EasyFiji: Eine grafische Oberfläche für benutzerfreundliche Fluoreszenzbildverarbeitung in Fiji

Summary

EasyFiji ist ein grafisches Benutzeroberflächen-Plugin für Fiji (ImageJ), das eine kuratierte Suite von Fluoreszenzbildvisualisierungs- und Verarbeitungstools bietet, die häufig von Lebenswissenschaftlern genutzt werden.

Abstract

Fiji (Fiji Is Just ImageJ) ist ein umfangreiches und erweiterbares Open-Source-Bildverarbeitungspaket, das von der Biobildanalyse-Community weit verbreitet eingesetzt wird. Für nicht-rechnergestützte Lebenswissenschaftler erfordert die manuelle Interaktion mit Fidschis zahlreichen Fähigkeiten jedoch das Erlernen und Navigieren eines tief vielschichtigen Menüsystems. Außerdem sind die Standardverhaltensweisen einiger Befehle nicht ideal für die Wiedergabe und Verarbeitung von Fluoreszenzbildern. Um die Effizienz für Lebenswissenschaftler mit Fluoreszenzmikroskopiebildern zu erhöhen, haben wir EasyFiji entwickelt, ein kuratiertes grafisches Benutzeroberflächen-Plugin (GUI) für Fidschi. Jeder EasyFiji-Befehl wird über tooltip-optimierte Buttons und Schieberegler ausgeführt und zeigt stets eine kanalspezifische Ausführung, wie es für fluoreszenzierte Bilder erforderlich ist. Befehle, die die Pixelintensität verändern, sind ebenfalls mit einem Klick unmöglich, um eine interaktivere Verarbeitung zu ermöglichen, und können automatisch aufgezeichnet und als Text für die Aufzeichnung gespeichert werden. Ein Bildinformationspanel zeigt Einstellungen an, die für die Bildinterpretation entscheidend sind. Neue Bildrendering- und Bleichkorrekturfunktionen sind ebenfalls vorhanden. Das Plugin ist frei auf GitHub und als Fiji Update Site verfügbar. Dieses Protokoll beschreibt die Schritte zur Nutzung der EasyFiji-Schnittstelle zur Visualisierung und Verarbeitung von Fluoreszenzmikroskopiebildern.

Introduction

Fiji (Fiji Is Just ImageJ) ist ein umfangreiches und erweiterbares Open-Source-Bildverarbeitungspaket, das von der Biobildanalyse-Community weit verbreitet verwendet^{wird 1,2}. Fidschis umfangreicher Codebestand aus allgemeinen Algorithmen sowie seine Makrosprache und Plugin-Oberfläche können von Computational Analysten bequem genutzt werden, um eine Lösung für nahezu jedes Bildverarbeitungs- oder Analyseproblem zu bieten. Für Life-Science-Nutzer mit wenig Rechenerfahrung können FIJIs >1.100 Befehle, verteilt auf ein tief geschichtetes Dropdown-Menü, jedoch äußerst komplex zu navigieren und effektiv zu bedienen sein. Es wurden verschiedene Ansätze zur Vereinfachung der manuellen Nutzung von Fidschi verfolgt. Die Suchleiste von Fiji ist eine Alternative zur Menünavigation und bietet Zugang zu hervorragenden Hilfedokumentationen, aber nur, wenn der Nutzer den Namen des benötigten Algorithmus kennt. Die Symbolleisten-Buttons von Fiji können angepasst werden, um schnellen Zugriff auf benutzerdefinierte Befehle zu ermöglichen, aber dieses Verfahren erfordert das Schreiben eines Makrocodes und eine Vorausschau, welche Befehle am nützlichsten sind. Das ActionBar-Plugin bietet ein eigenständiges grafisches Benutzeroberflächenfenster (GUI) mit anpassbaren und organisierbaren Button-Arrays, aber auch hier sind Programmierung und Erfahrung erforderlich, um^{die Buttons effektiv} auszufüllen. Keine dieser Lösungen erfüllt die Bedürfnisse von Lebenswissenschaftlern mit wenig Bildverarbeitungserfahrung.

