Methodenartikel

Ein vergleichender Ansatz für quantitative Zellzählungsstudien in sehr unterschiedlichen Säugetierhirnen

DOI:

10.3791/69446

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16. Januar 2026

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1Neuroscience Institute Cavalieri Ottolenghi, 2Department of Veterinary Sciences, University of Turin, 3Department of Anthropology and Center for the Advanced Study of Human Paleobiology, The George Washington University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Moderne Neurowissenschaften müssen Unterschiede zwischen vielen Arten erforschen, einschließlich Labornagetiere und Menschen. Dennoch entstehen technische Schwierigkeiten, wenn großhirnige Säugetiere beteiligt sind. Dieser Ansatz adressiert die interartische Variation neuronaler Populationen bei sehr unterschiedlichen Säugetieren und liefert vergleichbare Ergebnisse, die zur Aufdeckung evolutionärer Muster kartiert werden können.

Zusammenfassung

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Die meisten neurobiologischen Studien werden an Labornagetieren durchgeführt. Trotz vieler Ähnlichkeiten zwischen den Gehirnen von Säugetieren existieren auch wichtige Unterschiede, die in der Übersetzung irreführend sein können. Deutliche Unterschiede zwischen verschiedenen Arten wurden in der Gehirnplastizität, insbesondere bei der Neurogenese, festgestellt. Verschiedene neurogene Prozesse können aufgrund evolutionärer Abwägungen vorherrschen, was Unterschiede zwischen Gehirnstrukturen und Säugetieren zeigt und das Potenzial für Plastizität bei divergenten Arten wie Mäusen und Menschen verschoben. Der Vergleich sehr unterschiedlicher Arten wirft mehrere Probleme auf: Vergleichsstudien stoßen auf technische Schwierigkeiten, wenn große Gehirne beteiligt sind; Der Einsatz heterogener experimenteller Ansätze durch verschiedene Labore kann den Vergleich der Ergebnisse einschränken; Heterogenität kann mit unterschiedlichen Zeitverläufen neuroentwicklungsbedingter Prozessen bei Säugetieren zusammenhängen und somit Variablen zum Vergleich hinzufügen.

Um diese Einschränkungen zu begegnen, wurde ein Ansatz zur Untersuchung der interartischen Variation einer Population von Schicht-II-kortikalen Neuronen bei Säugetieren entwickelt, die sich hinsichtlich Gehirngröße, Gyrenzphalie, sozioökologische Nische und Alter stark unterscheiden. Trotz einiger Variablen, die nicht vollständig standardisiert werden können, wird eine Methode vorgeschlagen, die reduzierte Heterogenität bei der Gehirnsammlung mit der Etablierung gemeinsamer anatomischer Strukturen als Referenzpunkte für die Durchführung der Zellzählung auf entsprechenden Gehirnniveaus kombiniert. Gewonnene Daten (z. B. Zelldichten) können auf phylogenetische Bäume abgebildet werden, um evolutionäre Muster aufzudecken, und auf Kovarianz mit neuroanatomischen Merkmalen (z. B. Gehirngröße, kortikale Oberfläche) analysiert werden. Dieser Ansatz hat eine bemerkenswerte Variation in der Anzahl der kortikalen unreifen Neuronen zwischen phylogenetischen Gruppen und eine aufgedeckte Kovariation mit der Gehirngröße gezeigt. Die Methode kann auch verwendet werden, um Unterschiede über verschiedene Entwicklungsstadien derselben Art zu quantifizieren, und kann auf andere vielfältige Säugetiere und biologische Prozesse ausgeweitet werden, um vergleichbare Ergebnisse zu kartieren, die eine genauere Quantifizierung verschiedener Zellpopulationen im adulten Gehirn ermöglichen und so die Plastizität unterstützen.

Einleitung

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Die neurowissenschaftliche Forschung nutzt weitgehend inzestuöse Mäuse und Ratten, um Ergebnisse auf Menschen zu übertragen. Trotz zahlreicher molekularer, zellulärer und sogar anatomischer Ähnlichkeiten existieren auch wichtige Unterschiede zwischen den Arten, die bei der Interpretation präklinischer Daten 1,2 irreführend sein können. Obwohl vergleichende Studien notwendig sind, werden sie durch technische und praktische Schwierigkeiten erschwert, wenn große Gehirne betroffen sind (z. B. von durchschnittlich 0,5 g bei Mäusen auf 1300 g beim Menschen; Abbildung 1A). Darüber hinaus können heterogene experimentelle Ansätze verschiedener Labore den Vergleich von Ergebnissen, insbesondere quantitative Analysen, einschränken und manchmal Kontroversen hervorrufen. Dies ist der Fall der strukturellen Plastizität des Gehirns, mit besonderem Bezug auf neurogene Prozesse 3,4,5, ein Thema, das für das Verständnis von Entwicklungsneuroplastizität und Gehirnreparatur 6,7 von Interesse ist.

Jüngste Entdeckungen im Bereich der Gehirnplastizität deuten stark darauf hin, dass während der Evolution erhebliche Unterschiede in der Häufigkeit, Rate und anatomischen Lage verschiedener Arten neurogener Prozesse auftraten8. Ein Beispiel dafür ist der offensichtliche Rückgang der stammzellgesteuerten Neurogenese bei erwachsenen großhirnigen Säugetieren im Vergleich zu Labornagetieren 5,9,10, was wahrscheinlich mit unterschiedlicher Expansion von Hirnregionen und Funktionen als Anpassung an ökologischeBelastungen 7,8 sowie mit unterschiedlichen neuroentwicklungsbedingten Zeitverläufenverbunden ist 11,12. Die Rate der Neurogenese scheint sich zwischen Mäusen und Menschen bemerkenswert zu unterscheiden, was die Frage der Translation13 aufwirft.

