständnis regenerativer Mechanismen zu unterstützen.

Darüber hinaus weist D. claparedii eine spezifische geografische Verbreitung in Südostasien auf, mit besonders hoher Vertretung in malaysischen Küstenökosystemen 2,3. Die meisten Regenerationsstudien an Polychaeten und anderen Anneliden konzentrieren sich jedoch auf Arten aus Amerika oder anderen nicht-asiatischen Regionen 5,6. Zum Beispiel hat die gut untersuchte Diopatra neapolitana (D. neapolitana), die häufig als regenerative Biomarkerart verwendet wird, eine breite Verbreitung über das Rote Meer, den Indischen Ozean, das Mittelmeer und den AtlantischenOzean 7. Daher bleibt die Regenerationsforschung an in Südostasien heimischen Anneliden, einschließlich D. claparedii, begrenzt.

Frühere Studien an Polychaeten zeigten unterschiedliche und reproduzierbare Stadien der Regeneration, darunter Wundverschluss, Blastema-Bildung und segmentale Gewebedifferenzierung 7,8. Obwohl zuvor Studien auf molekularer Ebene zu D. claparedii berichtet wurden, sind Untersuchungen, die sich speziell auf Regeneration konzentrieren, selten. Darüber hinaus hat die bestehende Forschung weitgehend die molekulare Charakterisierung und nicht experimentelle Regenerationsprotokolle betont. Darüber hinaus zeigt D. claparedii sowohl Dedifferenzierungs- als auch Redifferenzierungsprozesse, was Mechanismen widerspiegelt, die eher mit denen höherer Organismen vergleichbar sind9. Diese Komplexität der regenerativen Antwort unterstreicht die wachsende Anerkennung von Polychaeten als wertvolle Zwischenmodelle, die effektiv die Lücke zwischen einfachen und komplexen Wirbeltieren in Regenerationsstudien überbrücken.

Die vorliegende Studie schließt diese Lücke, indem sie ein Regenerationsprotokoll für D. claparedii etabliert und optimiert, das einen robusten Rahmen für zukünftige funktionelle, entwicklungsbezogene und molekulare Untersuchungen der Regeneration bei dieser regional wichtigen Polychaetenart bietet. Konkret bietet dieses Protokoll einen zuverlässigen Ansatz zur Untersuchung der sequentiellen Stadien und der zugrunde liegenden Mechanismen der Regeneration bei Polychaeten. Dies ermöglicht eine systematische Beobachtung und Charakterisierung wichtiger regenerativer Prozesse, einschließlich Wundheilung, Blastema-Bildung und Segmentierung.

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Protokoll

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Ethikerklärung

Diese Studie wurde vom Forschungsethikkomitee der Universiti Malaysia Terengganu unter der Genehmigungsnummer UMT/JKEPH/2026/173 genehmigt