Abgesehen von Problemen mit der Benutzeroberfläche benötigen viele Lebenswissenschaftler, die mit Fluoreszenzmikroskopiebildern arbeiten, kanalspezifische Anzeige- und Verarbeitungsverfahren. Einige häufig verwendete Fiji-Befehle sind jedoch standardmäßig nicht kanalbewusst. Beispielsweise möchten Nutzer pseudofarbige Kanäle entweder gleich auffällig zusammenstellen, gezielt Bereiche mit ähnlicher Intensität zwischen den Kanälen hervorheben oder den Graustufenkontrast eines morphologischen Signals erhalten und gleichzeitig Fluoreszenz zeigen. In jedem dieser Anwendungsfälle verschleiert Fijis RGB-Composite-Rendering-Technik die gewünschten Informationen auf Wahrnehmungsebene. Bei der Verarbeitung von Mehrkanalbildern verwenden native Fiji-Bildfilter (d. h. Prozess| Filter), entweder nur die aktive 2D-Bitebene verarbeiten oder alle Bitebenen im Bildfenster (d. h. den 'Stack', wie er von der Klasse ImageStack definiert ist). Das erste Verhalten verarbeitet sich nicht über die z- oder t-Dimension eines bestimmten Kanals, während das zweite Verhalten fast immer unkorrekt ist, da jeder Kanal ein einzigartiges Färbungsmuster und ein Signal-Rausch-Verhältnis enthält, was die Verwendung kanalspezifischer Verarbeitungsparameter erforderlich macht. Die Korrekturbefehle der einheimischen Fidschi zur Bleichmittelkorrektur (Bild | Anpassen | Bleichkorrektur) wirken falsch, wenn sie auf Mehrkanal-Fluoreszenzbilder angewendet werden, da sie wiederum über den gesamten ImageStack korrigieren, wo Kanaldaten interleaved sind, anstatt über die z- oder t-Dimension innerhalb jedes einzelnen Kanals zu korrigieren.

Um diese Herausforderungen für Lebenswissenschaftler, die mit Fluoreszenzmikroskopiebildern arbeiten, anzugehen, haben wir EasyFiji entwickelt, ein kuratiertes und geführtes grafisches Benutzeroberflächen-Plugin für Fiji. EasyFiji ist eine kuratierte Sammlung thematisch organisierter Befehle, die kanalbewusstes Rendering und Verarbeitung ermöglichen. Vier tabellierte Panels: Anzeigen, Verarbeiten, Speichern und Bildinformationen, enthalten jeweils thematisch verwandte Sammlungen von Tooltip-erweiterten Buttons und Schiebern zur Ausführung von Befehlen. Weitere Annehmlichkeiten sind eine Undo-Funktion für interaktive Verarbeitung, ein einfacher Klartext-Aktionsrekorder, der automatisch pixelverändernde Aktionen zusammen mit einem Bild speichern kann, sowie eine formatierte Darstellung der Aufnahmeeinstellungen, die für die Bildinterpretation wichtig sind. EasyFiji bietet außerdem neue Werkzeuge zur Bildwiedergabe und Korrektur von Bleichmitteln an. EasyFiji unterstützt keine quantitative Bildanalyse oder Batch-Verarbeitung, da diese Verfahren nur mit Hilfe eines erfahrenen Biobild-Analysten durchgeführt werden sollten. Obwohl EasyFiji von Natur aus kompakt ist, sind alle native Fiji-Befehle stets über das native fidschianische Menüsystem verfügbar. Wir sind überzeugt, dass das zielgruppenorientierte Design⁴ von EasyFiji die Nutzung von Fiji unter Lebenswissenschaftlern erhöhen wird. Hier präsentieren wir das Design, die Umsetzung und Anwendung von EasyFiji auf Fluoreszenzmikroskopiebilder. Das Plugin lässt sich einfach über eine Fiji-Update-Seite installieren (https://imagej.github.io/list-of-update-sites/ und https://imagej.net/plugins/EasyFiji_plugin), während Open-Source-Code über GitHub heruntergeladen werden kann; Das Plugin und der Quellcode sind frei verfügbar (https://github.com/stjude/EasyFiji).

Protocol

Dieses Protokoll beschreibt, wie man EasyFiji installiert und nutzt.

1. Um EasyFiji zu installieren...

1. Laden Sie die neueste Version von Fiji (>1.54g), die für das Betriebssystem geeignet ist, herunter und installieren Sie sie in einem Ordner, auf den der Benutzer Lese- und Schreibzugriff hat (siehe die Materialtabelle für einen Link zur Fidschi-Download-Website).
2. Starte Fiji und navigiere zu Hilfe | Update... In der Menüleiste.
3. Im Updater-Fenster klicken Sie auf Update-Seiten verwalten. Wählen Sie EasyFiji aus der Liste und klicken Sie auf Apply and Schließen. EasyFiji wird automatisch installiert, und Fiji wird automatisch mit zukünftigen Versionen von EasyFiji aktualisiert.
4. Fidschi neu starten. Wählen Sie EasyFiji im Fiji-Plugins-Menü aus.
   HINWEIS: EasyFiji ist vollständig mit vielen älteren Versionen von Fiji kompatibel und hauptsächlich mit ImageJ. Detaillierte Informationen zu Kompatibilität und Abhängigkeit finden sich auf der EasyFiji GitHub-Wiki-Seite (https://github.com/stjude/EasyFiji) und auf der EasyFiji ImageJ.net Wiki-Seite (https://imagej.net/plugins/EasyFiji_plugin#quick-start). Feedback kann über die GitHub-Seite oder den EasyFiji-Thread im Image.sc-Forum (https://forum.image.sc/t/announcing-easyfiji-a-user-friendly-gui-plugin-for-fiji/117617) gegeben werden (siehe Materialtabelle für Links zu diesen Ressourcen).