Andererseits wurde eine neuartige Art von "Neurogenese ohne Teilung" vermutet, die durch Neuronen repräsentiert wird, die in der gestoppten Reifung blockiert sind (sogenannte unreife oder ruhende Neuronen 14,15,16,17,18,19), die sich von kleingehirnigen zu großhirnigen Arten ansteigen kann. Interessanterweise befindet sich die stammzellunabhängige Population unreifer Neuronen im Großhirnrinde (einem Ort der hochordentlichen Kognition bei gyrencephalen Arten 22,23) und weit entfernt von den kanonischen neurogenen Stellen, die meist mit Riechsüchs- und Raumnavigation verbunden sind, welche bei lissencephalen Arten von großer Bedeutung sind 7,8. Diese Unterschiede zwischen Gehirnstrukturen und Säugetierarten gehen über rein vergleichendes Interesse hinaus, da sie in der Übersetzung relevant sein können, indem sie das Potenzial für Plastizität bei Mäusen und Menschen verschieben. Aus diesen Gründen ist es entscheidend, auf eine "vergleichbare Weise" zu bewerten, inwieweit die Unterschiede eine phylogenetische Variation bei sehr unterschiedlichen Säugetieren darstellen, mit besonderem Bezug auf Labornagetiere und Primaten.

Ein kürzlich etablierter Ansatz zur Untersuchung der interartischen Variation einer Population von Schicht-II-kortikalen unreifen Neuronen (cINs) bei Säugetieren mit starkem Unterschied in Gehirngröße, Gyrenzephalie und sozioökologischer Nische 22,24,25 wird beschrieben. Diese Methode basiert auf drei Prinzipien: i) mehrere (verschiedene) Säugetierarten parallel mit denselben Verfahren zu verarbeiten; ii) Variablen zu minimieren, die in sehr unterschiedlichen Gehirnen nicht vollständig standardisiert werden können (Fixationsverfahren, postmortales Intervall, Alter) und die Art-Spezifität von Antikörpern für die Immunzytochemie zu adressieren, indem weit verbreitete Merkmale der untersuchten Zellpopulation als interne positive Kontrollmechanismen verwendet werden; und iii) um entsprechende anatomische Strukturen als Referenzpunkte für die Zellzählung auf korrespondierenden Gehirnniveaus verschiedener Arten zu etablieren (Abbildung 1B und Abbildung 2). Daten, die durch das Zählen von Zellen mit dem gut etablierten Marker Doublecortin (DCX 15,17,26) gewonnen werden, können auf phylogenetische Bäume abgebildet werden, um evolutionäre Muster aufzudecken, und auf Kovarianzen mit verschiedenen Parametern wie Gehirngröße, Gyrencephalie und kortikale Oberfläche analysiert werden.

Abbildung 1
Abbildung 1: Verarbeitung sehr unterschiedlicher Säugetierhirne zur Bestimmung der Verteilung und Menge der cINs im kortikalen Mantel. (A) Säugetiere verschiedener Arten und Ordnungen zeichnen sich durch sehr unterschiedliche Gehirngrößen sowie Grade von Gyrenzephalie und kortikaler Expansion aus. Gehirn-Icons reproduziert mit der BioRender-Lizenz. (B) Repräsentative Toluidin-blau gefärbte koronale Schnitte, die aus Gehirnen mit sehr unterschiedlicher Größe und kortikaler Mantelverlängerung geschnitten werden. Histologisch gefärbte Serienschnitte (Kryostatschnitt, koronal, 40 μm dick) werden verwendet, um die wichtigsten neuroanatomischen Strukturen jeder Tierart zu identifizieren (siehe Abbildung 3); Beachten Sie die bemerkenswerten Unterschiede in Gehirngröße und kortikalem Perimeter. Die Tierfiguren in Panel A wurden mit Genehmigung von La Rosa et al.22 reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abschließend, da alle plastischen Prozesse im Allgemeinen mit steigendemAlter 27,28 Jahren progressiv reduziert werden, besteht ein weiteres Thema der vergleichenden Neuroplastizität darin, die verschiedenen Zeitverläufe einer solchen Reduktion zu bewerten, die mit unterschiedlichen Zeitverläufen neuroentwicklungsbedingter Prozesse bei Säugetieren zusammenhängen können 12,29,30. Tatsächlich ist das Vorhandensein von schnell reifenden (Maus) versus langsam reifenden Arten (Primaten) ein weiterer Grund, warum das gebräuchlichste Modellsystem, die Labormaus, bei der Lösung von Herausforderungen in den biomedizinischen Wissenschaften eingeschränkt ist. Die hier beschriebene Methode kann auch nützlich sein, um Zellpopulationen unterschiedlichen Alters über die Lebensspanne jeder Art zu betrachten und dann die resultierenden Trends zwischen den Arten zu vergleichen. Phylogenetische Variationen in der cIN-Dichte sowie Unterschiede in ihrer Persistenz über das Alter hinweg wurden zwischen klein- und großhirnigen Säugetierenfestgestellt 22,28.