1. Sammlung und Gewöhnung von D. claparedii

  1. Lokalisieren Sie D. claparedii im Schlickflächenbereich der Ästuar-Intertidalzone (mittlere Gezeitenstufe mit mittelfeinem Sand), die als natürlicher Lebensraum dient.
  2. Den oberen Teil der Polychaetenröhren ausgraben, indem Sie vorsichtig mit einer Schaufel ins Sediment graben, um die Röhren nicht zu beschädigen.
  3. Bestätigen Sie das Vorhandensein des Wurms in jedem Rohr, indem Sie das Rohr vorsichtig kneifen und auf Bewegung oder Widerstand prüfen.
  4. Wählen Sie nur Exemplare mit einer minimalen entspannten Körperlänge von 5 cm aus.
    HINWEIS: Wähle Polychaeten nach Körperlänge, um Handhabungsschäden zu reduzieren und Fragmentierung beim Wiegen zu vermeiden.
  5. Sammeln Sie Sedimente mit einer Schaufel von denselben Orten, um die Umweltkonsistenz im Labor zu gewährleisten.
  6. Bringen Sie die gesammelten Proben in tragbaren Kühlbehältern bei Raumtemperatur ins Labor. Decken Sie die Schläuche mit einem mit Meerwasser befeuchteten Handtuch ab, um die Luftfeuchtigkeit zu erhalten und während des Transports Stress zu reduzieren.
  7. Im Labor werden Ablagerungen manuell vom Sediment getrennt und dann unter direkter Sonneneinstrahlung an der Luft getrocknet, bis sie vollständig trocken und frei von Restfeuchtigkeit sind.
  8. Entfernen oder reinigen Sie alle anderen Organismen (z. B. kleine Krabben, Muscheln oder Fremdstoffe), um sicherzustellen, dass das Sediment frei von Schadstoffen ist.
  9. Spülen Sie die Polychaetenrohre mit künstlichem Meerwasser (ASW), um Ablagerungen und lebende Organismen an der Oberfläche zu entfernen.
    HINWEIS: Um ASW herzustellen, mischen Sie 1/4 Tasse Instant Ocean Sea Salt in 1,9 Liter entchlortes, gereinigtes Wasser.
  10. Bereiten Sie Aquarien mit einem Kunststoffaquarium vor, das Sediment vom ursprünglichen Standort enthält, und füllen Sie sie mit künstlicher ASW, eingestellt auf 23–25 ppt Salzgehalt (Abbildung 1). Halten Sie die Wassertemperatur während der gesamten Eingewöhnungszeit konstant bei 28 °C.
    HINWEIS: Das verwendete Volumen der U-Boot-Bekämpfung betrug 58 L, basierend auf den Abmessungen des Aquariums: 61,5 cm (L) x 32 cm (W) x 33,5 cm (H).
  11. Überführen Sie D. claparedii in zylindrische Kunststoffbehälter (7 cm Durchmesser, 15 cm Höhe), die halb mit Sediment gefüllt sind, mit einer Dichte von einem Polychaet pro Behälter.
  12. Tauchen Sie die Behälter vollständig in ein Aquarium mit belüfteter ASW. Lass die Polychaeten sich graben und sich wieder etablieren.
  13. Füttern Sie die Polychaeten 2-3 Mal pro Woche mit sinkendem Fischfutter, um während der Gewöhnungszeit kontinuierliche Nahrung zu gewährleisten. Entfernen Sie regelmäßig überschüssige Nahrung, um Ansammlungen, Pilzwachstum und Kontamination zu verhindern.
  14. Die Habituation wurde durch Verhaltensbeobachtungen bewertet, wobei aktive Erkundung (Körperbewegung) und Nahrungssuchverhalten (Reaktion auf Reize) auf eine Rückkehr zum normalen physiologischen Zustand hindeuteten.
    HINWEIS: Planen Sie eine Gewöhnungszeit von zwei Wochen ein, bevor mit experimentellen Verfahren begonnen wird, damit sich die Würmer von etwaigen Belastungen oder versehentlichen Amputationen während der Entnahme erholen können.