2. Nutzung des EasyFiji-Displaypanels

HINWEIS: Wie in Abbildung 1A dargestellt, unterstützt das Display-Panel Fluoreszenzkanal-Pseudo-Färbung mittels Farbmustertasten, intuitive Kontrasteinstellungen und neue Optionen für wahrnehmungskalibrierte Mehrkanal-Bildrendering. Native Fiji-Befehle für 3D/4D-Bildprojektion und Re-Slicing sind ebenfalls enthalten. Tabelle 1 dokumentiert den Austausch zwischen den EasyFiji-Kommandos und den einheimischen fidschianischen Kommandos.

1. Stellen Sie die Farbe oder Sichtbarkeit eines Kanals ein (Anzeigepanel, Bereich Kanalfarbe).
   1. Wählen Sie den gewünschten Kanal mit dem Kanalschieber des Bildfensters aus.
   2. Drücken Sie eine Farbprobe-Taste, um eine neue Farbsuchtabelle (LUT) zuzuweisen.
   3. Drücken Sie die schwarze Farbstoffprobe-Taste, um die Anzeige eines Kanals auszuschalten.
   4. Drücken Sie die AllChs-Taste, um alle Kanäle gleichzeitig anzuzeigen.
   5. Drücken Sie die EachCh-Taste, um jeden Kanal nacheinander anzuzeigen, indem Sie den Kanalschieber im Bildfenster durchscrollen.
2. Stellen Sie den Kanalkontrast innerhalb oder zwischen Bildern ein (Display Panel, Abschnitt Channel Contrast ).
   1. Um den Anzeigebereich eines Kanals (Kontrast) zu ändern, wählen Sie den Kanal mit dem Kanalschieber am unteren Rand des Bildfensters aus.
   2. Verschieben Sie den Anzeigegewinn-Schieberegler, um die Bildpixelintensität (Wert rechts dargestellt) als hellster Wert auf dem Bildschirm anzuzeigen.
      HINWEIS: Wir verwenden den Begriff Anzeigeverstärkung, um diese Aktion zu beschreiben, weil sie den Kanal linear heller macht, analog zum Effekt einer Änderung des Verstärkungs bei einem Detektor während der Bildaufnahme.
   3. Drücken Sie die Reset-Taste für den Display-Gewinn, um die maximal mögliche Pixelintensität des Kanals (bestimmt durch seine Bittiefe) als hellsten Wert auf dem Bildschirm anzuzeigen.
   4. Verschieben Sie den Display-Offset-Schieberegler, um die Bildpixelintensität (Wert rechts dargestellt) als dunkelsten Wert auf dem Bildschirm anzuzeigen.
      HINWEIS: Wir haben den Begriff Display-Offset verwendet, um diese Aktion zu beschreiben, weil er den Schwarzwert des Bildes festlegt, analog zum Effekt des Setzens des Offset auf einen Detektor während der Bildaufnahme.
   5. Drücken Sie den Display-Offset-Reset-Knopf, um die Bildpixelintensität von null auf den dunkelsten Wert auf dem Bildschirm zu setzen.
   6. Drücken Sie die AutoCh-Taste, um automatisch die Anzeigeverstärkung und den Offset anzupassen.
   7. Drücken Sie die AutoAll-Taste, um automatisch die Anzeigeverstärkung und den Offset für alle Kanäle anzupassen.
   8. Drücken Sie die Propagate-Taste, um die Anzeigeverstärkung und -offset-Einstellungen vom aktiven Bild auf alle anderen offenen Bilder mit derselben Anzahl von Kanälen zu übertragen.
3. Erstellen Sie eine Mehrkanalanzeige (Anzeigepanel , Bereich Kanalansichten ).
   1. Um zwei Fluoreszenzkanäle zusammen als Farbbild darzustellen, verwenden Sie die FF-präfixierten Tasten (Fluoreszenz mit Fluoreszenz). Um Fluoreszenzkanäle und morphologische Graustufenkanäle zusammen als Farbbild darzustellen, verwenden Sie die FG-Präfix-Taste (Fluoreszenz mit Graustufen). Renderings werden in einem neuen Bildfenster erstellt.
      HINWEIS: Bevor Sie eine Channel View erstellen, passen Sie zunächst die Anzeigeverstärkung und den Offset für jeden Kanal so an, dass das interessierende Signal den Dynamikbereich des Displays umfasst (Abschnitt 2.2), und wenden Sie diese Verstärkungen und Verschiebungen dann mit den Apply Gain- und Offset-Buttons im Verarbeitungstab (Abschnitt 3.2.3) an. Renderings sind nicht optimal, wenn die Verstärkungen und Offsets nicht angepasst und angewendet werden.
   2. Drücken Sie die FFColoc-Taste, um eine Farbwiedergabe aus zwei Fluoreszenzkanälen zu erzeugen, die als gelbe Pixel hervorgehoben wird, wobei die Intensität in beiden Kanälen ähnlich ist (innerhalb von 25 %).
      HINWEIS: Pixel mit unterschiedlichen Intensitäten zwischen den Kanälen werden in Graustufen gerendert. Gelbe Pixel deuten auf korrelationsbasierte Kolokalisierung⁵ hin, wenn das interessierende Signal auf jedem Kanal den Dynamikbereich des Displays abdeckt.