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Protokoll

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Alle Tierverfahren entsprachen den einschlägigen nationalen und institutionellen Vorschriften. Mausgewebe wurde vom Neuroscience Institute Cavalieri Ottolenghi (NICO), Orbassano, Italien, unter Genehmigung des italienischen Gesundheitsministeriums (RRID: MGI:3696370) mit Genehmigung von Serena Bovetti und Charles River Laboratories gewonnen. Nackte Maulwurf-Rattengewebe wurden unmittelbar nach der Euthanasie an der Queen Mary University of London (UK) gemäß Anhang 1 des Animals (Scientific Procedures) Act 1986 gesammelt. Die Kaninchenversuche folgten der Richtlinie 86/609/EU des Europäischen Gemeinschaftsrats und dem italienischen Recht (DL.vo 116/92) mit Zustimmung des italienischen Gesundheitsministeriums (Genehmigung 66/99-A). Schaf- und Pferdehirne wurden posthum aus einem kommerziellen Schlachthof gemäß Richtlinie 86/609/EWG und kontinuierlicher tierärztlicher Aufsicht bezogen. Hundehirne wurden postmortem von MarshallBio Laboratories (Lyon, Frankreich) mit den erforderlichen Genehmigungen versorgt; Katzenhirne wurden postmortem an der Universität Padua während routinemäßiger diagnostischer Obduktionen mit Zustimmung des Besitzers entnommen. Alle Verfahren folgten der EU- und italienischen Gesetzgebung. Schimpansenproben wurden gemäß den internationalen Leitprinzipien des Council for International Organizations of Medical Sciences (CIOMS) und gemäß der Genehmigung A5761-01 des National Institutes of Health-Office of Laboratory Animal Welfare (NIH-OLAW) behandelt (Details zu jeder Tierart und jedem Experiment siehe ergänzende Tabelle 1 und Ref. 22,25).

1. Gehirne sammeln

  1. Sammeln Sie Gehirne direkt oder von anderen Institutionen und Gewebebanken, betrachten Sie jedoch nur die gesamten Hemisphären. Richten Sie gemeinsam mit den Institutionen das beste Verfahren ein, um Gehirne aus Tierarten zu extrahieren, wobei die Schädigung der Hemisphäre verringert wird und das minimale Postmortale Intervall (PMI, siehe UNTEN) sowie ein schnelles Eintauchen in die fixative Lösung nach der Extraktion gewährleistet ist.
    HINWEIS: Je nach Empfindlichkeit des interessierten Antikörpers sollte man sich der PMI bewusst sein. Angesichts der hohen Empfindlichkeit von Doublecortin (DCX) gegenüber Abbau wird Proben mit einem PMI-Bereich von 0–1 Stunde entnommen (abgesehen vom Schimpansen, der bis zu 14 Stunden PMI hatte, was jedoch keine Veränderung der Färbungsqualität verursachte, ergänzende Tabelle 1).
  2. Angesichts der hohen Variabilität der Lebensspanne des Tieres sollten die Altersgruppen vorher festgelegt werden, die unter den verschiedenen für die Studie berücksichtigten Säugetiere erfasst werden, um vergleichbare Daten zu erhalten.
    1. Für dieses Studiendesign und zur Festlegung vergleichbarer Altersgruppen analysieren Sie Informationen aus zwei Datenbanken zur Tiergeschichte und Vielfalt: AnAge, eine kuratierte Datenbank über Alterung und Lebensgeschichte von Tieren, und Animal Diversity Web, eine Online-Datenbank zur Naturgeschichte, Verbreitung, Klassifikation und Naturschutzbiologie der Tiere.
    2. Die Lebensspanne des Tieres wird in vier Stadien unterteilt (eine präpuberale und eine postpuberal, nämlich "adult"), beginnend mit der Klassifizierung der American Veterinary Medical Association (AVMA) für Lebensstadien beiHunden 31, wobei die Lebensspanne in sechs Stadien unterteilt wurde: Welpe, Junior, Erwachsene, Reife, Senior und Geriatrie.
    3. Durch die Kompaktierung von Senior- und Geriatrie-Altersstufen sowie Erwachsenen- und Reifenstufen wenden Sie diese Terminologie an: präpubertär, junger Erwachsener, mittleren Alter und senior/im Alter von 22 Jahren.

2. Fixierung und Verarbeitung von Gehirngewebe

HINWEIS: Fixierungsverfahren können je nach Gehirngröße und ethischen Bedenken bezüglich bestimmter Tierarten unterschiedlich sein (die meisten großhirnigen Primaten oder Pferde können nicht perfundiert werden und müssen nach der Extraktion durch Eintauchen in die fixative Lösung behoben werden).