2. Regeneration

  1. Wählen Sie Chaetiger 4 als Standard-Amputationsort, um konsistente und erfolgreiche Regenerationsergebnisse zu gewährleisten 7,9.
    HINWEIS: Die Auswahl der Amputationsstelle an der 4. Klasse basiert auf vorläufigen Ergebnissen. Verwenden Sie Segment 10 nur bei Bedarf – da es sich langsamer regeneriert.
  2. Bereiten Sie eine Anästhesielösung mit 4 % (Gewicht/Volumen) Magnesiumchloridhexahydrat (MgCl₂·6H₂O) in ASW (4 g MgCl₂·6H₂O in 1 L ASW) vor.
  3. Schieben Sie das Polychaete vorsichtig mit einem stumpfen Stab in die vordere Öffnung heraus.
    HINWEIS: Vermeiden Sie es, den Körper während der Entfernung zu beschädigen.
  4. Dann tauchen Sie das Polychaete in die Anästhesielösung, bis es vollständig entspannt und bewegungsunfähig ist (ca. 15 Minuten).
  5. Amputieren Sie am Chaetiger 4 mit einem sterilisierten Skalpell unter einem Stereomikroskop, um Präzision und minimale Gewebeschäden zu gewährleisten (Abbildung 1).
    HINWEIS: Tragen Sie immer geeignete persönliche Schutzausrüstung und achten Sie darauf, Schnitte beim Umgang mit dem Skalpell zu vermeiden.
  6. Bringen Sie den hinteren Teil des Wurms mit einer Pinzette zurück in sein ursprüngliches Röhrchen und setzen Sie zuerst das vordere Ende ein, um das natürliche Wiedergraben zu erleichtern.
  7. Nach diesem Eingriff überwachen Sie die Würmer täglich auf Verhaltensänderungen und körperlichen Zustand, einschließlich Anzeichen von Infektion, Gewebeverfall oder Sterblichkeit.
    HINWEIS: Personen mit abnormalem Verhalten, sichtbarer Nekrose oder fortschreitender Verschlechterung galten als erfolglos in der Genesung und wurden von weiteren Analysen ausgeschlossen.
  8. Halten Sie in diesem Stadium die Nahrung zurück, bis die Regeneration fortschreitet, da der Mundbereich aufgrund der vorderen Amputation fehlt. Normales Fressverhalten wird wieder aufgenommen, sobald sich der Mund entwickelt hat, etwa 60 Tage nach der Amputation (p.a.).
    HINWEIS: Halten Sie während des gesamten Regenerationsprozesses die gleichen Umweltbedingungen (Wassersalinität 23–25 ppt und die Wassertemperatur konstant bei 28 °C).
  9. Fotografieren Sie erfolgreich regenerierte Polychaeten mit einem Stereomikroskop an bestimmten Tagen (1, 6, 15, 30 und 60) p.a.
  10. Vollständige Überwachung der Regeneration nach 60 P.A.

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Ergebnisse

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Der Regenerationsprozess bei D. claparedii wurde kontinuierlich bis zur vollständigen Kopfregeneration überwacht. Das gesamte Regenerationsmuster war vergleichbar mit dem von D. neapolitana berichtet (Abbildung 2). Der Wundverschluss an der Amputationsstelle wurde innerhalb eines Tages nach der Amputation abgeschlossen (p.a.). Bis zum Tag 6 p.a. wurde bei den Überlebenden ein klar definiertes Blastema beobac...

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Diskussion

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Anneliden, die segmentierte Würmer in marinen, Süßwasser- und terrestrischen Umgebungen bewohnen, besitzen bemerkenswerte Regenerationsfähigkeiten auf mehreren Ebenen biologischer Organisation. Diese reichen von zellulärer Reparatur und Keimzellerneuerung über strukturelles Nachwachsen bis hin zu vollständiger Körperregeneration aus kleinen Körperfragmenten 8,10. Das derzeitige Protokoll konzentriert sich auf die vordere Regenera...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Danksagungen

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Die Forschungsarbeit wurde durch den TAPE Talent and Publication Enhancement Research Grant (55269) unterstützt, der der SZA verliehen wurde.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Künstliches MeerwasserSofortiger Ozean
Digitales Hand-Salzgehalts-HydrometerScionix
MgCl2· 6H2OSigmaM2670
Scapel
StereomikroskopLeica Microsystem
TeraBits KomplettfischfutterTetra
Pinzette

Referenzen

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  1. Anderson, D. T. Embryology and Phylogeny in Annelids and Arthropods. International Series of Monographs in Pure and Applied Biology Zoology. 50, Elsevier. (2013).
  2. Razmi Shah, R. S. B., Ibrahim, Y. S., Villalobos-Guerrero, T. F., Sato, M. Updated Checklist of Polychaete Species (Annelida) Recorded from Malaysia, with Remarks on the Research History. Biodivers. Data J. 11, e110021(2023).
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Schlagwörter

Polychaeten RegenerationAnneliden RegenerationBlastembildungSegment WiederherstellungStereomikroskopische BeobachtungWundverschlussAmputationsprotokoll

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