      VORSICHT: Das FFColoc-Rendering ist ausschließlich für Datenexploration oder Illustrationszwecke gedacht. Sie ist kein Ersatz für eine rigorose Quantifizierung der Kolokalisierung mit Hilfe eines Experten.
   3. Drücken Sie die FFMerge-Taste, um eine Farbwiedergabe aus zwei Fluoreszenzkanälen zu erzeugen, wobei das Signal in jedem Kanal gleichermaßen wahrnehmbar ist.
      HINWEIS: Bei jedem Pixel wird die Luminanz entsprechend dem Signal mit der höheren Intensität eingestellt, während der Farbton eine Funktion des Intensitätsverhältnisses zwischen den Kanälen ist (entsprechend den von Taylor et ^al.6 beschriebenen Konzepten). Siehe auch den Abschnitt Diskussion.
   4. Drücken Sie die FGMerge-Taste, um eine Farbwiedergabe aus Fluoreszenzkanälen und einem Graustufenkanal zu erzeugen, wobei die Färbung der Fluoreszenzkanäle erhalten bleibt, während der Kontrast des Graustufenkanals erhalten bleibt.
      HINWEIS: Der Graustufenkanal ist typischerweise eine nicht-fluoreszierende Modalität, die morphologische Informationen wie DIC, Phasenkontrast oder Elektronenmikroskopie enthält.
   5. Drücken Sie die Montage-Taste, um die Kanäle in einzelne Bilder zu unterteilen, sie automatisch über den Bildschirm zu kacheln und ihre Visualisierung zu synchronisieren.
   6. Drücken Sie den SyncWins-Button, um die Visualisierung mehrerer Bilder desselben Typs zu synchronisieren.
4. Erstellen Sie 2D-Ansichten eines 3D-Z- oder T-Stacks (Display-Panel , Abschnitt Stack-Views ).
   HINWEIS: Jede Darstellung wird in einem neuen Bildfenster angezeigt.
   1. Drücken Sie die MIP-Taste, um eine Projektion mit maximaler Intensität zu erzeugen.
      HINWEIS: Die Intensität an jedem Ort im resultierenden 2D-Bild entspricht der Intensität des intensivsten Pixels entlang der 3^. Dimension im 3D-Bild. Dieses Verfahren kann Rauschen betonen, daher kann es nützlich sein, den Stack vor der Erstellung eines MIP zu glätten (siehe Tabus Processing ).
   2. Drücken Sie die SIP-Taste, um eine Summenintensitätsprojektion zu erstellen.
      HINWEIS: Die Intensität an jeder Stelle im resultierenden 2D-Bild entspricht der Summe der Intensitäten entlang der 3^. Dimension im 3D-Bild. Dieses Verfahren bewahrt die Gesamtintensität, was zu einem weniger verrauschten Bild führt als bei jedem einzelnen Schnitt.
   3. Drücken Sie die Ortho-Taste, um einen orthogonalen Slices-Viewer zu erstellen, der interaktiv die drei orthogonalen Ebenen eines 3D-Stacks (z. B. xy, xz, yz) rendert, die sich an der aktuellen Cursorposition schneiden.
   4. Drücken Sie die Kymo-Taste, um einen Kymographen zu erstellen.
      HINWEIS: Ein Kymograph ist ein 2D-Bild, bei dem die vertikale (y-)Achse der dritten Dimension eines Stacks entspricht (meist t-), und die horizontale (x-) Achse der Position entlang einer vom Benutzer auf dem Eingabestack gezogenen Linie. Wenn die 3^{. Dimension Zeit} ist, wird ein Kymograph verwendet, um Bewegung zu illustrieren oder zu quantifizieren.
      Dieser Button basiert auf dem KymographBuilder-Plugin⁷ , das mit Fiji geliefert wird, aber separat heruntergeladen werden muss, wenn man ImageJ verwendet.
5. Setze verschiedene Optionen (Display-Panel ).
   1. Drücke den Dup-Button, um das aktive Bildfenster in Fiji zu duplizieren. Ein neues Bildfenster erscheint.
      HINWEIS: Zeichnen Sie mit Fijis Rechteck-ROI-Tool eine rechteckige Interessenregion (ROI) auf dem Bild, und die Dup-Taste schneidet bis zur ROI-Grenze zu. Spezifizieren Sie Kanal-, z- und/oder t-Bereiche, um die Dimensionalität des duplizierten Bildes neu zu formen.
   2. Drücken Sie die ToClip-Taste, um das aktive Bild , wie es aktuell auf dem Bildschirm angezeigt wird, auf die Systemzwischenablage zu kopieren. Um das Bild in eine andere Anwendung einzufügen (um Folien vorzubereiten oder Fotos zu bearbeiten), aktivieren Sie die andere Anwendung und wählen Sie Einfügen (Strg+V unter Windows oder Cmd+V auf Mac).
   3. Drücken Sie die |--ähm--| Taste, um eine Skalaleiste als Overlay auf dem Bild anzuzeigen. Schalte die |--ähm--| Taste um, um die Skalaleiste zu entfernen.