  1. Halten Sie das Gehirn vollständig in einer fixierenden Lösung (empfohlen werden 4 % Paraformaldehyd oder 10 % Formalin).
    HINWEIS: Der Zeitpunkt der Fixierung variiert je nach Gehirngröße (z. B. 3 Wochen beim Hundehirn; 3 Monate beim Pferdehirn, ergänzende Tabelle 1). Vermeiden Sie eine geringe oder übermäßige Zeit in der fixativen Lösung, um die Integrität des interessierten Antigens zu erhalten.
  2. Schneiden Sie die bevorzugte Gehirnhälfte mit einem Lineal (für einen geraden Schnitt) und einem Stichmesser in gleiche Scheiben (1–1,5 cm dick).
  3. Untertauchen Sie Gehirnscheiben in Phosphatpuffer (PB) 0,1 M (28,49 g Natriumphosphat-Dibasisk und 7,8 g Natriumphosphat-Monobasisk, gelöst in destilliertem Wasser, pH 7,4) und bewahren Sie sie 24 Stunden lang unter sanfter Rührung auf einem Shaker auf. Falls nötig (siehe UNTENSTEHENDE HINWEIS), entsorgen Sie die Lösung und ersetzen Sie sie am nächsten Tag durch eine frische Lösung mit PB 0,1 M, pH 7,4.
    HINWEIS: Das Volumen und die Anzahl der Waschen bei PB 0,1 M variiert je nach Gehirngröße (z. B. 30 Minuten für das Maushirn, 3 Tage für Pferdehirn). Stellen Sie sicher, dass das Gehirn vollständig in PB 0,1 M eingetaucht ist und dass Formalin, Blut und Gewebeabfälle nicht mehr vorhanden sind, um das Waschen zu verhindern.
  4. Die Scheiben werden mit Kryoschutz in Saccharoselösungen mit allmählich steigender Konzentration (10 %, 20 %, bis zu 30 %) in PB 0,1 M, pH 7,4 eingetaucht und sie sanft auf einem Shaker gerührt.
    HINWEIS: Das Volumen der Saccharose-Lösungen variiert je nach Gehirngröße. Stellen Sie sicher, dass das Gehirn vollständig in Saccharose-Lösungen untertaucht und vollständig absinkt, bevor es in eine erhöhte Konzentration versetzt wird.

3. Kryostat-Schneiden der gesamten Hemisphäre

  1. Entfernen Sie die Meningen aus den Gehirnscheiben mit einer gebogenen Pinzette, um Probleme beim Schneiden zu vermeiden.
  2. Geben Sie die Scheiben in Einbettformen, die mit optimaler Schneidetemperatur (OCT) gefüllt sind. Wenn die Scheibe die Einbettform nicht ausfüllt, schneide ein quadratisches Stück Parafilm, das etwas größer ist als die Gehirnscheibe, und gib OCT-Medium in die Mitte des Stücks und lege die Scheibe dann auf das OCT.
  3. Die Scheibe wird durch Eintauchen in 300 ml flüssigstickstoffgekühltes Isopentan bei -50 °C eingefroren, bis das OCT-Medium vollständig weiß wird. Gehirnschnitte können bei -80 °C zur langfristigen Lagerung bis zur Schnittteilung aufbewahrt werden.
  4. Vor der Schnittteilung sollten Sie die Gehirnscheibe mindestens 5 Stunden bei -20 °C halten, damit das Gewebe langsam und gleichmäßig die gleiche Temperatur wie der Kryostat erreichen kann.
  5. Schneiden Sie die Scheibe mit einem Kryostat in 40 μm dicke, serielle koronale Schnitte, wobei ein Innenraumtemperaturbereich von -20 °C bis -25 °C beibehalten wird.
  6. Sammeln Sie frei schwimmende Abschnitte in 12-Well-Platten und lagern Sie sie in kryoprotektiver Lösung (150 mL Glycerol, 150 mL Ethylenglykol, 150 mL destilliertes Wasser und 50 mL F-Puffer [1,682 g Natriumphosphat-monobasisches Dihydrat und 0,385 g Natriumhydroxid gelöst in destilliertem Wasser, pH 7,4]) (1 mL pro Bohrloch, um die Schnitte bei großen Gehirnen vollständig abzudecken) bei -20 °C bis zur Färbung.
    HINWEIS: Schnitte der ganzen Hemisphäre variieren je nach Gehirngröße. Größere Gehirne (z. B. Schimpansen, Pferde) müssen in zwei gleich große Blöcke (dorsal und ventral) unterteilt werden, um im Kryostat verarbeitet zu werden. In diesem Fall können frei schwebende Abschnitte in zwei 6-Well-Platten gesammelt werden. Eine Alternative ist, Hemisphären von großhirnigen Arten mit einem gleitenden Mikrotom zu durchschneiden, was größere Blöcke ermöglicht.

Abbildung 2
Abbildung 2: Verarbeitung sehr unterschiedlicher Gehirne nach demselben Verfahren und Umgang mit Variablen, die nicht standardisiert werden können. In der oben beschriebenen Methode werden alle standardisierten Verfahren auf die gleiche Weise durchgeführt (allgemeine Fixierung, Schneiden serieller koronaler Schnitte gleicher Dicke in der gesamten Hemisphäre, allgemeine immunzytochemische Verfahren, Zellzählung). Figur, erstellt mit BioRender (https://app.biorender.com/). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

4. Histologische Färbung

  1. Wähle serielle koronale Abschnitte (1 von 12 Abschnitten). Um diesen Abstand zu erhalten, wählen Sie alle Abschnitte eines Bohrlochs aus der 12-Well-Platte. Verwenden Sie sie, um eine vollständige Darstellung der gesamten Hemisphäre zu erhalten und als Referenz koronale Schnitte auf unterschiedlich vergleichbaren Gehirnebenen unter den untersuchten Arten auszuwählen (siehe Abschnitt 5). Montiere sie auf 1 % gelatinierten Objektträgern. Lass sie ein paar Stunden trocknen.
  2. Bereiten Sie folgende Lösungen (150 mL/Lösung) vor: Ethanol 50 %, 70 %, 96 %, 100 %, Xylol und Toluidinblau.
  3. Färbeprotokoll: Legen Sie die Objektträger in steigende Ethanolkonzentrationen (50%-100%), jeweils 1 Minute bei 50%-70%, jeweils 2 Minuten bei 96%-100% und dann für 1 Minute in Xylol-Lösung übergeben.
  4. Setzen Sie die Objektträger in umgekehrter Reihenfolge: Xylollösung für 1 Minute, dann abnehmende Ethanolkonzentrationen (100%-50%), jeweils 2 Minuten bei 100%-96%, jeweils 1 Minuten bei 70%-50%.
  5. Legen Sie die Objektträger in 150 ml destilliertes H2O (2 Min).
  6. Legen Sie die Objektträger in die Toluidin-Blau-Fleckenlösung (5–10 Minuten). Nach diesem Schritt erscheinen die gefleckten Abschnitte dunkelblau.
    HINWEIS: Die Zeitabschnitte, die in den Lösungen für die histologische Färbung aufbewahrt werden, können je nach Art variieren. Teste Gehirnabschnitte der jeweiligen Art, um das optimale Färbungsprotokoll festzulegen.
  7. Spülen Sie die Objektträger 1 Minute lang mit 150 ml destilliertem H2O.
  8. Fahren Sie mit dem Differenzierungsschritt fort, indem Sie die Objektträger für 1 Minute bei 70 %, jeweils 2 Minuten bei 96 % bis 100 % in eine Ethanolkonzentration (70 %–100 %) setzen und dann für 1 Minute 30 Sekunden in eine Xylol-Lösung übergeben. Während dieser Schritte wechseln die Abschnitte von dunkelblau zu himmelblau.
  9. Stelle sicher, dass die Abschnitte noch feucht vom letzten Xylol-Schritt sind, bevor du das Decken mit Montagemedium abdeckst (wenn sie trocknen, spüle sie 5 Sekunden lang in Xylol-Lösung ab). Dann lassen Sie die Objektträger ein paar Tage trocknen.

5. Auswahl der Gehirnwerte und immunhistochemische Färbung

  1. Anhand der histologisch gefärbten Schnitte aus Abschnitt 4 als Referenz werden Gehirnniveaus basierend auf spezifischen neuroanatomischen Merkmalen identifiziert: Stufe 1 (L1) – von der vorderen Öffnung des Seitenventrikels bis L2; Stufe 2 (L2) – vom vorderen Beginn der inneren Kapsel bis L3; Stufe 3 (L3) – vom vorderen Beginn der Amygdala bis L4; Stufe 4 (L4) – vom hinteren Schließen des Seitenventrikels zu einer Extension, die der von L2 entspricht (gleiche Anzahl von 40 μm dicken seriellen Schnitten; Abbildung 3).
    HINWEIS: Die oben genannten neuroanatomischen Referenzen dienen dazu, den Vergleich der Großhirnrinde, die zu Gehirnen unterschiedlicher Größe und Gyrencephalie gehören, zu ermöglichen. Je nach Hirnregion können sich die anatomischen Merkmale als Referenz ändern.
  2. Wählen Sie drei gleichmäßig verteilte koronale Abschnitte von jeder Gehirnebene aus.
    HINWEIS: Das Volumen jedes Puffers, das in den nächsten Schritten verwendet wird, variiert je nach Gehirngröße (z. B. 0,5 ml/Bohrloch für Mausabschnitte, 1,5 ml/Brunnen für Pferdeabschnitte). Stellen Sie sicher, dass die frei schwebenden Abschnitte vollständig von jedem Puffer abgedeckt sind.
  3. Waschen Sie die Abschnitte dreimal in PBS 0,01 M, pH 7,4, jeweils 5 Minuten lang.
  4. Inkubieren Sie Schnitte in endogener Peroxidase-Blocklösung (0,6 % H2O2, 1 % Triton X-100 in 0,01 M PBS, pH 7,4; 20 min) oder führen Sie Antigenentnahme mit Zitronensäure (10 mM Zitronensäure in destilliertem Wasser mit 0,05 % Tween 20, pH 6,0) 5 Minuten bei 90 °C durch.
    HINWEIS: Je nach Fixationsverfahren und -zeit sowie dem interessierten Antigen kann eine Antigenentnahme erforderlich sein, um eine optimale Färbung zu erzielen (Puffer, Temperatur, pH-Wert und verwendete Inkubationszeit können je nach interessiertem Antigen variieren).
  5. Waschen Sie erneut Abschnitte in PBS 0,01 M, pH 7,4 (3 x 5 Minuten Waschen).
  6. Inkubiere Abschnitte in Blocklösung (1–5 % Rinderserumalbumin (BSA), normales Serum, 1–1,5 % Triton X-100 in 0,01 m PBS, pH 7,4; 90 Minuten bei RT).
  7. Inkubieren Sie Schnitte mit primärer Antikörperlösung (1-5 % BSA, 2-3 % normales Serum, 1-1,5 % Triton X-100, primärer Antikörper in 0,01 m PBS, pH 7,4; 48 Stunden bei 4 °C bei sanftem Rühren).
    HINWEIS: Antikörper gegen das interessierte Antigen können unterschiedliche Ergebnisse hinsichtlich der Färbungsqualität liefern, wenn sie in verschiedenen Hirnregionen und bei verschiedenen Speziesverwendet werden. Ein Vergleich zwischen einer Reihe von Antikörpern verschiedener Hersteller ist erforderlich, um das optimale Werkzeug für die verschiedenen für die Studie betrachteten Arten auszuwählen (um die Variabilität zwischen den Proben zu verringern).
  8. Wiederholen Sie den Waschschritt, der in Schritt 5.3 beschrieben ist.
  9. Inkubieren Sie Schnitte mit sekundärer biotinylierter Antikörperlösung (1-5 % BSA, 2-3 % normales Serum, 1-1,5 % Triton X-100, sekundärer biotinylierter Antikörper in 0,01 M PBS, pH 7,4; 2 Stunden bei RT).
    HINWEIS: Die Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex-Methode wird für die Zellzählung bei Neurolucida verwendet (siehe Abschnitt 6), da sie einen dichten, langlebigen Niederschlag liefert, der somit beim Zählen durch die Schnittdicke fokussiert werden kann. Immunfluoreszenz- und konfokale Analyse können ebenfalls verwendet werden, um eine doppelte/dreifache Immunfärbung durchzuführen, um die Zellen weiter zu charakterisieren (für Protokolle siehe Ref.22,25,32).
  10. Bereiten Sie den Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex mit dem verfügbaren Kit vor.
    HINWEIS: Bereiten Sie eine Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplexlösung in Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5 (der einen stabilen pH-Wert für die Komplexbildung bietet), mindestens 1 Stunde vor der Verwendung her, um die Komplexbildung zu ermöglichen.
  11. Waschen Sie die Abschnitte zweimal in PBS 0,01 M, pH 7,4 (2 x 5 Minuten Waschen), und einmal in Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5 (5 Min).
    HINWEIS: Da der Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex in Lösung mit Tris-HCl 0,05M liegt, ermöglicht das Abspülen mit Tris-HCl 0,05 M die Habituation des Gewebes an die Lösung.
  12. Inkubieren Sie Schnitte im Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (1 Stunde bei RT).
  13. Waschabschnitte in Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5 (3 x 5 Minuten Waschen).
  14. Unter einer Abzughaube inkubieren Sie Schnitte in einer 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) Färbungslösung (H2O2, DAB in Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5), bis die optimale Färbung erreicht ist. Während dieses Schrittes wechseln die Schnitte von einem transparenten zu einem braunen/burgunderroten Farbton.
    HINWEIS: Die Zeit zur optimalen Färbung variiert je nach analysierter Art (z. B. bei DCX, 2–5 Minuten bei Mausschnitten, 20–30 Minuten bei Pferdeschnitten). Überprüfen Sie alle 2 Minuten die Flecken, um Überfleckungen zu vermeiden.
  15. Waschen Sie Abschnitte in PBS 0,01 M, pH 7,4 (3 x 5 Minuten Waschen).
  16. Befestige Abschnitte auf einer Rutsche, wenn sie trocken sind, decke sie mit einem Deckzettel mit Montagemedium ab und lass die Objektträger ein paar Tage trocknen.