3. Nutzung des EasyFiji-Prozesspanels

HINWEIS: Wie in Abbildung 1B dargestellt, bietet der Abschnitt Channel Features im Prozesspanel schieberbasierte Bildbearbeitungsbefehle mit Tooltips, die zur Verbesserung der Bilddarstellung verwendet werden können. Die Schaltfläche "Zuletzt rückgängig" ermöglicht interaktive Verarbeitung. Bildmaße können mit den Schaltflächen "Maße ändern" geändert werden. Die Action Table wird verwendet, um als Klartext-Verarbeitungsbefehle zu protokollieren, die die Pixelintensitätswerte des Bildes ändern. Das Protokoll kann dann automatisch mit dem Bild mit demselben Titel gespeichert werden (siehe Speichern-Panel).

1. Verändern Sie die räumlichen Merkmale eines Bildes (Prozesspanel , Abschnitt Kanalmerkmale ändern ).
   HINWEIS: Alle Befehle gelten nur für den aktiven Kanal, und die Ergebnisse werden automatisch im ursprünglichen Bildfenster angezeigt. Ein neues Bildfenster wird nicht erstellt.
   1. Verschieben Sie den Smooth-Schieberegler, um eine Gaußsche Unschärfe anzuwenden und so die normal verteilte Pixel-zu-Pixel-Variation (~shot-Rauschen und Leserauschen) zu reduzieren.
      1. Für ~Nyquist-abgetastete Bilder (70-150 nm xy Pixelgröße) beginnen Sie mit Schiebereglern zwischen 1,0 und 2,0.
      2. Für eine bestimmte Pixelgröße erhöhen Sie den Schiebereglerwert, wenn das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) des Bildes abnimmt.
      3. Gegeben ein SNR, erhöhen Sie den Schiebereglerwert, wenn die Pixelgröße abnimmt.
      4. Für Bildstacks wenden Sie eine 3D-Glättung an, bei der der z-Radius automatisch auf ein Drittel des xy-Radius gesetzt wird, entsprechend für Nyquist-abgetastete Daten.
         HINWEIS: Der Schieberegler entspricht der Standardabweichung eines Gaußschen Kernels, gemessen in Pixeln.
   2. Bewegen Sie den Denoise-Schieberegler , um einen Medianfilter anzuwenden und so extreme Ausreißer (Kamera-Hot Pixel oder PMT-Thermionen-Emissionen) zu entfernen.
      HINWEIS: Der Schieberegler entspricht dem Radius eines Box-Kernels in Pixeln. Werte zwischen 0,5 und 1,0 sind ein guter Ausgangspunkt.
   3. Bewegen Sie den Schärfen-Schieberegler, um eine 2D-unscharfe Maske aufzusetzen und so Unschärfe oder Nebel zu reduzieren, wie sie durch unscharfes Licht entstehen können. Das Schärfen verstärkt auch Lärm.
      HINWEIS: Der Schieberegler entspricht der Standardabweichung eines Gaußschen Kernels (in Pixeleinheiten), die zur Bestimmung der Unschärfe verwendet wird. Für ~Nyquist-abgetastete Bilder (70-150 nm xy Pixelgröße) sind Schieberegler zwischen 2,0 und 4,0 ein guter Ausgangspunkt. Der Gewichtsparameter ist bei 0,6 festgelegt.
2. Pixelintensitäten von Bildern ändern (Ablauf Panel, Kanalintensitäten modifizieren Abschnitt).
   HINWEIS: Alle Befehle gelten nur für den aktiven Kanal, und die Ergebnisse werden automatisch im Bildfenster angezeigt. Ein neues Bildfenster wird nicht erstellt.
   1. Verschieben Sie den Sub.Bkgd.-Schieberegler, um den 'Rolling Ball'-Algorithmus anzuwenden und so den Hintergrund (d. h. räumlich allmähliche Intensitätsänderungen) zu entfernen.