Abbildung 3
Abbildung 3: Feststellung neuroanatomischer Gehirnwerte zur Untersuchung der DCX+-Verteilung und -Menge der unreifen Neuronen im Großhirnrinde. Vier korrespondierende neuroanatomische Strukturen (vorderer Beginn des Seitenventrikels [Ebene 1, L1]; vorderer Beginn der internen Kapsel [L2]; vorderer Beginn der Amygdala [L3]); hinteres Verschließen des Seitenventrikels [L4]; gekennzeichnet durch rote Kreise) wurden als Nachweis von vier entsprechenden vorderen bis posterioren "Gehirnniveaus" bei allen betrachteten Säugetieren angesehen, um die cIN-Zahl im Großhirnrinde auf eine "vergleichbare" Weise zu untersuchen. (A) Ein Beispiel wird für Labornager (Maus, links) und Primaten (Schimpanse, rechts) gegeben. Drei koronale Schnitte von jeder Gehirnebene (insgesamt 12 Schnitte; rote Pfeilspitzen) werden für die Zellzählung am gesamten Umfang der Schicht II jedes koronalen Schnitts berücksichtigt (HINWEIS: Alle Schnitte enthalten Neokortex, während nur einige davon auch Paläokortex enthalten). Dieser Ansatz zielt darauf ab, die Analysen auf korrespondierenden neuroanatomischen Ebenen in Gehirnen mit stark unterschiedlicher Größe durchzuführen. (B) Ein Beispiel für die Identifikation der ersten Ebene (L1) in histologisch gefärbten Schnitten sehr unterschiedlicher Säugetierarten wird gegeben. Gehirn- und Tiersymbole, erstellt mit BioRender. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

6. Zellzählung

  1. Öffnen Sie die Neurolucida-Software auf der Arbeitsstation und legen Sie den Objektträger unter das Mikroskop mit dem ausgewählten Ziel für die Zellzählung.
    HINWEIS: Für DCX+-Zellzählungen wurde ein 20-faches Ziel verwendet.
  2. Bei niedriger Vergrößerung (z. B. 4x) zeichnen Sie die Umrisse der kortikalen Schicht II mit dem Freihand-Konturlinien-Werkzeug im Trace-Menü der Software, um den Längenumfang (sowohl Paleocortex als auch Neokortex) zu erhalten.
  3. Wählen Sie die bevorzugten Symbole für die Zellenzählung in der Marker-Werkzeugleiste aus, die sich im linken Bereich des Bildschirms befinden. Für diese Analyse zählt man je nach Morphologie (entsprechend unterschiedlichen Reifungszuständen) unterschiedlich zwei verschiedene Zellen in jeder Interessenregion (Paläokortex, Neokortex) entsprechend ihrer Morphologie (entsprechend unterschiedlichen Reifungszuständen: Typ 1, mit kleinem Soma und bipolarer Form, Soma-Durchmesserbereich von 3–9 μm; Typ 2, mit größerem Soma und komplexer dendritischer Arborisation, Soma-Durchmesserbereich von 9–18 μm).
    HINWEIS: Für diese Analyse werden für jede interessierende Region zwei verschiedene Symbole/Zelltypen in der Marker-Toolbar ausgewählt. Die Unterteilung des Soma-Durchmessers in verschiedene Bereiche ist entscheidend, um die Zellen ohne klare Morphologie sorgfältig zu kategorisieren, da diese sich möglicherweise in einem Zwischenreifungszustand befinden. Um Überzählungen zu vermeiden, werden Zellen, die an der oberen Oberfläche des Schnitts geschnitten werden, aus der Analyse ausgeschlossen.
  4. Sammeln Sie die Daten für die phylogenetische Analyse aus drei verschiedenen Regionen: Paläokortex, Neokortex und Großhirnrinde (letzterer durch Hinzufügen von Daten aus Paläo- und Neokortex).
  5. Erfassen Sie in einer Tabellenkalkulation die kortikale Schicht zwei Perimeter (mm), die in der Konturmaß-Werkzeugleiste der Software sichtbar ist.
  6. In derselben Tabelle erfassen Sie die Anzahl der Typ-1- und Typ-2-Zellen (sichtbar in der Marker-Werkzeugleiste) sowie die Gesamtzahl der Zellen (durch das Addieren von Typ-1- und Typ-2-Zellen) in jeder betrachteten Gehirnregion und Hirnebene (drei Abschnitte/Ebene, insgesamt 12 Abschnitte/Probe).
  7. Verwenden Sie diese Daten, um für jeden Abschnitt in jeder Region die lineare Zelldichte (Anzahl der Zellen/mm) und den Prozentsatz der Typ-1- und Typ-2-Zellen (Zellzahl Typ 1/Typ 2 geteilt durch die Gesamtzahl der Zellen und multipliziert mit 100) zu ermitteln.
  8. Berechnen Sie den medianen Dichtewert (mit der Medianfunktion in der Tabelle) der 12 betrachteten Abschnitte/Probe, um die lineare Zelldichte grafisch darzustellen. Verwenden Sie den Median als zentrales Maß, da die Stichprobe pro Gruppe relativ klein ist (4 Tiere pro Gruppe) und einige Gruppen asymmetrische Verteilungen aufweisen (Median wird weniger von extremen Werten beeinflusst).
  9. Berechnen Sie den Prozentsatz der Typ-1- und 2-Zellen in jedem Exemplar (mit der oben beschriebenen Formel) und erhalten Sie dann den Mittelwert der Prozentsätze unter den vier betrachteten Exemplaren/Arten (mit der Durchschnittsfunktion in der Tabelle). Anschließend wird die lineare Zelldichte genutzt, um phylogenetische Analysen durchzuführen (siehe Abschnitt 7), und verwendet die Gesamtzahl der in jedem koronalen Abschnitt gezählten Zellen, um die Gesamtzahl der unreifen Neuronen/Hemisphären zu schätzen.
  10. Verwenden Sie das Freehand-Konturwerkzeug von Neurolucida Software, um eine Linie quer über den Soma-Durchmesser senkrecht zur Hauptachse zu ziehen. Durch diesen Schritt berechnet man die Durchmesserlänge von mindestens 100 zufällig ausgewählten DCX-positiven (DCX+) Zellen beider Typen in jeder Spezies (25 Zellen/Probe) in jedem Hirnbereich, um den Soma-Durchmesserbereich der Typ-1- und Typ-2-Zellen zu erhalten.

7. Phylogenetische Analysen: Phylogenetische Baumbildung

  1. Erstellen Sie eine Liste der analysierten Arten in Notepad unter Verwendung ihrer wissenschaftlichen Namen und laden Sie sie dann https://timetree.org/ auf der Seite hoch.
    HINWEIS: Die wissenschaftlichen Namen können über die Website überprüft werden: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy
  2. Exportiere die erhaltene Baumdatei, indem du auf den Button zu Newick file klickst.

8. Phylogenetische Analysen: Zählen der Datenintegration im phylogenetischen Baum

  1. In separaten Spalten eines Datenblatts listet man alle analysierten Arten und die entsprechenden zu korrelierenden Daten auf (in diesem Fall: DCX+ Zelldichte des gesamten Kortex, DCX+ Zelldichte des Neokortex DCX+ und Paleocortex DCX+ Zelldichte). Wenn pro Art mehrere Individuen verfügbar sind, berechnen Sie den Durchschnitt der Mediandichte für die ausgewählten Parameter.
  2. Laden Sie die Mesquite Project-Software (https://www.mesquiteproject.org/) herunter, um den phylogenetischen Baum mit den Zähldaten zu verbinden.
    HINWEIS: Diese Software erfordert, dass Java bereits auf dem Computer vorhanden ist.
  3. Öffnen Sie die zuvor von Timetree gespeicherte Newick-Datei, indem Sie auf Datei öffnen klicken. Wählen Sie dann die Option Simple Newick/Phylip Treefile . Behandle die Datei als Text und speichere sie als ".nex".
  4. Auf der neuen Seite, die geöffnet wird, wählen Sie Taxa&Bäume gefolgt von Neues Drei-Fenster und wählen Sie mit Bäumen aus Quelle. Im Pop-up-Fenster wählen Sie Gespeicherter Baum und drücken Sie OK. Ein neuer Tab namens Importierte Bäume wird angezeigt.
  5. Modifizieren Sie den phylogenetischen Baum grafisch (z. B. Schriftart, Größe, Äste proportional zur Länge) im Anzeigebereich .
  6. Füge einen neuen Tab auf Mesquite hinzu, wähle Hinzufügen und dann Neue Zeichenmatrix und wähle die Anzahl der Zeichen (für diese Studie gilt Zahl = 3, was den drei DCX+-Zelldichten entspricht). Behandle Charaktere als kontinuierliche Daten.
    HINWEIS: Die Charaktere stellen die Daten dar, die mit dem phylogenetischen Baum korreliert werden sollen.
  7. Kopiere in diesen neu erstellten Tab die Daten, die mit dem phylogenetischen Baum korreliert werden sollen (Teil 6.4), und speichere sie.
  8. Im Reiter Importierte Bäume wählen Sie Analyse:Baum und Charakterhistorie nachverfolgen , um eine Analyse der Parsimony Ancestral States durchzuführen.
  9. Datei als PDF speichern.