      HINWEIS: Der Schieberegler ist der Radius der rollenden Kugel in Pixeln, sodass größere Werte weniger Gesamthintergrund abziehen. Der Wert hängt vom Bildinhalt ab, sollte aber im Allgemeinen ≥2x größer sein als die Größe (gemessen in Pixeln) der zu erhaltenen Merkmale. Werte zwischen 10 und 20 sind oft ein guter Ausgangspunkt.
   2. Verschieben Sie den Gamma-Schieberegler , um die Visualisierung schwächerer Signale zu verbessern, die mit helleren Signalen gemischt sind, wie sie benötigt werden, um feine Strukturen zu betonen, wenn sie mit großen Strukturen vermischt werden.
      HINWEIS: Nach der Normalisierung wird der Wert jedes Pixels auf eine Potenz (Exponent) erhöht, die durch den Wert des Reglers gegeben ist. Der Wert hängt vom Bildinhalt ab, aber Werte zwischen 0,6 und 0,8 sind oft ein guter Ausgangspunkt.
      VORSICHT: Bilder, bei denen Gamma angewendet wurde, dürfen nicht zur Intensitätsquantifizierung verwendet werden.
   3. Drücken Sie die Schaltfläche "Apply Gain and Offset: ToCh" oder "ToAll", um den Bildbereich (wie durch die Anzeige-Verstärkungs- und Offset-Schieberegler im Display-Panel angegeben) auf den gesamten Intensitätsbereich der Bildbittiefe zuzuordnen.
      HINWEIS: Dieser Prozess ist auch als Anwendung der Lookup-Tabelle (LUTs) bekannt. Die Anzeige-Verstärkung und -Versatz müssen auf diese Weise angewendet werden, bevor Kanalansichten im Display-Panel erstellt werden.
   4. Verwenden Sie die Intensitätskorrektur-Tasten , um Arteffaktische Intensitätsänderungen über die z- oder t-Dimensionen von 3D-Bildern hinweg zu korrigieren, wie sie beispielsweise durch Photobleaching, Aberrationen oder Lichtstreuung verursacht werden könnten.
      HINWEIS: Die Aktion wird nur auf den aktiven Kanal angewendet. Lokale und globale Korrekturen können sequentiell auf denselben Datensatz angewendet werden. Siehe den Abschnitt Ergebnisse für eine weitere Erklärung der zugrunde liegenden Methoden.
   5. Drücken Sie die Global-Tasten , um die allmählichen Signalintensitätsverluste in der gesamten z- oder t-Dimension zu korrigieren, während die meisten biologisch bedingten Intensitätsänderungen erhalten bleiben. Es gibt zwei Möglichkeiten:
      1. Drücken Sie die GlobalL-Taste, um z-Stacks zu korrigieren, bei denen die Anfangsschnitte dunkel oder schwarz sein können, und der gesamte Intensitätsverlust vom ersten bis zum letzten Bild ist gering (<50%). Der Algorithmus modelliert den Intensitätsverlust als linearen Trend und wendet dann jedem Schnitt einen Korrekturfaktor an, sodass die Steigung der Passlinie null wird.
      2. Drücken Sie die GlobalP-Taste, um Zeitreihen zu korrigieren, in der die ersten Bilder am hellsten sind und der Gesamtintensitätsverlust vom ersten bis zum letzten Bild erheblich ist (50%–95%). Der Algorithmus modelliert den Intensitätsverlust als einen polynomiellen Trend^{zweiter Ordnung} und wendet dann auf jede Scheibe einen Korrekturfaktor an, sodass die Passkurve in eine Linie mit einer Steigung von null transformiert wird.
   6. Drücken Sie die Local-Taste, um lokale, abrupte Signalintensitätsänderungen zu korrigieren, während die allmählichen Veränderungen erhalten bleiben.