9. Phylogenetische Analysen: Korrelation zwischen Gehirngröße und DCX+ Zelldichten

  1. Im zuvor erstellten Datenblatt fügen Sie eine Spalte mit der Gehirngröße jeder Art hinzu.
  2. Berechnen Sie den natürlichen Logarithmus der DCX+-Zelldichten und der Gehirngröße.
  3. Starten Sie das bevorzugte statistische Softwarepaket (https://www.statskingdom.com/linear-regression-calculator.html) und führen Sie eine einfache lineare Regression durch
  4. Laden Sie die Ergebnisdateien herunter und speichern Sie die Residuen als neue Spalten im Datenblatt.
    HINWEIS: Residuen stellen die Abweichung der Datenpunkte von der Regressionslinie dar.
  5. Im Datenblatt wählen Sie die Spalte Residualen und die Spalte mit den Artennamen aus. Gehe dann zum Einfügen und wähle das Histogrammdiagramm aus, um die Residuen grafisch darzustellen.

10. Phylogenetische Analysen: Neokortikale Erweiterung und neokortikale DCX+-Zelldichtekorrelation

  1. Im zuvor erstellten Datenblatt fügen Sie eine Spalte mit den Flächendaten der neokortikalen Schicht II jeder Art hinzu und berechnen Sie die natürlichen Logarithmen.
  2. In der statistischen Software wird eine einfache lineare Regression durchgeführt, indem man die Werte der logarithmischen neokortikalen Schicht-II-Oberfläche als X-Variable und die Zelldichte des logarithmischen Neokortex DCX+ als Y-Variable verwendet.
  3. Laden Sie die erhaltenen Dateien herunter und speichern Sie die Residuen in einer neuen Spalte im Datenblatt, wo der Residuengraph wie in Schritt 9.5 erstellt werden kann.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die DCX+-Zellen im Großhirnrinde aller untersuchten Arten teilen konsequent eine Reihe von Merkmalen, die auf das Vorhandensein einer gut erhaltenen Population undifferenzierter Neuronen hinweisen (Abbildung 4A). Kurz gesagt: (i) sind topographisch angeordnet, um eine Monoschicht entlang der kortikalen Schicht II zu bilden; (ii) zeigen die morphologischen Subtypen, die für verschiedene Reifungsstadien in unreifen Neuronen beschrieben werden, (a) mit einer hohen Prävalenz kleiner, unipolarer/...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die hier beschriebene Methode liefert vergleichbare quantitative Daten, wenn verschiedene Arten mit stark unterschiedlichen Gehirngrößen und Neuroanatomie betrachtet werden. Es kann verwendet werden, um die Konsistenz von Zellpopulationen im gesamten Gehirn verschiedener Säugetiere zu bewerten sowie deren Entwicklung in einer einzelnen Art über nachfolgende Stadien hinweg zu verfolgen, von der Nachgeburt bis zum Altern. Es geht davon aus, dass eine relativ hohe Anzahl von Gehirnen (ganze...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Matteo Piumatti und Chiara La Rosa dafür, dass sie zur Definition des hier berichteten Protokolls für kortikale unreife Neuronen beigetragen haben. Die Arbeit wurde von der Fondazione CRT - Cassa di Risparmio di Torino (Verleihung RF=2022.0618) an LB unterstützt; PRIN2022 (Zuschuss 2022LB4X3N) an LB; Die National Science Foundation (gewährt EF-2021785, DRL-2219759) und National Institutes of Health (vergibt NS092988, AG067419) an CCS.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10 % FormalinSigma-AldrichHT501128
2-Methylbutan Sigma-Aldrich320404Isopentan
3,3′-DiaminobensidintetrahydrochloridhydratSigma-AldrichD5637
4 % ParaformaldehydSigma-Aldrich441244
Rinderserum-AlbuminSigma-AldrichA9647
Zitronensäure  SigmaC0759
DPX-Mountant für HistologieSigma-Aldrich  06522
EthanolMerck1.00983
EthylenglykolSigma-Aldrich102466
GlycerolSigma-AldrichG7893
WasserstoffperoxidlösungSigma-AldrichH1009
Killik – O.C.T.-KomplexBiooptik  05-9801
Mesquite-SoftwareMesquite-ProjektMesquite Version 3.81 (Build 955)
Neo-MontageSigma-Aldrich1.09016
Phosphatpufferte (PB)NaNaMaßgefertigt
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)NaNaMaßgefertigt
NatriumhydroxidRiedel-de Haen6213
Natriumphosphat-dibasisisches DihydratSigma-Aldrich71645
Natriumphosphat-monobasisches DihydratSigma-Aldrich71500
SucroseSigma-AldrichS9378
Toluidine BlueSigma-Aldrich89640
Triton X-100 Sigma-AldrichT8787
Tween 20Sigma-AldrichP9416
VECTASTAIN Elite ABC-HRP Kit Peroxidase (Standard)VektorlaborePK-6100
Xylol Sigma-Aldrich247642

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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