      HINWEIS: Solche Veränderungen können durch das Bleichen einiger Ebenen innerhalb eines größeren Z-Stacks oder durch Schwankungen der Anregungsleistung (Flimmern) verursacht werden. Der Algorithmus modelliert biologisch relevante Intensitätsänderungen als Polynom vierter Ordnung und wendet dann einen Korrekturfaktor an, um sicherzustellen, dass die Medianintensität jedes Frames dem Wert der angepassten Kurve entspricht.
   7. Drücken Sie die Equalize-Taste, um die mittlere Signalintensität jedes Frames gleich zu machen, ähnlich wie bei der Fiji-Methode der Bleichmittelkorrektur.
      VORSICHT: Equalize kann für Visualisierungszwecke nützlich sein, wenn alle anderen Methoden versagen, aber es beseitigt biologisch relevante Variationen der medianen Intensität und kann daher nicht zusammen mit der Intensitätsquantifizierung verwendet werden.
3. Ändern Sie die Bilddimension (Prozesspanel , Abschnitt Dimensionen ändern ).
   HINWEIS: Diese Befehle gelten für alle Kanäle im Bildfenster und können nicht mit dem Rückgängig-Button rückgängig gemacht werden.
   1. Drücken Sie die Schaltfläche "Drehen ", um das Bild zu drehen, wie es erforderlich sein kann, um die anatomischen Achsen eines Embryos oder Gewebes mit der Seite oder dem Bildschirm auszurichten.
   2. Drücken Sie die Schaltfläche "Zuschneiden ", um die xy-Abmessungen des Bildes zu reduzieren. Achten Sie auf das rechteckige ROI-Tool , das automatisch ausgewählt wird, und beachten Sie die Aufforderung, einen ROI auf das Bild zu zeichnen, das zum Zuschneiden verwendet wird.
   3. Drücken Sie den Subset-Button, um aus einer Teilmenge der nicht-xy-Dimensionen des Eingabebildes einen neuen Bildstapel zu erstellen.
      HINWEIS: Dies wird verwendet, um Kanäle zu entfernen und/oder Schnitte in z oder t abzuschneiden.
4. Zeichnen Sie die Verarbeitungsbefehle auf, die auf ein Bild angewendet werden (Prozesspanel, Abschnitt Aktionen aufzeichnen).
   HINWEIS: Der Zweck des Action Recorders ist es, Aktionen automatisch als Klartext zu protokollieren und dann das Bild mit den angewendeten Aktionen zu speichern, die die Pixelintensitätswerte ändern. Das Protokoll ist eine Bequemlichkeit, sodass der Nutzer keine Notizen machen oder die Einträge des fidschianischen Makrorekorders entschlüsseln muss. Befehle, die die Pixelintensität nicht ändern, werden nicht protokolliert.
   1. Drücke die Rec-Taste, um die Kommandoaufnahme zu starten.
      HINWEIS: Die Tastenfläche zeigt 'ON' an, wenn der Recorder aufnimmt. Ausgeführte Befehle und zugehörige Parameter erscheinen in der Aktionstabelle. Befehle, die 'rückgängig' sind, werden aus der Tabelle entfernt.
   2. Drücke die Clr-Taste, um die Aktionstabelle zu leeren.
   3. Drücken Sie die Schaltfläche Speichern , um die Aktionstabelle als Textdatei zu speichern. Wenn Aktionen, die auf mehrere Bilder angewendet wurden, aufgezeichnet wurden, werden diese Aktionen nach Bildtitel gruppiert, wenn die Textdatei gespeichert wird.
      HINWEIS: Alternativ können Sie ein Bild im Save-Panel speichern (Abschnitt 4 unten). Aktivieren Sie das Feld "Speichern von Aktionen " und alle auf das Bild angewendeten Aktionen werden automatisch als Textdatei mit dem Namen des Bildes und dem Dateipfad gespeichert.

4. Nutzung des EasyFiji-Speicherpanels

HINWEIS: Wie in Abbildung 1C gezeigt, ist das Speicherfeld so konzipiert, dass Nicht-Experten bei der Auswahl des richtigen Bilddateiformats für ihren vorgesehenen Anwendungsfall unterstützt werden. Wenn das Kontrollkästchen Speichern Aktionen angekreuzt ist, werden alle auf ein Bild angewandten Verarbeitungsaktionen, wie sie in der Aktionstabelle aufgeführt sind, automatisch mit dem Bild gespeichert, mit demselben Dateinamen und Pfad, jedoch mit einer *.txt-Endung. Wenn mehrere Bilder geöffnet und parallel verarbeitet wurden, werden alle auf allen Bildern durchgeführten Aktionen in der Aktionstabelle angezeigt. Allerdings werden nur die auf das gespeicherte Bild angewendeten Aktionen mit diesem Bild gespeichert. Die gespeicherte Textdatei erscheint im Dateisystem, öffnet sich aber nicht in Fiji. Falls gewünscht, können Textdateien in Fiji geöffnet werden, indem man das Dateisymbol auf die Fiji-Werkzeugleiste zieht.

1. Speichern Sie ein Bild (Speicherpanel , Abschnitt Speichermethoden ).
   1. Drücken Sie die Schaltfläche "Raw Data ", um das Bild als *.tif-Datei zu speichern, in der exakte Pixelwerte, Kanalstruktur und einige Metadaten erhalten bleiben. Verwenden Sie diese Option, wenn das Ziel ist, ein Bild weiter zu quantifizieren oder zu analysieren.
   2. Drücken Sie die Schaltfläche "Für Präsentation speichern ", um das Bild mit JPEG-Kompression für E-Mail-Übertragungen oder eine Diapräsentation zu speichern.
      VORSICHT: Diese Option sollte niemals zur Erstellung von Zahlen oder zur quantitativen Analyse verwendet werden.
   3. Bewege den Qualitäts-Level-Schieberegler, um den JPEG-Kompressionswert einzustellen.
      HINWEIS: Höhere Werte entsprechen einer besseren Erhaltung von Pixelintensitäten und -merkmalen (und größerer Dateigröße), aber nie alle Merkmale werden erhalten.
   4. Drücken Sie die Schaltfläche "Figur speichern ", um das Bild so zu speichern, wie es derzeit im PNG-Format angezeigt wird, das mit anderen Grafikprogrammen (z. B. Photoshop, Illustrator, Publisher oder GIMP) kompatibel ist. Das Bild wird so gespeichert, wie es auf dem Bildschirm angezeigt wird, aber Kanäle und Metadaten bleiben nicht erhalten.
      VORSICHT: Diese Option sollte niemals zur Quantifizierung verwendet werden.
   5. Drücken Sie die Schaltfläche "Als Film speichern ", um einen Bildstapel als MOV-Format zu speichern, der die Schnitte nacheinander (z oder t) abspielt.
      HINWEIS: Das Abspielen von mov-Dateien auf einem Windows-basierten Betriebssystem erfordert den Open-Source-VLC Media Player.

5. Nutzung des EasyFiji Image Info-Panels

HINWEIS: Wie in Abbildung 1D dargestellt, zeigt das Bildinformationspanel herstellerspezifische Erwerbseinstellungen für Klartext, die für die Bildinterpretation entscheidend sind. Siehe Tabelle 2 für eine Liste der derzeit unterstützten Arten von konfokalen Bildformaten.

1. Drücke den Channel Info-Button , um die Erfassungseinstellungen zu laden.
2. Siehe den Abschnitt Channel Info für kanalspezifische Aufnahmeeinstellungen, einschließlich % Laserleistung, Laserwellenlänge, Emissionsbandpass(e), Verstärkung und Lochgröße.
3. Siehe den Abschnitt Systemkonfiguration für bildweite Einstellungen, einschließlich system Name, Ziel, Scan-Modus, Verweilzeit und Voxelgröße.

Results

Pseudofarbige Darstellungen von Mehrkanal-Fluoreszenzbildern können verwendet werden, um die räumlichen oder Intensitätsbeziehungen zwischen Signalen zu veranschaulichen; allerdings bietet das heimische Fidschi nur eine RGB-Composite-Rendering-Technik, die von Natur aus Farbgebung und Helligkeit auf Wahrnehmungsebene durcheinanderbringt. Zur Veranschaulichung dieses Problems verwendet Abbildung 2 ein Zweikanalbild von N-Myc und RNA Polymerase II (RNAPolII). ...

Discussion

Fiji ist eine Open-Source-Bildverarbeitungs- und Analysesoftware, die bei Bildanalytikern sehr beliebt ist. Allerdings stellen die komplexe Menüoberfläche und die mitunter unintuitiven Verhaltensweisen in Bezug auf die Darstellung und Verarbeitung von Fluoreszenzbildern Herausforderungen für nicht-rechnerische Lebenswissenschaftler dar. EasyFiji bietet Lebenswissenschaftlern eine kuratierte Auswahl thematisch organisierter und tooltip-optimierter Buttons und Regler, die bei der Arbeit mi...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
EasyFiji GitHub-Seite	Open Source		https://github.com/stjude/EasyFiji
EasyFiji Image.sc Forum	Open Source		https://forum.image.sc/t/announcing-easyfiji-a-user-friendly-gui-plugin-for-fiji/117617
EasyFiji ImageJ.net Seite	Open Source		https://imagej.net/plugins/EasyFiji_plugin#quick-start
FIJI-Software	Open Source		https://imagej.net/software/fiji/downloads
VLC Media Player	Open Source		https://www.videolan.org/vlc/